Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatisert analyse av intracellulære fenotyper av Salmonella ved bruk av ImageJ

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64263
Automatic Translation
1, 1, 1
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

Summary

Salmonella invaderer og replikerer inne i tarmepitelceller både i Salmonella-spesifikke vakuoler og fri i cytosolen (hyperreplikasjon). En fluorescensmikroskopibasert protokoll med høy gjennomstrømning er beskrevet her for å kvantifisere de intracellulære fenotypene av Salmonella ved to komplementære bildeanalyser gjennom ImageJ, og nå encellet oppløsning og skåring.

Abstract

Salmonella er et enterisk patogen som er i stand til å invadere tarmepitelet og replikere i enterocytter, både inne i Salmonella-spesifikke vakuoler og fri i cytosolen (cytosolisk hyperreplikasjon). Disse forskjellige fenotypene av intracellulær replikasjonsdrift til forskjellige patogeneseveier, dvs. cytosolisk hyperreplikasjon induserer inflammatorisk celledød og ekstrudering i tarmlumen, mens vacuolar replikasjon fører til transepitelpenetrasjon og systemisk spredning. Det ble gjort en betydelig innsats for å lage mikroskopiverktøy for å studere oppførselen til Salmonella inne i invaderte celler, for eksempel pCHAR-Duo fluorescensreporterplasmid som tillater diskriminering mellom vakuolære og cytosoliske bakterier ved differensialuttrykk av mCherry og GFP. Imidlertid blir intracellulære fenotyper ofte manuelt scoret, en tidkrevende prosedyre som begrenser analysen til et lite antall prøver og celler. For å overvinne disse begrensningene ble to komplementære og automatiserte bildeanalyser utviklet ved hjelp av ImageJ, en fritt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare. I high-throughput-protokollen ble epitelceller infisert med Salmonella som bærer pCHAR-Duo ved bruk av 96-brønnsplater. Avbildning ble utført ved hjelp av et automatisert fluorescensmikroskop. Deretter ble to bildeanalysemetoder brukt for å måle den intracellulære oppførselen til Salmonella på forskjellige detaljnivåer. Den første metoden måler den totale intracellulære bakteriebelastningen og omfanget av cytosolisk hyperreplikasjon. Det er raskt og tillater scoring av et høyt antall celler og prøver, noe som gjør det egnet for høy gjennomstrømningsanalyser som screeningeksperimenter. Den andre metoden utfører enkeltcelleanalyse for å bestemme prosentandelen infiserte celler, den gjennomsnittlige vakuolære belastningen av Salmonella og den cytosoliske hyperreplikasjonshastigheten som gir større detaljer om Salmonella-oppførsel inne i epitelceller. Protokollene kan utføres av spesialdesignede ImageJ-skript for automatisk å kjøre batchanalyser av de viktigste trinnene i Salmonella-enterocyttinteraksjon.

Introduction

Salmonella er det hyppigst rapporterte bakterielle middelet som forårsaker utbrudd av matbåren sykdom i EU1. Den primære patologiske manifestasjonen av Salmonella-infeksjon er enteritt, som er resultatet av patogenadferden i tarmen etter inntak og den påfølgende lokale inflammatoriske responsen2. Salmonella kan imidlertid også spre seg til ekstra-intestinale steder og forårsake systemisk infeksjon, spesielt hos immunkompromitterte individer. Typen interaksjon mellom Salmonella og tarmepitelet betinger utfallet av infeksjonen. En gang i tarmlumen invaderer og replikerer Salmonella inne i tarmepitelceller. På intracellulært nivå kan Salmonella presentere to forskjellige replikasjonsfenotyper, den cytosoliske hyperreplikasjonen og den intravacuolære langsomme replikasjonen i Salmonella-holdige vakuoler (SCVer). Den cytosoliske hyperreplikasjonen induserer inflammatorisk vertscelledød og Salmonella-ekstrudering i tarmlumen3; Den vakuolære replikasjonen fører til transepitelpenetrasjon og systemisk spredning4. Derfor påvirker omfanget av invasjon og vacuolar vs. cytosolisk replikasjon infeksjonsforløpet.

Slekten Salmonella er svært variert, inkludert tusenvis av serotyper med forskjellige vertsområder og evner til å forårsake sykdom. For eksempel S. Typhimurium er definert som en generalist serovar, fordi den infiserer flere ikke-relaterte verter, og representerer en av de viktigste årsakene til human salmonellose. Annerledes, S. Derby regnes som en svintilpasset serovar, da den for det meste er isolert fra svinet, men det er også rapportert i topp fem av serovarene som er ansvarlige for menneskelig infeksjon1. Imidlertid er kunnskap om bakteriell oppførsel inne i epitelceller i hovedsak begrenset til studiet av noen få referansestammer, som S. Typhimurium SL1344, som ikke representerer det store naturlige mangfoldet av Salmonella patogenitet. Karakterisering av samspillet mellom forskjellige stammer av Salmonella med epitelceller vil bidra til å forstå deres forskjellige patogenitet. Av denne grunn ble en fluorescensmikroskopibasert protokoll med høy gjennomstrømning utviklet for å analysere den intracellulære oppførselen til et stort antall stammer på en rask og i stor grad automatisert måte. I denne protokollen ble infeksjon av epitelceller utført i 96-brønns bildeplater og bildeinnsamling ble gjort ved hjelp av et automatisert fluorescensmikroskop. pCHAR-Duo-plasmidet ble brukt til å observere invasjons- og replikasjonsfenotyper av Salmonella inne i epitelceller gjennom fluorescerende mikroskopi5. Dette plasmidet bærer genet som koder for den røde fluorescerende reporteren mCherry, konstitutivt uttrykt av alle de transformerte bakteriecellene, og genet som koder for den grønne fluorescerende reporteren GFP, hvis uttrykk aktiveres av glukose-6-fosfat som utelukkende er tilstede i cytosolen av eukaryote celler og fraværende i SCVer. Derfor tillater plasmidet diskriminering mellom vakuolære og cytosoliske bakterier ved differensiell ekspresjon av mCherry- og GFP-reportere.

