Summary
Viene descritta una nuova procedura dettagliata per l'imaging funzionale di ratti svegli e fissati con la testa.
Abstract
Gli anestetici, comunemente usati nella ricerca scientifica preclinica e fondamentale, hanno un'influenza depressiva sulle funzioni metaboliche, neuronali e vascolari del cervello e possono influenzare negativamente i risultati neurofisiologici. L'uso di animali svegli per studi di ricerca è vantaggioso, ma pone la sfida principale di mantenere gli animali calmi e fermi per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l'acquisizione dei dati. L'imaging sveglio nei roditori di piccole dimensioni (ad esempio, topi) è molto comune, ma rimane scarso nei ratti poiché i ratti sono più grandi, più forti e hanno una maggiore tendenza a opporsi alle restrizioni di movimento e alla fissazione della testa per le lunghe durate richieste per l'imaging. Viene descritto un nuovo modello di neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa utilizzando imbracature personalizzate cucite a mano, protesi per la testa stampate in 3D, tappi per la testa e un telaio. I risultati ottenuti a seguito di una singola prova di stimolazione a baffo singolo suggeriscono un aumento dell'intensità della risposta funzionale evocata. L'acquisizione della risposta funzionale evocata da ratti svegli e fissi con la testa è più veloce di quella dei ratti anestetizzati, affidabile, riproducibile e può essere utilizzata per studi longitudinali ripetuti.
Introduction
La maggior parte delle indagini scientifiche di neuroimaging di base, precliniche e traslazionali sono acquisite da animali anestetizzati 1,2. Gli anestetici facilitano la sperimentazione ma influenzano continuamente il metabolismo del cervello e del corpo, la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca3. Il tipo di anestetico e la durata e la via di somministrazione aggiungono variabili confondenti all'interpretazione dei dati che potrebbero contribuire alla riproducibilità e ai fallimenti traslazionali4. Uno dei principali colli di bottiglia degli studi di neuroimaging del ratto sveglio e fissato con la testa è la necessità di mantenere il ratto fermo e calmo durante i processi di preparazione e acquisizione dei dati. Piccoli movimenti producono artefatti di movimento ingiustificati, che possono influire negativamente sull'analisi e sulle interpretazioni dei dati.
È stato ideato un nuovo modello di neuroimaging da ratti svegli e fissi con la testa utilizzando imbracature personalizzate, protesi per la testa tridimensionali stampate in 3D, tappi per la testa e un telaio per la testa che offre diversi vantaggi per una facile sperimentazione. L'impianto cranico 3D è leggero e copre una piccola porzione del cranio necessaria per il transfixing. Gli impianti cranici e i cappucci stampati in 3D sono progettati utilizzando software CAD (computer-aided design). I protocolli di stimolazione dei baffi, acquisizione dei dati, analisi dei dati e risultati di ratti anestetizzati sono stati descritti in dettaglio nel precedente lavoro 5,6,7.
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Protocol
Tutte le procedure erano conformi alle linee guida del National Institute of Health e approvate dall'Università della California, Irvine Animal Care and Use Committee. In questo studio sono stati utilizzati sette maschi e una femmina di ratto (Sprague-Dawley, peso: 185-350 g). Dopo il completamento dello studio, i ratti sono stati sacrificati usando overdose di anidride carbonica.
1. Progettazione di diversi componenti
- Progettazione dell'impianto cranico:
- Realizzare l'impianto della testa utilizzando un software CAD (Figura 1C) e progettarlo per visualizzare l'area posteriore al bregma e adiacente alla linea mediana centrata sulla corteccia somatosensoriale. Assicurarsi che l'impianto cranico copra un'area compresa tra 0,9 mm e 1,9 mm sul cranio lontano dall'area di imaging.
- Utilizzare solo tre viti per ancorare l'impianto della testa sul cranio del ratto. Progettare tutti i fori delle viti in modo che rimangano sul lato opposto della linea mediana nell'emisfero controlaterale dell'emisfero ripreso.
- Posizionare una barra, scavata dall'interno, nella parte superiore dell'impianto della testa per consentire ai fili di fissare il cappuccio della testa all'impianto della testa come mostrato nella Figura 1D.
