Summary
在这里，我们提出了噪声诱导听力损失（NIHL）小鼠模型的方案。为了诱导NIHL，我们开发了一种使用波纹塑料，捕鼠笼和扬声器的新型简单设备。采用听觉脑干反应和免疫荧光成像分别评估听力功能和外毛细胞损伤。
Abstract
噪声性听力损失（NIHL）的动物模型有助于病理学家、治疗师、药理学家和听力研究人员彻底了解NIHL的机制，并随后优化相应的治疗策略。本研究旨在为开发NIHL小鼠模型创建改进的方案。本研究使用雄性C57BL / 6J小鼠。将未麻醉的小鼠暴露于响亮的噪音（1和6kHz，以115-125db spl-A同时呈现）连续6小时，连续5天。使用听觉脑干反应（ABR）在噪声暴露后1天和1周评估听觉功能。ABR测量后，处死小鼠，收集其Corti器官进行免疫荧光染色。从听觉脑干反应（ABR）测量中，在噪声暴露后1天观察到明显的听力损失。1周后，实验小鼠的听力阈值降至~80 dB SPL，仍明显高于对照小鼠（~40 dB SPL）。从免疫荧光成像的结果来看，外毛细胞（OHC）被证明是受损的。总之，我们使用雄性C57BL / 6J小鼠创建了NIHL模型。开发并采用了一种新的简单设备，用于产生和传递纯音噪声。听力阈值的定量测量和OHC损伤的形态学确认都表明，施加的噪声成功地诱发了预期的听力损失。
Introduction
全世界约有13亿人因接触噪音而遭受听力损失1。在这项研究中，我们旨在建立一个明确的分步过程来诱导和确认噪声引起的听力损失（NIHL）。NIHL 由毛细胞 （HC） 和螺旋神经节神经元 （SGN） 的变性/破坏、HC 立体纤毛损伤和/或耳蜗内部 HC 和 SGN 之间的突触缺失引起。除NIHL外，此类异常还可能导致耳鸣和言语感知受损（特别是在复杂的声学环境中）。社会、心理和认知功能可能依次受到这些生理缺陷的影响2,3,4,5,6。
在基于小鼠的NIHL相关临床前研究中，最受欢迎的小鼠品系是CBA / CaJ 2,3,6,7和C57BL / 6 4,5,8。此外，雄性3,4,7小鼠比雌性小鼠更常用，因为雌激素对听力具有保护作用。因此，我们在这项研究中只使用了雄性小鼠9。参考文献后，我们选择了1 kHz和6 kHz作为施加噪声的频率。施加噪声的强度为115 dB SPL-A（笼子周围）至125 dB SPL-A（笼子中心）。在将实验小鼠连续暴露于噪音中6小时，连续5天后，听力阈值的最佳增加表明在实验小鼠中产生了NIHL的最佳程度。处理动物、构建实验装置和诱导噪音的操作都在提供的方案中逐步清楚地描述。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究中的动物实验得到了麦凯医学院动物护理委员会的批准。八周龄雄性C57BL / 6J小鼠从国家实验动物中心（台湾新北市）购买。所有小鼠均按照标准动物方案进行繁殖和饲养。
1. 诱导小鼠NIHL
- 为实验小鼠准备笼子
- 为此，请使用尺寸为 14 厘米× 17 厘米× 24 厘米的捕鼠笼。将四块瓦楞塑料板切成合适的尺寸，使它们适合笼子（13 厘米× 23 厘米和 13 厘米× 16 厘米）。
- 为了防止小鼠的脚被网状网格割伤，请分别将其中两块放在底部和背面。将另外两块垂直互锁放置，将笼子内的空间分成四等部分。
- 在隔音盒中进行这项研究。将扬声器放在笼子前面 8.5 厘米处，然后将扬声器和笼子都放在隔音盒中。
- 打开克里奥应用软件
- 将光标移动到扬声器图标上，然后单击 TwoSin。输入并更改频率 1 到 1000 Hz、频率 2 到 6000 Hz 的值，然后单击 OK 开始播放声音。
- 在 Leq 选项卡下，将 dBV 更改为 dBSPL。在软件界面上设置时间后，单击绿色三角形按钮播放声音。
- 将麦克风放在扬声器前面，距离 8.5 厘米以校准噪音水平（请参阅 补充文件 1）。将噪音水平调整为 125 dB SPL-A，并连续监测不少于3分钟，以确保噪音水平足够稳定。使用发生器、分析仪和放大器来产生和控制噪声。（图1）
注意：在隔音盒中执行此步骤，以避免损坏操作员的听力。 - 将四只雄性C57BL / 6J小鼠放入笼中（每季度一只）进行噪声暴露。在噪声暴露期间随机分配每个季度的小鼠。将麦克风放在保持架顶部，以监测噪声暴露期间的噪音水平（图2）。
注意：在隔音盒中执行此步骤，以避免损坏操作员的听力。 - 将小鼠暴露在1kHz和6kHz频率的噪音中，每天连续6小时，连续5天。
- 通过测量ABR测量噪声暴露后1天（即第 6天）小鼠的听力阈值。 在噪声暴露后1周（即第 13天）再次重复这些ABR测量。ABR测量后，处死所有受影响的小鼠并收获其耳蜗（图3）。
2. 基于听觉脑干反应（ABR）的听力阈值评估
- 使用专为小动物设计的商用ABR测试系统10.
