Summary
Une nouvelle procédure détaillée pour l’imagerie fonctionnelle de rats éveillés et fixés à la tête est décrite.
Abstract
Les anesthésiques, couramment utilisés dans la recherche préclinique et scientifique fondamentale, ont une influence dépressive sur les fonctions métaboliques, neuronales et vasculaires du cerveau et peuvent influencer négativement les résultats neurophysiologiques. L’utilisation d’animaux éveillés pour les études de recherche est avantageuse, mais pose le défi majeur de garder les animaux calmes et immobiles pour minimiser les artefacts de mouvement tout au long de l’acquisition de données. L’imagerie éveillée chez les rongeurs de petite taille (p. ex. souris) est très courante, mais reste rare chez les rats, car les rats sont plus gros, plus forts et ont une plus grande tendance à s’opposer aux contraintes de mouvement et à la fixation de la tête pendant les longues durées requises pour l’imagerie. Un nouveau modèle de neuroimagerie de rats éveillés et fixés à la tête à l’aide d’élingues cousues à la main, d’implants de tête imprimés en 3D, de casques et d’un chevalement est décrit. Les résultats obtenus à la suite d’un seul essai de stimulation à moustache unique suggèrent une augmentation de l’intensité de la réponse fonctionnelle évoquée. L’acquisition de la réponse fonctionnelle évoquée chez des rats éveillés fixés à la tête est plus rapide que celle des rats anesthésiés, fiable, reproductible et peut être utilisée pour des études longitudinales répétées.
Introduction
La plupart des examens scientifiques de neuroimagerie fondamentale, préclinique et translationnelle sont acquis à partir d’animaux anesthésiés 1,2. Les anesthésiques facilitent l’expérimentation, mais influencent continuellement le métabolisme, la pression artérielle et la fréquence cardiaque du cerveau etdu corps 3. Le type d’anesthésique ainsi que la durée et la voie d’administration ajoutent des variables confusionnelles à l’interprétation des données qui pourraient contribuer à la reproductibilité et aux échecs translationnels4. Un goulot d’étranglement majeur des études de neuroimagerie de rat éveillées et fixées sur la tête est la nécessité de garder le rat immobile et calme tout au long des processus de préparation et d’acquisition de données. De petits mouvements produisent des artefacts de mouvement injustifiés, qui peuvent nuire à l’analyse et à l’interprétation des données.
Un nouveau modèle de neuroimagerie à partir de rats éveillés et fixés à la tête à l’aide d’élingues personnalisées, d’implants de tête imprimés en trois dimensions (3D), de casques et d’un chevalement a été conçu qui offre plusieurs avantages pour une expérimentation facile. L’implant de tête 3D est léger et couvre une petite partie du crâne nécessaire à la transfixation. Les implants de tête et les capuchons imprimés en 3D sont conçus à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Les protocoles de stimulation des moustaches, d’acquisition de données, d’analyse de données et les résultats de rats anesthésiés ont été décrits en détail dans des travaux antérieurs 5,6,7.
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Protocol
Toutes les procédures étaient conformes aux directives du National Institute of Health et approuvées par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Irvine. Sept rats mâles et une femelle (Sprague-Dawley, poids: 185-350 g) ont été utilisés dans cette étude. Une fois l’étude terminée, les rats ont été sacrifiés en utilisant une surdose de dioxyde de carbone.
1. Conception des différents composants
- Conception de l’implant de tête :
- Réalisez l’implant de tête à l’aide d’un logiciel de CAO (Figure 1C) et concevez-le de manière à imager la zone postérieure au bregma et adjacente à la ligne médiane centrée sur le cortex somatosensoriel. Assurez-vous que l’implant de tête couvre une zone de 0,9 mm à 1,9 mm sur le crâne, loin de la zone d’imagerie.
- Utilisez seulement trois vis pour ancrer l’implant de tête sur le crâne du rat. Concevez tous les trous de vis de manière à ce qu’ils restent du côté opposé de la ligne médiane dans l’hémisphère controlatéral de l’hémisphère imagée.
