Summary
Ein detailliertes neues Verfahren zur funktionellen Bildgebung von wachen, kopffixierten Ratten wird beschrieben.
Abstract
Anästhetika, die häufig in der präklinischen und grundlagenwissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden, haben einen depressiven Einfluss auf die metabolischen, neuronalen und vaskulären Funktionen des Gehirns und können neurophysiologische Ergebnisse negativ beeinflussen. Die Verwendung wacher Tiere für Forschungsstudien ist vorteilhaft, stellt aber die große Herausforderung dar, die Tiere ruhig und stationär zu halten, um Bewegungsartefakte während der gesamten Datenerfassung zu minimieren. Die Bildgebung im Wachzustand bei kleineren Nagetieren (z. B. Mäusen) ist sehr häufig, bleibt aber bei Ratten selten, da Ratten größer und stärker sind und eine größere Tendenz haben, sich Bewegungsbeschränkungen und Kopffixierungen über die langen Zeiträume zu widersetzen, die für die Bildgebung erforderlich sind. Ein neues Modell der Neurobildgebung von wachen, kopffixierten Ratten unter Verwendung von maßgeschneiderten handgenähten Schlingen, 3D-gedruckten Kopfimplantaten, Kopfkappen und einem Kopfgestell wird beschrieben. Die Ergebnisse, die nach einem einzigen Versuch mit der Stimulation eines einzelnen Schnurrhaars erzielt wurden, deuten auf eine Zunahme der Intensität der evozierten funktionellen Antwort hin. Die Erfassung der evozierten funktionellen Antwort von wachen, kopffixierten Ratten ist schneller als die von anästhesierten Ratten, zuverlässig, reproduzierbar und kann für wiederholte Längsschnittstudien verwendet werden.
Introduction
Die meisten grundlegenden, präklinischen und translationalen wissenschaftlichen Neuroimaging-Untersuchungen werden von anästhesierten Tieren gewonnen 1,2. Anästhetika erleichtern das Experimentieren, beeinflussen aber kontinuierlich den Stoffwechsel des Gehirns und des Körpers, den Blutdruck und die Herzfrequenz3. Die Art des Anästhetikums sowie die Dauer und der Verabreichungsweg fügen der Dateninterpretation Störvariablen hinzu, die zur Reproduzierbarkeit und zu Translationsfehlern beitragen können4. Ein großer Engpass bei wachen, kopffixierten Neuroimaging-Studien an Ratten ist die Anforderung, die Ratte während des gesamten Vorbereitungs- und Datenerfassungsprozesses stationär und ruhig zu halten. Kleine Bewegungen erzeugen ungerechtfertigte Bewegungsartefakte, die sich negativ auf die Datenanalyse und -interpretation auswirken können.
Es wurde ein neues Modell der Neurobildgebung von wachen, kopffixierten Ratten mit maßgeschneiderten Schlingen, dreidimensionalen (3D) gedruckten Kopfimplantaten, Kopfkappen und einem Kopfgestell entwickelt, das mehrere Vorteile für einfache Experimente bietet. Das 3D-Kopfimplantat ist leicht und bedeckt einen kleinen Teil des Schädels, der für die Transfixierung benötigt wird. Die 3D-gedruckten Kopfimplantate und -kappen werden mit Hilfe von CAD-Software (Computer-Aided Design) entworfen. Die Protokolle der Schnurrhaarstimulation, der Datenerfassung, der Datenanalyse und der Ergebnisse von anästhesierten Ratten wurden in früheren Arbeiten ausführlich beschrieben 5,6,7.
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Protocol
Alle Verfahren entsprachen den Richtlinien des National Institute of Health und wurden von der University of California, Irvine Animal Care and Use Committee, genehmigt. Sieben Männchen und eine weibliche Ratte (Sprague-Dawley, Gewicht: 185-350 g) wurden in dieser Studie verwendet. Nach Abschluss der Studie wurden die Ratten mit einer Überdosis Kohlendioxid getötet.
