Summary
Presentert her er metoder for fremstilling av aktiv nematikk fra mikrotubuli og kinesinmotorer, inkludert proteinpreparasjon og konstruksjon og bruk av brønner for aktiv nematisk inneslutning.
Abstract
Dannelsen av biopolymerbaserte aktive faser har blitt en viktig teknikk for forskere som er interessert i å utforske det fremvoksende feltet av aktive flytende krystaller og deres mulige roller i cellebiologi. Disse nye systemene består av selvdrevne underenheter som forbruker energi lokalt, og produserer en dynamisk væske utenfor likevekt. For å danne den aktive flytende krystallfasen som er beskrevet i denne rapporten, kombineres rensede proteinkomponenter inkludert biopolymerer og molekylære motorer, og den aktive nematiske fasen dannes spontant i nærvær av adenosintrifosfat (ATP). For å observere nematisk tilstand må materialet begrenses i en egnet geometri for mikroskopi med høy nok tetthet. Denne artikkelen beskriver to forskjellige metoder for dannelse av en aktiv nematisk fase ved bruk av mikrotubuli og kinesinmotorer: montering av et todimensjonalt aktivt lag ved et olje- og vanngrensesnitt og montering under et oljelag ved hjelp av en elastomerisk brønn. Teknikker for å sette det aktive materialet inn i små brønner av forskjellige former er også beskrevet.
Introduction
Aktive væsker består av energidrevne partikler eller elementer som trekker drivstoff fra sitt lokale miljø. Under de rette forholdene kan disse bevegelige aktive elementene virke kollektivt for å produsere fremvoksende væskedynamikk over lange lengdeskalaer. Det finnes en rekke eksempler på slik ut-av-likevektsfaseoppførsel i litteraturen, og aktive faser finnes over hele spekteret av levende systemer. Noen bemerkelsesverdige eksempler er kolonier av bakterier1, celleark2,3 og flokking eller sverming av organismer 4,5. Aktive faser har også blitt studert grundig i kondenserte faser av cytoskeletale filamenter, enten som en del av celle6 eller i syntetiske systemer designet for å gjøre bruk av biologisk ekstraherte komponenter 7,8,9. Flytende krystallinsk bestilling og dannelse av topologiske defekter i både naturlig forekommende og syntetiske systemer satt sammen av biologiske ekstrakter er av spesiell interesse for forskningsmiljøet. I de senere år har forskningsgrupper undersøkt slike systemer, deres grunnleggende fysiske egenskaper og deres relevans for biologi 2,3,10,11.
Dette papiret fokuserer på dannelsen av den aktive nematiske tilstanden fra en kombinasjon av mikrotubuli og kinesinmotoriske proteiner. Den tradisjonelle nematiske flytende krystallen er en likevektsfase av materie der de konstituerende molekylene utviser orienteringsrekkefølge. For eksempel kan en væske bestående av relativt stive stanglignende molekyler utvise både den nematiske fasen og, ved høyere temperaturer, en uorientert isotropisk væske fase12. Det første eksperimentelle eksemplet på en aktiv nematisk fase ble utviklet av Sanchez et al.13, og tilpasset et tidligere in vitro-eksperiment 14 der klynger av motorproteiner ble brukt til å produsere en skjærebevegelse mellom nærliggende mikrotubulibunter. Da dette mikrotubulisystemet var begrenset til et tynt lag, oppstod spontan nematisk rekkefølge. I de senere år har den aktive nematiske tilstanden blitt studert intensivt av flere eksperimentelle 15,16 og teoretiske 17,18 forskningsgrupper, med fokus på fenomener som aktiv turbulens - en tilstand der væsken produserer selvdrevne kaotiske strømmer 19 - og mobile topologiske defekter. Dette papiret beskriver metoder for å forberede og danne den aktive nematiske tilstanden fra mikrotubuli og kinesinmotorer i forskjellige eksperimentelle geometrier. Først beskrives prepareringsmetoder for de forskjellige komponentløsningene, etterfulgt av metoder for å danne den aktive nematikken ved hjelp av to forskjellige strømningskammergeometrier. Typiske bilderesultater vises. Til slutt beskrives metoder for å begrense den aktive nematikken i brønner og kanaler.
