Summary
Salmonella dringt binnen en repliceert zich in intestinale epitheelcellen, zowel in Salmonella-specifieke vacuolen als vrij in het cytosol (hyperreplicatie). Een high-throughput fluorescentiemicroscopie-gebaseerd protocol wordt hier beschreven om de intracellulaire fenotypen van Salmonella te kwantificeren door middel van twee complementaire beeldanalyses via ImageJ, waarbij een eencellige resolutie en scoring wordt bereikt.
Abstract
Salmonella is een enterische ziekteverwekker die in staat is om het darmepitheel binnen te dringen en zich te vermenigvuldigen in enterocyten, zowel in Salmonella-specifieke vacuolen als vrij in het cytosol (cytosolische hyperreplicatie). Deze verschillende fenotypen van intracellulaire replicatie drijven naar verschillende routes van pathogenese, d.w.z. cytosolische hyperreplicatie induceert inflammatoire celdood en extrusie in het darmlumen, terwijl vacuolaire replicatie leidt tot transepitheelpenetratie en systemische verspreiding. Er werd aanzienlijke inspanning geleverd om microscopie-instrumenten te creëren om het gedrag van Salmonella in binnengedrongen cellen te bestuderen, zoals het pCHAR-Duo fluorescentierapporteurplasmide dat discriminatie tussen vacuolaire en cytosolische bacteriën mogelijk maakt door differentiële expressie van mCherry en GFP. Intracellulaire fenotypen worden echter vaak handmatig gescoord, een tijdrovende procedure die de analyse beperkt tot een klein aantal monsters en cellen. Om deze beperkingen te overwinnen, werden twee complementaire en geautomatiseerde beeldanalyses ontwikkeld met behulp van ImageJ, een vrij beschikbare beeldanalysesoftware. In het high-throughput protocol werden epitheelcellen geïnfecteerd met Salmonella die pCHAR-Duo droeg met behulp van 96-well platen. Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop. Vervolgens werden twee beeldanalysemethoden toegepast om het intracellulaire gedrag van Salmonella op verschillende detailniveaus te meten. De eerste methode meet de totale intracellulaire bacteriële belasting en de mate van cytosolische hyperreplicatie. Het is snel en maakt het mogelijk om een groot aantal cellen en monsters te scoren, waardoor het geschikt is voor high-throughput assays zoals screeningsexperimenten. De tweede methode voert eencellige analyse uit om het percentage geïnfecteerde cellen, de gemiddelde vacuolaire belasting van Salmonella en de cytosolische hyperreplicatiesnelheid te bepalen die meer details geeft over Salmonella-gedrag in epitheelcellen. De protocollen kunnen worden uitgevoerd door speciaal ontworpen ImageJ-scripts om automatisch batchanalyses uit te voeren van de belangrijkste stappen van Salmonella-enterocyte-interactie.
Introduction
Salmonella is het meest gemelde bacteriële agens dat uitbraken van door voedsel overgedragen ziekten in de Europese Unie veroorzaakt1. De primaire pathologische manifestatie van Salmonella-infectie is enteritis, die het resultaat is van het pathogene gedrag in de darm na inname en de daaruit voortvloeiende lokale ontstekingsreactie2. Salmonella kan zich echter ook verspreiden naar extra-intestinale plaatsen en systemische infecties veroorzaken, vooral bij immuungecompromitteerde personen. Het type interactie tussen Salmonella en het darmepitheel bepaalt de uitkomst van de infectie. Eenmaal in het darmlumen dringt Salmonella binnen en repliceert het zich in intestinale epitheelcellen. Op intracellulair niveau kan Salmonella twee verschillende replicatiefenotypen presenteren, de cytosolische hyperreplicatie en de intravacuolaire langzame replicatie binnen Salmonella-bevattende vacuolen (SCV's). De cytosolische hyperreplicatie induceert inflammatoire gastheerceldood en Salmonella-extrusie in het darmlumen3; de vacuolaire replicatie leidt tot een transepitheelpenetratie en systemische verspreiding4. Daarom beïnvloedt de mate van invasie en vacuolaire versus cytosolische replicatie het verloop van de infectie.
Het geslacht Salmonella is zeer divers, waaronder duizenden serotypen met verschillende gastheerbereiken en mogelijkheden om ziekten te veroorzaken. Bijvoorbeeld S. Typhimurium wordt gedefinieerd als een generalistische serovar, omdat het meerdere niet-verwante gastheren infecteert en een van de belangrijkste oorzaken van menselijke salmonellose vertegenwoordigt. Anders, S. Derby wordt beschouwd als een aan varkens aangepaste serovar, omdat het meestal geïsoleerd is van het varken, maar het wordt ook gemeld in de top vijf van de serovars die verantwoordelijk zijn voor menselijke infectie1. Kennis over het bacteriële gedrag in de epitheelcellen is echter in wezen beperkt tot de studie van een paar referentiestammen, zoals S. Typhimurium SL1344, die niet de enorme natuurlijke diversiteit van Salmonella pathogeniciteit vertegenwoordigen. Het karakteriseren van de interactie van verschillende stammen van Salmonella met epitheelcellen zou bijdragen aan het begrijpen van hun verschillende pathogeniciteit. Om deze reden werd een high-throughput fluorescentiemicroscopie-gebaseerd protocol ontwikkeld om het intracellulaire gedrag van een groot aantal stammen op een snelle en grotendeels geautomatiseerde manier te analyseren. In dit protocol werd infectie van epitheelcellen uitgevoerd in 96-well beeldvormingsplaten en werd beeldacquisitie gedaan met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop. Het pCHAR-Duo plasmide werd gebruikt om de invasie- en replicatiefenotypen van Salmonella in epitheelcellen te observeren door middel van fluorescerende microscopie5. Dit plasmide draagt het gen dat codeert voor de rode fluorescerende reporter mCherry, constitutief tot expressie gebracht door alle getransformeerde bacteriële cellen, en het gen dat codeert voor de groene fluorescerende reporter GFP, waarvan de expressie wordt geactiveerd door glucose-6-fosfaat dat uitsluitend aanwezig is in het cytosol van eukaryote cellen en afwezig is in SCV's. Daarom maakt het plasmide onderscheid tussen vacuolaire en cytosolische bacteriën mogelijk door differentiële expressie van mCherry- en GFP-verslaggevers.