- 腹膜内将替他明和唑拉西泮（40mg / kg）和甲苯噻嗪（9.3mg / kg）的混合物注射到小鼠中进行全身麻醉。
注意：ABR评估需要~2小时。确保通过加热垫提供热支持，并涂抹眼膏以防止鼠标麻醉时干燥。 - 在全身麻醉下测量小鼠中的ABR。将皮下针状电极 （12 mm） 放在顶点、左耳耳廓后面和靠近尾巴的背部以测量听力阈值。
- 使用放置在距离动物左耳 1 厘米处的扬声器呈现声音刺激。
- 使用示波器控制声音刺激。为刺激选择 正弦波 ，为窗口刻度选择 10 k 。转动频率旋钮以获得所需的声音刺激 频率 。
- 通过转动函数发生器上的 AMLP 旋钮来调整刺激强度。通过将 AMLP 旋钮旋转到根据校准计算得出的合适电压来获得所需的激励强度。
- 收集一系列激励强度下的 ABR 测量值，从 10 dB SPL 到 100 dB SPL，步长为 10 dB。
注意：在隔音盒中测量听力阈值。假设在收集的信号中产生可识别的 Wave V 的最小刺激强度水平为ABR 阈值 10,11（图 4）。ABR评估后，监测动物，直到它从麻醉中恢复（~1小时）。
3. 显微镜检查
- 固定收获的组织
- ABR测量后，通过腹膜内注射替他明和唑拉西泮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（23.25mg / kg）的混合物进行显微镜检查来牺牲小鼠。
- 从小鼠中收获耳蜗，并立即将它们浸入10%甲醛（FA）中以在4°C下固定（两个耳蜗/ mL）至少8小时。
- 固定后，用10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液替换FA溶液，在4°C下脱钙3-4天。 然后，用镊子检查每个耳蜗，以确认耳蜗是否充分软化。
- 将耳蜗放入装有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中，并将Corti（OC）（每个脱钙的耳蜗）的螺旋形器官切成三部分 - 基底转，中间转和顶端转 - 用于组织染色。
- 在解剖显微镜下（放大倍数：8x-35x），去除脱钙耳蜗的骨结构（前庭鳞片，鼓室鳞片和微鳞片），并获得软组织，包括OC（厚度：约40μm）。
- 耳蜗免疫荧光染色
- 封闭缓冲液的制备：在PBS中制备2%牛血清白蛋白（BSA）和0.2%Triton X-100溶液。
- 将要染色的组织从培养皿转移到微量离心管中，并将组织浸入0.1mL封闭缓冲液中在室温（RT）下2小时。
- Myo7A一抗缓冲液的制备：在封闭缓冲液中以1：200的体积比稀释Myo7A一抗。
- 用 100 μL Myo7A 一抗缓冲液在室温下处理微量离心管中的组织 2 小时。
- 在PBS中冲洗纸巾三次，每次5分钟。
- Myo7A二抗（Myo7A-Rb-488）和鬼笔环肽抗体（鬼笔环肽-594）缓冲液的制备：在封闭缓冲液中稀释Myo7A二抗（1：400）和鬼笔环肽抗体（1：200）。
- 用 100 μL Myo7A 二抗和鬼笔环肽抗体缓冲液在室温下处理组织 2 小时。
- 抗体+鬼笔环肽抗体处理后，用PBS冲洗组织三次，每次5分钟。
- 使用带有切割尖端的 1 mL 塑料移液管将冲洗的组织从微量离心管转移到装有 PBS 的培养皿中。
- 为了准备显微镜检查，展开组织，将其放在载玻片上，然后将 15 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 氟安装培养基添加到组织中以完全覆盖它。将玻璃盖玻片轻轻地放在纸巾上。将载玻片在室温下放置过夜，然后用指甲油密封。
- 图像采集
- 使用正置荧光显微镜和图像采集软件采集 2D 图像。
- 在进行显微镜检查之前，将组织置于视野的中心，并将感光度调整为ISO 100。首先通过单击软件的 “自动模式” 按钮来调整曝光时间，然后通过单击“ 调整 ”按钮进行手动微调以优化信噪比。
- 通过旋转荧光立方体来调整入射光的波长以激发荧光团。伪色用于标记不同荧光标记的发射（蓝光：DAPI;绿光：Myo7A;红光：鬼笔环肽）。
- 通过扫描组织样本，生成并收集成像数据作为.tif和.jpg图像文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR 听力阈值的变化
在噪声暴露后1天或1周使用音爆ABR测量小鼠的听力阈值。在噪声暴露后1天（即第6天），观察到所有三个测试频率（12 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL;24 kHz：91.43 ± 0.92 dB SPL;32 kHz：98.57± 1.43 dB SPL）的听力阈值显着增加。部分听力恢复发生在噪声暴露后1周（即第13天），但所有频率（12 kHz：72.86±2.86 dB SPL;24 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL;32 kHz：87.14 ± 4.21 dB SPL）与对照组（12 kHz：41 ± 0 dB SPL;24 kHz： 51 ± 0 dB 声压级;32 kHz： 51 ± 0 dB SPL）。在这项研究中，听力在高频下受损更大（图5）。使用双向方差分析检验进行分析，使用邦弗朗尼校正进行后检验。在第6天和第13天，对照组和实验组之间观察到显着差异（p < 0.001）。在第6天和第13天测量的听力阈值之间的比较显示，在12 kHz和32 kHz的频率下存在显着差异（p < 0.05）。
