Summary
描述了清醒的固定头大鼠功能成像的详细新程序。
Abstract
麻醉剂通常用于临床前和基础科学研究，对大脑的代谢、神经元和血管功能有抑制作用，并可能对神经生理学结果产生不利影响。使用清醒的动物进行研究是有利的，但带来了保持动物平静和静止的主要挑战，以最大限度地减少整个数据采集过程中的运动伪影。在较小尺寸的啮齿动物（例如小鼠）中，清醒成像非常常见，但在大鼠中仍然很少，因为大鼠更大，更强壮，并且在成像所需的长时间内更倾向于反对运动限制和头部固定。描述了使用定制的手工缝制吊带，3D打印头部植入物，头帽和头架的清醒，头部固定大鼠的神经成像新模型。单次单须刺激试验后获得的结果表明诱发功能反应的强度增加。从清醒的固定头部大鼠获得诱发的功能反应比从麻醉大鼠获得更快，可靠，可重复，可用于重复的纵向研究。
Introduction
大多数基础、临床前和转化科学神经影像学研究都是从麻醉动物身上获得的1，2。麻醉剂简化了实验，但不断影响大脑和身体的新陈代谢、血压和心率3.麻醉剂的类型以及给药的持续时间和途径为数据解释增加了混杂变量，这可能导致可重复性和转化失败4。清醒，头部固定大鼠神经影像学研究的一个主要瓶颈是需要在整个制备和数据采集过程中保持大鼠静止和平静。小动作会产生不必要的运动伪影，这可能会对数据分析和解释产生不利影响。
已经设计了一种来自清醒的头部固定大鼠的神经成像新模型，使用定制的吊带，三维（3D）打印的头部植入物，头帽和头架，该模型为易于实验提供了多种优势。3D头部植入物很轻，覆盖了转固定所需的一小部分颅骨。3D打印的头部植入物和帽子是使用计算机辅助设计（CAD）软件设计的。晶须刺激，数据采集，数据分析和麻醉大鼠结果的方案已在以前的工作5，6，7中详细描述。
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Protocol
所有程序均符合美国国立卫生研究院的指导方针，并得到加州大学欧文分校动物护理和使用委员会的批准。本研究使用了七只雄性和一只雌性大鼠（Sprague-Dawley，体重：185-350克）。研究完成后，使用二氧化碳过量处死大鼠。
1. 不同组件的设计
- 头部植入物的设计：
- 使用CAD软件（图1C）制作头部植入物，并将其设计为对前膛后方和与躯体感觉皮层为中心的中线相邻的区域进行成像。确保头部植入物覆盖颅骨上远离成像区域的 0.9 mm 至 1.9 mm 区域。
- 只需三个螺钉即可将头部植入物固定在大鼠的头骨上。设计所有螺丝孔，使它们保持在成像半球对侧半球中线的另一侧。
- 在头部植入物的上部放置一根从内部挖空的杆，让电线将头帽固定在头部植入物上，如图 1D 所示。
- 头盖设计：
- 确保头帽完全覆盖成像区域，并保护其免受任何类型的创伤，如图 1A，B所示。在头盖上添加一个曲率，使其与头部的形状对齐，而不会给动物在标准浓缩笼中的日常活动带来困难。
- 将头罩的内侧切成更宽的矩形形状，以便头部植入物的上部可以放入其中，如图 1E 所示。垂直于这个矩形，切割另外两个矩形区域，将头盖固定在头部植入物上。
- 将一根导线穿过头部植入物的上空心杆，将头帽固定在大鼠头上，如图1E-G所示。以相同的方式通过第二根电线。
注意：这些电线可以使用钳子或镊子轻松移除。3D打印文件（文件格式：STL）作为补充 文件1 和 补充文件2提供。
- 头架设计：
- 设计头部框架的方式是，一个切割部分可以穿过头部植入物的上杆，并使用夹子固定。
- 倾斜另一个切割部分以提供额外的强度以保持大鼠头部固定，以使对侧完全可进行成像。出于本研究的目的，用锡剪切割钢板以产生头架（图1H，I）。