De vakuolære og cytosoliske bakteriene på mikroskopibilder kvantifiseres vanligvis ved manuell skåring6, men dette er en tidkrevende metode som begrenser analysen til et lite antall prøver. Derfor ble to komplementære og automatiserte bildeanalyser utviklet områdeanalyse og enkeltcelleanalyse ved hjelp av ImageJ7, en fritt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare. Områdeanalysen måler den totale intracellulære bakteriebelastningen og omfanget av cytosolisk hyperreplikasjon ved å bruke data fra områder okkupert av epitelceller, røde og grønne Salmonellae i hvert ervervet mikroskopibilde. Denne metoden kan brukes på bilder oppnådd ved lav forstørrelse; Derfor tillater det å score et høyt antall epitelceller med få bilder, noe som forkorter oppkjøpstiden. Enkeltcelleanalysen bruker cellesegmentering for å bestemme prosentandelen infiserte celler, gjennomsnittlig vakuolær belastning og prosentandelen infiserte celler som gjennomgår cytosolisk hyperreplikasjon med enkeltcelleoppløsning.

I denne protokollen er alle trinnene i bildeanalysen beskrevet i detalj for å bli utført manuelt, men den samme analysen kan automatiseres av våre spesialdesignede ImageJ-skript. Disse skriptene tillater også å kjøre batchanalyser for automatisk å analysere flere bilder og dermed øke hastigheten på utførelsen av metoden.

Protocol

1. Infeksjon av epitelceller med Salmonella som bærer pCHAR-Duo reporter plasmid

MERK: En flerkanals pipette anbefales.

  1. Belegg 96-brønns bildeplater med svarte vegger og flat glassbunn med kollagen rett før bruk.
    1. Fortynnet iseddik (17. 4 M) i sterilt demineralisert vann under en kjemisk hette for å oppnå en 20 mM eddiksyreoppløsning. Under sterile forhold, filtrer løsningen gjennom et sprøytefilter med 0,2 μm porestørrelse. La løsningen stå i et 0-4 °C rack i 5 min.
    2. Fortynn 3 mg/ml kollagenstammen til 50 μg/ml i forkjølt 20 mM eddiksyreoppløsning. Bland ved å snu 10 ganger, og dispenser deretter 30 μL kollagenoppløsning per brønn (5 μg kollagen / cm2), hold løsningen i et 0-4 ° C rack for å unngå kollagensalg.
    3. Sørg for at brønnbunnene er helt dekket med kollagen, og la platen ligge under laminær strømning i 1 time ved romtemperatur (RT).
    4. Fjern løsningen forsiktig og utfør tre vasker med 30 μL fosfatbufret saltvann (PBS). Bruk en flerkanals 100 μL eller 50 μL pipette for å unngå kollagenløsning.
  2. Kultur INT407 epitelceller i kollagenbelagte avbildningsplater 20-24 timer før infeksjon.
    1. Rutinemessig dyrker INT407-celler i 25 cm2 kolber i minimum essensielt medium med 10 % føtalt bovint serum (FBS), heretter definert kulturmedium (CM), supplert med penicillin 100 U/ml og streptomycin 100 μg/ml (Pen/Strep).
    2. Vask to ganger INT407-kolber med 5 ml PBS, og løsne deretter cellene med 1 ml trypsin-EDTA-oppløsning i 3-5 minutter ved 37 °C i fuktet 5 % CO2-atmosfære 20-24 timer før infeksjon. Tell cellene og lag en 3 x 105 celler/ml suspensjon i CM.
    3. Dispenser 100 μL cellesuspensjon/brønn i kollagenbelagte avbildningsplater for å oppnå 100 % konfluens. Inkuber ved 37 °C i fuktet 5 % CO2-atmosfære i 1 time for å lette celleadhesjon. Tilsett deretter 100 μL CM og inkuber ved 37 °C i fuktet 5% CO2 atmosfære i 20-24 timer til infeksjonen (trinn 1.4).
      MERK: For å avbilde intracellulære bakterier, blir Salmonella-stammer transformert med pCHAR-Duo-reporterplasmidet som ble levert av Dr. Olivia Steele-Mortimer. De testede stammene her ble valgt for å representere fenotypediversiteten som dekkes av protokollen og validere bildeanalysene i avsnitt 4. Se de representative resultatene for mer informasjon om stammene som ble brukt i denne studien.
  3. Forbered stasjonære fasekulturer av Salmonella-stammer som bærer pCHAR-Duo-reporterplasmidet.
    1. Prøv Salmonella-glyserolstammen med spissen av en 10 μL-pipette og inokuler den til 1 ml Luria Bertani-buljong (10 g trypton, 5 g gjærekstrakt og 10 g natriumklorid per liter) supplert med ampicillin 100 μg / ml.
    2. Inkuber inokulum statisk ved 37 °C i 20 timer før infeksjon for å nå den stasjonære vekstfasen, tilsvarende ~1 x 109 Colony Forming Units (CFU)/ml8.
  4. Infiser INT407 epitelceller med Salmonella.
    MERK: Infeksjoner utføres i tre eksemplarer.
    1. Vask INT407-celler forsiktig med 200 μL PBS/brønn.
    2. Forbered Salmonella inoculum ved å fortynne bakterier over natten kultur i CM for å oppnå ønsket antall CFU per epitelcelle, definert som multiplikasjon av infeksjon (MOI). Her ble MOI 100 brukt.
    3. Inokuler 200 μL / brønn, og dekk deretter platen med en pustende tetningsmembran og inkuber ved 37 ° C i fuktet 5% CO2 atmosfære i 1 time. Inokulasjon betraktes som tid null av infeksjonen.
    4. Fjern inokulum og vask forsiktig med 200 μL PBS / brønn, og tilsett deretter 200 μL CM med gentamicin 100 μg / ml per brønn. Dekk platen med en pustende tetningsmembran, og inkubert deretter ved 37 °C i fuktet 5 % CO2-atmosfære i 1 time.
    5. Fjern CM med gentamicin 100 μg / ml og vask forsiktig med 200 μL PBS / brønn. Tilsett 200 μL CM med gentamicin 10 μg / ml per brønn, dekk platen med en pustende tetningsmembran, og inkuber deretter ved 37 ° C i fuktet 5% CO2 atmosfære i 8 timer.

2. Prøvefiksering og epitelcellefarging

MERK: Oppretthold prøvene beskyttet mot direkte lyseksponering. Volumer er indikert for brønner på en 96-brønns plate. Volumoptimalisering er nødvendig for forskjellige cellekulturplater eller støtter.