De vacuolaire en cytosolische bacteriën op microscopiebeelden worden vaak gekwantificeerd door handmatige scoring6, maar dit is een tijdrovende methode die de analyse beperkt tot een klein aantal monsters. Daarom werden twee complementaire en geautomatiseerde beeldanalyses ontwikkeld - gebiedsanalyse en eencellige analyse - met behulp van ImageJ7, een vrij beschikbare beeldanalysesoftware. De gebiedsanalyse meet de totale intracellulaire bacteriële belasting en de mate van cytosolische hyperreplicatie door gebruik te maken van gegevens van gebieden bezet door epitheelcellen, rode en groene Salmonellae in elk verkregen microscopiebeeld. Deze methode kan worden toegepast op afbeeldingen die zijn verkregen bij een lage vergroting; daarom maakt het het mogelijk om een groot aantal epitheelcellen te scoren met weinig afbeeldingen, waardoor de acquisitietijd wordt verkort. De eencellige analyse maakt gebruik van celsegmentatie om het percentage geïnfecteerde cellen, de gemiddelde vacuolaire belasting en het percentage geïnfecteerde cellen te bepalen dat cytosolische hyperreplicatie met eencellige resolutie ondergaat.
In dit protocol worden alle stappen van de beeldanalyse in detail beschreven om handmatig te worden uitgevoerd, maar dezelfde analyse kan worden geautomatiseerd door onze speciaal ontworpen ImageJ-scripts. Deze scripts maken het ook mogelijk om batchanalyses uit te voeren om automatisch meerdere afbeeldingen te analyseren en zo de uitvoering van de methode te versnellen.
Protocol
1. Infectie van epitheelcellen met Salmonella met pCHAR-Duo reporter plasmide
OPMERKING: Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen.
- Bekleed 96-well beeldvormingsplaten met zwarte wanden en vlakke glazen bodem met collageen vlak voor gebruik.
- Verdun glaciaal azijnzuur (17, 4 M) in steriel gedemineraliseerd water onder een chemische kap om een azijnzuuroplossing van 20 mM te verkrijgen. Filter onder steriele omstandigheden de oplossing door een spuitfilter met een poriegrootte van 0,2 μm. Laat de oplossing gedurende 5 minuten in een rek van 0-4 °C staan.
- Verdun 3 mg/ml collageenbouillon tot 50 μg/ml in voorgekoelde azijnzuuroplossing van 20 mM. Meng door 10 keer om te keren en doseer vervolgens 30 μL collageenoplossing per putje (5 μg collageen / cm2), waarbij de oplossing in een rek van 0-4 ° C wordt bewaard om collageengegoten te voorkomen.
- Zorg ervoor dat de bodems van de put volledig bedekt zijn met collageen en laat de plaat vervolgens 1 uur onder laminaire stroom bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de oplossing voorzichtig en voer drie wasbeurten uit met 30 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik een meerkanaals pipet van 100 μL of 50 μL om collageenloslating te voorkomen.
- Kweek INT407 epitheelcellen in collageen-gecoate beeldvormingsplaten 20-24 uur voorafgaand aan infectie.
- Kweek routinematig INT407-cellen in 25 cm2 kolven in Minimum Essential Medium met 10% foetaal runderserum (FBS), hierna gedefinieerd kweekmedium (CM), aangevuld met penicilline 100 U / ml en streptomycine 100 μg / ml (pen / strep).
- Was tweemaal int407-kolven met 5 ml PBS en maak de cellen vervolgens los met 1 ml trypsine-EDTA-oplossing gedurende 3-5 minuten bij 37 °C in bevochtigde 5% CO2-atmosfeer 20-24 uur voorafgaand aan de infectie. Tel de cellen en bereid een suspensie van 3 x 105 cellen/ml in de CM.
- Doseer 100 μL celsuspensie/put in collageengecoate beeldvormingsplaten om 100% confluentie te verkrijgen. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-atmosfeer gedurende 1 uur om de celhechting te vergemakkelijken. Voeg vervolgens 100 μL CM toe en incubeer bij 37 °C in bevochtigde 5% CO2-atmosfeer gedurende 20-24 uur tot de infectie (stap 1.4).
OPMERKING: Om intracellulaire bacteriën in beeld te brengen, worden Salmonella-stammen getransformeerd met het pCHAR-Duo reporter plasmide dat vriendelijk werd verstrekt door Dr. Olivia Steele-Mortimer. De geteste stammen hier werden geselecteerd om de fenotypediversiteit weer te geven die onder het protocol valt en de beeldanalyses in sectie 4 te valideren. Zie de representatieve resultaten voor meer informatie over de stammen die in dit onderzoek worden gebruikt.
- Bereid stationaire faseculturen van Salmonella-stammen voor die het pCHAR-Duo reporterplasmide dragen.
- Bemonster de Salmonella glycerol bouillon met de punt van een 10 μL pipet en ent deze in tot 1 ml Luria Bertani bouillon (10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g natriumchloride per liter) aangevuld met ampicilline 100 μg/ml.
- Incubeer het entmateriaal statisch bij 37 °C gedurende 20 uur voorafgaand aan de infectie om de stationaire groeifase te bereiken, overeenkomend met ~1 x 109 Colony Forming Units (CFU)/ml8.
- Infecteer INT407 epitheelcellen met Salmonella.
OPMERKING: Infecties worden uitgevoerd in drievoud.- Was int407 cellen voorzichtig met 200 μl PBS/put.
- Bereid Salmonella inoculum voor door bacteriën 's nachts in CM te verdunnen om het gewenste aantal CFU's per epitheelcel te verkrijgen, gedefinieerd als de veelheid van infectie (MOI). Hier werd MOI 100 gebruikt.
- Ent 200 μL/put in en bedek de plaat vervolgens met een ademend afdichtingsmembraan en incubeer bij 37 °C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer gedurende 1 uur. Inenting wordt beschouwd als tijd nul van de infectie.
- Verwijder het entmateriaal en was voorzichtig met 200 μL PBS/put en voeg vervolgens 200 μL CM toe met gentamicine 100 μg/ml per putje. Bedek de plaat met een ademend afdichtingsmembraan en incubeer vervolgens bij 37 °C in bevochtigde 5% CO2-atmosfeer gedurende 1 uur.
- Verwijder de CM met gentamicine 100 μg/ml en was voorzichtig met 200 μL PBS/put. Voeg 200 μL CM toe met gentamicine 10 μg/ml per putje, bedek de plaat met een ademend afdichtingsmembraan en incubeer vervolgens bij 37 °C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer gedurende 8 uur.
2. Monsterfixatie en epitheelcelkleuring
OPMERKING: Houd de monsters beschermd tegen directe blootstelling aan licht. Volumes worden aangegeven voor putten van een 96-well plaat. Volumeoptimalisatie is vereist voor verschillende celkweekplaten of -steunen.
- Verwijder CM 8 uur na de infectie en was driemaal voorzichtig met 200 μL/put pbs. Verwijder PBS door de plaat om te keren op absorberend papier; vermijd aspiratie.
- Bevestig de geïnfecteerde monolagen met 100 μL/putje paraformaldehyde (PFA) 4% in PBS gedurende 20 minuten bij RT. Verwijder PFA 4% en was drie keer met 200 μL/putje PBS. De plaat kan maximaal 16-24 uur bij 4 °C worden bewaard. Ga verder met de volgende stap.
- Vlek epitheelcellen.