注意：这部分也可以3D打印。
2. 初始大鼠训练
- 让大鼠在笼子里适应动物饲养环境2-3天。
- 开始在一个安静的房间里处理老鼠。打开笼子，让实验者把手放在大鼠附近的笼子里15-20分钟，让大鼠习惯。
- 一旦老鼠表现出平静，没有受到惊吓或从实验者的手中逃跑，轻轻地把老鼠抱起来处理。每天在吊带训练前处理大鼠 30-45 分钟。
3. 吊带训练
- 在手术植入头部植入物和头帽之前，在吊带中训练大鼠至少2-3天。
- 如图 2A所示安排吊索设置。使用乙醇湿巾清洁吊带设置。
注意：所有吊索都是手工缝制的，底部或两侧均由网状材料制成，如图 2A、B 所示。 - 对于吊带训练，使用4%异氟醚进行诱导和1%维持麻醉大鼠，直到没有后爪捏反射。
- 在异氟醚麻醉下，将大鼠放在20cm x 8cm（长x宽）的柔性塑料片上，其中10cm x 8cm的塑料片完全覆盖有魔术贴的较软部分。
注意：麻醉大鼠进行吊带训练是一个可选步骤，主要用于减轻压力和焦虑。 - 在训练的前2天，将大鼠紧紧地放入婴儿袜子（0-3个月大小）中，头部通过袜子末端切开的小孔伸出。
- 在下半身部位缠上一小块吸收垫，以保持老鼠干燥并收集排泄物。
- 用透气的棉布（尺寸：25厘米x 25厘米）包裹老鼠。将老鼠放在粘有魔术贴条的塑料布上。
- 使用0.5厘米宽的魔术贴条进一步将大鼠固定在塑料片上，彼此相距3-6毫米。
- 将老鼠固定在吊索中。取出气体麻醉。让大鼠从吊带中的气体麻醉中恢复过来。
- 当大鼠开始搅拌时，每10-15分钟提供几滴10%蔗糖溶液作为奖励。
- 随机向大鼠呈现将在成像期间使用的感官刺激（此处为晶须刺激，每15-25分钟一次），以使其习惯感官刺激。以随机间隔手动刺激晶须。
- 如图 2C所示，在第1天训练大鼠在吊带中1小时，在第2天训练2小时，在第3天训练3小时。
4.术前准备
- 使用3D打印机打印头部植入物和头帽（图1）。
- 通过将设备浸入 Metricide28 杀菌剂中 10 小时，对所有手术器械和头件（植入物和帽子）进行消毒。手术前用无菌水彻底冲洗工具。
- 将大鼠暴露于4%异氟醚，然后保持在1%-2%异氟醚，直到没有后爪捏反射。这种手术可以在多种类型的麻醉下进行，例如异氟醚、戊巴比妥钠和氯胺酮-甲苯噻嗪。
- 肌内注射阿托品 （0.05 mg/kg），以减少粘液分泌物，帮助呼吸。
- 使用从眼睛之间到耳朵后部的理发器以中线为中心剃掉大鼠的头部 5 毫米。
- 通过固定在大鼠后腿上的脉搏血氧仪和心率监测器探头监测氧分饱和度和心率。
- 用甜菜碱和70%酒精湿巾交替擦拭老鼠的头部和周围区域三次。
- 将大鼠固定在立体定位系统中。
- 插入凡士林润滑的直肠探头以测量大鼠的体温，并通过加热毯的反馈系统保持体温，以避免麻醉给药后体温过低。
- 在手术部位皮下注射浓度为20mg / ml，0.07mg / kg + /-0.2体重的局部麻醉剂盐酸利多卡因。
- 在双眼上涂抹眼药膏以防止干燥。
- 在手术部位皮下注射 2% 的局部麻醉剂。
- 在室温下皮下注射 3 mL 乳酸林格氏液，以防止脱水并在手术过程中提供营养。
5. 手术
- 使用锋利的手术剪刀去除手术部位上的皮肤部分（直径4毫米，以中线和头部中心为中心）。解剖并去除头部颞部耳朵和眼睛之间的部分皮肤（~2 mm直径，在左侧躯体感觉皮层上）。
- 使用手术刀切除下面的皮肤（颅周）组织以露出颅骨。使用无菌棉纱布清洁头骨。
- 回缩/切除颞肌以暴露成像区域所需的尺寸[本研究为 7.5 mm x 7.5 mm]。
- 将头骨暴露在对侧半球上以进行头部植入物。将头部植入物放在颅骨上以确定植入物锚固螺钉的位置，如图2D-F所示。