  1. Ved 8 timer etter infeksjon, fjern CM og vask forsiktig tre ganger med 200 μL / brønn PBS. Fjern PBS ved å invertere platen på absorberende papir; Unngå å aspirere.
  2. Fest de infiserte monolagene med 100 μL / brønn paraformaldehyd (PFA) 4% i PBS i 20 minutter ved RT. Fjern PFA 4% og vask tre ganger med 200 μL / brønn PBS. Platen kan oppbevares i maksimalt 16-24 timer ved 4 °C. Fortsett med neste trinn.
  3. Flekkepitelceller.
    MERK: DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) DNA-flekk (trinn 2.3.1) brukes til områdeanalysen kun for å flekke kjerner, og High Content Screening (HCS) flekk (trinn 2.3.2) brukes til enkeltcelleanalyse for å farge hele epitelcellen. Andre cellulære flekker kan brukes, men optimalisering av bildeinnsamling og analyse er nødvendig.
    1. Områdeanalyse: dispenser 100 μL / brønn av DAPI (300 nM-løsning i PBS) og inkuber 5 min ved RT beskyttet mot lys.
    2. Enkeltcelleanalyse: permeabiliser med 100 μL / brønn triton 0,1x i PBS i 15 minutter ved RT. Vask tre ganger med PBS og dispenser 100 μL / brønn HCS-flekk fortynnet 1:2000 i PBS. Inkuber i 30 minutter ved RT beskyttet mot lys.
  4. Fjern fargeløsningen og vask tre ganger med 200 μL / brønn PBS. Legg til 50 μL / brønn PBS for automatisert bildeinnsamling.

3. Bildeopptak med et automatisert fluorescensmikroskop

MERK: Her brukes lav forstørrelse (10x/0.3 NA, 1 μm/pixel mål) i trinn 3.1.1 for områdeanalysen og høy forstørrelse (40x/0.75 NA, 0.255 μm/pixel mål) i trinn 3.1.2 for enkeltcelleanalysen i oppkjøpsprotokollen. Andre forstørrelser kan brukes, men optimalisering av bildeoppkjøp og analyse er nødvendig. Hvis det er tillatt av det tilgjengelige mikroskopet, kan du skaffe bilder som Tile Regions (TRs), en "mosaikk" av sammenhengende felt kalt fliser, for å registrere store prøveområder. Still inn autofokusen i midten av en TR i stedet for å angi en for hver flis, for å redusere prøveeksponeringen under autofokusprosedyren.

  1. Bruk programvareautofokus i cellefargingskanalen (blå kanal for HCS-flekk og DAPI-kjernefarge) som referanse z-posisjon. Skaff bilder i cellefargingskanal (465 nm, celler eller kjerner) og i pCHAR-Duo reporterkanaler mCherry (610 nm, intracellulær Salmonellae) og GFP (509 nm, cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae).
    1. Områdeanalyse: Bilde ≥104 celler/teknisk replikering (dvs. minst tre TR-er med fire fliser/brønn som tilsvarer en teknisk replikasjon anbefales) ved 10x forstørrelse.
      MERK: Et enkelt z-plan er tilstrekkelig til å avbilde både celler som inneholder vakuolar og celler som inneholder cytosoliske hyperreplikerende Salmonellae ved 10x forstørrelse.
    2. Enkeltcelleanalyse: Image ≥1000 celler/teknisk replikering (dvs. minst to TR-er med 16 fliser/brønn som tilsvarer en teknisk replikasjon anbefales) ved 40x forstørrelse. Flere z-plan er nødvendig for å avbilde både celler som inneholder vacuolar og celler som inneholder cytosoliske hyperreplikerende Salmonellae. Definer den optimale z-stacken (3,85 μm z-stack med 0,55 μm intervall for å oppnå åtte z-plan er indikert for å avbilde INT407-celler infisert med cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae ved 40x). Hvert z-plan identifiseres heretter som n/8, med n mellom 1 (tilsvarende det nederste z-planet) og 8 (tilsvarende det øverste z-planet).
  2. Utdataene for hvert brukeranskaffelse er en fil med navnet Acquisition.czi som inneholder bilder av alle felt, kanaler og z-plan. Hvis TR-er ble anskaffet, smelter du flisene sammen for å få et samlet bilde av hver TR ved å bruke en enkelt Acquisition.czi-fil som inndata for sømmetoden.

4. Bildeanalyse ved hjelp av ImageJ

MERK: Trinn 4.1 og trinn 4.2 er spesielt utviklet for eksperimentet og oppkjøpet beskrevet ovenfor. Andre eksperimentelle innstillinger kan kreve optimalisering av analysen. Analysen av en enkelt Acquisition.czi-fil er beskrevet. For batchanalysen finner du enkeltcelleanalyseskriptet og områdeanalyseskriptet som tilleggsfiler (tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2). Etiketter som brukes i skriptene og ImageJ-kommandoene, er i fet skrift i avsnittene nedenfor.