OPMERKING: DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) DNA-kleuring (stap 2.3.1) wordt alleen gebruikt voor de gebiedsanalyse om kernen te kleuren, en High Content Screening (HCS) -vlek (stap 2.3.2) wordt gebruikt voor de eencellige analyse om de hele epitheelcel te kleuren. Andere cellulaire vlekken kunnen worden gebruikt, maar optimalisatie van beeldacquisitie en -analyse is vereist.- Gebiedsanalyse: doseer 100 μL/put DAPI (300 nM-oplossing in PBS) en incubateer 5 minuten bij RT beschermd tegen licht.
- Eencellige analyse: permeabiliseren met 100 μL/put triton 0,1x in PBS gedurende 15 minuten bij RT. Driemaal wassen met PBS en 100 μL/put hcs-vlek verdund 1:2000 in PBS afgeven. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT beschermd tegen licht.
- Verwijder de kleuringsoplossing en was drie keer met 200 μL/putje PBS. Voeg 50 μL/put PBS toe voor geautomatiseerde beeldacquisitie.
3. Beeldacquisitie met een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop
OPMERKING: Hier worden lage vergroting (10x/0,3 NA, 1 μm/pixel objectief) in stap 3.1.1 voor de gebiedsanalyse en hoge vergroting (40x/0,75 NA, 0,255 μm/pixel objectief) in stap 3.1.2 voor de eencellige analyse gebruikt in het acquisitieprotocol. Andere vergrotingen kunnen worden gebruikt, maar optimalisatie van beeldacquisitie en -analyse is vereist. Indien toegestaan door de beschikbare microscoop, verkrijg afbeeldingen als Tile Regions (TR's), een "mozaïek" van aaneengesloten velden die tegels worden genoemd, om grote monstergebieden vast te leggen. Stel de autofocus in het midden van een TR in plaats van één in te stellen voor elke tegel, om de belichting van het monster tijdens de autofocusprocedure te verminderen.
- Gebruik software autofocus in het celkleuringskanaal (blauw kanaal voor HCS-vlek en DAPI-kernvlek) als referentie z-positie. Verkrijg beelden in celkleuringskanaal (465 nm, cellen of kernen) en in pCHAR-Duo-reporterkanalen mCherry (610 nm, intracellulaire Salmonellae) en GFP (509 nm, cytosolische hyperreplicerende Salmonellae).
- Gebiedsanalyse: Beeld ≥104 cellen/technische replicatie (d.w.z. ten minste drie TR's van vier tegels/put die overeenkomen met een technische replicatie worden aanbevolen) bij 10x vergroting.
OPMERKING: Een enkel z-vlak is voldoende om zowel cellen met vacuolaire als cellen met cytosolische hyperreplicerende Salmonellae bij 10x vergroting in beeld te brengen. - Analyse met één cel: afbeelding ≥1.000 cellen/technische replicatie (d.w.z. ten minste twee TR's van 16 tegels/put die overeenkomen met een technische replicatie worden aanbevolen) bij 40x vergroting. Meerdere z-vlakken zijn nodig om zowel cellen met vacuolaire als cellen met cytosolische hyperreplicerende Salmonellae in beeld te brengen. Definieer de optimale z-stack (3,85 μm z-stack met 0,55 μm interval om acht z-vlakken te verkrijgen wordt aangegeven om INT407-cellen in beeld te brengen die zijn geïnfecteerd met cytosolische hyperreplicerende Salmonellae bij 40x). Elk z-vlak wordt hierna aangeduid als n/8, met n tussen 1 (overeenkomend met het onderste z-vlak) en 8 (overeenkomend met het bovenste z-vlak).
- Gebiedsanalyse: Beeld ≥104 cellen/technische replicatie (d.w.z. ten minste drie TR's van vier tegels/put die overeenkomen met een technische replicatie worden aanbevolen) bij 10x vergroting.
- De uitvoer van elke acquisitie is een bestand met de naam Acquisition.czi dat afbeeldingen bevat van alle velden, kanalen en z-vlakken. Als TR's zijn verkregen, smelt u de tegels samen om een algemeen beeld van elke TR te krijgen door één Acquisition.czi-bestand te gebruiken als invoer voor de Stitching-methode.
4. Beeldanalyse met ImageJ
OPMERKING: Stap 4.1 en stap 4.2 zijn specifiek ontworpen voor het hierboven beschreven experiment en acquisitie. Andere experimentele instellingen kunnen optimalisatie van de analyse vereisen. De analyse van een enkel Acquisition.czi-bestand wordt beschreven. Zoek voor de batchanalyse het analysescript met één cel en het gebiedsanalysescript als aanvullende bestanden (aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2). Labels die worden gebruikt in de scripts en ImageJ-opdrachten zijn vetgedrukt in de onderstaande secties.
- Gebiedsanalyse
- Open het bestand Acquisition.czi in ImageJ, met de naam AcquisitionTitle in het script: File > Open > AcquisitionTitle.czi. Er wordt een venster geopend met alle kanalen. De kanalen worden aangeduid als c:1-3/3 afhankelijk van de overnameorder. Hier komt c:1/3 overeen met blauw (DAPI), c:2/3 met mCherry (intracellulaire Salmonellae) en c:3/3 met GFP (cytosolische hyperreplicerende Salmonellae).
- Verminder willekeurige ruis om beelden voor te bereiden op gebiedsmeting in stap 4.1.6 en 4.1.7.
- Dupliceer het venster Acquisitietitel met Afbeelding > dubbele > OK om het venster Acquisitietitle1 te verkrijgen.
- Pas Gaussiaanse vervaging toe op Acquisitietitle1 via Process > Filter > Gaussiaanse vervaging. Laat de standaard Sigma-waarde op 2 staan en klik op OK. Er wordt een Process Stack? -venster geopend, klik op Ja om alle kanalen te verwerken.
- Trek de met Gaussen gefilterde Acquisitietitle1 af van het oorspronkelijke bestand AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: selecteer AcquisitionTitle als Image1, kies de bewerking Aftrekken in de vervolgkeuzelijst en selecteer vervolgens AcquisitionTitle1 als Image2. Klik op OK. Er wordt een venster Processtack? geopend. Klik op Ja om alle drie de afbeeldingen (kanalen) te verwerken om het venster ResultsOfAcquisitionTitle te verkrijgen.
- Splits kanalen via beeld > kleur > gesplitste kanalen. Elke kanaalafbeelding wordt nu weergegeven in een apart venster, automatisch door ImageJ benoemd als C-ResultsOfAcquisitionTitle. Hier komt C1-ResultsOfAcquisitionTitle overeen met DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle to mCherry (intracellulair Salmonellae) en C3-ResultsOfAcquisitionTitle to GFP (cytosolic hyper-replicating Salmonellae).
- Verwerk de C1-ResultsOfAcquisitionTitle-afbeelding om het gebied te meten dat wordt ingenomen door epitheelcelkernen.