- Placez une barre, creusée de l’intérieur, dans la partie supérieure de l’implant de tête pour permettre aux fils de fixer le capuchon de tête à l’implant de tête, comme illustré à la figure 1D.
- Conception de l’embout :
- Assurez-vous que le capuchon couvre complètement la zone d’imagerie et la protège de tout type de traumatisme, comme le montre la figure 1A, B. Ajoutez une courbure au capuchon de tête afin qu’il s’aligne sur la forme de la tête sans causer de difficulté aux activités quotidiennes de l’animal dans les cages aménagées standard.
- Coupez la face interne du capuchon de tête dans une forme rectangulaire plus large afin que la partie supérieure de l’implant de tête puisse s’y insérer, comme le montre la figure 1E. Perpendiculairement à ce rectangle, coupez deux autres régions rectangulaires pour ancrer le capuchon de tête à l’implant de tête.
- Passez un fil à travers la barre supérieure creusée de l’implant de tête pour la fixation du capuchon de tête sur la tête du rat, comme le montre la figure 1E-G. Passez le deuxième fil de la même manière.
REMARQUE: Ces fils peuvent être facilement retirés à l’aide de pinces ou de pinces. Les fichiers d’impression 3D sont fournis (format de fichier: STL) en tant que fichier supplémentaire 1 et fichier supplémentaire 2.
- Conception du chevalement de la tête :
- Concevez le cadre de tête de manière à ce qu’une pièce coupée puisse se déplacer à travers la barre supérieure de l’implant de tête et soit fixée à l’aide d’une pince.
- Inclinez l’autre partie coupée pour fournir une force supplémentaire pour garder la tête du rat fixée afin de rendre le côté controlatéral complètement accessible pour l’imagerie. Aux fins de la présente étude, couper la plaque d’acier avec des morceaux d’étain pour produire le chevalement (figure 1H, I).
REMARQUE: Cette pièce peut également être imprimée en 3D.
2. Formation initiale des rats
- Permettez aux rats de s’acclimater à l’environnement du vivarium dans leurs cages pendant 2-3 jours.
- Commencez à manipuler le rat dans une pièce calme. Ouvrez la cage et demandez à l’expérimentateur de mettre sa main à l’intérieur de la cage près du rat pendant 15-20 minutes pour laisser le rat s’habituer.
- Une fois que le rat fait preuve de calme en ne se faisant pas sursauter ou en ne fuyant pas les mains de l’expérimentateur, ramassez doucement le rat pour le manipuler. Manipulez le rat pendant 30 à 45 minutes chaque jour avant l’entraînement à l’élingue.
3. Formation à l’élingue
- Entraînez les rats pendant au moins 2-3 jours dans les écharpes avant l’implantation chirurgicale de l’implant de tête et du capuchon de tête.
- Organisez la configuration de l’élingue comme illustré à la figure 2A. Nettoyez la configuration de l’élingue à l’aide de lingettes à l’éthanol.
NOTA : Toutes les élingues sont cousues à la main et faites d’un matériau de filet sur le fond ou des deux côtés, comme le montre la figure 2A, B. - Pour l’entraînement à l’élingue, anesthésier les rats en utilisant 4 % d’isoflurane pour l’induction et 1 % pour l’entretien jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de réflexe de pincement de la patte postérieure.
- Sous anesthésie à l’isoflurane, placer les rats sur une feuille de plastique souple mesurant 20 cm x 8 cm (longueur x largeur), où 10 cm x 8 cm de la feuille de plastique est entièrement recouverte de la partie la plus molle du velcro.
REMARQUE: L’anesthésie des rats pour l’entraînement à l’élingue est une étape facultative, principalement utilisée pour réduire le stress et l’anxiété. - Pendant les 2 premiers jours de la formation, mettez le rat confortablement dans une chaussette pour bébé (taille 0-3 mois) avec la tête sortie à travers un petit trou incisé au bout de la chaussette.
- Enroulez un petit morceau de tampon absorbant autour de la partie inférieure du corps pour garder le rat au sec et recueillir les excréments.
- Enveloppez le rat dans un chiffon en coton respirant (taille: 25 cm x 25 cm). Placez le rat sur une feuille de plastique sur laquelle sont collées des bandes Velcro.