- 使用带有钻头 1 的印度墨水标记用于钻螺钉的头骨。使用牙钻头 3 钻螺钉的毛刺孔。将头部植入物拧到位。
- 使用无菌纱布擦干头骨。在头部植入物周围和下方涂上一层薄薄的组织粘合剂，将其粘在颅骨上。涂上一层牙科水泥以进一步支撑头部植入物到位，让水泥干燥2-3分钟。
注意：除牙科水泥外，还使用纸巾粘合剂可确保牢固的固定力8. - 使用牙钻头 3，在颅骨左侧的后方和中线的外侧细化 7.5 mm x 7.5 mm 的区域。如图 3A所示，将头骨薄至~50μm。
- 在手术部位涂抹局部抗生素软膏，然后用一层薄薄的硅橡胶覆盖以保护变薄的颅骨，如图3B所示。使用头帽覆盖手术部位，如图3C所示。用穿过头部植入物和头帽的两小根电线将其固定到位，如图 3D 和 E 所示。应用硅橡胶覆盖头帽和头骨，以将头盖进一步稳定在大鼠的头部，如图3F所示。
注意：硅橡胶为变薄的头骨提供额外的保护。 - 皮下注射氟尼辛葡甲胺（2.5mg / kg）用于疼痛和炎症管理。为预防感染，腹腔注射恩诺沙星抗生素恩诺沙星（22.7mg/ml，10mg/kg +/-.01）。
- 将大鼠移至恢复室，用加热毯和加热灯帮助保持体温。持续监测大鼠，直到它恢复意识并可以保持胸骨卧位。
- 一旦老鼠完全恢复，将它放回单独的笼子里。
- 在接下来的 3 天里，给予氟尼辛和丁丙诺啡以缓解炎症和疼痛，并入组以预防感染，每日两次。
6. 清醒成像
- 当没有后爪捏反射时，用4%异氟醚麻醉大鼠进行诱导，1%用于维持。皮下注射乙酰丙嗪（0.3-0.5 mg/kg）。
注意：这种浓度的乙酰丙嗪低于轻度镇静水平，仅有助于在整个成像过程中保持大鼠平静。 - 使用定制的魔术贴条，将大鼠固定在训练过程中使用的塑料布上。使用吸收垫包裹下半身，并将大鼠紧紧地放在吊带中。
- 取出硅橡胶。通过取下固定线来取下头盖。如图 2G所示，将头架固定在头部植入物中。
- 将头架锁定在夹子中，如图 2H，I所示。
- 去除气体麻醉。用生理盐水冲洗成像区域3倍，并用湿纱布清洁。干燥成像区域，并使用凡士林在成像区域周围打一个孔。用无菌盐水填充孔，并用载玻片盖住（图2E）。
- 请参阅本征信号光学成像的采集程序、晶须刺激协议以及数据分析和呈现，这些程序已在前面详细讨论过6，7。
- 在整个实验过程中，监测大鼠的激动和不安的迹象，可以通过用软布或纱布（可选）覆盖大鼠的眼睛来进一步减少。
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Representative Results
显示了来自麻醉大鼠单次试验的代表性光学成像信号和清醒大鼠的总和反应（40项收集的试验）（图4）。清醒大鼠单须刺激的信号强度可以在比麻醉大鼠更高的阈值下可视化，显示出来自清醒动物的更强信号。以5Hz刺激大鼠的C2胡须1秒，并且功能反应显示为与基线相比的分数变化。较暗的区域（低于负阈值）是神经元活动的主要区域，明亮的白色区域（高于正阈值）显示含氧血液对刺激的反应9。图像对齐，以便从左到右是从嘴部到尾部（C），从上到下是从内侧到外侧（L）方向，如箭头所示。
图 1：头帽、头部植入物和头部框架。 （A）头帽（顶视图）：顶视图的侧面显示沿头部曲率对齐以保护头部的曲率;两个镂空矩形部件用于金属线穿过头盖。（B） 头帽（底视图）显示较宽的矩形切口以适合头部植入物的顶杆，以及两个垂直切口，用于电线穿过植入物和头帽以将其固定到位。（C）头部植入物，带有三个用于锚固螺钉的切孔。头部植入物上的锚固螺钉的位置可以根据大鼠的头部进行调整。（D） 头帽和头部植入物（侧视图）;头部植入物的侧视图显示了从内部挖空的矩形杆，以允许电线穿过以将头盖固定到头部植入物上。