- Navigeer naar Proces > Glad om de nucleolus te homogeniseren die verschijnt als gaten in het kerngebied.
- Drempel de C1-ResultsOfAcquisitionTitle afbeelding om de achtergrond uit te sluiten met behulp van Afbeelding > Aanpassen > drempel: vink Donkere achtergrond aan en selecteer Rood in de vervolgkeuzelijst. Stel de driehoeksdrempel in en gebruik vervolgens de bovenste schuifregelaar om de minimumdrempelwaarde in te stellen wanneer de kernen rood lijken en de achtergrond zwart wordt weergegeven (Drempel = 100, toegepast in dit protocol).
OPMERKING: De in de stappen 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 en 4.2.4.3 beschreven automatische drempels worden voorgesteld als leidraad voor de gebruiker om de best passende drempel voor respectievelijk kernen/epitheelcellen en bacteriën handmatig te definiëren. De waarde van de automatische drempel wordt in het script overschreven door de gedefinieerde handmatige drempel. De gedefinieerde handmatige drempel wordt toegepast op de gehele batchanalyse.
- Kies de interessante metingen met behulp van Analyseren > Meting instellen: Limiet tot drempelwaarde controleren om de meting te beperken tot drempelpixels. Controleer gebied, overeenkomend met het totale gebied bezet door gedrempelde pixels (d.w.z. kernen in C1-ResultsOfAcquisitionTitle, intracellulaire Salmonellae in C2-ResultsOfAcquisitionTitle, cytosolic hyper-replicerende Salmonellae in C3- ResultsOfAcquisitionTitle). Schakel Label weergeven in om de overnametitel en het kanaal voor elke afbeelding in de resultatentabel vast te leggen.
- Meet het gebied dat door de kernen wordt ingenomen met behulp van Analyze > Measure. Metingen worden geregistreerd in de resultatentabel die automatisch wordt geopend.
- Proces C2-ResultsOfAcquisitionTitle en C3-ResultsOfAcquisitionTitle om het gebied te meten dat wordt ingenomen door respectievelijk de totale intracellulaire Salmonellae en cytosolic hyperreplicerende Salmonellae. Volg stap 4.1.4-4.1.6 met enkele wijzigingen: sla de afvlakstap in stap 4.1.4.1 over en gebruik de automatische Otsu-drempel in plaats van de driehoek in stap 4.1.4.2 als leidraad om de minimale drempelwaarde in te stellen (bovenste schuifregelaar) wanneer Salmonellae rood lijkt en de achtergrond zwart wordt weergegeven (drempel = 200 voorgesteld).
- Sla de tabel Resultaat op met Bestand > Opslaan als > Alle bestanden.
- Open de tabel Resultaat in een spreadsheet om gebiedsverhoudingen te berekenen voor elk geanalyseerd AcquisitionTitle-bestand :
- Bereken de infectieratio: deel het gebied dat wordt ingenomen door totale intracellulaire Salmonellae (hier rood kanaal, C2-) door het gebied dat wordt ingenomen door epitheelcelkernen (hier DAPI, C1-).
- Bereken de hyperreplicatieratio: deel het gebied dat wordt ingenomen door cytosolische hyperreplicerende Salmonellae (groen kanaal, C3-) door het gebied dat wordt ingenomen door totale intracellulaire Salmonellae (rood kanaal, C2-).
- Eencellige analyse
- Open het bestand Acquisition.czi in ImageJ, genoemd als AcquisitionTitle in het script: File Menu > Open > Acquisition.czi. Er wordt een venster geopend met de beelden van alle kanalen en alle z-planes.
- Splits de kanalen op afbeelding > kleur > gesplitste kanalen. De kanalen worden nu weergegeven in gescheiden vensters, automatisch door ImageJ aangeduid als C-AcquisitionTitle. Hier komt het C1-AcquisitionTitle-venster overeen met epitheelcellen (blauw), het C2-AcquisitionTitle-venster met intracellulaire Salmonellae (mCherry) en het C3-AcquisitionTitle-venster met cytosolic hyperreplicerende Salmonellae-kanaal (GFP). Elk C-AcquisitionTitle-venster bevat alle verworven z-planes.
- Verwerk de C1-AcquisitieTitle venster, overeenkomend met epitheelcellen, om cellen te segmenteren.
- Kies de z-plane-afbeelding die u wilt gebruiken voor celsegmentatie. Selecteer het venster C1-AcquisitionTitle en gebruik Image > Duplicate: schrijf het nummer van het gekozen z-plane (d.w.z. 1 om z 1/8 te selecteren), schrijf C1Zplane in het vak Titel, schakel Duplicate Stack uit en klik vervolgens op OK om alleen de geselecteerde z-plane-afbeelding te dupliceren. Er wordt een venster met de naam C1Zplane met de geselecteerde z-plane-afbeelding geopend.
- Verwerk de verkregen C1Zplane-afbeelding om het beeldcontrast te verbeteren. Open Proces > Contrast verbeteren: pas de verzadigde pixels aan (d.w.z. hier wordt 1% gebruikt) en vink Normaliseren aan. Klik vervolgens op OK om de contrastverbeteringstechniek toe te passen om een contrastgenormaliseerde C1Zplane-afbeelding te verkrijgen.
- Verwerk de contrastgenormaliseerde C1Zplane-afbeelding om de epitheelcellen te segmenteren. Gebruik Proces > Zoek Maxima om het FindMaxima-menu te openen: markeer eerst de voorbeeldpuntselectie om ruistolerantie in te stellen om slechts één maximumpunt toe te kennen aan elke epitheelcel. Markeer Exclude Edge Maxima. Selecteer het uitvoertype Gesegmenteerde deeltjes en klik op OK om C1ZplaneSegmented te verkrijgen, een nieuwe binaire maskerachtige afbeelding met elk gesegmenteerd deeltje per gemarkeerd maximumpunt.
OPMERKING: Het Locate Maxima ImageJ-algoritme wordt gebruikt om cellen te segmenteren. Maximapunten (pixelintensiteitspieken) worden gedetecteerd in de afbeelding, mogelijk overeenkomend met cellen. Een ruisdrempel (ruistolerantie) wordt ingesteld en het aaneengesloten gebied rond maximapunten wordt geanalyseerd om een binair maskerachtig beeld te creëren dat elk gesegmenteerd deeltje per maximumpunt definieert, vandaar elke cel. - Verwerk de C1ZplaneSegmented-afbeelding om een masker van gesegmenteerde cellen te maken. Gebruik Analyseren > Deeltjes analyseren: selecteer de optie Maskers weergeven en Uitsluiten op randen. Pas het gebiedsbereik van gesegmenteerde deeltjes aan om op te nemen in het masker, overeenkomend met de parameter Grootte , om verkeerd gesegmenteerde objecten zoals celclusters en celfracties uit te sluiten. Als u het gebied van onjuist gesegmenteerde objecten wilt scoren, gebruikt u het gereedschap Staven voor overtrekken op de werkbalk: selecteer deeltje met de Staaf en opent u vervolgens > meten om het gebied van foutieve objecten te meten. Stel het grootte-interval in (voorgesteld bereik 250-1700 pixel2) en klik op OK om het binaire masker MaskofC1ZplaneSegmented te verkrijgen.