- Design del cappuccio:
- Assicurarsi che il cappuccio copra completamente l'area di imaging e la protegga da qualsiasi tipo di trauma, come mostrato nella Figura 1A, B. Aggiungi una curvatura alla calotta della testa in modo che si allinei alla forma della testa senza causare difficoltà alle attività quotidiane dell'animale nelle gabbie arricchite standard.
- Tagliare il lato interno del cappuccio in una forma rettangolare più ampia in modo che la parte superiore dell'impianto cranico possa adattarsi ad esso, come mostrato nella Figura 1E. Perpendicolare a questo rettangolo, tagliare altre due regioni rettangolari per ancorare il cappuccio alla protesi della testa.
- Far passare un filo attraverso la barra scavata superiore dell'impianto della testa per il fissaggio del cappuccio sulla testa del ratto, come mostrato nella Figura 1E-G. Passa il secondo filo allo stesso modo.
NOTA: Questi fili possono essere facilmente rimossi utilizzando pinze o pinze. I file di stampa 3D vengono forniti (formato file: STL) come file supplementare 1 e file supplementare 2.
- Design del telaio della testa:
- Progettare il telaio della testa in modo che una parte tagliata possa muoversi attraverso la barra superiore dell'impianto della testa e venga fissata utilizzando un morsetto.
- Inclinare l'altra parte tagliata per fornire una resistenza extra per mantenere la testa del ratto fissata per rendere il lato controlaterale completamente accessibile per l'imaging. Ai fini di questo studio, tagliare la piastra di acciaio con ceole di stagno per produrre il telaio della testa (Figura 1H, I).
NOTA: anche questa parte può essere stampata in 3D.
2. Addestramento iniziale dei ratti
- Consentire ai ratti di acclimatarsi all'ambiente del vivaio nelle loro gabbie per 2-3 giorni.
- Inizia a maneggiare il topo in una stanza tranquilla. Apri la gabbia e chiedi allo sperimentatore di mettere la mano all'interno della gabbia vicino al topo per 15-20 minuti per consentire al topo di abituarsi.
- Una volta che il topo mostra calma non spaventandosi o scappando dalle mani dello sperimentatore, raccogli delicatamente il topo per la manipolazione. Maneggiare il topo per 30-45 minuti ogni giorno prima dell'allenamento dell'imbracatura.
3. Allenamento con imbracatura
- Allenare i ratti per almeno 2-3 giorni nelle imbracature prima dell'impianto chirurgico dell'impianto cranico e del cappuccio.
- Disporre la configurazione dell'imbracatura come mostrato nella Figura 2A. Pulire la configurazione dell'imbracatura utilizzando salviette a etanolo.
NOTA: Tutte le imbracature sono cucite a mano e realizzate con un materiale di rete sul fondo o su entrambi i lati, come mostrato nella figura 2A, B. - Per l'addestramento dell'imbracatura, anestetizzare i ratti usando il 4% di isoflurano per l'induzione e l'1% per il mantenimento fino a quando non c'è il riflesso del pizzicamento della zampa posteriore.
- In anestesia con isoflurano, posizionare i ratti su un foglio di plastica flessibile di 20 cm x 8 cm (lunghezza x larghezza), dove 10 cm x 8 cm del foglio di plastica sono completamente coperti con la parte più morbida del Velcro.
NOTA: Anestetizzare i ratti per l'allenamento con l'imbracatura è un passaggio facoltativo, utilizzato principalmente per ridurre lo stress e l'ansia. - Per i primi 2 giorni dell'allenamento, metti il topo comodamente in un calzino per bambini (taglia 0-3 mesi) con la testa fuori attraverso un piccolo foro inciso all'estremità del calzino.
- Avvolgere un piccolo pezzo di tampone assorbente intorno alla parte inferiore del corpo per mantenere il ratto asciutto e raccogliere gli escrementi.
- Avvolgere il topo in un panno di cotone traspirante (dimensioni: 25 cm x 25 cm). Metti il topo su un foglio di plastica che ha Velcro strisce incollate ad esso.
