Summary
Um novo procedimento detalhado para imagens funcionais de ratos acordados com a cabeça fixada é descrito.
Abstract
Os anestésicos, comumente usados em pesquisas pré-clínicas e científicas fundamentais, têm uma influência depressiva nas funções metabólicas, neuronais e vasculares do cérebro e podem influenciar negativamente os resultados neurofisiológicos. O uso de animais acordados para estudos de pesquisa é vantajoso, mas representa o grande desafio de manter os animais calmos e estacionários para minimizar artefatos de movimento ao longo da aquisição de dados. Imagens acordadas em roedores de tamanho menor (por exemplo, camundongos) são muito comuns, mas permanecem escassas em ratos, pois os ratos são maiores, mais fortes e têm uma maior tendência a se opor às restrições de movimento e fixação da cabeça durante as longas durações necessárias para a aquisição de imagens. Um novo modelo de neuroimagem de ratos acordados e fixados na cabeça usando tipoias personalizadas costuradas à mão, implantes de cabeça impressos em 3D, toucas de cabeça e uma estrutura de cabeça é descrito. Os resultados obtidos após uma única tentativa de estimulação com bigode único sugerem um aumento na intensidade da resposta funcional evocada. A aquisição da resposta funcional evocada de ratos acordados com a cabeça fixada é mais rápida do que a de ratos anestesiados, confiável, reprodutível e pode ser usada para estudos longitudinais repetidos.
Introduction
A maioria das investigações básicas, pré-clínicas e translacionais de neuroimagem científica é adquirida de animais anestesiados 1,2. Os anestésicos facilitam a experimentação, mas influenciam continuamente o metabolismo do cérebro e do corpo, a pressão arterial e a frequência cardíaca3. O tipo de anestésico, a duração e a via de administração adicionam variáveis de confusão à interpretação dos dados que podem contribuir para a reprodutibilidade e falhas translacionais4. Um grande gargalo dos estudos de neuroimagem em ratos acordados e fixados na cabeça é a necessidade de manter o rato estacionário e calmo durante todo o processo de preparação e aquisição de dados. Pequenos movimentos produzem artefatos de movimento injustificados, o que pode afetar negativamente a análise e a interpretação dos dados.
Um novo modelo de neuroimagem de ratos acordados e fixados na cabeça usando tipoias personalizadas, implantes de cabeça impressos em tridimensional (3D), toucas de cabeça e uma estrutura de cabeça foi desenvolvido que oferece várias vantagens para fácil experimentação. O implante de cabeça 3D é leve e cobre uma pequena porção do crânio necessária para a transfixação. Os implantes e tampas de cabeça impressos em 3D são projetados usando software CAD (computer-aided design). Os protocolos de estimulação com whisker, aquisição de dados, análise de dados e resultados de ratos anestesiados foram descritos em detalhes em trabalhos anteriores 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos estavam em conformidade com as diretrizes do National Institute of Health e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Irvine. Sete ratos machos e uma fêmea (Sprague-Dawley, peso: 185-350 g) foram utilizados neste estudo. Após a conclusão do estudo, os ratos foram sacrificados usando overdose de dióxido de carbono.
1. Projeto de diferentes componentes
- Projeto do implante de cabeça:
- Realizar o implante cefálico utilizando software CAD (Figura 1C) e projetá-lo para obter imagens da área posterior ao bregma e adjacente à linha média, centrada no córtex somatossensorial. Certifique-se de que o implante de cabeça cubra uma área de 0,9 mm a 1,9 mm no crânio longe da área de imagem.
- Use apenas três parafusos para ancorar o implante de cabeça no crânio do rato. Projete todos os orifícios do parafuso de modo que permaneçam no lado oposto da linha média no hemisfério contralateral do hemisfério imageado.
- Coloque uma barra, vazada por dentro, na parte superior do implante de cabeça para permitir que os fios fixem a tampa da cabeça ao implante de cabeça, como mostra a Figura 1D.
- Design da touca da cabeça:
- Certifique-se de que a calota cubra completamente a área de imagem e a proteja de qualquer tipo de trauma, como mostrado na Figura 1A, B. Adicione uma curvatura à touca para que ela se alinhe ao formato da cabeça sem causar dificuldade às atividades diárias do animal nas gaiolas enriquecidas padrão.