1. Design verschiedener Komponenten
- Aufbau des Kopfimplantats:
- Stellen Sie das Kopfimplantat mit einer CAD-Software her (Abbildung 1C) und entwerfen Sie es so, dass es den Bereich hinter dem Bregma abbildet, der an die Mittellinie angrenzt, die auf dem somatosensorischen Kortex zentriert ist. Stellen Sie sicher, dass das Kopfimplantat einen Bereich von 0,9 mm bis 1,9 mm auf dem Schädel abdeckt, der vom Bildgebungsbereich entfernt ist.
- Verwenden Sie nur drei Schrauben, um das Kopfimplantat am Schädel der Ratte zu verankern. Entwerfen Sie alle Schraubenlöcher so, dass sie auf der gegenüberliegenden Seite der Mittellinie in der kontralateralen Hemisphäre der abgebildeten Hemisphäre verbleiben.
- Platzieren Sie einen von innen ausgehöhlten Steg im oberen Teil des Kopfimplantats, damit die Kopfkappe mit Drähten am Kopfimplantat befestigt werden kann, wie in Abbildung 1D gezeigt.
- Aufbau der Kopfkappe:
- Stellen Sie sicher, dass die Kopfkappe den Bildgebungsbereich vollständig abdeckt und ihn vor jeder Art von Trauma schützt, wie in Abbildung 1A, B gezeigt. Fügen Sie der Kopfkappe eine Krümmung hinzu, damit sie sich an die Form des Kopfes anpasst, ohne die täglichen Aktivitäten des Tieres in den standardmäßig ausgestalteten Käfigen zu erschweren.
- Schneiden Sie die Innenseite der Kopfkappe in eine breitere rechteckige Form, so dass der obere Teil des Kopfimplantats hineinpasst, wie in Abbildung 1E gezeigt. Schneiden Sie senkrecht zu diesem Rechteck zwei weitere rechteckige Bereiche ab, um die Kopfkappe am Kopfimplantat zu verankern.
- Führen Sie einen Draht durch den oberen ausgehöhlten Stab des Kopfimplantats, um die Kopfkappe auf dem Rattenkopf zu fixieren, wie in Abbildung 1E-G gezeigt. Führen Sie den zweiten Draht auf die gleiche Weise durch.
Anmerkungen: Diese Drähte können leicht mit einer Zange oder Pinzette entfernt werden. Die 3D-Druckdateien werden (Dateiformat: STL) als Supplemental File 1 und Supplemental File 2 bereitgestellt.
- Aufbau des Förderrahmens:
- Gestalten Sie das Kopfgestell so, dass sich ein geschnittenes Teil durch den oberen Steg des Kopfimplantats bewegen kann und mit einer Klemme fixiert wird.
- Winkeln Sie den anderen geschnittenen Teil an, um zusätzliche Festigkeit zu erhalten, um den Rattenkopf fixiert zu halten, damit die kontralaterale Seite für die Bildgebung vollständig zugänglich ist. Schneiden Sie für diese Studie die Stahlplatte mit einer Zinnschere zu, um das Kopfgestell herzustellen (Abbildung 1H, I).
HINWEIS: Dieses Teil kann auch 3D-gedruckt werden.
2. Anfängliches Rattentraining
- Lassen Sie die Ratten 2-3 Tage lang in ihren Käfigen an die Vivariumsumgebung gewöhnen.
- Beginne mit dem Umgang mit der Ratte in einem ruhigen Raum. Öffnen Sie den Käfig und lassen Sie den Experimentator seine Hand für 15-20 Minuten in den Käfig in der Nähe der Ratte stecken, damit sich die Ratte daran gewöhnen kann.
- Sobald die Ratte Ruhe zeigt, indem sie sich nicht erschrecken lässt oder vor den Händen des Experimentators wegläuft, heben Sie die Ratte vorsichtig hoch, um sie zu handhaben. Fassen Sie die Ratte jeden Tag 30-45 Minuten lang an, bevor Sie mit dem Schlingentraining trainieren.
3. Schlingentraining
- Trainieren Sie die Ratten mindestens 2-3 Tage in den Schlingen vor der chirurgischen Implantation des Kopfimplantats und der Kopfkappe.
- Ordnen Sie die Gurtaufstellung wie in Abbildung 2A gezeigt an. Reinigen Sie das Tragegurt-Setup mit Ethanol-Tüchern.