- Fissare ulteriormente il ratto al foglio di plastica usando strisce Velcro larghe 0,5 cm ad una distanza di 3-6 mm l'una dall'altra.
- Fissare il topo nella fionda. Rimuovere l'anestesia gassosa. Consentire al ratto di riprendersi dall'anestesia gassosa nell'imbracatura.
- Quando il topo inizia a frullare, offri alcune gocce di soluzione di saccarosio al 10% come ricompensa ogni 10-15 minuti.
- Presentare casualmente al ratto gli stimoli sensoriali che verranno utilizzati durante l'imaging (qui la stimolazione dei baffi, ogni 15-25 minuti) per abituarlo agli stimoli sensoriali. Stimolare manualmente i baffi a intervalli casuali.
- Allena il topo nell'imbracatura per 1 ora il giorno 1, 2 ore il giorno 2 e 3 ore il giorno 3 come mostrato nella Figura 2C.
4. Preparazione prechirurgica
- Stampare l'impianto cranico e il cappuccio della testa utilizzando la stampante 3D (Figura 1).
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e i copricapi (impianti e cappucci) immergendo l'apparecchiatura nel germicida Metricide28 per 10 ore. Risciacquare accuratamente gli strumenti con acqua sterile poco prima dell'intervento.
- Esporre il ratto al 4% di isoflurano e quindi mantenere all'1% -2% di isoflurano fino a quando non c'è il riflesso del pizzicamento della zampa posteriore. Questo intervento chirurgico può essere eseguito sotto molti tipi di anestesia, come isoflurano, pentobarbital di sodio, e ketamina-xilazina.
- Iniettare atropina (0,05 mg/kg) per via intramuscolare per ridurre le secrezioni mucose per aiutare nella respirazione.
- Rasare la testa del ratto di 5 mm centrata attorno alla linea mediana usando un tagliacapelli partendo da tra gli occhi fino alla parte posteriore delle orecchie.
- Monitorare la saturazione parziale di ossigeno e la frequenza cardiaca attraverso un pulsossimetro e una sonda cardiofrequenzimetro fissata alla zampa posteriore del ratto.
- Pulire la testa del topo e l'area circostante tre volte con cicli alternati di betadine e salviette imbevute di alcool al 70%.
- Fissare il topo in un sistema stereotassico.
- Inserire una sonda rettale lubrificata con vaselina per misurare la temperatura corporea del ratto e mantenerla attraverso il sistema di feedback della coperta riscaldante per evitare l'ipotermia dopo la somministrazione di anestetico.
- Somministrare anestetico locale lidocaina cloridrato ad una concentrazione di 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 peso corporeo per via sottocutanea nel sito chirurgico.
- Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione.
- Somministrare il 2% di anestetico locale per via sottocutanea sul sito chirurgico.
- Iniettare 3 ml di soluzione di suoneria lattata a temperatura ambiente per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e fornire nutrimento durante l'intervento chirurgico.
5. Chirurgia
- Rimuovere la parte della pelle sopra il sito chirurgico (diametro di 4 mm centrato attorno alla linea mediana e al centro della testa) utilizzando forbici chirurgiche affilate. Sezionare e rimuovere parte della pelle (~ 2 mm di diametro, sopra la corteccia somatosensoriale sinistra) tra l'orecchio e l'occhio sulla parte temporale della testa.
- Rimuovere, utilizzando un bisturi, il tessuto cutaneo sottostante (pericranio) per esporre il cranio. Pulire il cranio con una garza di cotone sterilizzata.
- Ritrarre / resecare il muscolo temporale per esporre la dimensione desiderata per l'area di imaging [7,5 mm per 7,5 mm per questo studio].
- Esporre il cranio sull'emisfero controlaterale per l'impianto della testa. Posizionare l'impianto della testa sul cranio per accertare la posizione delle viti di ancoraggio per l'impianto, come mostrato in Figura 2D-F.
- Contrassegnare il teschio per forare le viti usando l'inchiostro indiano con la punta 1. Praticare i fori di bava per le viti utilizzando la punta del trapano dentale 3. Avvitare l'impianto della testa in posizione.