- Standaard heeft het binaire masker MaskOfC1ZplaneSegmented een inverterende LUT. Gebruik LUT > LUT omkeren op de werkbalk.
- Verwerk het MaskOfC1ZplaneSegmented binaire masker om celsegmentatie te corrigeren:
- Drempelcontrast-genormaliseerd C1Zplane-beeld verkregen in stap 4.2.3.2. Gebruik Afbeelding > > drempel aanpassen: vink Donkere achtergrond aan. Stel de instelling Standaard automatische drempel in. Kies de optie Rood en pas de minimale afkapwaarde (bovenste balk) aan totdat cellen volledig rood lijken, waardoor een donkere achtergrond overblijft (Threshold = 8.000 toegepast in dit protocol). Klik vervolgens op Toepassen om de contrastgenormaliseerde C1Zplane-afbeelding om te zetten in een binaire afbeelding met cellen in wit en de achtergrond in zwart.
- Correcte celsegmentatie in MaskOfC1ZplaneSegmented binair masker. Proces > image calculator gebruiken: selecteer MaskOfC1ZplaneSegmented als Image1, kies de bewerking AND in de vervolgkeuzelijst en selecteer vervolgens het genormaliseerde C1Zplane met drempelwaarde als Image2. Klik op OK. De uitvoerafbeelding wordt automatisch door ImageJ benoemd als Resultaten van masker van C1Zplane Gesegmenteerd.
- Procesresultaten van masker van C1Zplane gesegmenteerd om elke afzonderlijke cel te labelen als een regio van belang (ROI). Gebruik Analyseren > Deeltjes analyseren. Pas de grootte aan zoals in stap 4.2.3.4 en selecteer vervolgens de optie Niets weergeven. Schakel Toevoegen aan Manager in om alle deeltjes (gesegmenteerde cellen) toe te voegen aan het hulpprogramma ROI Manager. Vink ook Uitsluiten op randen aan. Klik op OK. Het ROI Manager-menu toont een lijst met alle deeltjes (gesegmenteerde cellen), gedefinieerd als ROI's, uniek gelabeld met hun respectievelijke y- en x-coördinaten.
- Sla ROIs-gegevens op als ROI-cells-AcquisitionTitle.zip via het ROI Manager-menu door op Meer > Opslaan te klikken. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip wordt geopend in stap 4.2.4.6 voor de single cell analyse.
- Verwerk de C2-AcquisitieTitle venster (hier rood kanaal), overeenkomend met intracellulair Salmonellae, om het aantal geïnfecteerde cellen en de intracellulaire vacuolaire belasting te meten.
- Trek het groene kanaal (C3-) af van het rode kanaal (C2-) om onscherpe pixels van de cytosolische hyperreplicerende Salmonellae te verwijderen.
- Gebruik Process > Image Calculator. Selecteer C2-Acquisitietitel als Afbeelding1, kies de bewerking Aftrekken in de vervolgkeuzelijst en selecteer vervolgens C3-Acquisitietitel als Afbeelding2. Vink Nieuw venster maken aan en klik op OK.
- Aftrekken toepassen op de hele z-stack door op Ja te klikken in de Process Stack? venster. Het uitvoervenster krijgt in het script de naam ResultsOfC2AcquisitionTitle .
- Process ResultsOfC2AcquisitionTitle om willekeurige ruis te verminderen.
- Dupliceer het venster ResultsOfC2AcquisitionTitle door op Image Menu > Duplicate te klikken. Schakel Duplicate Stack in en druk op OK om het venster ResultsOfC2AcquisitionTitle1 te verkrijgen.
- Pas Gaussiaanse vervaging toe op het venster ResultsOfC2AcquisitionTitle1 via Process > Filter > Gaussiaanse vervaging. Laat de Sigma-waarde als 2 staan of pas deze aan (d.w.z. hier werd Sigma: 4 gebruikt). Klik op OK en pas Gaussian Blur toe op de hele z-stack door op Ja te klikken in het venster Process Stack? .
- Trek de Gaussisch gefilterde ResultatenOfC2AcquisitionTitle1 af van ResultsOfC2AcquisitionTitle door te klikken op Process > Image Calculator. Selecteer ResultsOfC2AcquisitionTitle as Image1, kies de Bewerking Aftrekken in de vervolgkeuzelijst en selecteer vervolgens ResultsOfC2AcquisitionTitle1 als Image2. Klik op OK. Pas aftrekking toe op de hele z-stack door op Ja te klikken in het venster Processtack? om een venster te verkrijgen dat automatisch door ImageJ wordt genoemd als Resultaten van resultaten van C2-AcquisitieTitle.
- Verwerk de resultaten van de resultaten van C2-AcquisitieTitle om Salmonellae van de achtergrond te scheiden. Afbeelding gebruiken > > drempel aanpassen: vink Donkere achtergrond aan en stel de automatische Otsu-drempel in. Pas de minimale afkapwaarde (bovenste balk) aan totdat Salmonellae volledig rood lijkt, waardoor een donkere achtergrond overblijft (Threshold = 100 toegepast in dit protocol). Klik op Toepassen en het venster Converteren naar binair wordt geopend: vink Zwarte achtergrond aan en klik vervolgens op OK. De volledige z-stack wordt nu omgezet in binaire afbeeldingen.
- Selecteer het middelste Z-vlak, overeenkomend met het vacuolaire Salmonellae-focusvlak , in de resultaten van het binaire venster Resultaten van C2-Acquisitietitle uit stap 4.2.4.3: Afbeelding > Stacks > Set Slice en schrijf het nummer van het z-vlak van keuze (hier wordt bijvoorbeeld z: 4/8 gebruikt). Klik op OK.
- Stel de metingen in om te registreren voor elke ROI (cel). Gebruik Analyseren > Meting instellen: controleer Gebied, overeenkomend met het totale gebied van elke ROI. Controleer Gebiedsfractie en Limiet tot drempel om alleen de oppervlaktefractie vast te leggen die wordt bezet door gedrempelde pixels (intracellulaire Salmonellae) voor elke ROI. Vink Display Label aan om elke ROI te labelen met de afbeeldingstitel, het kanaal, het z-vlak en de x-y-coördinaten in de resultatentabel.
- Verwerk het gekozen z-vlak van intracellulaire Salmonellae om labels, gebied en % gebied bezet door Salmonellae voor elke afzonderlijke cel (ROI) vast te leggen: open het ROI-cellen-acquisitietitle.zip bestand, opgeslagen in stap 4.2.3.8, op Bestand > Openen en klik op Meten in het ROI Manager-menu. De uitvoer is een tabel die de geselecteerde metingen weergeeft.