- Fixez davantage le rat à la feuille de plastique à l’aide de bandes velcro de 0,5 cm de large à une distance de 3 à 6 mm les unes des autres.
- Fixez le rat dans l’écharpe. Retirez l’anesthésie gazeuse. Laissez le rat récupérer de l’anesthésie au gaz dans l’élingue.
- Lorsque le rat commence à fouetter, offrez quelques gouttes de solution de saccharose à 10% en récompense toutes les 10-15 minutes.
- Présentez au hasard au rat les stimuli sensoriels qui seront utilisés lors de l’imagerie (ici la stimulation des moustaches, toutes les 15-25 minutes) pour le rendre habitué aux stimuli sensoriels. Stimulez manuellement les moustaches à intervalles aléatoires.
- Entraînez le rat dans l’élingue pendant 1 h le jour 1, 2 h le jour 2 et 3 h le jour 3, comme le montre la figure 2C.
4. Préparation préchirurgicale
- Imprimez l’implant de tête et le capuchon à l’aide de l’imprimante 3D (Figure 1).
- Stérilisez tous les instruments chirurgicaux et les coiffes (implants et capuchons) en immergeant l’équipement dans le germicide Metricide28 pendant 10 heures. Rincez soigneusement les outils à l’eau stérile juste avant la chirurgie.
- Exposer le rat à 4 % d’isoflurane, puis maintenir à 1 % à 2 % d’isoflurane jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de réflexe de pincement de la patte postérieure. Cette chirurgie peut être réalisée sous de nombreux types d’anesthésie, tels que l’isoflurane, le pentobarbital sodique et la kétamine-xylazine.
- Injectez de l’atropine (0,05 mg / kg) par voie intramusculaire pour réduire les sécrétions muqueuses afin d’aider à respirer.
- Rasez la tête du rat de 5 mm centrée autour de la ligne médiane à l’aide d’une tondeuse à cheveux partant d’entre les yeux jusqu’à l’arrière des oreilles.
- Surveillez la saturation partielle en oxygène et la fréquence cardiaque à l’aide d’un oxymètre de pouls et d’une sonde de moniteur de fréquence cardiaque fixés à la patte arrière du rat.
- Essuyez la tête du rat et la zone environnante trois fois avec une alternance de séries de bétadine et de lingettes alcoolisées à 70%.
- Fixez le rat dans un système stéréotaxique.
- Insérez une sonde rectale lubrifiée à la vaseline pour mesurer la température corporelle du rat et maintenez-la grâce au système de rétroaction de la couverture chauffante pour éviter l’hypothermie après l’administration d’anesthésiques.
- Administrer du chlorhydrate de lidocaïne anesthésique local à une concentration de 20 mg / ml, 0,07 mg / kg +/- 0,2 poids corporel par voie sous-cutanée au site chirurgical.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement.
- Administrer 2% d’anesthésique local par voie sous-cutanée sur le site chirurgical.
- Injectez 3 mL de solution de sonnerie lactate à température ambiante par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation et nourrir pendant la chirurgie.
5. Chirurgie
- Retirez la partie de la peau sur le site chirurgical (4 mm de diamètre centré autour de la ligne médiane et du centre de la tête) à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants. Disséquer et enlever une partie de la peau (~2 mm de diamètre, sur le cortex somatosensoriel gauche) entre l’oreille et l’œil sur la partie temporale de la tête.
- Enlevez, à l’aide d’un scalpel, le tissu sous-jacent de la peau (péricrâne) pour exposer le crâne. Nettoyez le crâne à l’aide de gaze de coton stérilisée.
- Rétracter / réséquer le muscle temporal pour exposer la taille souhaitée pour la zone d’imagerie [7,5 mm par 7,5 mm pour cette étude].
- Exposez le crâne sur l’hémisphère controlatéral pour l’implant de tête. Placez l’implant de tête sur le crâne pour déterminer l’emplacement des vis d’ancrage de l’implant, comme illustré à la figure 2D-F.