- Corte a parte interna da tampa da cabeça em uma forma retangular mais larga para que a parte superior do implante de cabeça possa se encaixar nela, como mostrado na Figura 1E. Perpendicularmente a esse retângulo, corte duas outras regiões retangulares para ancorar a calota craniana ao implante cefálico.
- Passar um fio através da barra oca superior do implante de cabeça para fixação da touca na cabeça do rato como mostrado na Figura 1E-G. Passe o segundo fio da mesma forma.
OBS: Estes fios podem ser facilmente removidos utilizando alicates ou pinças. Os arquivos de impressão 3D são fornecidos (formato de arquivo: STL) como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2.
- Projeto da estrutura da cabeça:
- Projete a estrutura da cabeça de forma que uma parte cortada possa se mover através da barra superior do implante de cabeça e seja fixada usando uma braçadeira.
- Incline a outra parte do corte para fornecer força extra para manter a cabeça do rato fixa para tornar o lado contralateral completamente acessível para aquisição de imagens. Para fins deste estudo, corte a chapa de aço com snips de estanho para produzir a armação da cabeça (Figura 1H, I).
NOTA: Esta parte também pode ser impressa em 3D.
2. Treinamento inicial de ratos
- Permitir que os ratos se aclimatem ao ambiente do biotério em suas gaiolas por 2-3 dias.
- Comece a manusear o rato em uma sala tranquila. Abra a gaiola e peça ao experimentador que coloque a mão dentro da gaiola perto do rato por 15-20 minutos para deixar o rato se habituar.
- Uma vez que o rato mostre calma por não se assustar ou fugir das mãos do experimentador, pegue suavemente o rato para manuseio. Manuseie o rato por 30-45 min todos os dias antes do treino de tipoia.
3. Treinamento de Sling
- Treine os ratos por pelo menos 2-3 dias nas tipoias antes da implantação cirúrgica do implante de cabeça e da touca de cabeça.
- Organize a configuração da tipoia conforme mostrado na Figura 2A. Limpe a configuração da tipoia usando lenços umedecidos a etanol.
NOTA: Todas as tipoias são costuradas à mão e feitas de um material de rede na parte inferior ou em ambos os lados, como mostrado na Figura 2A, B. - Para o treinamento da tipoia, anestesiar os ratos utilizando isoflurano a 4% para indução e 1% para manutenção até que não haja reflexo de pinça da pata traseira.
- Sob anestesia com isoflurano, colocar os ratos sobre uma folha plástica flexível medindo 20 cm x 8 cm (comprimento x largura), onde 10 cm x 8 cm da folha plástica é totalmente coberta com a parte mais macia da Velcro.
NOTA: Anestesiar os ratos para treinamento de tipoia é uma etapa opcional, usada principalmente para reduzir o estresse e a ansiedade. - Nos primeiros 2 dias do treinamento, coloque o rato aconchegante em uma meia de bebê (tamanho 0-3 meses) com a cabeça para fora através de um pequeno orifício incisado no final da meia.
- Enrole um pequeno pedaço de absorvente ao redor da parte inferior do corpo para manter o rato seco e coletar excrementos.
- Embrulhe o rato em um pano de algodão respirável (tamanho: 25 cm x 25 cm). Coloque o rato em uma folha de plástico que tenha Velcro tiras coladas nele.
- Fixe ainda mais o rato à folha de plástico usando tiras de Velcro de 0,5 cm de largura a uma distância de 3-6 mm uma da outra.
- Segure o rato na tipoia. Remova a anestesia gasosa. Permita que o rato se recupere da anestesia com gás na tipoia.
- Quando o rato começar a bater, ofereça algumas gotas de solução de sacarose a 10% como recompensa a cada 10-15 min.
- Apresente aleatoriamente ao rato os estímulos sensoriais que serão utilizados durante a aquisição de imagens (aqui estimulação com bigode, a cada 15-25 min) para acostumá-lo aos estímulos sensoriais. Estimule manualmente os bigodes em intervalos aleatórios.
- Treine o rato na tipoia por 1 h no dia 1, 2 h no dia 2 e 3 h no dia 3, como mostrado na Figura 2C.
4. Preparo pré-cirúrgico
- Imprima o implante de cabeça e a tampa da cabeça usando a impressora 3D (Figura 1).
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e cabeçotes (implantes e tampas) imergindo o equipamento no germicida Metricide28 por 10 horas. Enxágue bem as ferramentas com água estéril pouco antes da cirurgia.