- Sla de resultatentabel op met Bestand > Opslaan als in het resultatenvenster.
- Resultaat openenTabel in een spreadsheet: labelGebied en %Gebied bezet door intracellulaire Salmonellae worden aangegeven voor elke ROI, overeenkomend met een voorgevormde cel die uniek is geïdentificeerd met x- en y-coördinaten.
- Meet het aantal geïnfecteerde cellen dat overeenkomt met URI's met een %Gebied > 0 bezet door gedrempelde pixels, overeenkomend met Salmonellae (d.w.z. hier wordt een %Gebied > 0,2% beschouwd om geïnfecteerde cellen te identificeren). Bereken vervolgens het percentage geïnfecteerde cellen op de totale cellen.
- Meet de vacuolaire belasting van Salmonella/cel door het gemiddelde %Gebied bezet door vacuolaire Salmonellae voor alle geïnfecteerde cellen te berekenen.
- Trek het groene kanaal (C3-) af van het rode kanaal (C2-) om onscherpe pixels van de cytosolische hyperreplicerende Salmonellae te verwijderen.
- Verwerk groen kanaal (C3-AcquisitionTitle) om het aantal cellen te meten dat cytosolische hyperreplicerende Salmonellae vertoont. Volg de stappen 4.2.4.2 tot en met 4.2.4.9, maar met enkele wijzigingen.
- Werk aan de bovenste z-vlakken (hier z:7/8), omdat cellen met cytosolische hyperreplicerende Salmonellae uit de monolaag steken; daarom zijn ze in focus op een ander niveau in vergelijking met cellen zonder hyperreplicerende Salmonellae.
- Meet het aantal cellen dat cytosolische hyperreplicerende Salmonellae (groen) bevat door cellen (URI's) te scoren met een hoog %gebied bezet door Salmonellae (bijv. een %Gebied > 20% wordt geacht cellen te identificeren die cytosolische hyperreplicerende Salmonellae bevatten). Bereken vervolgens het percentage cellen dat cytosolische hyperreplicerende Salmonellae bevat op het totaal van geïnfecteerde cellen gescoord in stap 4.2.4.9.
Representative Results
Infectie van epitheelcellen met Salmonella-stammen
Dit protocol is ontwikkeld om de cellulaire invasie en de cytosolische replicatie (figuur 1A) versus vacuolaire belasting (figuur 1B) van Salmonella in epitheelcellen te analyseren. Het protocol werd gevalideerd met behulp van de drie volgende Salmonella-stammen, S. Typhimurium SL1344 referentiestam (S. Tm), S. Derby ER1175 wildtype (S. Derby wt) en de isogene mutant van S. Derby ER1175 zonder sipA-gen (S. Derby ΔsipA). S. Derby ER1175 stam werd geïsoleerd uit varkens en behoort tot de IZSLER surveillance collectie van Salmonella isolaten. De stammen werden geselecteerd om de fenotypediversiteit weer te geven die onder het protocol valt. In het bijzonder werden deze stammen gekozen omdat hun gedrag in epitheelcellen al bekend was om te verschillen in termen van invasie of replicatie9; daarom waren het waardevolle controles om te testen of het protocol het toestond om kwantitatief onderscheid te maken tussen verschillen in intracellulaire Salmonella-fenotypen. In het bijzonder, S. Tm en S. Derby wt werden opgenomen omdat we eerder hadden aangetoond dat S. Tm heeft een hogere invasie- en intracellulaire replicatie-efficiëntie dan S. Derby wt9 terwijl S. Derby ΔsipA werd toegevoegd als een hyperreplicatie-aangetaste stam omdat de virulentie-effector SipA een cruciale rol speelt bij het begin van hyperreplicatie10,11. Het werd eerder gemeld voor S. Tm dat cytosolische replicatie 4 uur na de invasie begint, en dan hyperrepliceert de cytosolische populatie snel om de epitheelcel te vullen met 8 h 11,12. Consequent was een 8 uur lange infectie geschikt om het cytosolische hyperreplicatiefenotype ook bij S te observeren en te kwantificeren. Derby wt en S. Derby ΔsipA.
Gebiedsanalyse
De gebiedsanalyse in stap 4.1 biedt een meting van de totale kolonisatie van epitheelcellen door Salmonella (infectieratio), samen met een meting van de hyperreplicatie (hyperreplicatieratio). In de in figuur 2 beschreven gebiedsanalyseworkflow wordt de willekeurige ruis verminderd en vervolgens worden kanalen onafhankelijk van elkaar gesplitst en verwerkt. Voor elk kanaal wordt een drempelwaarde ingesteld om de achtergrond uit te sluiten van de gebiedsmeting. Vervolgens wordt het gebied dat wordt ingenomen door drempelpixels gemeten voor elk kanaal. De output van gebiedsanalyse is een tabel die voor elk acquisitiebestand de uitbreiding rapporteert van de gebieden die worden ingenomen door epitheelcelkernen (blauw kanaal), intracellulaire mCherry-expresserende Salmonellae (rood kanaal) en cytosolische hyperreplicerende Salmonellae die GFP (groen kanaal) samen met mCherry uitdrukken. De infectieratio wordt berekend door het gebied dat wordt ingenomen door mCherry-expressing Salmonellae te delen door het gebied dat wordt ingenomen door gastheercelkernen. De resultaten van de geteste stammen toonden aan dat S. Tm vertoont een significant hogere infectieratio in vergelijking met beide S. Derby-stammen, zoals verwacht (figuur 3A). Daarom tonen deze resultaten de werkzaamheid van gebiedsanalyse aan bij het detecteren van verschillen in het vermogen van Salmonella-stammen om epitheelcellen te koloniseren. Salmonella hyper-replicatieratio wordt gemeten door het gebied bezet door GFP-expressing Salmonellae te delen door het gebied bezet door intracellulaire mCherry-expresserende Salmonellae. Consistent met de rol van SipA bij het bepalen van hyperreplicatie, een aanzienlijk verminderde hyperreplicatieratio voor S. Derby ΔsipEen stam werd gemeten in vergelijking met S. Derby wt, (Figuur 3B). Er werd geen hyperreplicatieverschil waargenomen tussen S. Tm en S. Derby wt. Over het algemeen onthulde gebiedsanalyse effectief verschillende hyperreplicatieniveaus onder de geteste stammen.