  1. Analyse av areal
    1. Åpne filen Acquisition.czi i ImageJ, navngitt som AcquisitionTitle i skriptet: File > Open > AcquisitionTitle.czi. Et vindu som viser alle kanalene åpnes. Kanalene er angitt som c:1-3/3 avhengig av anskaffelsesordren. Her tilsvarer c:1/3 blå (DAPI), c:2/3 til mCherry (intracellulær Salmonellae) og c:3/3 til GFP (cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae).
    2. Reduser tilfeldig støy for å klargjøre bilder for områdemåling i trinn 4.1.6 og 4.1.7.
      1. Dupliser AcquisitionTitle-vinduet ved hjelp av Image > Duplicate > OK for å få tak i AcquisitionTitle1-vinduet .
      2. Bruk Gaussisk uskarphet på AcquisitionTitle1 gjennom Prosess > Filter > Gaussisk uskarphet. La standard Sigma-verdi være 2, og klikk på OK. Et prosessstabel? vindu åpnes, klikk på Ja for å behandle alle kanalene.
      3. Trekk den gaussiskfiltrerte AcquisitionTitle1 fra originalfilen AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: velg AcquisitionTitle som bilde1, velg operasjonen Subtrahere i rullegardinlisten, og velg deretter AcquisitionTitle1 som Image2. Klikk på OK. Et prosessstabel? vindu åpnes. Klikk på Ja for å behandle alle tre bildene (kanalene) for å få vinduet ResultsOfAcquisitionTitle.
    3. Del kanaler gjennom bilde- > farge- > delte kanaler. Hvert kanalbilde vises nå i et eget vindu, automatisk navngitt av ImageJ som C-ResultsOfAcquisitionTitle. Her tilsvarer C1-ResultsOfAcquisitionTitle DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle til mCherry (intracellulær Salmonellae) og C3-ResultsOfAcquisitionTitle til GFP (cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae).
    4. Behandle C1-ResultsOfAcquisitionTitle-bildet for å måle området okkupert av epitelcellekjerner.
      1. Naviger til Process > Smooth for å homogenisere nukleolus som vises som hull inne i kjerneområdet.
      2. Terskel C1-ResultsOfAcquisitionTitle-bildet for å ekskludere bakgrunnen ved hjelp av Image > Juster > terskel: Merk av for Mørk bakgrunn og velg Rød i rullegardinlisten. Angi den automatiske trekantterskelen, og bruk deretter den øvre glidebryteren til å angi minimumsterskelverdien når kjernene ser røde ut, og bakgrunnen vises svart (Terskel = 100, brukt i denne protokollen).
        MERK: De automatiske tersklene som er beskrevet i trinn 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 og 4.2.4.3, foreslås som en veiledning for brukeren for å definere den best passende terskelen for henholdsvis kjerner/epitelceller og bakterier manuelt. Verdien av den automatiske terskelen overstyres i skriptet av den definerte manuelle terskelen. Den definerte manuelle terskelen vil bli brukt på hele batchanalysen.
    5. Velg målernesom er av interesse ved å bruke Analyser > Angi måling: Merk av for Grense til terskelverdi for å begrense målingen til terskelbildepunkter. Kontrollområde, tilsvarende det totale arealet okkupert av terskelpiksler (dvs. kjerner i C1-ResultsOfAcquisitionTitle, intracellulær salmonella i C2-ResultsOfAcquisitionTitle, cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae i C3- ResultsOfAcquisitionTitle). Merk av for Vis etikett for å registrere anskaffelsestittelen og -kanalen for hvert bilde i resultattabellen.
    6. Mål området okkupert av kjernene ved hjelp av Analyser > mål. Målinger registreres i resultattabellen som åpnes automatisk.
    7. Prosess C2-ResultsOfAcquisitionTitle og C3-ResultsOfAcquisitionTitle for å måle området okkupert av henholdsvis samlet intracellulær Salmonella og cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae. Følg trinn 4.1.4-4.1.6 med noen endringer: Hopp over utjevningstrinnet i trinn 4.1.4.1 og bruk Otsu autoterskel i stedet for trekanten i trinn 4.1.4.2 som en veiledning for å angi minimumsterskelverdien (øvre glidebryter) når Salmonellae vises rød og bakgrunnen vises svart (Terskel = 200 foreslått).
    8. Lagre resultattabellen ved hjelp av Fil > Lagre som > alle filer.
    9. Åpne resultattabellen i et regneark for å beregne arealforhold for hver analyserte AcquisitionTitle-fil :
      1. Beregn infeksjonsforholdet: del området okkupert av total intracellulær Salmonellae (her rød kanal, C2-) med området okkupert av epitelcellekjerner (her DAPI, C1-).
      2. Beregn hyperreplikasjonsforholdet: del området okkupert av cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae (grønn kanal, C3-) med området okkupert av total intracellulær Salmonellae (rød kanal, C2-).
  2. Encellet analyse
    1. Åpne filen Acquisition.czi i ImageJ, navngitt som AcquisitionTitle i skriptet: Fil-menyen > Åpne > Acquisition.czi. Et vindu som viser bilder av alle kanaler og alle z-fly åpnes.
    2. Del kanalene etter bilde > farge > delte kanaler. Kanalene vises nå i atskilte vinduer, automatisk navngitt av ImageJ som C-AcquisitionTitle. Her tilsvarer C1-AcquisitionTitle-vinduet epitelceller (blå), C2-AcquisitionTitle-vinduet til intracellulær Salmonellae (mCherry) og C3-AcquisitionTitle-vinduet til cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae-kanal (GFP). Hvert C-AcquisitionTitle-vindu inneholder alle z-flyene som er anskaffet.
    3. Behandle C1-oppkjøpstittel -vinduet, som tilsvarer epitelceller, for å segmentere celler.
      1. Velg z-planbildet som skal brukes til cellesegmentering. Velg C1-AcquisitionTitle-vinduet og bruk Image > Duplicate: skriv nummeret til det valgte z-planet (dvs. 1 for å velge z 1/8), skriv C1Zplane i Tittel-boksen, fjern merket for Duplicate Stack, og klikk deretter på OK for å duplisere det valgte z-plane-bildet. Et vindu kalt C1Zplane som viser det valgte z-planbildet åpnes.
      2. Behandle det oppnådde C1Zplane-bildet for å forbedre bildekontrasten. Åpen prosess > forbedre kontrasten: juster de mettede pikslene (dvs. her brukes 1% og sjekk Normaliser. Klikk deretter på OK for å bruke kontrastforbedringsteknikken for å få et kontrastnormalisert C1Zplane-bilde .
      3. Behandle det kontrastnormaliserte C1Zplane-bildet for å segmentere epitelcellene. Bruk Process > Find Maxima for å åpne FindMaxima-menyen : Først flagger du Preview Point Selection for å angi støytoleranse for å tilskrive bare ett maksimumspunkt til hver enkelt epitelcelle. Flagg ekskluder Edge Maxima. Velg utgangstype Segmenterte partikler og klikk på OK for å få C1ZplaneSegmented, et nytt binært maskelignende bilde som viser hver segmentert partikkel per maksimumspunkt merket.
        MERK: Find Maxima ImageJ-algoritmen brukes til å segmentere celler. Maksimumspunkter (pikselintensitetstopper) oppdages over hele bildet, som potensielt tilsvarer celler. En støyterskel (støytoleranse) er satt, og det sammenhengende området rundt maxima-punkter analyseres for å skape et binært maskelignende bilde som definerer hver segmentert partikkel per maksimapunkt, derav hver celle.
      4. Behandle C1ZplaneSegmented-bilde for å opprette en maske med segmenterte celler. Bruk Analyser > analysere partikler: velg alternativet Vis masker og ekskluder på kanter. Juster området for segmenterte partikler som skal inkluderes i masken, tilsvarende størrelsesparameteren , for å ekskludere feilsegmenterte objekter som celleklynger og cellefraksjoner. Hvis du vil rangere området for feilaktig segmenterte objekter, bruker du tryllestavsporingsverktøyet på verktøylinjen: partikkel med tryllestaven , og åpne deretter Analyser > mål for å måle arealet av feilaktige objekter. Angi størrelsesintervallet (foreslått område 250-1700 piksler2) og klikk på OK for å få tak i MaskofC1ZplaneSegmented binærmaske.