- Asciugare il cranio usando una garza sterile. Applicare un sottile strato di adesivo tissutale intorno e sotto l'impianto della testa per incollarlo al cranio. Applicare uno strato di cemento dentale per sostenere ulteriormente l'impianto della testa in posizione e lasciare asciugare il cemento per 2-3 minuti.
NOTA: L'uso di adesivo per tessuti in aggiunta al cemento dentale garantisce una forte tenuta8. - Utilizzando la punta 3 del trapano dentale, assottigliare un'area di 7,5 mm x 7,5 mm sul lato sinistro del cranio appena posteriore al bregma e laterale alla linea mediana. Assottigliare il cranio a ~50 μm come mostrato nella Figura 3A.
- Applicare un unguento antibiotico topico sul sito chirurgico e quindi coprirlo con un sottile strato di gomma siliconica per proteggere il cranio assottigliato, come mostrato nella Figura 3B. Coprire il sito chirurgico utilizzando il cappuccio della testa come mostrato nella Figura 3C. Fissarlo in posizione con i due piccoli pezzi di fili che attraversano sia l'impianto cranico che il cappuccio della testa come mostrato in Figura 3D, E. Applicare gomma siliconica per coprire la calotta della testa e il cranio per stabilizzare ulteriormente la cuffia sulla testa del ratto, come mostrato nella Figura 3F.
NOTA: La gomma siliconica fornisce una protezione aggiuntiva al cranio assottigliato. - Iniettare nel ratto flunixin meglumina (2,5 mg/kg) per via sottocutanea per la gestione del dolore e dell'infiammazione. Per prevenire l'infezione, iniettare enrofloxacina antibiotica Enrosite (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-0,01), per via intraperitoneale.
- Spostare il topo nella camera di recupero per aiutare a mantenere la temperatura corporea con una coperta riscaldante e una lampada di calore. Monitorare continuamente il ratto fino a quando non riprende conoscenza e può mantenere la recumenza sternale.
- Riportare il topo nella sua gabbia separata una volta che si è completamente ripreso.
- Per i prossimi 3 giorni, somministrare flunixina e buprenorfina per alleviare l'infiammazione e il dolore e arruolarsi per prevenire l'infezione due volte al giorno.
6. Imaging sveglio
- Anestetizzare il ratto con il 4% di isoflurano per l'induzione e l'1% per il mantenimento quando non c'è riflesso del pizzicamento della zampa posteriore. Iniettare acepromazina (0,3-0,5 mg/kg) per via sottocutanea.
NOTA: Questa concentrazione di acepromazina è inferiore a livelli di sedazione lievi e aiuta solo a mantenere calmi i ratti durante il processo di imaging. - Utilizzando strisce di Velcro personalizzate, fissare il ratto sul foglio di plastica utilizzato durante le procedure di allenamento. Avvolgere la parte inferiore del corpo usando un tampone di assorbimento e posizionare il ratto comodamente nell'imbracatura.
- Rimuovere la gomma siliconica. Rimuovere il cappuccio della testa rimuovendo i fili di fissaggio. Fissare il telaio della testa nell'impianto della testa come mostrato nella Figura 2G.
- Bloccare il telaio della testa in morsetti come mostrato nella Figura 2H, I.
- Rimuovere l'anestesia gassosa. Lavare l'area di imaging con soluzione salina 3x e pulire con una garza bagnata. Asciugare l'area di imaging e creare un pozzo, usando vaselina, attorno all'area di imaging. Riempire il pozzetto con soluzione salina sterilizzata e coprire con un vetrino (Figura 2E).
- Fare riferimento alle procedure di acquisizione per l'imaging ottico del segnale intrinseco, il protocollo di stimolazione dei baffi e l'analisi e la presentazione dei dati, che sono state discusse in dettaglio in precedenza 6,7.
- Durante l'esperimento, monitorare i ratti per segni di agitazione e irrequietezza, che possono essere ulteriormente ridotti coprendo gli occhi dei ratti con un panno morbido o una garza (opzionale).