Eencellige analyse
De eencellige analyse maakt het kwantificeren van Salmonella-invasie en vacuolaire belasting versus cytosolische replicatie in epitheelcellen met eencellige resolutie mogelijk. Zoals beschreven in stap 4.2 werden voor elk acquisitiebestand blauwe, rode en groene kanalen onafhankelijk van elkaar verwerkt (figuur 4). Specifiek werd het blauwe kanaal, overeenkomend met epitheelcellen, in stap 4.2.3 verwerkt om celsegmentatie te verkrijgen. Vervolgens werden gesegmenteerde cellen toegevoegd aan de Region of Interest (ROI) Manager om een lijst met ROI's te verkrijgen, die overeenkomen met alle gesegmenteerde cellen die uniek zijn gelabeld met y-x-coördinaten. Om onscherpe pixels van GFP- die hyperreplicerende Salmonellae uitdrukken te verwijderen, werden de pixels van het groene kanaal afgetrokken van die van het rode kanaal. De outputtabel van single cell analysis rapporteert, voor elke ROI, het gebied en het percentage van het ROI-gebied dat wordt ingenomen door Salmonellae en die alleen de mCherry constitutieve reporter of de GFP cytosol-responsieve reporter uitdrukt. Het percentage van het gebied van de cel dat wordt ingenomen door mCherry-only dat Salmonellae tot expressie brengt, werd in stap 4.2.4 verwerkt om het percentage geïnfecteerde cellen en de gemiddelde vacuolaire belasting te berekenen (figuur 5A). Analyse van de vacuolaire belasting toonde aan dat de S. Derby-stammen genereren een gemiddelde vacuolaire belasting die aanzienlijk lager is dan S. Tm (figuur 5B). Omgekeerd werd slechts een lichte en niet significante vermindering van het percentage geïnfecteerde cellen waargenomen bij S. Derby stammen vergeleken met S. Tm (figuur 5A). Het percentage van het gebied van de cel dat wordt ingenomen door GFP-expresserende Salmonellae werd in stap 4.2.5 verwerkt om de hyperreplicatiesnelheid te verkrijgen. Er werd geen verschil waargenomen tussen S. Tm en S. Derby wt, terwijl S. Derby ΔsipA vertoonde een significante afname van hyperreplicatie, in overeenstemming met het resultaat van de gebiedsanalyse (figuur 5C) en de rol van SipA bij het induceren van hyperreplicatie.
Figuur 1: Salmonella cytosolische hyperreplicatie en vacuolaire belasting. Representatieve beelden van (A) de Salmonella hyperreplicatie en (B) de vacuolaire belasting verkregen bij hoge vergroting (40x) worden getoond. Paneel B toont de verschillende focusvlakken van cellen die hyperreplicerende Salmonellae bevatten (z:7/8), vergeleken met niet-hyperreplicerende Salmonellae (z:4/8). Witte schaalbalken zijn 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow van de gebiedsanalyse. De workflow van de gebiedsanalyse wordt getoond voor een representatieve lage vergroting (10x) acquisitie van INT407-cellen die gedurende 8 uur zijn geïnfecteerd met Salmonella die het pCHAR-Duo-plasmide (MOI 100) draagt. Eerst wordt de willekeurige ruis verminderd en vervolgens worden de kanalen opgesplitst in C1, C2 en C3 en onafhankelijk verwerkt. Voor elk kanaal wordt een drempelwaarde ingesteld om de achtergrond uit te sluiten van het meetgebied. Vervolgens wordt het gebied dat wordt ingenomen door de gedrempelde pixels - die alleen overeenkomen met celkernen in C1, alle intracellulaire Salmonellae in C2 en cytosolische Salmonellae in C3 - gemeten voor elk kanaal. De hier geanalyseerde afbeeldingen zijn de resultaten van vier tegels verkregen bij 10x vergroting die samengesmolten zijn door stiksels. Witte schaalbalken zijn 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Resultaten van de gebiedsanalyse. De resultaten van de gebiedsanalyse worden getoond. (A) De infectieverhouding wordt berekend door het gebied dat wordt ingenomen door mCherry-expresserende Salmonellae (C2-kanaal), dat alle intracellulaire bacteriën vertegenwoordigt, te delen door het gebied dat wordt ingenomen door gastheercelkernen (C1-kanaal). (B) De hyperreplicatieratio werd gemeten door het gebied dat wordt ingenomen door GFP-expresserende Salmonellae (C3-kanaal), dat alleen cytosolische hyperreplicerende bacteriën vertegenwoordigt, te delen door het gebied dat wordt ingenomen door alle intracellulaire mCherry-expresserende Salmonellae. Elke stip vertegenwoordigt een replica. De analyse werd uitgevoerd op drie biologische replicaties, elk getest in drievoud. De zwarte lijnen geven de gemiddelde waarden aan. De significantie werd berekend met behulp van een tweezijdige t-test en p-waarden worden gerapporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Workflow van de eencellige analyse. De workflow van de eencellige analyse wordt getoond voor een representatieve hoge vergrotingsacquisitie (40x) van INT407-cellen die gedurende 8 uur zijn geïnfecteerd met Salmonella die het pCHAR-Duo-plasmide (MOI 100) dragen. Ten eerste worden kanalen opgesplitst in C1, C2 en C3 en onafhankelijk van elkaar verwerkt. Blauw kanaal (C1), overeenkomend met epitheelcellen, wordt verwerkt om celsegmentatie te verkrijgen en vervolgens wordt elke gesegmenteerde cel gedefinieerd als een regio van belang (ROI) die uniek is gelabeld met y-x-coördinaten. Het rode kanaal (C2) wordt verwerkt door het groene kanaal (C3) af te trekken om onscherpe cytosolische hyperreplicerende Salmonellae te verwijderen, waardoor alle vacuolaire Salmonellae alleen mCherry tot expressie brengt, en vervolgens werd willekeurige ruis verminderd en de drempel is ingesteld om de achtergrond uit te sluiten van metingen. Ten slotte wordt het gebied dat wordt ingenomen door vacuolaire Salmonellae voor elke ROI gemeten. Het groene kanaal (C3), overeenkomend met totale cytosolische GFP-expresserende Salmonellae, wordt op dezelfde manier verwerkt. De hier geanalyseerde afbeeldingen zijn de resultaten van 16 tegels die door stiksels met elkaar zijn versmolten. Witte schaalbalken zijn 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Resultaten van de eencellige analyse. De resultaten van de eencellige analyse worden getoond. (A) Het percentage geïnfecteerde cellen wordt verkregen door het aantal cellen met een percentage van het gebied dat wordt ingenomen door mCherry-only salmonellae> 0,2 te delen door het totale aantal cellen. (B) De gemiddelde vacuolaire belasting werd verkregen door het gemiddelde percentage van de oppervlakte te berekenen die wordt ingenomen door mCherry-only die Salmonellae in de geïnfecteerde cellen tot expressie brengt. (C) De hyperreplicatiesnelheid werd berekend door het aantal cellen met een percentage van het gebied bezet door GFP-expresserende Salmonellae≥20% te delen door het totale aantal geïnfecteerde cellen. Gegevens van drie tot vier biologische replicaties getest in drievoud worden gerapporteerd. De balken geven de standaard meetfout aan. De significantie werd berekend met behulp van een tweezijdige t-test en p-waarden worden gerapporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Gebiedsanalysescript. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Analysescript voor één cel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De manier waarop Salmonella intestinale epitheelcellen koloniseert, beïnvloedt de infectie-uitkomst. Bij invasie induceert de cytosolische hyperreplicatie ontsteking van de darm3, terwijl vacuolaire replicatie kan leiden tot systemische verspreiding4. Salmonellastammen kunnen variëren in hun vermogen om binnen te dringen en zich te vermenigvuldigen in intestinale epitheelcellen9. Salmonella is inderdaad een zeer divers geslacht met meer dan 2.500 serovars, die verschillende capaciteiten hebben om ziekten te veroorzaken. Bovendien is Salmonella de meest gemelde oorzaak van door voedsel overgedragen uitbraken in de Europese Unie, wat wijst op een grote verspreiding van de menselijke bevolking1. Daarom is de beschikbaarheid van betrouwbare, high-throughput methoden voor de kwantificering van de intracellulaire fenotypen van Salmonella van groot belang om verschillen in virulentie tussen grote aantallen Salmonella-stammen te evalueren en uiteindelijk een nauwkeurige en stamspecifieke risicobeoordeling van dit pathogeen mogelijk te maken.