- Marquez le crâne pour percer les vis à l’aide d’encre de Chine avec foret 1. Percez les trous de bavure pour les vis à l’aide du foret dentaire 3. Vissez l’implant de tête en place.
- Sécher le crâne à l’aide de gaze stérile. Appliquez une fine couche d’adhésif tissulaire autour et sous l’implant de tête pour le coller au crâne. Appliquez une couche de ciment dentaire pour soutenir davantage l’implant de tête en place et laissez le ciment sécher pendant 2-3 min.
REMARQUE: L’utilisation d’adhésif tissulaire en plus du ciment dentaire assure une forte tenue8. - À l’aide du foret dentaire 3, éclaircir une zone de 7,5 mm x 7,5 mm sur le côté gauche du crâne, juste en arrière du bregma et latéralement à la ligne médiane. Affiner le crâne à ~50 μm comme le montre la figure 3A.
- Appliquez une pommade antibiotique topique sur le site chirurgical, puis recouvrez-la d’une fine couche de caoutchouc de silicone pour protéger le crâne aminci comme le montre la figure 3B. Couvrir le site chirurgical à l’aide du capuchon de tête comme le montre la figure 3C. Fixez-le en place avec les deux petits morceaux de fils traversant à la fois l’implant de tête et le capuchon de tête, comme illustré à la Figure 3D, E. Appliquez du caoutchouc de silicone pour couvrir le capuchon et le crâne afin de stabiliser le capuchon de tête plus loin sur la tête du rat, comme le montre la figure 3F.
REMARQUE: Le caoutchouc de silicone offre une protection supplémentaire au crâne aminci. - Injectez au rat de la flunixine méglumine (2,5 mg/kg) par voie sous-cutanée pour la gestion de la douleur et de l’inflammation. Pour prévenir l’infection, injectez l’antibiotique enrofloxacine Enrosite (22,7 mg / ml, 10 mg / kg +/-0,01), par voie intrapéritonéale.
- Déplacez le rat vers la chambre de récupération pour aider à maintenir sa température corporelle avec une couverture chauffante et une lampe chauffante. Surveillez le rat en continu jusqu’à ce qu’il reprenne conscience et puisse maintenir une position couchée sternale.
- Remettez le rat dans sa cage séparée une fois qu’il se rétablit complètement.
- Pendant les 3 prochains jours, administrer la flunixine et la buprénorphine pour soulager l’inflammation et la douleur et enrosite pour prévenir l’infection deux fois par jour.
6. Imagerie éveillée
- Anesthésier le rat avec 4 % d’isoflurane pour l’induction et 1 % pour l’entretien lorsqu’il n’y a pas de réflexe de pincement de la patte postérieure. Injectez de l’acépromazine (0,3-0,5 mg / kg) par voie sous-cutanée.
REMARQUE: Cette concentration d’acépromazine est inférieure aux niveaux de sédation légère et aide seulement à garder les rats calmes tout au long du processus d’imagerie. - À l’aide de bandes de velcro personnalisées, fixez le rat sur la feuille de plastique utilisée pendant les procédures d’entraînement. Enveloppez la partie inférieure du corps à l’aide d’un tampon d’absorption et placez le rat bien ajusté dans l’élingue.
- Retirez le caoutchouc de silicium. Retirez le capuchon de tête en retirant les fils de fixation. Fixez le chevalement dans l’implant de tête comme illustré à la figure 2G.
- Verrouillez le chevalement dans des pinces comme illustré à la Figure 2H, I.
- Retirez l’anesthésie gazeuse. Rincer la zone d’imagerie avec une solution saline 3x et nettoyer avec de la gaze humide. Sécher la zone d’imagerie et faire un puits, en utilisant de la vaseline, autour de la zone d’imagerie. Remplir le puits avec une solution saline stérilisée et le recouvrir d’une lame de verre (figure 2E).
- Reportez-vous aux procédures d’acquisition pour l’imagerie optique du signal intrinsèque, le protocole de stimulation des moustaches et l’analyse et la présentation des données, qui ont été discutés en détail précédemment 6,7.
- Tout au long de l’expérience, surveillez les rats pour détecter les signes d’agitation et d’agitation, qui peuvent être encore réduits en couvrant les yeux des rats avec un chiffon doux ou de la gaze (facultatif).