- Expor o rato a 4% de isoflurano e, em seguida, manter a 1%-2% de isoflurano até que não haja reflexo de pinça da pata traseira. Essa cirurgia pode ser realizada sob vários tipos de anestesia, como isoflurano, pentobarbital sódico e quetamina-xilazina.
- Injetar atropina (0,05 mg/kg) por via intramuscular para reduzir as secreções mucosas para ajudar na respiração.
- Faça a barba da cabeça do rato 5 mm centrada em torno da linha média usando um aparador de cabelo começando entre os olhos até a parte de trás das orelhas.
- Monitore a saturação parcial de oxigênio e a frequência cardíaca através de um oxímetro de pulso e sonda do monitor de frequência cardíaca fixada na pata traseira do rato.
- Limpe a cabeça do rato e a área circundante três vezes com rodadas alternadas de betadina e lenços com álcool a 70%.
- Fixe o rato em um sistema estereotáxico.
- Inserir uma sonda retal lubrificada com vaselina para medir a temperatura corporal do rato e mantê-la através do sistema de feedback da manta de aquecimento para evitar hipotermia após a administração do anestésico.
- Administrar anestésico local cloridrato de lidocaína na concentração de 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 de peso corporal por via subcutânea no sítio cirúrgico.
- Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
- Administrar anestésico local a 2% por via subcutânea sobre o sítio cirúrgico.
- Injetar 3 mL de solução de ringer com lactato à temperatura ambiente por via subcutânea para evitar a desidratação e fornecer nutrição durante a cirurgia.
5. Cirurgia
- Remova a parte da pele sobre o sítio cirúrgico (4 mm de diâmetro centrado em torno da linha média e centro da cabeça) usando tesoura cirúrgica afiada. Dissecar e remover parte da pele (~2 mm de diâmetro, sobre o córtex somatossensorial esquerdo) entre a orelha e o olho na parte temporal da cabeça.
- Remover, usando um bisturi, o tecido subjacente da pele (pericrânio) para expor o crânio. Limpe o crânio com gaze de algodão esterilizada.
- Retrair/ressecção do músculo temporal para expor o tamanho desejado para a área de imagem [7,5 mm por 7,5 mm para este estudo].
- Expor o crânio no hemisfério contralateral para o implante de cabeça. Coloque o implante de cabeça no crânio para verificar a localização dos parafusos de ancoragem para o implante, como mostra a Figura 2D-F.
- Marque o crânio para furar os parafusos usando tinta indiana com broca 1. Faça os furos da broca para os parafusos usando broca dental broca 3. Rosqueie o implante de cabeça no lugar.
- Secar o crânio com gaze estéril. Aplique uma fina camada de adesivo de tecido ao redor e abaixo do implante de cabeça para colá-lo ao crânio. Aplique uma camada de cimento dental para apoiar ainda mais o implante da cabeça no lugar e deixe o cimento secar por 2-3 min.
OBS: O uso de adesivo tecidual em adição ao cimento dental garante uma forte fixação8. - Usando broca odontológica broca 3, fina uma área de 7,5 mm x 7,5 mm no lado esquerdo do crânio logo posterior ao bregma e lateral à linha média. Afinar o crânio até ~50 μm como mostrado na Figura 3A.
- Aplique pomada antibiótica tópica sobre o local cirúrgico e, em seguida, cubra-o com uma fina camada de borracha de silicone para proteger o crânio afinado, como mostrado na Figura 3B. Cobrir o sítio cirúrgico com a touca cefálica, conforme demonstrado na Figura 3C. Fixe-o no lugar com os dois pequenos pedaços de fios que atravessam o implante da cabeça e a tampa da cabeça, como mostrado na Figura 3D, E. Aplique borracha de silicone para cobrir a cabeça e o crânio para estabilizar a cabeça ainda mais na cabeça do rato, como mostrado na Figura 3F.
NOTA: A borracha de silicone fornece proteção adicional ao crânio afinado. - Injetar flunixina meglumina (2,5 mg/kg) no rato por via subcutânea para controlar a dor e a inflamação. Para prevenir a infecção, injetar o antibiótico Enrosite enrofloxacina (22,7mg/ml, 10mg/kg +/-.01), por via intraperitoneal.
- Mova o rato para a câmara de recuperação para ajudar a manter sua temperatura corporal com uma manta de aquecimento e uma lâmpada de calor. Monitorar o rato continuamente até que ele recupere a consciência e possa manter a decúbito esternal.