Protocol
1. Forbereder det aktive materialet
MERK: Den 2D aktive nematikken er montert i en tre-trinns prosess. Først fremstilles to separate løsninger: a) polymeriserte, stabiliserte mikrotubuli og b) MIX (en løsning som inneholder kinesinmotorer). Disse kombineres og aktivitet initieres ved tilsetning av adenosintrifosfat (ATP). Materialet er da begrenset i en egnet geometri, slik at dens tetthet er høy nok til at nematisk orden kan dukke opp. Protokoller er inkludert for utarbeidelse av alle nødvendige komponenter og hvordan man monterer den aktive fasen.
- Kinesin motor protein cluster forberedelse
- Ekspress og rens rekombinante K401-BIO motorproteiner (K401 motorer) fra Escherichia coli etter protokollen av Edgar C. Young20.
MERK: K401-BIO motorproteiner er dimeriske og består av to hoder forbundet med en spiralformet stilk. Motorene ble levert av Brandeis Biomaterials Facility og brukt som tidligere rapportert16. For å danne en aktiv nematisk blir kinesinmolekylene biotinylert og deretter forbundet via en streptavidinforbindelse for å danne kinesinklynger på opptil fire motorer 13,15,21,22. Det er nyttig å uttrykke kinesin med en grønn fluorescerende protein (GFP) tag. - Etter rensing og inkubering av streptavidin og motorer på is i 40 minutter, flash-frys K401-motorene i flytende nitrogen i 5 μL aliquots ved en endelig konsentrasjon på 0,7 mg / ml, og lagre ved -80 ° C.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause her. Tine kinesinet forsiktig når det er nødvendig, og ikke frys på nytt. - Forbered klynger av biotinmerket kinesin (KSA) ved å blande 24 vol% av 0,7 mg / ml K401 motorer, 27 vol% av 0,325 mg / ml streptavidin og 3 vol% av 5 mM dithiothreitol (DTT) (for å forhindre aggregering) ved 4 ° C i 46 vol% M2B buffer (80 mM RØR [1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, pH 6,8], 2 mM MgCl2 og 1 mM EGTA [etylenglykol-bis (β-aminoetyleter) -N, N,N′,N′-tetraeddiksyre]). La KSA ruge på is i 40 minutter.
- Ekspress og rens rekombinante K401-BIO motorproteiner (K401 motorer) fra Escherichia coli etter protokollen av Edgar C. Young20.
- Klargjøring av mikrotubulioppløsning
MERK: Guanosin-5'-[(α,β)-metyleno]trifosfat, natriumsalt (GMPCPP) er en langsomt hydrolyserbar analog av guanosintrifosfat (GTP), og mikrotubuli dannet i nærvær av GMPCPP er tre ganger stivere enn GTP-mikrotubuli23 og kortere. Bruken av korte, stive mikrotubuli er gunstig for dannelsen av den aktive nematiske fasen, da disse faktorene kombineres for å fremme flytende krystallinsk rekkefølge.- Polymeriser umerket syklustubulin (99%, se materialtabell) ved bruk av 0,6 mM GMPCPP ved en tubulinkonsentrasjon på 6 mg / ml.
MERK: Tubulin av høy kvalitet kan også renses fra storfe- eller svinhjerne etter etablerte protokoller eller hentes fra en annen pålitelig kilde, for eksempel Brandeis Biomaterials Facility, hvor materialer kan sendes frosset for å forhindre skade. For tubulinrensing fra storfehjerne, se den publiserte protokollen fra Bate et al.24. For tubulinrensing fra svinhjerne, se de publiserte protokollene fra Castoldi et al.25 og Tayar et al.26. - Som forberedelse til polymerisering, lag et varmebad ved 37 ° C og forkjøl sentrifugen til 4 ° C. Kombiner den umerkede tubulinløsningen i M2B-buffer (trinn 1.1.3) i et 500 μL ultracentrifugerør med 4 mol% rhodaminmerket tubulin (se materialtabell) for å produsere 4% merkede mikrotubuli etter polymerisering.
- Kontroller tubulinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford-analyse27. Den totale tubulinkonsentrasjonen i sentrifugerøret skal være 6,5-6,9 mg/ml.