HINWEIS: Alle Schlingen sind handgenäht und bestehen entweder auf der Unterseite oder auf beiden Seiten aus einem Netzmaterial, wie in Abbildung 2A, B gezeigt. - Für das Schlingentraining betäuben Sie die Ratten mit 4 % Isofluran zur Induktion und 1 % zur Erhaltung, bis kein Quetschreflex der Hinterpfote mehr auftritt.
- Legen Sie die Ratten unter Isofluran-Narkose auf eine flexible Plastikfolie mit den Maßen 20 cm x 8 cm (Länge x Breite), wobei 10 cm x 8 cm der Plastikfolie vollständig mit dem weicheren Teil der Velcro bedeckt sind.
HINWEIS: Die Betäubung der Ratten für das Schlingentraining ist ein optionaler Schritt, der in erster Linie dazu dient, Stress und Angst abzubauen. - Stecken Sie die Ratte in den ersten 2 Tagen des Trainings kuschelig in eine Babysocke (Größe 0-3 Monate) mit dem Kopf durch ein kleines Loch, das am Ende der Socke eingeschnitten ist.
- Wickeln Sie ein kleines Stück saugfähiges Pad um den unteren Körperteil, um die Ratte trocken zu halten und Exkremente zu sammeln.
- Wickeln Sie die Ratte in ein atmungsaktives Baumwolltuch (Größe: 25 cm x 25 cm). Lege die Ratte auf eine Plastikfolie, auf die Velcro Streifen geklebt sind.
- Befestigen Sie die Ratte weiter mit 0,5 cm breiten Velcro Streifen in einem Abstand von 3-6 mm zueinander an der Plastikfolie.
- Befestigen Sie die Ratte in der Schlinge. Entfernen Sie die Gasnarkose. Lassen Sie die Ratte sich von der Gasnarkose in der Schlinge erholen.
- Wenn die Ratte anfängt zu schlagen, bieten Sie alle 10-15 Minuten ein paar Tropfen 10%ige Saccharoselösung als Belohnung an.
- Präsentieren Sie der Ratte nach dem Zufallsprinzip die sensorischen Reize, die während der Bildgebung verwendet werden (hier Schnurrhaarstimulation, alle 15-25 Minuten), um sie an sensorische Reize zu gewöhnen. Stimulieren Sie die Schnurrhaare in zufälligen Abständen manuell.
- Trainieren Sie die Ratte an Tag 1 1 Stunde, an Tag 2 2 Stunden und an Tag 3 3 Stunden in der Schlinge, wie in Abbildung 2C gezeigt.
4. Präoperative Vorbereitung
- Drucken Sie das Kopfimplantat und die Kopfkappe mit dem 3D-Drucker aus (Abbildung 1).
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Kopfbedeckungen (Implantate und Kappen), indem Sie das Gerät 10 Stunden lang in das keimtötende Mittel Metricide28 tauchen. Spülen Sie die Werkzeuge kurz vor der Operation gründlich mit sterilem Wasser ab.
- Setzen Sie die Ratte 4 % Isofluran aus und halten Sie sie dann bei 1 % bis 2 % Isofluran, bis kein Quetschreflex der Hinterpfote mehr auftritt. Diese Operation kann unter vielen Arten von Anästhesie durchgeführt werden, wie z. B. Isofluran, Natrium-Pentobarbital und Ketamin-Xylazin.
- Injizieren Sie Atropin (0,05 mg/kg) intramuskulär, um die Schleimsekretion zu reduzieren und die Atmung zu unterstützen.
- Rasieren Sie den Kopf der Ratte 5 mm mittig um die Mittellinie herum mit einem Haarschneider, beginnend zwischen den Augen bis zur Rückseite der Ohren.
- Überwachen Sie die partielle Sauerstoffsättigung und die Herzfrequenz durch ein Pulsoximeter und eine Herzfrequenzmessersonde, die am Hinterbein der Ratte befestigt sind.
- Wischen Sie den Kopf der Ratte und die Umgebung dreimal mit abwechselnden Runden Betadin- und 70%iger Alkoholtücher ab.
- Fixiere die Ratte in einem stereotaktischen System.