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Representative Results
Vengono mostrati i segnali rappresentativi di imaging ottico di un singolo studio di un ratto anestetizzato e la risposta sommata (di 40 studi raccolti) di un ratto sveglio (Figura 4). L'intensità del segnale per la stimolazione a baffo singolo di un ratto sveglio può essere visualizzata a una soglia più alta rispetto al ratto anestetizzato, mostrando un segnale più forte dall'animale sveglio. I baffi C2 dei ratti vengono stimolati a 5 Hz per 1 s e la risposta funzionale viene visualizzata come una variazione frazionaria rispetto alla linea di base. Le aree più scure (al di sotto della soglia negativa) sono le principali aree di attività neuronale e le aree bianche luminose (sopra la soglia positiva) mostrano la risposta ossigenata del sangue alla stimolazione9. Le immagini sono allineate in modo che da sinistra a destra sia da rostrale a caudale (C) e dall'alto verso il basso sia la direzione da mediale a laterale (L), come mostrato dalle frecce.
Figura 1: Capo, impianto della testa e telaio della testa. (A) Il cappuccio della testa (vista dall'alto): il lato della vista superiore mostra la curvatura da allineare lungo la curvatura della testa per proteggere la testa; Le due parti rettangolari scavate servono per far passare i fili metallici attraverso il cappuccio della testa. (B) Il cappuccio della testa (vista in basso) mostra il taglio rettangolare più ampio per adattarsi alla barra superiore dell'impianto della testa e i due tagli perpendicolari per i fili per muoversi attraverso l'impianto e il cappuccio della testa per mantenerli in posizione. (C) Impianto di testa con i tre fori tagliati per le viti di ancoraggio. Le posizioni delle viti di ancoraggio sull'impianto della testa possono essere regolate in base alla testa del ratto. (D) Cuffia e impianto cranico (vista laterale); La vista laterale dell'impianto di testa mostra la barra rettangolare scavata dall'interno per consentire al filo di passare attraverso per ancorare il cappuccio alla protesi della testa. (E-G) Vista dell'impianto di testa ancorato nel cappuccio della testa attraverso un pezzo di filo; Vista in basso, vista laterale e vista dall'alto per mostrare come l'impianto cranico è montato all'interno del cappuccio. (H) Telaio della testa, (I) impianto della testa ancorato nel telaio della testa. La distanza tra due linee sulla scala (come mostrato dal rettangolo blu) è di 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: imbracature, impianto della testa e fissaggio del telaio della testa per l'imaging sveglio e fissato alla testa. (A,B) imbracatura personalizzata con materiale di rete solo per il fondo o per entrambi i lati; C) ratto posto sul foglio di plastica, fissato con strisce Velcro, durante l'addestramento dell'imbracatura; (D-F) vista superiore e laterale dell'impianto della testa su un cranio di ratto sopra l'emisfero controlaterale. Le linee tratteggiate mostrano l'area di imaging. Le viste superiore e laterale mostrano chiaramente i tre fori per fissare l'impianto della testa al cranio con la vite di ancoraggio. (E) La vista laterale mostra la barra cava attraverso la quale passa il filo per ancorare la calotta alla protesi della testa quando i ratti non sono ripresi. Una gamba del telaio della testa passava attraverso la parte cava dell'impianto della testa per l'imaging della corteccia del ratto. (G) Telaio della testa attraverso l'impianto della testa per ratti svegli e fissati con la testa. (H) Il telaio della testa attraverso l'impianto della testa con le sue due gambe bloccate per l'imaging sveglio, fissato alla testa (I) di ratti svegli e fissi con la testa durante le sessioni di imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Posizionamento dell'impianto di testa. (A) La preparazione del cranio sottile per l'imaging sveglio e fissato con la testa. (B) Impianto cranico fissato sul cranio di ratto e l'area di imaging del cranio sottile ricoperta con silicone di gomma. (C) Cuffia per la testa posizionata sull'impianto cranico. (D,E) Tappo per la testa ancorato all'impianto della testa utilizzando fili metallici rivestiti. (F) Il cappuccio e l'area circostante ricoperti di gomma-silicone per un ulteriore