（E-G）通过一根钢丝固定在头盖上的头部植入物视图;底视图、侧视图和顶视图，以显示头部植入物如何安装在头罩内。（H）头部框架，（I）头部植入物固定在头部框架中。刻度上的两条线之间的距离（如蓝色矩形所示）为 1 毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：吊带、头部植入物和头架固定，用于清醒、头部固定成像。 （A，B） 定制吊索，带网状材料，仅用于底部或两侧;（C）将大鼠放在塑料片上，用魔术贴条固定，进行吊带训练;（D-F） 对侧半球上方大鼠头骨上头部植入物的顶视图和侧视图。虚线显示成像区域。顶视图和侧视图清楚地显示了三个孔，用于用锚固螺钉将头部植入物固定到颅骨上。（E）侧视图显示了空心杆，当大鼠未成像时，电线通过该空心杆将头帽固定在头部植入物上。头架的一条腿穿过头部植入物的中空部分，用于对大鼠皮层进行成像。（G）通过头部植入物的头部框架，用于清醒的头部固定大鼠。（H）通过头部植入物的头部框架，其两条腿夹紧，以便在成像会议期间对清醒的头部固定大鼠进行清醒的头部固定成像（I）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：头部植入物放置 。 （A）用于清醒，头部固定成像的薄颅骨准备。（B）头部植入物固定在大鼠头骨上，薄颅骨成像区域覆盖有橡胶硅胶。（C）头帽放置在头部植入物上。（D，E）头帽使用涂层金属线固定在头部植入物上。（F）头帽和周围区域覆盖有橡胶硅胶，以进一步支撑颅骨的固定和保护。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：C2 晶须刺激的功能反应。 （A） 5 Hz C2 晶须刺激的代表性单项试验功能反应，持续 1 秒清醒、头部固定大鼠成像，每次试验持续 7 秒，试验间隔为 3 秒± 2 秒。从基线开始分数变化的灰度表示阈值（−3.5 × 10−3 到 3.5 × 10−3）。（B）麻醉（戊巴比妥钠）大鼠5Hz C2晶须刺激1秒的代表性单项试验功能反应。从基线开始分数变化的灰度表示阈值（−2.5 × 10−4 到 2.5 × 10−4）。清醒的固定头部大鼠的功能反应比麻醉大鼠强140倍。每帧为 0.5 秒帧。图像对齐，以便从左到右是从嘴部到尾部，从上到下是从内侧到横向，如箭头所示。较暗的区域（低于负阈值）是神经元活动的主要区域，明亮的白色区域（高于正阈值）显示含氧血液对刺激的反应。比例尺 = 1 毫米。 缩写：C = 尾部;L = 横向。请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：头部植入物的3D打印文件。请点击此处下载此文件。
补充文件2：头帽的3D打印文件。请点击此处下载此文件。
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Discussion
使用清醒的头部固定大鼠成像在易用性和定制方面具有许多优势。定制设计的吊索允许通过透气的网材料包裹大鼠，无需将动物长时间封闭在封闭的塑料约束室中10，11。在连续成像会话的长时间内，使用非常低剂量的乙酰丙嗪低于大鼠轻度镇静水平（1.0-2.5mg / kg）12，使大鼠保持冷静和无压力。为了保持大鼠稳定并在成像过程中进一步消除运动伪影，使用了魔术贴条。魔术贴条彼此相距 3-6 毫米，以避免长时间不必要的身体收缩。大鼠在很小的时候就被训练并习惯于吊带，以确保它们在准备和数据采集期间保持平静和舒适的休息。根据初步结果，体重约150-175克的年轻大鼠比老年大鼠更容易和更快地训练。