- Devolva o rato à sua gaiola separada assim que se recuperar totalmente.
- Nos próximos 3 dias, administrar flunixina e buprenorfina para aliviar a inflamação e dor e enrosita para prevenir a infecção duas vezes ao dia.
6. Imagem acordada
- Anestesiar o rato com isoflurano a 4% para indução e 1% para manutenção quando não houver reflexo de pinça da pata traseira. Injetar acepromazina (0,3-0,5 mg/kg) por via subcutânea.
NOTA: Esta concentração de acepromazina está abaixo dos níveis de sedação suaves e só ajuda a manter os ratos calmos durante todo o processo de imagem. - Usando tiras de Velcro personalizadas, fixe o rato na folha plástica usada durante os procedimentos de treinamento. Envolva a parte inferior do corpo usando uma almofada de absorção e coloque o rato confortavelmente na tipoia.
- Remova a borracha de silicone. Remova a tampa da cabeça removendo os fios de fixação. Fixe a estrutura da cabeça no implante de cabeça como mostrado na Figura 2G.
- Trave a moldura da cabeça em grampos como mostrado na Figura 2H, I.
- Remova a anestesia com gás. Lave a área de imagem com soro fisiológico 3x e limpe com gaze molhada. Seque a área de imagem e faça um poço, usando vaselina, ao redor da área de imagem. Preencher o poço com soro fisiológico esterilizado e cobrir com uma lâmina de vidro (Figura 2E).
- Referem-se aos procedimentos de aquisição de imagem óptica de sinal intrínseco, ao protocolo de estimulação com whisker, análise e apresentação dos dados, que foram discutidos em detalhes anteriormente 6,7.
- Durante todo o experimento, monitore os ratos em busca de sinais de agitação e inquietação, que podem ser ainda mais reduzidos cobrindo os olhos dos ratos com um pano macio ou gaze (opcional).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os sinais representativos de imagem óptica de um único ensaio de um rato anestesiado e a resposta somada (de 40 tentativas coletadas) de um rato acordado são mostrados (Figura 4). A intensidade de sinal para estimulação com um único bigode de um rato acordado pode ser visualizada em um limiar mais alto do que para o rato anestesiado, mostrando um sinal mais forte do animal acordado. Os bigodes C2 de ratos são estimulados a 5 Hz por 1 s, e a resposta funcional é apresentada como uma mudança fracionada em relação à linha de base. As áreas mais escuras (abaixo do limiar negativo) são as principais áreas de atividade neuronal, e as áreas brancas brilhantes (acima do limiar positivo) mostram a resposta do sangue oxigenado à estimulação9. As imagens são alinhadas de forma que da esquerda para a direita seja do rostral para o caudal (C) e de cima para baixo seja o sentido medial para lateral (L), como mostram as setas.
Figura 1: Touca, implante de cabeça e armação da cabeça. (A) A touca (vista superior): o lado da vista superior mostra a curvatura a alinhar ao longo da curvatura da cabeça para proteger a cabeça; As duas partes retangulares vazadas são para os fios metálicos passarem pela tampa da cabeça. (B) A touca (vista inferior) mostra o corte retangular mais largo para encaixar na barra superior do implante de cabeça e os dois cortes perpendiculares para que os fios se movam através do implante e a touca para mantê-los no lugar. (C) Implante de cabeça com os três orifícios cortados para os parafusos de ancoragem. As posições dos parafusos de ancoragem no implante de cabeça podem ser ajustadas de acordo com a cabeça do rato. (D) Touca e implante de cabeça (vista lateral); A vista lateral do implante de cabeça mostra a barra retangular vazada por dentro para permitir que o fio passe para ancorar a tampa da cabeça ao implante de cabeça. (E-G) Vista do implante de cabeça ancorado na tampa da cabeça através de uma peça de arame; vista inferior, vista lateral e vista superior para mostrar como o implante de cabeça é instalado dentro da tampa da cabeça. (H) Estrutura da cabeça, (I) Implante de cabeça ancorado na estrutura da cabeça. A distância entre duas linhas na escala (como mostrado pelo retângulo azul) é de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Tipoias, implante de cabeça e fixação da estrutura da cabeça para imagens acordadas e fixadas na cabeça. (A,B) Tipoia personalizada com material de