      5. Som standard har MaskOfC1ZplaneSegmented binærmaske en inverterende LUT. Bruk LUT > Inverter LUT på verktøylinjen.
      6. Behandle MaskOfC1ZplaneSegmented binærmaske for å korrigere cellesegmentering:
        1. Terskelkontrastnormalisert C1Zplane-bilde oppnådd i trinn 4.2.3.2. Bruk bilde > Juster > terskel: Merk av for Mørk bakgrunn. Angi innstillingen Standard automatisk terskel. Velg det røde alternativet og juster minimum avskjæringsverdi (øvre linje) til cellene vises helt rødt, og etterlater mørk bakgrunn (Terskel = 8,000 brukt i denne protokollen). Klikk deretter på Bruk for å konvertere det kontrastnormaliserte C1Zplane-bildet til et binært bilde med celler i hvitt og bakgrunnen i svart.
        2. Riktig cellesegmentering i MaskOfC1ZplaneSegmented binær maske. Bruk Process > Image Calculator: velg MaskOfC1ZplaneSegmented as Image1, velg operasjonen AND i rullegardinlisten, og velg deretter det terskelformede kontrastnormaliserte C1Zplane som Image2. Klikk på OK. Utdatabildet navngis automatisk av ImageJ som Results of Mask of C1Zplane Segmented.
      7. Prosessresultater av maske av C1Zplane Segmentert for å merke hver enkeltsegmentert celle som en interesseregion (ROI). Bruk analyser > analysere partikler. Juster Størrelse som i trinn 4.2.3.4, og velg deretter alternativet Vis ingenting. Merk av for Legg til i administrator for å legge til alle partiklene (segmenterte celler) i ROI Manager-verktøyet. Merk også av for Ekskluder på kanter. Klikk på OK. ROI Manager-menyen viser en liste over alle partikler (segmenterte celler), definert som ROIer, unikt merket med deres respektive y- og x-koordinater.
      8. Lagre ROIs data som ROI-celler-AcquisitionTitle.zip gjennom ROI Manager-menyen ved å klikke på Mer > Lagre. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip vil bli åpnet i trinn 4.2.4.6 for enkeltcelleanalysen.
    4. Behandle C2-oppkjøpstittel vindu (her rød kanal), tilsvarende intracellulær Salmonellae, for å måle antall infiserte celler og den intracellulære vakuumbelastningen.
      1. Trekk den grønne kanalen (C3-) fra den røde kanalen (C2-) for å fjerne ufokuserte piksler av den cytosoliske hyperreplikerende Salmonellae.
        1. Bruk Prosess > Bildekalkulator. Velg C2-Acquisitiontitle som bilde1, velg operasjonen Trekk fra i rullegardinlisten, og velg deretter C3-Acquisitiontitle som Image2. Merk av for Opprett nytt vindu og klikk på OK.
        2. Bruke subtraksjon på hele z-stakken ved å klikke på Ja i prosessstakken? vindu. Utdatavinduet heter ResultsOfC2AcquisitionTitle i skriptet.
      2. Process ResultsOfC2AcquisitionTitle for å redusere tilfeldig støy.
        1. Dupliser vinduet ResultsOfC2AcquisitionTitle ved å klikke på Bildemeny > Dupliser. Merk av for Duplicate Stack , og trykk OK for å få vinduet ResultsOfC2AcquisitionTitle1 .
        2. Bruk Gaussisk uskarphet på vinduet ResultsOfC2AcquisitionTitle1 gjennom Process > Filter > Gaussian Blur. La Sigma verdi som 2 eller tilpasse den (dvs. her Sigma: 4 ble brukt). Klikk på OK og bruk Gaussian Blur på hele z-stacken ved å klikke på Ja i Process Stack?- vinduet.
        3. Trekk fra Gaussian filtrert ResultsOfC2AcquisitionTitle1 til ResultsOfC2AcquisitionTitle ved å klikke på Process > Image Calculator. Velg ResultsOfC2AcquisitionTitle as Image1, velg Operation Subtract i rullegardinlisten, og velg deretter ResultsOfC2AcquisitionTitle1 som Image2. Klikk på OK. Bruk subtraksjon på hele z-stakken ved å klikke på Ja i prosessstakken?-vinduet for å få et vindu automatisk navngitt av ImageJ som Resultater av C2-AcquisitionTitle.
      3. Behandle resultatene av C2-AcquisitionTitle for å skille Salmonellae fra bakgrunnen. Bruk bilde > Juster > terskel: Merk av for Mørk bakgrunn og angi automatisk terskel for Otsu . Juster minste grenseverdi (øvre stolpe) til Salmonellae vises helt rødt, og etterlater mørk bakgrunn (terskel = 100 brukt i denne protokollen). Klikk på Bruk og Konverter til binær-vinduet åpnes: sjekk Svart bakgrunn, og klikk deretter på OK. Hele z-stacken er nå konvertert til binære bilder.
      4. Velg det midterste Z-planet, som tilsvarer vacuolar Salmonellae-fokusplanet, i resultatene av Results of C2-AcquisitionTitle binært vindu fra trinn 4.2.4.3: Image > Stacks > Set Slice og skriv nummeret på det valgte z-planet (f.eks. her z: 4/8 brukes). Klikk på OK.
      5. Angi at målene skal registreres for hver avkastning (celle). Bruk Analyser > Angi måling: Merk av for Område, som tilsvarer det totale arealet for hver avkastning. Merk av for Område brøk og Begrens til terskel for å registrere bare arealfraksjonen okkupert av terskelpiksler (intracellulære salmonellaer) for hver avkastning. Merk av for Display Label for å merke hver eneste ROI med bildetittelen, kanalen, z-planet og x-y-koordinatene i resultattabellen.
      6. Behandle det valgte z-planet av intracellulær Salmonellae til plateselskaper, Område og% Område okkupert av Salmonellae for hver enkelt celle (ROI): åpne ROI-celler-AcquisitionTitle.zip-filen, lagret i trinn 4.2.3.8, etter Fil > Åpne og klikk på Mål i ROI Manager-menyen. Resultatet er en tabell som rapporterer de valgte målingene.
      7. Lagre resultattabellen ved hjelp av Fil > Lagre som i resultatvinduet.
      8. Åpne resultattabell i et regneark: etikett Areal og %Areal okkupert av intracellulær Salmonellae er angitt for hver avkastning, tilsvarende en konturert celle unikt identifisert med x- og y-koordinater.
      9. Mål antall infiserte celler som tilsvarer avkastning som viser et %Areal > 0 okkupert av terskelpiksler, tilsvarende Salmonellae (dvs. her anses et %Areal > 0,2% å identifisere infiserte celler). Deretter beregner du prosentandelen av infiserte celler på de totale cellene.
      10. Mål vacuolar belastning av Salmonella / celle ved å beregne gjennomsnittet% Areal okkupert av vacuolar Salmonellae for alle infiserte celler.
    5. Behandle grønn kanal (C3-AcquisitionTitle) for å måle antall celler som viser cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae. Følg fra trinn 4.2.4.2 til 4.2.4.9, men med noen endringer.
      1. Arbeid på de øvre z-planene (her z: 7 / 8), siden celler som viser cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae stikker ut fra monolaget; derfor er de i fokus på et annet plan sammenlignet med celler uten hyperreplikerende Salmonellae.
      2. Mål antall celler som inneholder cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae (grønn) ved å score celler (ROI) som viser høyt% Areal okkupert av Salmonellae (f.eks. Et %Areal > 20% anses å identifisere celler som inneholder cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae). Deretter beregner du prosentandelen av celler som inneholder cytosolisk hyperreplikasjon-Salmonellae på totalt infiserte celler scoret i trinn 4.2.4.9.