- Führen Sie eine mit Vaseline geschmierte rektale Sonde ein, um die Körpertemperatur der Ratte zu messen, und halten Sie sie durch das Rückkopplungssystem der Heizdecke aufrecht, um eine Unterkühlung nach der Verabreichung des Anästhetikums zu vermeiden.
- Lokalanästhetikum Lidocainhydrochlorid in einer Konzentration von 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 Körpergewicht subkutan an der Operationsstelle verabreichen.
- Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Verabreichen Sie 2 % Lokalanästhetikum subkutan über die Operationsstelle.
- Injizieren Sie 3 ml laktatierte Ringerlösung bei Raumtemperatur subkutan, um eine Austrocknung zu verhindern und die Operation mit Nährstoffen zu versorgen.
5. Chirurgie
- Entfernen Sie den Teil der Haut über der Operationsstelle (4 mm Durchmesser, zentriert um die Mittellinie und die Mitte des Kopfes) mit einer scharfen chirurgischen Schere. Präparieren und entfernen Sie einen Teil der Haut (~2 mm Durchmesser, über dem linken somatosensorischen Kortex) zwischen Ohr und Auge im temporalen Teil des Kopfes.
- Entfernen Sie mit einem Skalpell das darunter liegende Hautgewebe (Perikranium), um den Schädel freizulegen. Reinigen Sie den Schädel mit sterilisierter Baumwollgaze.
- Zurückziehen/Resektieren des Schläfenmuskels, um die gewünschte Größe für den Bildgebungsbereich freizulegen [7,5 mm x 7,5 mm für diese Studie].
- Legen Sie den Schädel auf der kontralateralen Hemisphäre für das Kopfimplantat frei. Platzieren Sie das Kopfimplantat auf dem Schädel, um die Position der Verankerungsschrauben für das Implantat zu bestimmen, wie in Abbildung 2D-F gezeigt.
- Markieren Sie den Schädel zum Bohren der Schrauben mit Tusche mit Bohrer 1. Bohren Sie die Gratlöcher für die Schrauben mit dem Dentalbohrer 3. Schrauben Sie das Kopfimplantat fest.
- Trocknen Sie den Schädel mit steriler Gaze. Tragen Sie eine dünne Schicht Gewebekleber um und unter dem Kopfimplantat auf, um es auf den Schädel zu kleben. Tragen Sie eine Schicht Zahnzement auf, um das Kopfimplantat weiter zu stützen, und lassen Sie den Zement 2-3 Minuten trocknen.
HINWEIS: Die Verwendung von Gewebekleber zusätzlich zu Zahnzement sorgt für einen starken Halt8. - Dünnen Sie mit dem Dentalbohrer 3 einen 7,5 mm x 7,5 mm großen Bereich auf der linken Seite des Schädels aus, direkt hinter dem Bregma und seitlich der Mittellinie. Verdünnen Sie den Schädel auf ~50 μm, wie in Abbildung 3A gezeigt.
- Tragen Sie eine topische antibiotische Salbe auf die Operationsstelle auf und bedecken Sie sie dann mit einer dünnen Schicht Silikonkautschuk, um den ausgedünnten Schädel zu schützen, wie in Abbildung 3B gezeigt. Decken Sie die Operationsstelle mit der Kopfkappe ab, wie in Abbildung 3C gezeigt. Befestigen Sie es mit den beiden kleinen Drähten, die sowohl durch das Kopfimplantat als auch durch die Kopfkappe verlaufen, wie in Abbildung 3D, E gezeigt. Tragen Sie Silikonkautschuk auf, um die Kopfkappe und den Schädel zu bedecken, um die Kopfkappe weiter auf dem Kopf der Ratte zu stabilisieren, wie in Abbildung 3F gezeigt.
HINWEIS: Silikonkautschuk bietet zusätzlichen Schutz für dünneren Schädel. - Injizieren Sie der Ratte subkutan Flunixin-Meglumin (2,5 mg/kg) zur Schmerz- und Entzündungsbehandlung. Um eine Infektion zu verhindern, injizieren Sie das Enrosit-Antibiotikum Enrofloxacin (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-.01) intraperitoneal.
- Bringen Sie die Ratte mit einer wärmenden Decke und einer Wärmelampe in die Aufwachkammer, um ihre Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Beobachten Sie die Ratte kontinuierlich, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt und das Brustbein aufrechterhält.