rede para ambos os lados ou inferiores; (C) rato colocado sobre a folha plástica, fixado com tiras de Velcro, durante o treino de tipoia; (D-F) vistas superior e lateral do implante de cabeça em um crânio de rato acima do hemisfério contralateral. Linhas pontilhadas mostram a área de imagem. As vistas superior e lateral mostram claramente os três orifícios para fixar o implante de cabeça ao crânio com o parafuso de ancoragem. (E) A vista lateral mostra a barra oca através da qual o fio passa para ancorar a tampa da cabeça ao implante cefálico quando os ratos não são fotografados. Uma perna da estrutura da cabeça passou pela parte oca do implante da cabeça para obter imagens do córtex do rato. (G) Estrutura da cabeça através do implante de cabeça para ratos acordados e fixados na cabeça. (H) A estrutura da cabeça através do implante de cabeça com suas duas pernas presas para imagens acordadas e fixadas na cabeça (I) de ratos acordados e fixados na cabeça durante as sessões de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Colocação do implante cefálico. (A) O preparo fino do crânio para imagens acordadas e fixadas na cabeça. (B) Implante de cabeça fixado no crânio de rato e a área de imagem do crânio fino coberta com silicone de borracha. (C) Touca de cabeça colocada sobre o implante de cabeça. (D,E) Tampa de cabeça ancorada ao implante de cabeça usando fios metálicos revestidos. (F) A calota e a área circundante coberta com borracha-silicone para maior apoio na fixação e proteção do crânio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Respostas funcionais dos estímulos de whisker C2. (A) Uma resposta funcional representativa de um único ensaio de uma estimulação de bigode C2 de 5 Hz para 1 s de imagem de rato acordado e fixado na cabeça, com cada ensaio durando 7 s com um intervalo inter-ensaio de 3 s ± 2 s. O limiar de representação em tons de cinza da mudança fracionada da linha de base (−3,5 × 10−3 a 3,5 × 10−3). (B) Uma resposta funcional representativa de um único ensaio de uma estimulação com whisker C2 de 5 Hz por 1 s de um rato anestesiado (pentobarbital sódico). O limiar de representação em tons de cinza da mudança fracionada da linha de base (−2,5 × 10−4 a 2,5 × 10−4). A resposta funcional do rato acordado com a cabeça fixa é 140 vezes mais forte do que a do rato anestesiado. Cada quadro é um quadro de 0,5 s. As imagens são alinhadas de forma que da esquerda para a direita seja do rostral para o caudal e de cima para baixo seja do sentido medial para o lateral, como mostram as setas. As áreas mais escuras (abaixo do limiar negativo) são as principais áreas de atividade neuronal, e as áreas brancas brilhantes (acima do limiar positivo) mostram a resposta do sangue oxigenado à estimulação. Barra de escala = 1 mm. Abreviaturas: C = caudal; L = lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: arquivo de impressão 3D para o implante de cabeça. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2: arquivo de impressão 3D para a tampa da cabeça. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O uso de imagens de ratos acordados e com a cabeça fixa oferece muitas vantagens em termos de facilidade e personalização. As tipoias personalizadas permitem que os ratos sejam envolvidos através de material de rede respirável, eliminando a necessidade de envolver os animais em câmaras de retenção plásticas fechadas por longos períodos de tempo10,11. Os ratos são mantidos calmos e livres de estresse durante as longas durações de sucessivas sessões de imagem usando uma dose muito baixa de acepromazina abaixo dos níveis de sedação leve em ratos (1,0-2,5 mg/kg)12. Para manter o rato estável e eliminar ainda mais os artefatos de movimento durante as sessões de imagem, Velcro tiras são usadas. As tiras Velcro são colocadas a 3-6 mm umas das outras para evitar constrição corporal desnecessária por longas horas. Os ratos são treinados e habituados com tipoias em uma idade jovem para garantir que eles permaneçam calmos e confortáveis descansando em suas tipoias durante a preparação e aquisição de dados. Com base nos resultados preliminares, ratos jovens pesando cerca de 150-175 g são mais fáceis e rápidos de treinar do que ratos mais velhos.