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Representative Results
Les signaux d’imagerie optique représentatifs d’un seul essai sur un rat anesthésié et la réponse additionnée (de 40 essais recueillis) d’un rat éveillé sont présentés (Figure 4). L’intensité du signal pour la stimulation à moustache unique d’un rat éveillé peut être visualisée à un seuil plus élevé que pour le rat anesthésié, montrant un signal plus fort de l’animal éveillé. Les moustaches C2 des rats sont stimulées à 5 Hz pendant 1 s, et la réponse fonctionnelle est affichée comme un changement fractionnaire par rapport à la ligne de base. Les zones les plus sombres (en dessous du seuil négatif) sont les principales zones d’activité neuronale, et les zones blanches brillantes (au-dessus du seuil positif) montrent la réponse sanguine oxygénée à la stimulation9. Les images sont alignées de manière à ce que de gauche à droite soit de rostrale à caudale (C) et de haut en bas est la direction médiale à latérale (L), comme indiqué par les flèches.
Figure 1 : Chapeau de tête, implant de tête et chevalement de tête. (A) Le capuchon (vue de dessus): le côté de la vue de dessus montre la courbure à aligner le long de la courbure de la tête pour protéger la tête; Les deux parties rectangulaires creusées permettent aux fils métalliques de passer à travers le capuchon de tête. (B) Le capuchon de tête (vue du bas) montre la coupe rectangulaire plus large pour s’adapter à la barre supérieure de l’implant de tête et les deux coupes perpendiculaires pour que les fils se déplacent à travers l’implant et le capuchon de tête pour les maintenir en place. (C) Implant de tête avec les trois trous de coupe pour les vis d’ancrage. Les positions des vis d’ancrage sur l’implant de tête peuvent être ajustées en fonction de la tête du rat. D) Chapeau de tête et implant de tête (vue latérale); La vue latérale de l’implant de tête montre la barre rectangulaire creusée de l’intérieur pour permettre au fil de passer pour ancrer le capuchon de tête à l’implant de tête. (E-G) Vue de l’implant de tête ancré dans le capuchon de tête à travers une pièce de fil; Vue inférieure, vue latérale et vue de dessus pour montrer comment l’implant de tête est monté à l’intérieur du capuchon de tête. (H) Chevalement de tête, (I) Implant de tête ancré dans le chevalement de la tête. La distance entre deux lignes sur l’échelle (comme indiqué par le rectangle bleu) est de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Élingues et implant de tête et fixation du chevalement de la tête pour l’imagerie éveillée et fixe de la tête. (A,B) Élingue personnalisée avec matériau de filet pour le fond seulement ou les deux côtés; C) rat placé sur la bâche en plastique, fixé avec des bandes velcro, pendant l’entraînement à l’élingue; (D-F) vues supérieures et latérales de l’implant de tête sur un crâne de rat au-dessus de l’hémisphère controlatéral. Des lignes pointillées montrent la zone d’imagerie. Les vues de dessus et de côté montrent clairement les trois trous pour fixer l’implant de tête au crâne avec la vis d’ancrage. (E) La vue latérale montre la barre creuse à travers laquelle passe le fil pour ancrer le capuchon de tête à l’implant de tête lorsque les rats ne sont pas imagés. Une jambe du chevalement a traversé la partie creuse de l’implant de tête pour l’imagerie du cortex du rat. (G) Cadre de tête à travers l’implant de tête pour les rats éveillés et fixés à la tête. (H) Le cadre de la tête à travers l’implant de tête avec ses deux pattes serrées pour l’imagerie éveillée, fixée à la tête (I) de rats éveillés et fixés sur la tête pendant les séances d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mise en place de l’implant de tête. (A) La préparation du crâne mince pour l’imagerie éveillée et fixée par la tête. (B) Implant de tête fixé sur le crâne de rat et la zone d’imagerie du crâne mince recouverte de silicone en caoutchouc. (C) Chapeau de tête placé sur l’implant de tête. (D, E) Capuchon de tête ancré à l’implant de tête à l’aide de fils métalliques revêtus. (F) Le capuchon et la zone environnante recouverts de caoutchouc-silicone pour un soutien supplémentaire dans la fixation et la protection du