Representative Results

Infeksjon av epitelceller med Salmonella-stammer
Denne protokollen ble utviklet for å analysere den cellulære invasjonen og den cytosoliske replikasjonen (figur 1A) vs vakuolær belastning (figur 1B) av Salmonella inne i epitelceller. Protokollen ble validert ved å bruke de tre følgende Salmonella-stammene, S. Typhimurium SL1344 referansestamme (S. Tm), S. Derby ER1175 villtype (S. Derby wt) og den isogene mutanten av S. Derby ER1175 uten sipA gen (S. Derby ΔsipA). S. Derby ER1175-stammen ble isolert fra svin og tilhører IZSLER-overvåkingssamlingen av Salmonella-isolater. Stammene ble valgt for å representere fenotypemangfoldet som omfattes av protokollen. Spesielt ble disse stammene valgt fordi deres oppførsel i epitelceller allerede var kjent for å avvike når det gjelder invasjon eller replikasjon9; derfor var de verdifulle kontroller for å teste om protokollen tillot kvantitativt å skille forskjeller i intracellulære Salmonella-fenotyper. Spesielt S. Tm og S. Derby wt ble tatt med fordi vi tidligere hadde vist at S. Tm har høyere invasjons- og intracellulær replikasjonseffektivitet enn S. Derby wt9 mens S. Derby Δ sipA ble lagt til som en hyperreplikasjonshemmet belastning siden virulenseffektorenSipA spiller en avgjørende rolle i begynnelsen av hyperreplikasjon10,11. Det er tidligere anmeldt for S. Tm at cytosolisk replikasjon starter 4 timer etter invasjonen, og deretter hyperreplikerer den cytosoliske befolkningen raskt for å fylle epitelcellen med 8 t11,12. Konsekvent var 8 timer lang infeksjon egnet til å observere og kvantifisere den cytosoliske hyperreplikasjonsfenotypen også i S. Derby wt og S. Derby ΔsipA.

Analyse av areal
Områdeanalysen i trinn 4.1 gir en måling av den totale koloniseringen av epitelceller av Salmonella (infeksjonsforhold), sammen med en måling av hyperreplikasjonen (hyperreplikasjonsforhold). I områdeanalysearbeidsflyten beskrevet i figur 2 reduseres den tilfeldige støyen, og deretter deles kanalene og behandles uavhengig. Det settes en terskel for hver kanal for å ekskludere bakgrunnen fra områdemålingen. Deretter måles området okkupert av terskelpiksler for hver kanal. Resultatet av områdeanalyse er en tabellrapportering, for hver anskaffelsesfil, utvidelsen av områdene okkupert av epitelcellekjerner (blå kanal), intracellulær mCherry-uttrykkende Salmonellae (rød kanal) og cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae som uttrykker GFP (grønn kanal) sammen med mCherry. Infeksjonsforholdet beregnes ved å dele området okkupert av mCherry-uttrykkende Salmonellae med området okkupert av vertscellekjerner. Resultatene av de testede stammene viste at S. Tm viser et betydelig høyere infeksjonsforhold sammenlignet med begge S. Derbystammer, som forventet (figur 3A). Derfor viser disse resultatene effekten av områdeanalyse for å oppdage forskjeller i salmonellastammers evne til å kolonisere epitelceller. Salmonella hyperreplikasjonsforhold måles ved å dele området okkupert av GFP-uttrykkende Salmonellae med området okkupert av intracellulær mCherry-uttrykkende Salmonellae. Konsekvent med rollen som SipA i å bestemme hyperreplikasjon, et betydelig redusert hyperreplikasjonsforhold for S. Derby ΔsipA-stammen ble målt sammenlignet med S. Derby wt, (figur 3B). Ingen hyperreplikasjonsforskjell ble observert mellom S. Tm og S. Derby vekt. Samlet sett avslørte områdeanalyse effektivt forskjellige hyperreplikasjonsnivåer blant de analyserte stammene.

Encellet analyse
Enkeltcelleanalysen gjør det mulig å kvantifisere Salmonella-invasjon og vakuolær belastning vs. cytosolisk replikasjon inne i epitelceller med enkeltcelleoppløsning. Som beskrevet i trinn 4.2 ble blå, røde og grønne kanaler behandlet uavhengig for hver anskaffelsesfil (figur 4). Spesielt ble den blå kanalen, tilsvarende epitelceller, behandlet i trinn 4.2.3 for å oppnå cellesegmentering. Deretter ble segmenterte celler lagt til i Manager for interesseområde (ROI) for å få en liste over ROIer, tilsvarende alle segmenterte celler unikt merket med yx-koordinater. For å fjerne ufokuserte piksler av GFP- som uttrykker hyperreplikerende Salmonellae, ble pikslene til den grønne kanalen trukket fra den røde kanalen. Utgangstabellen for enkeltcelleanalyserapporter, for hver avkastning, området og prosentandelen av avkastningens område okkupert av Salmonellae som bare uttrykker mCherry konstituerende reporter eller GFP cytosol-responsiv reporter. Prosentandelen av cellens areal okkupert av mCherry-only uttrykker Salmonellae ble behandlet i trinn 4.2.4 for å beregne prosentandelen av infiserte celler og gjennomsnittlig vakuolær belastning (figur 5A). Analyse av vacuolarbelastningen viste at S. Derbystammer genererer en gjennomsnittlig vakuolær belastning betydelig lavere enn S. Tm (figur 5B). Omvendt ble det bare observert en liten og ikke signifikant reduksjon av prosentandelen infiserte celler i S. Derbystammer sammenlignet med S. Tm (figur 5A). Prosentandelen av cellens område okkupert av GFP-uttrykkende Salmonellae ble behandlet i trinn 4.2.5 for å oppnå hyperreplikasjonshastigheten. Det ble ikke observert noen forskjell mellom S. Tm og S. Derby wt, mens S. Derby ΔsipA viste en signifikant reduksjon av hyperreplikasjon, i samsvar med resultatet av områdeanalysen (figur 5C) og SipAs rolle i å indusere hyperreplikasjon.