sostegno nella fissazione e nella protezione del cranio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risposte funzionali delle stimolazioni dei baffi C2. (A) Una risposta funzionale rappresentativa di prova singola di una stimolazione dei baffi C2 a 5 Hz per 1 s di imaging del ratto sveglio e fissato con la testa, con ogni prova della durata di 7 s con un intervallo inter-prova di 3 s ± 2 s. La soglia della rappresentazione in scala di grigi della variazione frazionaria rispetto al basale (da -3,5 × 10−3 a 3,5 × 10−3). (B) Una risposta funzionale rappresentativa di prova singola di una stimolazione baffare C2 a 5 Hz per 1 s di un ratto anestetizzato (pentobarbital di sodio). La soglia della rappresentazione in scala di grigi della variazione frazionaria rispetto al basale (da -2,5 × 10−4 a 2,5 × 10−4). La risposta funzionale del ratto sveglio e fissato con la testa è 140 volte più forte di quella del ratto anestetizzato. Ogni fotogramma è un fotogramma di 0,5 s. Le immagini sono allineate in modo che da sinistra a destra sia da rostrale a caudale e dall'alto verso il basso sia dalla direzione mediale a quella laterale come mostrato dalle frecce. Le aree più scure (al di sotto della soglia negativa) sono le principali aree di attività neuronale e le aree bianche luminose (sopra la soglia positiva) mostrano la risposta ossigenata del sangue alla stimolazione. Barra della scala = 1 mm. Abbreviazioni: C = caudale; L = laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: file di stampa 3D per l'impianto della testa. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: file di stampa 3D per il cappuccio. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'uso dell'imaging del ratto sveglio e fissato con la testa offre molti vantaggi in termini di facilità e personalizzazione. Le imbracature progettate su misura consentono ai ratti di essere avvolti attraverso materiale di rete traspirante, eliminando la necessità di racchiudere gli animali in camere di contenimento di plastica chiuse per lunghi periodi di tempo10,11. I ratti sono mantenuti calmi e senza stress per tutta la lunga durata delle successive sessioni di imaging utilizzando una dose molto bassa di acepromazina al di sotto dei livelli di lieve sedazione nei ratti (1,0-2,5 mg/kg)12. Per mantenere il ratto stabile ed eliminare ulteriormente gli artefatti di movimento durante le sessioni di imaging, vengono utilizzate Velcro strisce. Le strisce Velcro sono posizionate a 3-6 mm l'una dall'altra per evitare inutili costrizioni del corpo per lunghe ore. I ratti vengono addestrati e abituati con le imbracature in giovane età per garantire che rimangano calmi e comodi riposando nelle loro imbracature durante la preparazione e l'acquisizione dei dati. Sulla base dei risultati preliminari, i ratti giovani che pesano circa 150-175 g sono più facili e veloci da addestrare rispetto ai ratti più anziani.
L'impianto della testa sulla testa del ratto pesa solo 0,174 g e il cappuccio della testa rimovibile pesa 1,483 g. L'impianto della testa copre un'area da 0,5 cm a 1,5 cm su un emisfero, consentendo la completa accessibilità dell'altro emisfero per il neuroimaging. La dimensione del cappuccio della testa garantisce una copertura completa del sito chirurgico. I pesi dell'impianto cranico e del cappuccio non sembrano ostacolare la mobilità e le attività quotidiane e i ratti possono essere alloggiati insieme in gabbie standard. Utilizzando questo metodo di contenimento della testa e del corpo, i ratti possono essere ripresi per 2-3 ore ogni volta in giorni diversi per studi longitudinali. È possibile eseguire più sessioni di imaging su un singolo ratto per almeno fino a 3 mesi utilizzando questa configurazione. Ci vogliono un totale di 25 minuti per stampare in 3D l'impianto cranico e il cappuccio della testa. Le parti sono facilmente personalizzabili a seconda delle dimensioni del roditore e possono anche essere personalizzate per essere utilizzate nei topi. Per gli studi che richiedono la differenziazione dei ratti, diversi colori e materiali possono fornire una facile identificazione. Inoltre, la parte superiore del cappuccio può essere personalizzata per aggiungere simboli, numeri o lettere per una facile identificazione.