crâne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Réponses fonctionnelles des stimulations des moustaches C2. (A) Une réponse fonctionnelle représentative d’essai unique d’une stimulation à moustaches C2 de 5 Hz pendant 1 s d’imagerie éveillée et fixée à la tête chez le rat, chaque essai durant 7 s avec un intervalle inter-essais de 3 s ± 2 s. Seuil de représentation en niveaux de gris de la variation fractionnaire par rapport à la ligne de base (−3,5 × 10−3 à 3,5 × 10−3). (B) Une réponse fonctionnelle représentative d’un essai unique de stimulation à moustaches C2 de 5 Hz pendant 1 s d’un rat anesthésié (pentobarbital sodique). Le seuil de représentation en niveaux de gris de la variation fractionnaire par rapport à la ligne de base (−2,5 × 10−4 à 2,5 × 10−4). La réponse fonctionnelle du rat éveillé et fixé à la tête est 140 fois plus forte que celle du rat anesthésié. Chaque image est une image de 0,5 s. Les images sont alignées de manière à ce que de gauche à droite soit de rostrale à caudale et de haut en bas est de la direction médiale à latérale comme indiqué par les flèches. Les zones les plus sombres (en dessous du seuil négatif) sont les principales zones d’activité neuronale, et les zones blanches brillantes (au-dessus du seuil positif) montrent la réponse sanguine oxygénée à la stimulation. Barre d’échelle = 1 mm. Abréviations: C = caudale; L = latéral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : fichier d’impression 3D pour l’implant de tête. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : fichier d’impression 3D pour le casque. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’utilisation de l’imagerie éveillée et fixe de la tête chez le rat offre de nombreux avantages en termes de facilité et de personnalisation. Les élingues conçues sur mesure permettent aux rats d’être enveloppés dans un matériau de filet respirant, éliminant ainsi le besoin d’enfermer les animaux dans des chambres de retenue en plastique fermées pendant de longues périodes10,11. Les rats sont gardés calmes et sans stress pendant les longues durées des séances d’imagerie successives en utilisant une très faible dose d’acépromazine inférieure aux niveaux de sédation légère chez le rat (1,0-2,5 mg/kg)12. Pour garder le rat stable et éliminer davantage les artefacts de mouvement pendant les séances d’imagerie, des bandes velcro sont utilisées. Les bandes velcro sont placées à 3-6 mm les unes des autres pour éviter une constriction inutile du corps pendant de longues heures. Les rats sont entraînés et habitués aux élingues à un jeune âge pour s’assurer qu’ils restent calmes et à l’aise au repos dans leurs écharpes pendant la préparation et l’acquisition de données. Sur la base des résultats préliminaires, les jeunes rats pesant environ 150-175 g sont plus faciles et plus rapides à entraîner que les rats plus âgés.
L’implant de tête sur la tête de rat ne pèse que 0,174 g et le capuchon amovible pèse 1,483 g. L’implant de tête couvre une zone de 0,5 cm à 1,5 cm sur un hémisphère, permettant une accessibilité complète de l’autre hémisphère pour la neuroimagerie. La taille du capuchon de tête assure une couverture complète du site chirurgical. Les poids de l’implant de tête et du capuchon ne semblent pas entraver la mobilité et les activités quotidiennes, et les rats peuvent être logés ensemble dans des cages standard. En utilisant cette méthode de contention de la tête et du corps, les rats peuvent être imagés pendant 2-3 heures à chaque fois à différents jours pour des études longitudinales. Plusieurs séances d’imagerie peuvent être effectuées sur un seul rat pendant au moins 3 mois à l’aide de cette configuration. Il faut un total de 25 minutes pour imprimer en 3D l’implant de tête et le capuchon de tête. Les pièces sont facilement personnalisables en fonction de la taille du rongeur et peuvent également être personnalisées pour être utilisées chez la souris. Pour les études qui nécessitent une différenciation des rats, différentes couleurs et matériaux peuvent faciliter l’identification. De plus, la partie supérieure du capuchon peut être personnalisée pour ajouter des symboles, des chiffres ou des lettres pour une identification facile.