- Bringen Sie die Ratte in ihren separaten Käfig zurück, sobald sie sich vollständig erholt hat.
- Verabreichen Sie in den nächsten 3 Tagen zweimal täglich Flunixin und Buprenorphin, um Entzündungen und Schmerzen zu lindern, und Enrosit, um Infektionen vorzubeugen.
6. Wache Bildgebung
- Betäuben Sie die Ratte mit 4 % Isofluran zur Induktion und 1 % zur Erhaltung, wenn es keinen Quetschreflex für die Hinterpfote gibt. Acepromazin (0,3-0,5 mg/kg) subkutan injizieren.
HINWEIS: Diese Konzentration von Acepromazin liegt unter dem Niveau einer leichten Sedierung und trägt nur dazu bei, die Ratten während des gesamten Bildgebungsprozesses zu beruhigen. - Befestigen Sie die Ratte mit speziellen Velcro-Streifen auf der Plastikfolie, die während des Trainings verwendet wird. Wickeln Sie den unteren Körperteil mit einem Absorptionskissen ein und legen Sie die Ratte fest in die Schlinge.
- Entferne den Silikongummi. Entfernen Sie die Kopfkappe, indem Sie die Befestigungsdrähte entfernen. Befestigen Sie das Kopfgerüst im Kopfimplantat, wie in Abbildung 2G gezeigt.
- Verriegeln Sie das Fördergerüst in Klemmen, wie in Abbildung 2H, I gezeigt.
- Entfernen Sie die Gasnarkose. Spülen Sie den Bildbereich 3x mit Kochsalzlösung und reinigen Sie ihn mit feuchter Gaze. Trocknen Sie den Abbildungsbereich und machen Sie mit Vaseline eine Vertiefung um den Bildbereich. Füllen Sie die Vertiefung mit sterilisierter Kochsalzlösung und decken Sie sie mit einem Glasobjektträger ab (Abbildung 2E).
- Beziehen Sie sich auf die Erfassungsverfahren für die optische Bildgebung mit intrinsischen Signalen, das Whisker-Stimulationsprotokoll sowie die Datenanalyse und -präsentation, die zuvor ausführlich besprochen wurden 6,7.
- Überwachen Sie die Ratten während des gesamten Experiments auf Anzeichen von Unruhe und Unruhe, die weiter reduziert werden können, indem die Augen der Ratten mit einem weichen Tuch oder einer Gaze (optional) bedeckt werden.
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Representative Results
Die repräsentativen optischen Bildgebungssignale eines einzelnen Versuchs mit einer anästhesierten Ratte und das summierte Ansprechen (von 40 gesammelten Studien) einer wachen Ratte sind dargestellt (Abbildung 4). Die Signalintensität für die Stimulation mit einem Schnurrbart kann bei einer wachen Ratte an einem höheren Schwellenwert als bei der anästhesierten Ratte visualisiert werden, was ein stärkeres Signal des wachen Tieres zeigt. Die C2-Schnurrhaare der Ratten werden 1 s lang mit 5 Hz stimuliert, und die funktionelle Antwort wird als fraktionelle Veränderung im Vergleich zur Ausgangslinie angezeigt. Die dunkleren Bereiche (unterhalb der negativen Schwelle) sind die Hauptbereiche der neuronalen Aktivität, und die hellweißen Bereiche (oberhalb der positiven Schwelle) zeigen die sauerstoffreiche Blutreaktion auf die Stimulation9. Die Bilder sind so ausgerichtet, dass von links nach rechts von rostral nach kaudal (C) und von oben nach unten die mediale nach laterale (L) Richtung verläuft, wie durch die Pfeile dargestellt.