Het hier beschreven protocol meet het gedrag van Salmonella in epitheelcellen op een snelle en geautomatiseerde manier. De infectie van epitheelcellen wordt uitgevoerd in 96-well imaging microplaten en een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop wordt gebruikt voor beeldacquisitie, waardoor het protocol geschikt is voor toepassingen met hoge doorvoer. Dit protocol maakt gebruik van het pCHAR-Duo plasmide, waarmee vacuolaire van cytosolische Salmonellae kan worden onderscheiden door de differentiële expressie van twee fluorescerende melders5. De intracellulaire fenotypen van Salmonella worden vaak geanalyseerd door handmatige scoring, een tijdrovende procedure die niet geschikt is voor de analyse van grote aantallen stammen en celculturen per stam en gevoelig is voor fouten van de operator en inter-operator variatie. Om deze beperkingen te overwinnen, werden twee complementaire en geautomatiseerde beeldanalyses ontwikkeld, de gebiedsanalyse en de eencellige analyse. ImageJ, een vrij beschikbare software, werd gebruikt om de twee analyses te ontwikkelen. Om de uitvoering van het protocol te versnellen, worden ImageJ-scripts voor batchanalyse van meerdere acquisitiebestanden zonder tussenkomst van de operator geleverd als aanvullende bestanden.
De gebiedsanalyse is ontworpen om in een paar stappen de algehele kolonisatie van epitheelcellen (infectieratio) en het hyperreplicatieniveau (hyperreplicatieratio) te kwantificeren door de meting van de gebieden die specifiek worden ingenomen door de kernen van epitheelcellen en door Salmonellae die mCherry of mCherry samen met GFP tot expressie brengt. De gebiedsanalyse wordt toegepast op beelden verkregen bij lage vergroting, waarbij zowel vacuolaire als hyperreplicerende Salmonellae in hetzelfde z-vlak in focus zijn en een groot aantal epitheelcellen per microscopisch veld wordt weergegeven, waardoor de grootte en het aantal acquisitiebestanden worden verminderd. De gebiedsanalyse maakt een geautomatiseerde, snelle en computationeel lichte analyse van een groot aantal monsters mogelijk, waardoor het geschikt is voor high-throughput assays zoals screeningexperimenten.
De eencellige analyse is ontworpen om Salmonella-fenotypes in epitheelcellen te kwantificeren met eencellige resolutie, verkregen door celsegmentatie en meting van het cellulaire gebied en het percentage van het gebied dat wordt ingenomen door vacuolaire en cytosolische hyperreplicerende Salmonellae. De algehele kolonisatie van epitheelcellen die door de gebiedsanalyse worden gekenmerkt, wordt hier onderverdeeld in drie kwantitatieve parameters, het percentage geïnfecteerde cellen, de gemiddelde vacuolaire belasting en de hyperreplicatiesnelheid, waardoor de bijdrage van elk fenotype aan de algehele kolonisatie kan worden geëvalueerd en gekwantificeerd, daarom als aanvulling op de resultaten van gebiedsanalyse. De grotere details die de eencellige analyse biedt, gaan ten koste van langzamere beeldacquisitie en -analyse. Om een eencellige resolutie te bereiken, wordt beeldacquisitie zelfs uitgevoerd bij een hoge vergroting. Dit impliceert dat meerdere z-vlakken nodig zijn om zowel vacuolaire als cytosolische Salmonellae in focus te observeren en dat de verwerving van een groot aantal velden per monster nodig is om een hoog aantal epitheelcellen te scoren, waardoor de acquisitietijd wordt verlengd in vergelijking met gebiedsanalyse. Bovendien is de analyse van verschillende grote acquisitiebestanden computationeel veeleisend, waardoor een geschikt werkstation nodig is (een 6-core, 32 GB RAM-werkstation werd gebruikt). Daarom kan eencellige analyse worden gebruikt als een stand-alone in beperkte doorvoeromstandigheden of als een methode op het tweede niveau gekoppeld aan de gebiedsanalyse om een dieper inzicht te krijgen in de Salmonella-fenotypen in epitheelcellen.
De twee complementaire analyses werden gevalideerd met behulp van S. Tm, S. Derby wt, en S. Derby ΔsipA, gekozen omdat hun gedrag in epitheelcellen al bekend was om te verschillen in termen van invasie of replicatie 9,10. De resultaten van de gebieds- en eencellige analyses tonen aan dat het protocol het mogelijk maakte om verschillen in intracellulaire Salmonella-fenotypen kwantitatief te onderscheiden in overeenstemming met de kenmerken van de geteste stammen. Bovendien tonen deze resultaten aan dat de eencellige analyse kwantificering mogelijk maakt van de bijdrage van elk intracellulair fenotype (invasie, vacuolaire belasting en cytosolische replicatie) aan de totale kolonisatie gescoord met behulp van de gebiedsanalyse.
Dit protocol werd hier toegepast om de in vitro pathogeniciteit van verschillende stammen van Salmonella te bestuderen, maar het kan andere toepassingen hebben, zoals de studie van willekeurige mutanten om genen te identificeren die betrokken zijn bij de invasie en / of replicatie in epitheelcellen. Bovendien kan het protocol worden aangepast om het gedrag van Salmonella in andere cellijnen dan INT407-cellen te analyseren. Het kan ook worden gebruikt als uitgangspunt om vergelijkbare methoden te ontwikkelen voor het bestuderen van cel-pathogeeninteractie van andere intracellulaire micro-organismen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Olivia Steele-Mortimer bedanken voor het delen van pCHAR-Duo plasmide. Dit werk werd gefinancierd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid, subsidies PRC2019014 en PRC2021004.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
| Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
| Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
| Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
| Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
| Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
| Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
| HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
| Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
| Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
| Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
| Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
| Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
| Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
| Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
| Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |
References
- European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
- Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
- Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
- Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
- Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
- Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
- Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
- Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
- Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).