Figure 1
Figur 1: Salmonella cytosolisk hyperreplikasjon og vakuolær belastning. Representative bilder av (A) Salmonella hyperreplikasjon og (B) vacuolar belastning oppnådd ved høy forstørrelse (40x) er vist. Panel B viser de forskjellige fokusplanene til celler som inneholder hyperreplikerende Salmonellae (z: 7 / 8), sammenlignet med ikke-hyperreplikerende Salmonellae (z: 4 / 8). Hvite skalastenger er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for områdeanalysen. Arbeidsflyten for områdeanalysen er vist for en representativ lav forstørrelse (10x) oppkjøp av INT407-celler infisert i 8 timer med Salmonella som bærer pCHAR-Duo-plasmidet (MOI 100). Først reduseres den tilfeldige støyen, og deretter deles kanalene inn i C1, C2 og C3 og behandles uavhengig. Det settes en terskel for hver kanal for å ekskludere bakgrunnen fra måleområdet. Deretter måles området okkupert av de terskelformede pikslene som bare tilsvarer cellekjerner i C1, alle intracellulære salmonellaer i C2 og cytosoliske salmonellaer i C3 - for hver kanal. Bildene som analyseres her er resultatene av fire fliser oppnådd ved 10x forstørrelse smeltet sammen ved søm. Hvite skalastenger er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Resultater fra områdeanalysen. Resultatene av områdeanalysen er vist. (A) Infeksjonsforholdet beregnes ved å dele området okkupert av mCherry-uttrykkende Salmonellae (C2-kanal), som representerer alle intracellulære bakterier, med området okkupert av vertscellekjerner (C1-kanal). (B) Hyperreplikasjonsforholdet ble målt ved å dele området okkupert av GFP-uttrykkende Salmonellae (C3-kanal), som bare representerer cytosoliske hyperreplikerende bakterier, av området okkupert av alle intracellulære mCherry-uttrykkende Salmonellae. Hver prikk representerer en replikasjon. Analysen ble utført på tre biologiske replikasjoner, hver testet i tre eksemplarer. De svarte linjene angir middelverdiene. Signifikansen ble beregnet med en tosidig t-test, og p-verdier er rapportert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Arbeidsflyt for enkeltcelleanalysen. Arbeidsflyten til enkeltcelleanalysen er vist for en representativ høy forstørrelsesoppkjøp (40x) av INT407-celler infisert i 8 timer med Salmonella som bærer pCHAR-Duo-plasmidet (MOI 100). Først deles kanalene inn i C1, C2 og C3 og behandles uavhengig. Blå kanal (C1), som tilsvarer epitelceller, behandles for å oppnå cellesegmentering, og deretter defineres hver segmentert celle som en interesseregion (ROI) unikt merket med y-x-koordinater. Den røde kanalen (C2) behandles ved å trekke fra den grønne kanalen (C3) for å fjerne cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae som ikke er i fokus, slik at alle vakuolære salmonellaer kun uttrykker mCherry, og deretter ble tilfeldig støy redusert, og terskelen er satt for å ekskludere bakgrunnen fra målinger. Til slutt måles området okkupert av vacuolar Salmonellae for hver avkastning. Den grønne kanalen (C3), som tilsvarer total cytosolisk GFP-uttrykkende Salmonellae, behandles på samme måte. Bildene som analyseres her er resultatene av 16 fliser smeltet sammen ved søm. Hvite skalastenger er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Resultater fra encelleanalysen. Resultatene av enkeltcelleanalysen er vist. (A) Prosentandelen av infiserte celler oppnås ved å dele antall celler med en prosentandel av arealet okkupert av mCherry-bare uttrykker Salmonellae> 0,2 med totalt antall celler. (B) Den gjennomsnittlige vacuolære belastningen ble oppnådd ved å beregne gjennomsnittlig prosentareal okkupert av mCherry-bare uttrykker Salmonellae i de infiserte cellene. (C) Hyperreplikasjonshastigheten ble beregnet ved å dele antall celler med en prosentandel av arealet okkupert av GFP-uttrykkende Salmonellae≥20% med det totale antall infiserte celler. Data fra tre til fire biologiske replikater testet i tre eksemplarer rapporteres. Stolpene angir standard målefeil. Signifikansen ble beregnet med en tosidig t-test, og p-verdier er rapportert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Områdeanalyseskript. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Encellet analyseskript. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Måten Salmonella koloniserer tarmepitelceller, påvirker infeksjonsresultatet. Ved invasjon induserer den cytosoliske hyperreplikasjonen betennelse i tarmen3, mens vacuolar replikasjon kan føre til systemisk spredning4. Salmonellastammer kan variere i deres evne til å invadere og replikere inne i tarmepitelceller9. Faktisk er Salmonella en ekstremt mangfoldig slekt som består av mer enn 2,500 serovarer, som har forskjellige evner til å forårsake sykdom. I tillegg er Salmonella den hyppigst rapporterte årsaken til matbårne utbrudd i EU, noe som indikerer en stor spredning i den menneskelige befolkningen1. Derfor er tilgjengeligheten av pålitelige, høykapasitetsmetoder for kvantifisering av de intracellulære fenotypene av Salmonella av stor betydning for å evaluere forskjeller i virulens blant et stort antall Salmonella-stammer og til slutt tillate en nøyaktig og belastningsspesifikk risikovurdering av dette patogenet.