- Inkuber tubulinblandingen på is i 10 minutter og ultrasentrifuge i 10 minutter ved 352 700 x g ved 4 °C. Dette trinnet fjerner dysfunksjonell tubulin, som vil være i pelleten.
- Bruk en pipette, trekk forsiktig ut supernatanten som inneholder funksjonell tubulin i et mikrosentrifugerør. Tilsett GMPCPP til en endelig konsentrasjon på 0,6 mM for å indusere tubulinpolymerisasjon og DTT til en endelig konsentrasjon på 1 mM for å forhindre proteinaggregering.
- Inkuber blandingen i varmebadet ved 37 °C i 30 minutter, sentrifuger deretter igjen i 10 minutter ved 14 000 x g ved romtemperatur. Fjern supernatanten, fortynn deretter pelleten med M2B-bufferen for å nå en endelig mikrotubulikonsentrasjon på 6 mg / ml.
MERK: Denne oppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur i minst 4 timer før bruk. - For å kontrollere at mikrotubuli har polymerisert vellykket, fortynn 1 μL av mikrotubuliløsningen 100: 1 med M2B-buffer og pipette på et mikroskopglass. Deksel med et deksel slip for avbildning ved hjelp av et fluorescensmikroskop (se materialtabell) med en 40x objektivlinse.
MERK: Eksitasjons- og emisjonsbølgelengder velges i henhold til fluorescensmerkingen som brukes på mikrotubuli. I denne protokollen brukes rhodaminmerking (se trinn 1.2.2), slik at avbildning utføres ved hjelp av et eksitasjonsbånd på 515-560 nm og et 590 nm langt passfilter. Figur 1 viser et representativt eksempel. - Etter at polymerisasjonen er fullført, fryses mikrotubuli som 2 μL aliquots i flytende nitrogen og lagres ved -80 ° C (om nødvendig).
- Polymeriser umerket syklustubulin (99%, se materialtabell) ved bruk av 0,6 mM GMPCPP ved en tubulinkonsentrasjon på 6 mg / ml.
- Tilberedning av MIX
MERK: MIX er en vandig løsning som inkluderer kinesin-streptavidinklyngene (KSA). Tilberedt MIX skal oppbevares ved -80 °C i 4 μL aliquots før forsøket. Når MIX kombineres med ATP og mikrotubulioppløsningen beskrevet i trinn 1.2 ved romtemperatur, initieres aktiviteten. MIX tilberedes som følger13,19.- Forbered en løsning for å forhindre fluorescensfalming (ANTIFADE) ved å blande to antioksidantløsninger. Kombiner AO1 (250 mM DTT, 65 mM katalase) og AO2 (750 μM katalase, 3 mM glukoseoksidase) i et volumforhold på 1:1. Inkluder 20 mM Trolox, en annen antioksidant som brukes til å redusere skade forårsaket av fluorescensmikroskopi.
- Forbered MIX ved å lage en KSA-oppløsning (beskrevet i trinn 1.1.3) som inneholder 6 vekt% 20 kDa polyetylenglykol (PEG) for å indusere bunting av mikrotubuli, 3 vol% ANTIFADE og 5 vol% pyruvatkinase / melkesyredehydrogenase (PKLDH) ved 70 mg / ml for ATP-regenerering.
2. Opprette den aktive nematiske
MERK: Aktivitet i materialet initieres av ATP-tillegg. Det aktive nettverket er forberedt friskt for hvert eksperiment ved å legge til ATP i en konsentrasjon som er høy nok til å indusere motoraktivitet. For å danne en jevn, fullt utviklet aktiv nematisk fase, må mikrotubuli være i tilstrekkelig høy tetthet. Dette kan oppnås ved å begrense mikrotubuli mellom to ublandbare væsker for å danne et todimensjonalt (2D) aktivt nematisk lag. Denne metoden ble opprinnelig utviklet ved Brandeis University13 og er fortsatt en populær teknikk for å produsere en homogen, høy kvalitet, aktiv nematisk fase.
- Strømningscellemetode for aktiv nematisk dannelse
- Forbered hydrofile dekselslips med et akrylamidbelegg.