Abbildung 1: Kopfkappe, Kopfimplantat und Kopfrahmen. (A) Die Kopfkappe (Draufsicht): Die Seite der Draufsicht zeigt die Krümmung, die entlang der Kopfkrümmung ausgerichtet werden soll, um den Kopf zu schützen; Die beiden ausgehöhlten rechteckigen Teile dienen dazu, dass die Metalldrähte durch die Kopfkappe geführt werden. (B) Die Kopfkappe (Ansicht von unten) zeigt den breiteren rechteckigen Schnitt, der in den oberen Stab des Kopfimplantats passt, und die beiden senkrechten Schnitte für die Drähte, die sich durch das Implantat bewegen, und die Kopfkappe, um sie an Ort und Stelle zu halten. (C) Kopfimplantat mit den drei geschnittenen Löchern für die Verankerungsschrauben. Die Positionen der Verankerungsschrauben am Kopfimplantat können entsprechend dem Kopf der Ratte eingestellt werden. (D) Kopfkappe und Kopfimplantat (Seitenansicht); Die Seitenansicht des Kopfimplantats zeigt den rechteckigen Steg, der von innen ausgehöhlt ist, damit der Draht zur Verankerung der Kopfkappe am Kopfimplantat durchgelassen werden kann. (E-G) Ansicht des Kopfimplantats, das durch ein Drahtstück in der Kopfkappe verankert ist; Ansicht von unten, von der Seite und von oben, um zu zeigen, wie das Kopfimplantat in die Kopfkappe eingesetzt wird. (H) Kopfgestell, (I) Kopfimplantat, das im Kopfgestell verankert ist. Der Abstand zwischen zwei Linien auf der Skala (dargestellt durch das blaue Rechteck) beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schlingen, Kopfimplantat und Fixierung des Kopfrahmens für eine wache, kopffixierte Bildgebung. (A,B) Maßgeschneiderte Schlinge mit Netzmaterial nur für den Boden oder für beide Seiten; (C) Ratte, die während des Schlingentrainings auf die mit Velcro Streifen fixierte Plastikfolie gelegt wird; (D-F) Draufsicht und Seitenansicht des Kopfimplantats auf einem Rattenschädel oberhalb der kontralateralen Hemisphäre. Gestrichelte Linien zeigen den Bildbereich an. In der Draufsicht und in der Seitenansicht sind die drei Löcher zur Befestigung des Kopfimplantats am Schädel mit der Verankerungsschraube deutlich zu erkennen. (E) Die Seitenansicht zeigt den hohlen Stab, durch den der Draht geführt wird, um die Kopfkappe am Kopfimplantat zu verankern, wenn die Ratten nicht abgebildet sind. Ein Bein des Kopfgestells wurde durch den hohlen Teil des Kopfimplantats geführt, um die Rattenrinde abzubilden. (G) Kopfgestell durch das Kopfimplantat für wache, kopffixierte Ratten. (H) Das Kopfgestell durch das Kopfimplantat mit seinen beiden Beinen geklemmt für die wache, kopffixierte Bildgebung (I) von wachen, kopffixierten Ratten während der Bildgebungssitzungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Einsetzen des Kopfimplantats. (A) Die dünne Schädelpräparation für die wache, kopffixierte Bildgebung. (B) Kopfimplantat, das auf dem Rattenschädel befestigt ist, und der Bildgebungsbereich des dünnen Schädels ist mit dem Gummisilikon bedeckt. (C) Kopfkappe auf dem Kopfimplantat. (D,E) Die Kopfkappe wird mit beschichteten Metalldrähten am Kopfimplantat verankert. (F) Die Kopfkappe und der umgebende Bereich sind mit Gummi-Silikon bedeckt, um die Fixierung und den Schutz des Schädels weiter zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Funktionelle Reaktionen von C2-Whisker-Stimulationen. (A) Eine repräsentative funktionelle Reaktion einer 5-Hz-C2-Whisker-Stimulation für 1 s wacher, kopffixierter Rattenbildgebung, wobei jeder Versuch 7 s dauerte, mit einem Inter-Trial-Intervall von 3 s ± 2 s. Der Schwellenwert für die Graustufendarstellung der fraktionalen Änderung gegenüber dem Ausgangswert (−3,5 × 10−3 bis 3,5 × 10−3). (B) Eine repräsentative funktionelle Reaktion einer 5 Hz