Il existe plusieurs étapes importantes pour une implantation et une imagerie réussies, dont la plus importante est la formation et l’accoutumance des rats. Les rats sont présentés au hasard avec des stimuli sensoriels pour minimiser le potentiel d’apprentissage associatif, qui peut influencer les résultats de l’imagerie. La chirurgie et tous les instruments chirurgicaux doivent être stériles pour prévenir l’infection, et l’utilisation d’antibiotiques locaux est impérative. L’utilisation de l’acépromazine au début de l’imagerie est importante pour garder les animaux calmes et silencieux afin d’éviter les mouvements inutiles pendant les séances d’imagerie. Le crâne du rat doit être sec pour une fixation correcte, et la couche de ciment dentaire déposé doit être suffisamment mince pour que le capuchon de tête puisse s’adapter à l’implant de tête.
Pour la présente étude, la zone d’imagerie était centrée sur le cortex somatosensoriel. La zone amincie mesure environ 7,5 mm x 7,5 mm, ce qui est l’étendue de la zone qui peut être imagée dans la présente étude. Cependant, la surface imagée peut être augmentée à 11 mm x 11 mm si nécessaire. Un autre avantage de cette conception est qu’elle permet d’imager toute la zone amincie malgré la courbure du cortex.
Les implants de tête précédemment signalés nécessitent près de 7 à 12 vis d’ancrage pour fixer l’implant de tête sur la tête du rat13,14. Cela empêche l’imagerie d’une plus grande zone par la préparation d’un crâne aminci. Une autre méthode de fixation nécessite la fixation d’un matériau de résine sur une grande surface à l’aide de vis de tête, rendant le crâne inaccessible pour l’imagerie14. L’imagerie éveillée de rats à l’aide de l’IRM nécessite l’immobilisation des animaux dans des tubes cylindriques, ce qui rend les expériences d’imagerie stressantes pour les animaux11,15. Dans d’autres configurations, l’implant de tête dépasse de la tête et pourrait s’emmêler dans des cages standard16,17. L’implant de tête et le capuchon de tête éliminent l’utilisation de la fixation des lames de verre et l’aplatissement du crâne mince pour l’imagerie chronique18,19. La taille de l’implant de tête et l’utilisation d’une courbure sur le capuchon de tête éliminent la nécessité d’apporter des modifications aux cages standard comme dans d’autres procédures chroniques18,19. Les implants de tête chez la souris sont plus faciles car une seule configuration d’écrou et de vis est utilisée, ce qui n’est pas possible chez les rats, car les rats sont beaucoup plus forts et plus difficiles à maintenir stables20.
La limitation de l’implant de tête est que, malgré sa petite taille, il nécessite l’ancrage de l’implant au crâne à l’aide de vis. L’implant de tête est nécessaire pour maintenir la tête de l’animal stable, mais limite l’imagerie de l’ensemble du cerveau du rat. Cependant, un avantage de l’utilisation de cet implant de tête est qu’il peut être utilisé pour imager une zone plus large pour une stimulation sensorielle évoquée en utilisant diverses modalités de neuroimagerie telles que l’imagerie optique à signal intrinsèque, la tomographie par cohérence optique Doppler et l’imagerie par mouchetage laser.
Les représentations fonctionnelles corticales basées sur les signaux intrinsèques de rats éveillés et fixés à la tête ont tendance à être plus fortes en intensité que chez les rats anesthésiés utilisant le même protocole de stimulation des moustaches. Une augmentation similaire de la force de réponse du signal intrinsèque évoqué a été rapportée chez les singes éveillés21,22. Des travaux sont en cours pour améliorer la conception de l’implant de tête et du capuchon de tête pour des environnements plus difficiles tels que l’habitat naturaliste23.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha et Amirsoheil Zareh pour leur aide lors de l’entraînement des rats et de la préparation des frondes. Le financement a été fourni par les National Institutes of Health (NIH, numéro de subvention: NS119852) et la Fondation Leducq (numéro de subvention: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
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