- Rengjør dekslene grundig med såpevann, etanol og 0,1 M NaOH med alternative skyll med nanopurt vann. Når de er skyllet, belegg dekslene med en silanoppløsning sammensatt av 100 ml etanol, 1 ml eddiksyre og 500 μL 3- (trimetoksysilyl) propylmetakrylat i 15 minutter, skyll deretter med nanorent vann.
- Forbered en akrylamidoppløsning fra 95 ml nanorent vann og 5 ml 40 vekt% akrylamid, og avis deretter løsningen i 30 minutter i en vakuumovn.
- Tilsett 35 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) for en 2,3 mM endelig konsentrasjon og deretter 0,07 g ammoniumpersulfat. Hell akrylamidoppløsningen over dekselene mens du vender opp og inkuber over natten ved romtemperatur.
- Forbered hydrofobe mikroskop lysbilder. Pipette 100 μL av en vannavvisende løsning (se Materialtabell) på et rent glassmikroskopglass, og plasser deretter et nytt rent glassglass på toppen. Dette sikrer et jevnt belegg av den vannavvisende løsningen på overflaten der den sitter i 2 minutter. Etter 2 minutter, fjern det andre glassglasset og skyll det første lysbildet grundig med nanorent vann, og tørk deretter med nitrogengass. Rengjør forsiktig området der båndet skal plasseres (rundt mønsteret) med aceton for å sikre at den vannavvisende løsningen ikke forhindrer vedheft til glasset.
- Forbered en blanding av konstruert olje som inneholder 1,8% (v / v) 008-fluorosurfaktant (se materialtabell).
- Monter glassglasset og dekselet med det hydrofobe glassglasset på bunnen av strømningscellen og det hydrofile dekselet glir som den øvre overflaten i en sandwichgeometri ved hjelp av 40 μm dobbeltsidige klebende avstandsstykker. Plasser avstandsstykkene 1,5 mm fra hverandre på det hydrofobe mikroskopglasset. Plasser deretter det akrylamidbelagte dekselet på toppen av avstandsstykkene med den behandlede siden ned for å feste seg. Sørg for at adhesjonen er komplett med trykk fra en stump gjenstand.
MERK: Målet er å sette sammen en strømningscelle med et flatt olje/vann-grensesnitt inni (figur 2A,B). Det er her det aktive laget vil danne seg. Alternative avstandsbånd og filmer kan også brukes til å produsere en lignende celletykkelse. - Etter at strømningscellen er konstruert, pipetter du umiddelbart oljeblandingen inn i strømningscellen, og fyller det lukkede rommet.
- Ved hjelp av en pipette blandes i et separat hetteglass forsiktig 6 μL aktivt materiale med 3,73 μL MIX, 1 μL mikrotubulioppløsning, 0,6 μL ATP-løsning (konsentrasjonen kan varieres for å variere mikrotubulihastighet) og 0,67 μL M2B buffer.
- Pipette nyblandet aktivt materiale i en åpen ende av strømningscellen, volumene vil variere, men bør overstige volumet av strømningscellen (omtrent 3-6 μL). Noe olje vil bli forskjøvet av den vandige løsningen når den injiseres i kanalen; Dette kan være ondt opp i motsatt ende av strømningskanalen ved hjelp av et lite stykke silkepapir.
- Etter fylling forsegler du begge sider av strømningscellen med et epoksylim (se materialtabell) som herdes når det utsettes for UV-lys i 20 s.
MERK: På dette tidspunktet danner det aktive materialet et 3D-nettverk som forblir suspendert i vannlaget. - For å begrense det aktive laget mellom de to ublandbare væskene i et kvasi-2D-lag, plasser strømningscellen i en svingende bøtte sentrifuge (se Materialtabell) med den vandige fasen på toppen og det tettere oljelaget under. Sentrifuge ved 212 x g i 10 min. Etter at dette trinnet er fullført, kan strømningscellen tas til et epifluorescensmikroskop for avbildning med et 10x eller 20x forstørrelsesmål. Figur 2C,D viser typiske bilder før og etter dette trinnet.
- Forbered hydrofile dekselslips med et akrylamidbelegg.