O implante de cabeça na cabeça do rato pesa apenas 0,174 g, e a touca removível pesa 1,483 g. O implante de cabeça cobre uma área de 0,5 cm a 1,5 cm em um hemisfério, permitindo a acessibilidade completa do outro hemisfério para neuroimagem. O tamanho da calota garante a cobertura total do sítio cirúrgico. Os pesos do implante de cabeça e da touca não parecem prejudicar a mobilidade e as atividades diárias, e os ratos podem ser alojados juntos em gaiolas padrão. Usando este método de contenção da cabeça e do corpo, os ratos podem ser fotografados por 2-3 h cada vez em dias diferentes para estudos longitudinais. Várias sessões de imagem podem ser realizadas em um único rato por pelo menos até 3 meses usando essa configuração. Leva um total de 25 minutos para imprimir em 3D o implante de cabeça e a tampa da cabeça. As peças são facilmente personalizáveis dependendo do tamanho do roedor e também podem ser personalizadas para serem usadas em ratos. Para estudos que necessitem de diferenciação dos ratos, diferentes cores e materiais podem proporcionar fácil identificação. Além disso, a parte superior da tampa pode ser personalizada para adicionar símbolos, números ou letras para facilitar a identificação.
Existem várias etapas importantes para o sucesso do implante e da imagem, sendo a mais importante delas o treinamento e a habituação dos ratos. Os ratos são aleatoriamente apresentados a estímulos sensoriais para minimizar o potencial de aprendizagem associativa, o que pode influenciar os resultados de imagem. A cirurgia e todos os instrumentos cirúrgicos precisam ser estéreis para prevenir infecção, e o uso de antibióticos locais é imperativo. O uso de acepromazina no início da imagem é importante para manter os animais calmos e silenciosos para evitar movimentos desnecessários durante as sessões de imagem. O crânio do rato precisa estar seco para a fixação adequada, e a camada de cimento dentário depositado precisa ser fina o suficiente para que a tampa da cabeça caiba no implante da cabeça.
Para o presente estudo, a área de imagem foi centrada no córtex somatossensorial. A área delgaçada mede aproximadamente 7,5 mm x 7,5 mm, que é a extensão da área que pode ser visualizada no presente estudo. No entanto, a área da imagem pode ser aumentada para 11 mm x 11 mm, se necessário. Outra vantagem deste design é que ele permite a imagem de toda a área afinada, apesar da curvatura do córtex.
Implantes de cabeça previamente relatados requerem quase 7-12 parafusos de ancoragem para fixar o implante de cabeça na cabeça do rato13,14. Isso impede a obtenção de imagens de uma área maior através do preparo do crânio afinado. Outro método de fixação requer a fixação de material resinoso sobre uma grande área com parafusos cefálicos, tornando o crânio inacessível para exames deimagem14. A imagem de ratos acordados por RM requer imobilização dos animais em tubos cilíndricos, tornando as experiências de imagem estressantes para os animais11,15. Em algumas outras montagens, o implante cefálico se projeta para fora da cabeça e pode ficar emaranhado em gaiolas padrão16,17. O implante de cabeça e a touca eliminam o uso de fixação de lâminas de vidro e achatamento do crânio fino para exames de imagemcrônicos 18,19. O tamanho do implante cefálico e o uso de curvatura na touca eliminam a necessidade de mudanças nas gaiolas padrão, como em outros procedimentos crônicos18,19. Os implantes de cabeça em camundongos são mais fáceis, pois são utilizados apenas uma única configuração de porca e parafuso, o que não é possível em ratos, pois os ratos são muito mais fortes e difíceis de serem mantidosestáveis20.
A limitação do implante de cabeça é que, apesar de seu pequeno tamanho, requer a ancoragem do implante ao crânio por meio de parafusos. O implante de cabeça é necessário para manter a cabeça do animal estável, mas limita a imagem de todo o cérebro do rato. No entanto, uma vantagem do uso desse implante de cabeça é que ele pode ser usado para obter imagens de uma área mais ampla para estimulação sensorial evocada usando várias modalidades de neuroimagem, como imagem óptica de sinal intrínseco, tomografia de coerência óptica com doppler e imagem com pontilhado a laser.
As representações funcionais corticais baseadas em sinais intrínsecos de ratos acordados com a cabeça fixa tendem a ser mais fortes em intensidade do que em ratos anestesiados usando o mesmo protocolo de estimulação com bigodes. Um aumento semelhante na força da resposta do sinal intrínseco evocado foi relatado em macacos acordados21,22. Trabalhos atuais estão em andamento para melhorar o design do implante e da touca para ambientes mais desafiadores, como o habitat naturalista23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha e Amirsoheil Zareh por sua ajuda durante o treinamento dos ratos e preparação dos slings. O financiamento foi fornecido pelo National Institutes of Health (NIH, Grant Number: NS119852) e Leducq Foundation (Grant Number:15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