外毛细胞脱落
与对照小鼠相比，在从NIHL小鼠获得的显微图像中始终观察到OHC的损失。相比之下，观察到所有图像中的内毛细胞都是完整的。此外，Corti器官基底和中转的OHC受损更严重，而顶端转弯的OHC几乎完好无损（图6）。
图1：噪声暴露设置。 将麦克风放置在扬声器前面，距离为8.5厘米，以校准噪音水平。噪音水平调整为125 dB SPL-A，与附近警报器的水平相似。 请点击此处查看此图的大图。
图2：适应本研究的捕鼠笼。 在噪声暴露期间，每季度随机分配三只雄性C57BL / 6J小鼠。麦克风被粘在笼子的顶部，以监测噪音暴露期间的噪音水平。在多个位置多次测量声压级。这些位置在图中进行了标记。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：测试组和对照组的实验时间表。 将小鼠暴露在1和6kHz频率的噪声中，每天连续6小时，持续5天。连续5天噪声暴露后，在第6天用 ABR测量实验小鼠的听力阈值。在第 13天再次在实验小鼠和对照小鼠中进行ABR测量，然后处死所有参与的小鼠以收获其耳蜗。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：听力的 ABR 测量。 12 kHz 下的代表性 ABR 结果，在第 13天（ 噪声暴露后 1 周）收集。如果可辨别，则标记每个强度的波 V。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：第 6 天和第 13 天测量的听力阈值。频率为 （A） 12 kHz、（B） 24 kHz 和 （C） 32 kHz 时的听力阈值。使用双向方差分析检验进行分析，然后进行邦弗朗尼校正。*p < 0.05，***p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
图6：从OC获得的免疫荧光成像结果 。 （A）从耳蜗的顶端转动获得的图像。（B）从耳蜗的中间转动获得的图像。（C）从耳蜗的基部转动获得的图像。蓝色：用DAPI染色的细胞核;绿色：用Myo7A染色的毛细胞;红色：用鬼笔环肽染色的细胞骨架。箭头表示OHC的损失。比例尺= 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：通过校准计算电压。对于每个特定频率，所选电压（水平轴）的值将被输入到校准曲线中，以获得相应的声级（垂直轴）。 请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIHL可分为两种类型：临时NIHL，其显示听力阈值的时间偏移，以及永久性NIHL，其特征是永久性听力阈值偏移。我们在第 6天（噪音暴露后1天）观察到的听力损失被认为是这两种类型的组合。在这种情况下，由于听力损失的时间成分，听力阈值将随着时间的推移逐渐恢复。在我们的初步实验研究中，在相同的设置和动物下获得的结果，2天噪声暴露产生的听力损失在2周内完全恢复，表明永久性NIHL实际上并没有产生。相反，在本研究中，5天噪声暴露产生的听力损失建议包括永久性成分，因为听力阈值在第13天（ 噪声暴露后1周）仍明显高于对照水平。
当前协议的局限性之一是我们使用在12 kHz处检测到的听力阈值来表示小鼠的低频听力阈值，它对应于耳蜗的顶端转动。严格来说，耳蜗的顶端转弯对4 kHz至8 kHz的声音更敏感12。然而，这种限制几乎不会降低本研究和协议的价值，因为所提出的协议提供了操作步骤的每个细节，并使用了模型创建中涉及的设备。大多数提出的参数，如噪声暴露持续时间、噪声频率、ABR 的刺激频率以及何时进行 ABR 测试和动物处死，都可以在未来的研究中针对不同的目的进行更改和进一步优化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
无需披露利益冲突。
Acknowledgments
我們感謝台灣政府科技部（MOST）的撥款（MOST 110-2314-B-715-005，MOST 111-2314-B-715-009-MY3），以及麥凱醫學院的校內研究基金（MMC-RD-110-1B-P030，MMC-RD-111-CF-G002-03）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063 (2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173 (2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254 (2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189 (2019).