- Invertert metode for aktiv nematisk formasjon
MERK: En alternativ metode til det som er beskrevet i trinn 2.1 er å sette sammen det aktive nematiske laget under et tykt oljelag begrenset til en dyp PDMS-brønn28. Denne metoden gir lignende resultater, og er noe lettere å mestre; Bildekvaliteten ved hjelp av denne metoden er imidlertid vanligvis ikke så god som flytcellemetoden.- Klargjør polydimetylsiloksan (PDMS) ved hjelp av et elastomerherdemiddel og en elastomerbase (se materialtabell). Bland de to komponentene i forholdet 1:10 ved hjelp av en metallspatel. Små bobler vises under blanding som er vanskelig å fjerne, og blandingen virker melkeaktig. For å fjerne disse boblene, plasser blandingen under et vakuum til degas i 1 time, hvorpå den uherdede PDMS skal virke gjennomsiktig.
MERK: PDMS er nå klar til å danne hvilken som helst form ved hjelp av en form, eller den kan herde i beholderen og deretter kuttes eller stanses i ønsket mønster. - Hell PDMS i en passende form og la den stivne over natten ved 60 °C.
MERK: Ubehandlet er overflaten av herdet PDMS hydrofob, men med overflatebehandling kan den gjøres hydrofil. - For å forberede en hydrofil PDMS-overflate, belegg PDMS med en akrylamidpolymerbørste29. Dette trinnet forhindrer også proteiner i å feste seg til overflaten.
- Start med å rengjøre PDMS i 10 minutter med både etanol og isopropanol, skyll deretter grundig med avionisert vann 3x og tørk. Bruk en plasmarenser i 5 minutter for å rengjøre den tørre, herdede PDMS. Dette trinnet gjør overflaten mer hydrofil.
- Deretter fremstiller du en silanløsning (98,5 vekt% etanol, 1 vekt% eddiksyre og 0,5 vekt% trimetoksysilylpropylmetakrylat) og senker substratet i den løsningen i 15 minutter for å forberede seg på akrylamidbelegget. Skyll substratet grundig med avionisert vann og senk det ned i akrylamidoppløsning (2 vekt% akrylamid/bis-oppløsning, 2,3 mM TEMED og 3 mM ammoniumpersulfat).
MERK: Disse substratene kan oppbevares ved romtemperatur dekket av akrylamidoppløsning i et glass petriskål, og bør brukes innen 2 uker.
- Når den er klar til bruk, skyll overflaten med avionisert vann og tørk med nitrogen for umiddelbar bruk. Tilsett den aktive blandingen (beskrevet i trinn 2.1.6) i brønnene og tilsett umiddelbart silikonolje på toppen til en tykkelse på ca. 2 mm.
MERK: På dette stadiet vil den aktive blandingen bli klemt mellom oljen og det hydrofile belegget på PDMS, men det vil fortsatt være noe tredimensjonalt. - For å skyve materialet lenger inn i et 2D-lag, lim PDMS-enheten på et glassglass, legg den i en svingende bøtte sentrifuge og spinn i 12 minutter ved 212 x g. Enheten må plasseres slik at silikonoljen er på toppen av det vandige laget. Representative resultater er vist i figur 3.
- Klargjør polydimetylsiloksan (PDMS) ved hjelp av et elastomerherdemiddel og en elastomerbase (se materialtabell). Bland de to komponentene i forholdet 1:10 ved hjelp av en metallspatel. Små bobler vises under blanding som er vanskelig å fjerne, og blandingen virker melkeaktig. For å fjerne disse boblene, plasser blandingen under et vakuum til degas i 1 time, hvorpå den uherdede PDMS skal virke gjennomsiktig.
3. Forbereder aktiv nematikk i begrensede geometrier
MERK: Aktiv nematikk som dette kvasi-todimensjonale systemet kan være utfordrende å begrense til små mikrofluidiske geometrier som brønner eller kanaler. Her beskrives en pålitelig metode for å begrense materialet i forskjellige formede PDMS-brønner.
- Først må du designe en mesterform for PDMS. Dette kan oppnås ved å 3D-printe søyler på et underlag. Etter 3D-utskrift av harpiksmesterformen, rengjør med isopropanol og herd deretter formen under en UV-lampe i 45 minutter og i ovnen ved 120 °C i 2 timer (figur 4).
MERK: Herding under UV og termisk etterherding forbedrer kvaliteten på replikasjon i PDMS ved å fjerne monomerer og fotoinhibitorrester fra harpiksen30. - Bruk masterformen til å lage brønner fra PDMS. Klargjør PDMS som beskrevet i trinn 2.2.1. Senk mesterformen i uherdet PDMS og herd over natten i en ovn ved 60 °C.
- Etter at PDMS-herdingen er fullført, fjern forsiktig hovedformen og kutt PDMS etter ønske for å jobbe med brønnene (figur 4). Behandle PDMS-overflaten som beskrevet i trinn 2.2.3. Før eksperimentet kan overflaten festes til et glassglass med epoksylim for å gjøre bildebehandlingen enklere.
- Pipette 1 μL av den aktive blandingen beskrevet i trinn 2.1.6 på PDMS-substratet og tilsett umiddelbart silikonolje med 100-1000 cSt viskositet28 på toppen av den aktive nettverksdråpen. Det aktive nettverket vil bevege seg inn i brønnen; denne prosessen tar opptil 60 minutter (figur 4). Som beskrevet i trinn 2.2.5, kan 2D-nettverket forbedres ved å spinne ned PDMS-brønnen i den svingende bøttesentrifugen i 12 minutter ved 212 x g.
Representative Results
Figur 1 viser et representativt bilde av enkeltmikrotubuli fremstilt fra GMPCPP tubulin. Bildet viser korte mikrotubuli med lignende lengder (med en viss spredning til stede). Tilstrekkelig fortynning av mikrotubulioppløsningen skal gi et bilde av godt separerte mikrotubuli for lengdeverifisering. De enkelte mikrotubuli kan være utfordrende å avbilde på grunn av sin lille størrelse. Bruk av et høysensitivt kamera designet for fluorescensmikroskopi er best for denne applikasjonen. Figur 2 og figur 3 viser eksempler på fluorescensmikroskopibilder av vellykkede eksperimenter utført med henholdsvis flytcellemetoden (pkt. 2.1) og den inverterte metoden (pkt. 2.2). Et velformet aktivt nematisk lag er homogent i tekstur, uten signifikante tomromsområder og mobile topologiske defekter tilstede. Vær imidlertid oppmerksom på at det kan være noen akseptable små hulrom i defektkjernene. I tillegg til eksemplene vist i figur 2 og figur 3, er det tatt med tre tilleggsfilmer (film 1, film 2 og film 3) for å demonstrere hvordan den aktive nematikken skal fremstå i et vellykket eksperiment. Alle filmene demonstrerer den jevne kontinuerlige bevegelsen til den aktive nematiske fasen. Ingen variasjoner i konsentrasjonen av mikrotubuli er tydelige etter at materialet har nådd sin stabile tilstand. Så lenge tilstrekkelig ATP er tilstede i systemet, vil materialet fortsette å bevege seg jevnt.
Figur 1: Fluorescensmikroskopbilde av GMPCPP-mikrotubuli. GMPCPP-mikrotubuli ble merket til 4% med rhodamintubulin og polymerisert i 20 minutter ved 37 ° C. Avbildning ble utført ved romtemperatur. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikrotubulinematikk i en strømningscelle . (A) Tverrsnittsskjema for strømningscellen, 1 mm x 18 mm geometri. (B) Skjematisk toppvisning av flytcellen. (C) Fluorescensmikroskopibilde som viser det typiske utseendet til den aktive løsningen før montering ved olje/vann-grensesnittet. (D) Fluorescensmikroskopibilde av den aktive nematiske fasen montert ved olje / vann-grensesnittet inne i strømningscellen. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescensmikroskopbilde som viser en aktiv nematisk fremstilt med den inverterte metoden. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Flytskjema som illustrerer metoden for aktiv nematisk innesperring i en PDMS-brønn, inkludert formfabrikasjon og overflatebehandling. Skalalinje til høyre (begrenset aktivt materiale) = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Representativt resultat for aktiv nematisk fremstilt ved bruk av strømningscellemetoden. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Representativt resultat for aktiv nematisk fremstilt ved hjelp av den inverterte metoden. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: Representativt resultat for aktiv nematisk fremstilt ved hjelp av den inverterte metoden begrenset til en elliptisk brønn. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Discussion
Det er noen få punkter gjennom protokollene der eksperimentøren kan gjøre noen viktige kontroller. Før du fyller en av enhetene med aktivt materiale, bør fluorescensmikroskopi (se figur 1) brukes til å kontrollere at mikrotubuli er polymerisert og ideelt ~ 2-3 μm i lengde. Hvis mikrotubuli ikke er synlige under mikroskopet, kan de ha depolymerisert og den aktive nematiske vil ikke danne seg. Fordi individuelle mikrotubuli er svært små, kan det være utfordrende å observere dem direkte gjennom mikroskopet. I denne studien ble et fluorescenskamera av høy kvalitet designet for utfordrende applikasjoner med lite lys brukt med tilhørende programvare for å verifisere filamentvekst. Signifikante fluorescerende aggregater bør ikke være tilstede på dette stadiet, da dette kan indikere depolymerisering eller tilstedeværelse av denaturert protein. Det er også en god ide å lage et enkelt mikroskoptestskred ved å kombinere mikrotubuli, MIX og ATP i samme forhold som beskrevet i protokollene. Aktiviteten bør begynne på å kombinere komponentene, og materialet skal se ut som det som er vist i figur 2C med bunter tilstede og merkbare filamentbevegelser som er synlige overalt.
Ved bruk av strømningscellemetoden er sentrifugetiden og orienteringen av strømningscellen viktig for dannelsen av et jevnt aktivt lag. Dette trinnet kan kreve litt finjustering avhengig av sentrifugetypen som brukes. Sentrifugering av strømningscellen med det aktive planet orientert vinkelrett på rotasjonsplanet gir de beste resultatene, da materialet kan skyves jevnt på væskegrensesnittet. Dobbeltsjekk at strømningscellen er nøye forseglet før sentrifugering.
Når du bruker den inverterte metoden for å produsere begrenset aktiv nematikk, er det flere trinn for å optimalisere. For det første er det viktig å bruke en 3D-utskriftsmetode som produserer strukturer med høy oppløsning. Ujevne sidevegger kan føre til at mikrotubuli fanger, noe som vil forstyrre strømmen. Brønnene bør ikke være for dype (150-200 μm dype brønner med et 2 mm tykt overliggende oljelag ble brukt i denne studien). Eksperimenter må kanskje justere disse parametrene litt ved prøving og feiling for å få det beste resultatet.
Strømningscellemetoden og den omvendte metoden har blitt brukt av forskjellige forfattere for å se på en rekke effekter som påvirker de aktive strømmene, inkludert forskjellige oljer12 og nedsenkede strukturer13. Valg av metode avhenger av det eksperimentelle målet. Ved hjelp av strømningscellemetoden er optisk avbildning fra over det aktive laget klarere enn for den inverterte metoden på grunn av de forskjellige overliggende væskene. I strømningscellemetoden utføres avbildning gjennom en glassdekselslipp og et tynt lag vann, mens den omvendte metoden er designet for å ha oljelaget på toppen. Dette betyr at et langdistansemål er nødvendig for den inverterte metoden, og bildekvaliteten reduseres. Bildekvalitetsforskjeller kan sees ved å sammenligne figur 2D (flytcellemetode) og figur 3 (invertert metode), og henholdsvis film 1 og film 2. Et lavere forstørrelsesobjektiv med lengre arbeidsavstand var nødvendig for figur 3 enn det som ble brukt for figur 2. Disse avbildningsulempene for den inverterte metoden kan unngås hvis et passende invertert mikroskop er tilgjengelig, kombinert med mål med passende arbeidsavstand for mikroskopets glideunderlag. Tynnere glass kan brukes som substrat for å tillate bruk av standard arbeidsavstandsmål.
Som en fordel tillater den inverterte geometrien bruk av et bredere spekter av oljeviskositeter, krever ikke nødvendigvis svingende bøtte sentrifugering (hvis dette ikke er tilgjengelig), og forberedelse av systemet er relativt enklere når formen er forberedt. For innesperring i brønner ved hjelp av den inverterte metoden kan imidlertid noe sentrifugering være viktig for å få materialet inn i et veldefinert 2D-lag.
Strømningscellemetoden har nylig blitt brukt svært vellykket i eksperimenter der et kontinuerlig aktivt lag er nødvendig. Vårt siste arbeid har sett på dynamikken i topologiske defekter i det aktive laget, hvor høykvalitets bildebehandling og teksturanalyse er viktig19. I tillegg har strømningscellemetoden blitt brukt til å undersøke effekten av oljesenkede mikrostrukturer på aktive strømmer16 og søyler for å fange defekter i de aktive strømmene31. Denne metoden fungerer veldig bra for dannelsen av et kontinuerlig aktivt lag, og bildekvaliteten er utmerket. Imidlertid kan sentrifugeringstrinnet som brukes til å produsere det endelige 2D-aktive laget være vanskelig å utføre, og strømningscellene er utsatt for lekkasjer og luftbobler. Den omvendte metoden er et veldig nyttig alternativ med høy suksessrate, er enkel å konstruere, og kan brukes til ethvert substratmønster eller geometri forutsatt at en høyoppløselig 3D-trykt hovedform kan opprettes. Denne metoden er også nyttig for å se på effekten av geometrisk inneslutning på aktiv nematisk dynamikk fordi den gjør fyllingsbrønner relativt enkle.
I dette papiret beskrives to måter å danne en aktiv nematikk fra mikrotubuli og kinesinmotorer, pluss en teknikk for å begrense materialene i brønner. Systemet som presenteres representerer det reneste eksempelet på en aktiv nematisk fase som for tiden er i litteraturen og har blitt reprodusert av flere grupper rundt om i verden. Betydningen av dette materialet ligger ikke bare i den biologiske opprinnelsen til komponentene, men også fordi den åpner en helt ny retning i aktive bestilte væsker. Ved å jobbe med dette systemet og belyse dets grunnleggende egenskaper, kan forskere bevege seg mot utformingen av helsyntetiske aktive faser.
Forsøkene fokusert på effekten av inneslutning på aktiv nematikk har potensial til å svare på grunnleggende spørsmål angående oppførselen til aktive strømmer og topologisk defektdynamikk under topologisk inneslutning. Metoden som presenteres her vil hjelpe til med utførelsen av en rekke geometrifokuserte eksperimenter og deres analyse, inkludert mikrofluidikk og aktiv blanding.
Disclosures
Noen materialer som ble brukt i dette arbeidet ble levert gratis av Cytoskeleton Inc (Denver, USA).
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne National Science Foundation (NSF) prisen DMR-1808926 for sjenerøs finansiering. Prosjektet ble også støttet av NSF gjennom Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines ved University of California Merced (HRD-1547848) og Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Vi vil gjerne takke Dr. Bin Liu ved University of California Merced for hjelp med 3D-utskrift av formen, og Dr. Jordi Ignes for vitenskapelig rådgivning under utviklingen av den omvendte eksperimentelle metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
- Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria. Physics Review Letters. 98 (15), 158102 (2007).
- Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
- Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).
- Toner, J., Tu, Y. Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together. Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).
- Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).
- Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).
- Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).
- Memarian, F. L., et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).
- Bausch, A., Sciortino, A. R. Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).
- Maroudas-Sacks, Y., et al. Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis. Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).
- Liu, J., et al. Topological braiding and virtual particles on the cell membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).
- Hirst, L. S. Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed. , CRC Press. (2019).
- Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S.
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8, 564 (2017).
- Thijssen, K., et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).
- Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. Dancing disclinations in confined active nematics. Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).
- Giomi, L. Geometry and topology of turbulence in active nematics. Physical Review X. 5 (3), 031003 (2015).
- Tan, A. J., et al.
- Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod. The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
- Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli. Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).
- Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. Kinesin Protocol. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).
- Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments. Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).
- Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature. Journal of Visualized Experiments. (153), e60484 (2019).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. Microtubules. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. Probing the shear viscosity of an active nematic film. Physical Review E. 94 (6), 060602 (2016).
- Rudy, A., et al. Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS). Tribology Letters. 65, 3 (2017).
- Venzac, B., et al. PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it. Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).
- Khaladj, D. A., Hirst, L. S. Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows. Frontiers of Physics. 10, 880941 (2022).