Ci sono diversi passaggi importanti per il successo dell'impianto e dell'imaging, il più importante dei quali è l'addestramento e l'assuefazione dei ratti. I ratti sono presentati in modo casuale con stimoli sensoriali per ridurre al minimo il potenziale di apprendimento associativo, che può influenzare i risultati dell'imaging. L'intervento chirurgico e tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterili per prevenire l'infezione e l'uso di antibiotici locali è imperativo. L'uso di acepromazina all'inizio dell'imaging è importante per mantenere gli animali calmi e tranquilli per evitare movimenti non necessari durante le sessioni di imaging. Il cranio del ratto deve essere asciutto per una corretta fissazione e lo strato di cemento dentale depositato deve essere abbastanza sottile da consentire al cappuccio di adattarsi all'impianto della testa.
Per il presente studio, l'area di imaging era centrata sulla corteccia somatosensoriale. L'area assottigliata misura circa 7,5 mm x 7,5 mm, che è l'estensione dell'area che può essere ripresa nello studio attuale. Tuttavia, l'area ripresa può essere aumentata a 11 mm x 11 mm, se necessario. Un altro vantaggio di questo design è che consente l'imaging dell'intera area assottigliata nonostante la curvatura della corteccia.
Gli impianti cranici precedentemente riportati richiedono quasi 7-12 viti di ancoraggio per fissare l'impianto della testa sulla testa del ratto13,14. Ciò preclude l'imaging di un'area più ampia attraverso la preparazione del cranio assottigliata. Un altro metodo di fissazione richiede la fissazione di un materiale in resina su una vasta area utilizzando viti a testa, rendendo il cranio inaccessibile per l'imaging14. L'imaging sveglio dei ratti mediante risonanza magnetica richiede l'immobilizzazione degli animali in tubi cilindrici, rendendo le esperienze di imaging stressanti per gli animali11,15. In alcune altre configurazioni, l'impianto della testa sporge dalla testa e potrebbe rimanere impigliato in gabbie standard16,17. L'impianto cranico e il cappuccio della testa eliminano l'uso della fissazione di vetrini e l'appiattimento del cranio sottile per l'imaging cronico18,19. Le dimensioni dell'impianto cranico e l'uso della curvatura sulla calotta della testa eliminano la necessità di apportare modifiche alle gabbie standard come in altre procedure croniche18,19. Gli impianti di testa nei topi sono più facili perché viene utilizzata solo una singola configurazione di dado e vite, che non è possibile nei ratti, poiché i ratti sono molto più forti e più difficili da mantenere fermi20.
Il limite dell'impianto della testa è che, nonostante le sue piccole dimensioni, richiede l'ancoraggio dell'impianto al cranio utilizzando viti. L'impianto della testa è necessario per mantenere ferma la testa dell'animale, ma limita l'imaging dell'intero cervello del ratto. Tuttavia, un vantaggio dell'utilizzo di questo impianto di testa è che può essere utilizzato per visualizzare un'area più ampia per la stimolazione sensoriale evocata utilizzando varie modalità di neuroimaging come l'imaging ottico a segnale intrinseco, la tomografia a coerenza ottica doppler e l'imaging a speckle laser.
Le rappresentazioni funzionali corticali basate su segnali intrinseci di ratti svegli e fissi con la testa tendono ad essere più forti in intensità rispetto ai ratti anestetizzati che utilizzano lo stesso protocollo di stimolazione dei baffi. Un simile aumento della forza della risposta intrinseca del segnale evocato è stato riportato nelle scimmie sveglie21,22. Attualmente sono in corso lavori per migliorare il design dell'impianto della testa e del cappuccio per ambienti più difficili come l'habitat naturalistico23.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha e Amirsoheil Zareh per il loro aiuto durante l'addestramento dei ratti e la preparazione delle imbracature. Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH, numero di sovvenzione: NS119852) e dalla Fondazione Leducq (numero di sovvenzione: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
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