C2-Whisker-Stimulation für 1 s einer anästhesierten (Natrium-Pentobarbital) Ratte. Der Schwellenwert für die Graustufendarstellung der fraktionellen Änderung gegenüber dem Ausgangswert (−2,5 × 10−4 bis 2,5 × 10−4). Die funktionelle Reaktion der wachen, kopffixierten Ratte ist 140-mal stärker als die der anästhesierten Ratte. Jeder Frame ist ein 0,5-Sekunden-Frame. Die Bilder sind so ausgerichtet, dass von links nach rechts von rostral nach kaudal und von oben nach unten von medial nach lateral verläuft, wie durch die Pfeile dargestellt. Die dunkleren Bereiche (unterhalb der negativen Schwelle) sind die Hauptbereiche der neuronalen Aktivität, und die hellweißen Bereiche (oberhalb der positiven Schwelle) zeigen die sauerstoffreiche Blutreaktion auf die Stimulation. Maßstabsbalken = 1 mm. Abkürzungen: C = kaudal; L = seitlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusatzdatei 1: 3D-Druckdatei für das Kopfimplantat. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Supplemental File 2: 3D-Druckdatei für die Kopfkappe. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Verwendung der wachen, kopffixierten Rattenbildgebung bietet viele Vorteile in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit und Individualisierung. Die speziell angefertigten Schlingen ermöglichen es, die Ratten durch atmungsaktives Netzmaterial zu wickeln, so dass die Tiere nicht über längere Zeiträume in geschlossene Rückhaltekammern aus Kunststoff eingeschlossen werdenmüssen 10,11. Ratten werden während der langen Dauer aufeinanderfolgender Bildgebungssitzungen mit einer sehr niedrigen Dosis Acepromazin unter dem Niveau einer leichten Sedierung bei Ratten (1,0-2,5 mg/kg) ruhig und stressfrei gehalten12. Um die Ratte ruhig zu halten und Bewegungsartefakte während der Bildgebungssitzungen weiter zu eliminieren, werden Velcro Streifen verwendet. Die Velcro Streifen werden in einem Abstand von 3-6 mm zueinander platziert, um eine unnötige Einschnürung des Körpers über viele Stunden zu vermeiden. Die Ratten werden in jungen Jahren trainiert und an Schlingen gewöhnt, um sicherzustellen, dass sie während der Vorbereitung und Datenerfassung ruhig und bequem in ihren Schlingen ruhen. Basierend auf den vorläufigen Ergebnissen sind junge Ratten mit einem Gewicht von etwa 150-175 g einfacher und schneller zu trainieren als ältere Ratten.
Das Kopfimplantat auf dem Rattenkopf wiegt nur 0,174 g und die abnehmbare Kopfkappe wiegt 1,483 g. Das Kopfimplantat deckt auf einer Hemisphäre eine Fläche von 0,5 cm bis 1,5 cm ab und ermöglicht so eine vollständige Zugänglichkeit der anderen Hemisphäre für die Neurobildgebung. Die Größe der Kopfkappe gewährleistet eine vollständige Abdeckung des Operationsfeldes. Die Gewichte des Kopfimplantats und der Kopfkappe scheinen die Mobilität und die täglichen Aktivitäten nicht zu behindern, und die Ratten können zusammen in Standardkäfigen untergebracht werden. Mit dieser Kopf- und Körperfixierungsmethode können die Ratten jeweils 2-3 h an verschiedenen Tagen für Längsschnittstudien abgebildet werden. Mit diesem Setup können mehrere Bildgebungssitzungen an einer einzelnen Ratte für mindestens 3 Monate durchgeführt werden. Es dauert insgesamt 25 Minuten, um das Kopfimplantat und die Kopfkappe in 3D zu drucken. Die Teile sind je nach Größe des Nagetiers leicht anpassbar und können auch für die Verwendung in Mäusen angepasst werden. Für Studien, die eine Differenzierung der Ratten erfordern, können verschiedene Farben und Materialien eine einfache Identifizierung ermöglichen. Darüber hinaus kann der obere Teil der Kappe angepasst werden, um Symbole, Zahlen oder Buchstaben zur einfachen Identifizierung hinzuzufügen.
Für eine erfolgreiche Implantation und Bildgebung gibt es mehrere wichtige Schritte, von denen der wichtigste das Training und die Gewöhnung der Ratten ist. Den Ratten werden nach dem Zufallsprinzip sensorische Reize präsentiert, um das Potenzial für assoziatives Lernen zu minimieren, das die Bildgebungsergebnisse beeinflussen kann. Die Operation und alle chirurgischen Instrumente müssen steril sein, um Infektionen zu vermeiden, und der Einsatz lokaler Antibiotika ist zwingend erforderlich. Die Verwendung von Acacepromazin zu Beginn der Bildgebung ist wichtig, um die Tiere ruhig und ruhig zu halten und unnötige Bewegungen während der Bildgebungssitzungen zu vermeiden. Der Schädel der Ratte muss für eine ordnungsgemäße Fixierung trocken sein, und die Schicht des abgelegten Zahnzements muss dünn genug sein, damit die Kopfkappe in das Kopfimplantat passt.
Für die aktuelle Studie wurde der Bildgebungsbereich auf den somatosensorischen Kortex zentriert. Die ausgedünnte Fläche misst etwa 7,5 mm x 7,5 mm, was der Ausdehnung der Fläche entspricht, die in der aktuellen Studie abgebildet werden kann. Der abgebildete Bereich kann jedoch bei Bedarf auf 11 mm x 11 mm vergrößert werden. Ein weiterer Vorteil dieses Designs ist, dass es trotz der Krümmung der Hirnrinde die Abbildung des gesamten ausgedünnten Bereichs ermöglicht.
Zuvor berichtete Kopfimplantate erfordern fast 7-12 Verankerungsschrauben, um das Kopfimplantat auf dem Kopf der Ratte zu befestigen13,14. Dies schließt die Abbildung eines größeren Bereichs durch eine Präparation des ausgedünnten Schädels aus. Eine andere Fixationsmethode erfordert die großflächige Fixierung eines Harzmaterials mit Kopfschrauben, wodurch der Schädel für die Bildgebung unzugänglich wird14. Die wache Bildgebung von Ratten mittels MRT erfordert die Immobilisierung der Tiere in zylindrischen Röhren, was die Bildgebung für die Tiere stressig macht11,15. In einigen anderen Konfigurationen ragt das Kopfimplantat aus dem Kopf heraus und kann sich in Standardkäfigen verfangen16,17. Das Kopfimplantat und die Kopfkappe machen die Fixierung von Objektträgern und die Abflachung des dünnen Schädels für die chronische Bildgebung überflüssig18,19. Die Größe des Kopfimplantats und die Verwendung einer Krümmung der Kopfkappe machen Änderungen an den Standardkäfigen wie bei anderen chronischen Eingriffen überflüssig18,19. Die Kopfimplantate bei Mäusen sind einfacher, da nur eine einzige Muttern- und Schraubenkonfiguration verwendet wird, was bei Ratten nicht möglich ist, da Ratten viel stärker sind und schwieriger stabil zu haltensind 20.
Die Einschränkung des Kopfimplantats besteht darin, dass es trotz seiner geringen Größe eine Verankerung des Implantats am Schädel mit Schrauben erfordert. Das Kopfimplantat ist notwendig, um den Kopf des Tieres ruhig zu halten, schränkt aber die Bildgebung des gesamten Rattengehirns ein. Ein Vorteil der Verwendung dieses Kopfimplantats besteht jedoch darin, dass es verwendet werden kann, um einen größeren Bereich für evozierte sensorische Stimulation mit verschiedenen Neuroimaging-Modalitäten wie der optischen Bildgebung mit intrinsischem Signal, der optischen Doppler-Kohärenztomographie und der Laser-Speckle-Bildgebung abzubilden.
Die kortikalen funktionellen Repräsentationen, die auf intrinsischen Signalen wacher, kopffixierter Ratten basieren, sind tendenziell stärker in der Intensität als bei anästhesierten Ratten, die das gleiche Schnurrhaarstimulationsprotokoll verwenden. Eine ähnliche Zunahme der Stärke der evozierten intrinsischen Signalantwort wurde bei wachen Affen berichtet21,22. Derzeit wird daran gearbeitet, das Design des Kopfimplantats und der Kopfkappe für anspruchsvollere Umgebungen wie das naturalistische Habitat23 zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha und Amirsoheil Zareh für ihre Hilfe beim Training der Ratten und bei der Vorbereitung der Schlingen. Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health (NIH, Fördernummer: NS119852) und die Leducq Foundation (Fördernummer: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
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