大鼠头上的头部植入物仅重0.174克，可拆卸头帽重1.483克。头部植入物覆盖一个半球上 0.5 cm 至 1.5 cm 的区域，允许另一个半球完全可及以进行神经成像。头帽的尺寸可确保完全覆盖手术部位。头部植入物和头帽的重量似乎不会妨碍活动和日常活动，并且可以将大鼠一起安置在标准笼子中。使用这种头部和身体约束方法，可以在不同的日子里每次对大鼠进行2-3小时的成像以进行纵向研究。使用此设置，可以在一只大鼠上进行多次成像会话至少长达 3 个月。3D打印头部植入物和头盖总共需要25分钟。这些部件可以根据啮齿动物的大小轻松定制，也可以定制用于小鼠。对于需要区分大鼠的研究，不同的颜色和材料可以提供容易的识别。此外，可以定制盖子的顶部以添加符号、数字或字母，以便于识别。
成功植入和成像有几个重要步骤，其中最重要的是大鼠的训练和习惯化。随机向大鼠呈现感官刺激，以尽量减少联想学习的可能性，这可能会影响成像结果。手术和所有手术器械都需要无菌以防止感染，并且必须使用当地的抗生素。在成像开始时使用乙酰丙嗪对于保持动物冷静和安静以避免成像过程中不必要的运动非常重要。大鼠的头骨需要干燥才能正确固定，沉积的牙科水泥层需要足够薄，以使头帽适合头部植入物。
对于目前的研究，成像区域以躯体感觉皮层为中心。变薄区域约为 7.5 mm x 7.5 mm，这是当前研究中可以成像的区域范围。但是，如果需要，成像区域可以增加到11 mm x 11 mm。这种设计的另一个优点是，尽管皮层曲率，它允许对整个变薄的区域进行成像。
先前报道的头部植入物需要近7-12个锚固螺钉才能将头部植入物固定在大鼠的头部13，14上。这排除了通过变薄的颅骨准备对更大区域进行成像的可能性。另一种固定方法需要使用头部螺钉将树脂材料固定在大面积上，使颅骨无法成像14。使用MRI对大鼠进行清醒成像需要将动物固定在圆柱形管中，使动物的成像经历压力大11，15。在其他一些设置中，头部植入物从头部突出，可能会缠绕在标准笼子 16，17 中。头部植入物和头帽消除了固定载玻片和扁平薄颅骨用于慢性成像的使用18，19。头部植入物的尺寸和头盖曲率的使用消除了像其他慢性手术那样改变标准笼的需要18，19。小鼠的头部植入更容易，因为只使用单个螺母和螺钉配置，这在大鼠中是不可能的，因为大鼠更强壮并且更难保持稳定20。
头部植入物的局限性在于，尽管其尺寸很小，但它需要使用螺钉将植入物固定在颅骨上。头部植入物对于保持动物头部稳定是必要的，但限制了整个大鼠大脑的成像。然而，使用这种头部植入物的一个优点是，它可用于使用各种神经成像方式（如固有信号光学成像、多普勒光学相干断层扫描和激光散斑成像）对更广泛的诱发感觉刺激区域进行成像。
基于清醒的头部固定大鼠的内在信号的皮质功能表征往往比使用相同的晶须刺激方案的麻醉大鼠更强。据报道，在清醒的猴子中诱发的内在信号反应强度也有类似的增加21，22。目前正在努力改进头部植入物和头帽设计，以适应更具挑战性的环境，例如自然栖息地23。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Clara Jones，James Stirwalt，Linh Hoang，Young Joon Ha和Amirsoheil Zareh在训练老鼠和准备吊索期间提供的帮助。资金由美国国立卫生研究院（NIH，批准号：NS119852）和Leducq基金会（批准号：15CVD02）提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
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