Protokollen beskrevet her måler oppførselen til Salmonella inne i epitelceller på en rask og automatisert måte. Infeksjonen av epitelceller utføres i 96-brønns avbildningsmikroplater, og et automatisert fluorescensmikroskop brukes til bildeopptak, noe som gjør protokollen egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning. Denne protokollen utnytter pCHAR-Duo-plasmidet, som gjør det mulig å skille vacuolar fra cytosolisk Salmonellae gjennom differensialuttrykket til to fluorescerende reportere5. De intracellulære fenotypene av Salmonella analyseres ofte ved manuell scoring, en tidkrevende prosedyre som er uegnet for analyse av et stort antall stammer og cellekulturer per stamme og utsatt for operatørens feil og variasjon mellom operatører. For å overvinne disse begrensningene ble det utviklet to komplementære og automatiserte bildeanalyser, områdeanalysen og enkeltcelleanalysen. ImageJ, en fritt tilgjengelig programvare, ble brukt til å utvikle de to analysene. For å akselerere protokollutførelsen leveres ImageJ-skript for satsvis analyse av flere anskaffelsesfiler uten operatørintervensjon som tilleggsfiler.

Områdeanalysen ble designet for å kvantifisere, i noen få trinn, den totale koloniseringen av epitelceller (infeksjonsforhold) og hyperreplikasjonsnivået (hyperreplikasjonsforholdet) gjennom måling av områdene som er spesielt okkupert av kjernene i epitelceller og ved Salmonellae som uttrykker enten mCherry eller mCherry sammen med GFP. Områdeanalysen brukes på bilder oppnådd ved lav forstørrelse, hvor både vakuolar og hyperreplikerende Salmonellae er i fokus i samme z-plan, og et stort antall epitelceller vises per mikroskopisk felt, noe som reduserer størrelsen og antall oppkjøpsfiler. Områdeanalysen muliggjør en automatisert, rask og beregningsmessig lett analyse av et stort antall prøver, noe som gjør den egnet for analyser med høy gjennomstrømning som screeningeksperimenter.

Enkeltcelleanalysen ble designet for å kvantifisere Salmonella-fenotyper inne i epitelceller med enkeltcelleoppløsning, oppnådd gjennom cellesegmentering og måling av det cellulære området og prosentandelen av areal okkupert av vakuolar og cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae. Den totale koloniseringen av epitelceller karakterisert gjennom områdeanalysen er her brutt ned i tre kvantitative parametere, prosentandelen infiserte celler, gjennomsnittlig vakuolær belastning og hyperreplikasjonshastigheten, noe som gjør det mulig å evaluere og kvantifisere bidraget fra hver fenotype til den totale koloniseringen, og utfyller derfor resultatene av områdeanalysen. De større detaljene som tilbys av enkeltcelleanalysen kommer på bekostning av langsommere bildeoppkjøp og analyse. Faktisk, for å oppnå enkeltcelleoppløsning, utføres bildeoppkjøp ved høy forstørrelse. Dette innebærer at det er behov for flere z-plan for å observere både vakuolære og cytosoliske Salmonellae i fokus, og at innsamling av et stort antall felt per prøve er nødvendig for å score et høyt antall epitelceller, og dermed forlenge innsamlingstiden sammenlignet med områdeanalyse. Videre er analysen av flere store anskaffelsesfiler beregningskrevende, og krever dermed en passende arbeidsstasjon (en 6-kjerners, 32 GB RAM-arbeidsstasjon ble brukt). Derfor kan enkeltcelleanalyse brukes som frittstående i begrensede gjennomstrømningsforhold eller som en andrenivåmetode koblet til områdeanalysen for å få en dypere forståelse av Salmonella-fenotypene i epitelceller.

De to komplementære analysene ble validert ved bruk av S. Tm, S. Derby wt, og S. Derby ΔsipA, valgt fordi deres oppførsel inne i epitelceller allerede var kjent for å variere når det gjelder invasjon eller replikasjon 9,10. Resultatene fra areal- og encelleanalysene viser at protokollen tillot kvantitativt å skille forskjeller i intracellulære Salmonella-fenotyper i samsvar med egenskapene til de testede stammene. Videre viser disse resultatene at enkeltcelleanalysen tillater kvantifisering av bidraget fra hver intracellulær fenotype (invasjon, vakuolær belastning og cytosolisk replikasjon) til den totale koloniseringsskåren ved hjelp av områdeanalysen.

Denne protokollen ble brukt her for å studere in vitro patogenitet av forskjellige stammer av Salmonella, men det kan ha andre anvendelser som studiet av tilfeldige mutanter for å identifisere gener involvert i invasjonen og / eller replikasjon i epitelceller. I tillegg kan protokollen tilpasses for å analysere oppførselen til Salmonella inne i andre cellelinjer enn INT407-celler. Det kan også brukes som utgangspunkt for å utvikle lignende metoder for å studere cellepatogeninteraksjon av andre intracellulære mikroorganismer.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Olivia Steele-Mortimer for å dele pCHAR-Duo plasmid. Dette arbeidet ble finansiert av det italienske helsedepartementet, tilskudd PRC2019014 og PRC2021004.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well imaging microplate Eppendorf 30741030 Cell culture and infection
Ampicillin Sigma-Aldrich 59349 Bacteria culture
Axio observer inverted microscope ZEISS Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono ZEISS Microscope Camera
Breathable sealing membrane Sigma-Aldrich Z380059 Infection assay
Colibrì 5/7 ZEISS Led light source
Collagen I rat tail Life Technologies A1048301 Collagen coating
DAPI Invitrogen D3571 Cell staining
Fetal bovine serum Gibco 10099-141 Cell culture and infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G12664 Infection assay
Glacial acetic acid Carlo Erba 401391 Collagen coating
HCS CellMask Blue Invitrogen H32720 Cell staining
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium Sigma-Aldrich M5650-500ML Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4% Invitrogen FB002 Cell fixation
Potassium chloride PanReac AppliChem 131494.1211 PBS preparation
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60220 PBS preparation
Sodium Chloride PanReac AppliChem 131659.1214 Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 71640 PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap Euroclone ET7025 Cell culture
Triton X-100 Biorad 1610407 Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Cell culture and infection
Tryptone Oxoid LP0042B Bacteria culture
Yeast extract Biolife 4122202 Bacteria culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
  2. Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
  3. Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
  4. Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
  6. Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  8. Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
  9. Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
  10. Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
  11. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
  12. Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 186 Salmonella intracellulære fenotyper vakuolær replikasjon cytosolisk hyperreplikasjon høy gjennomstrømningsprotokoll automatisert bildeanalyse fluorescensmikroskopi ImageJ-skript
Automatisert analyse av intracellulære fenotyper av <em>Salmonella</em> ved bruk av ImageJ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi,… More

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi, M. Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ. J. Vis. Exp. (186), e64263, doi:10.3791/64263 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter