Summary
Подробно описана новая процедура функциональной визуализации бодрствующих крыс с фиксированной головой.
Abstract
Анестетики, широко используемые в доклинических и фундаментальных научных исследованиях, оказывают депрессивное влияние на метаболические, нейронные и сосудистые функции мозга и могут отрицательно влиять на нейрофизиологические результаты. Использование бодрствующих животных для научных исследований выгодно, но создает серьезную проблему поддержания спокойствия и неподвижности животных, чтобы свести к минимуму артефакты движения во время сбора данных. Визуализация бодрствования у грызунов меньшего размера (например, мышей) очень распространена, но остается скудной у крыс, поскольку крысы крупнее, сильнее и имеют большую тенденцию противостоять ограничениям движения и фиксации головы в течение длительного времени, необходимого для визуализации. Описана новая модель нейровизуализации бодрствующих крыс с фиксированной головой с использованием сшитых вручную строп, напечатанных на 3D-принтере головных имплантатов, головных колпачков и каркаса головы. Результаты, полученные после одного испытания стимуляции одним усом, свидетельствуют об увеличении интенсивности вызванного функционального ответа. Приобретение вызванного функционального ответа у бодрствующих крыс с фиксированной головой происходит быстрее, чем у крыс, подвергшихся анестезии, надежно, воспроизводимо и может использоваться для повторных лонгитюдных исследований.
Introduction
Большинство базовых, доклинических и трансляционных научных исследований нейровизуализации получены от анестезированных животных 1,2. Анестетики облегчают эксперименты, но постоянно влияют на обмен веществ в мозге и организме, кровяное давление и частоту сердечных сокращений3. Тип анестетика, а также продолжительность и путь введения добавляют смешанные переменные к интерпретации данных, которые могут способствовать воспроизводимости и трансляционным сбоям4. Основным узким местом исследований нейровизуализации крыс в бодрствующем состоянии с фиксированной головой является требование сохранять крысу неподвижной и спокойной на протяжении всего процесса подготовки и сбора данных. Небольшие движения создают необоснованные артефакты движения, которые могут отрицательно сказаться на анализе и интерпретации данных.
Была разработана новая модель нейровизуализации от бодрствующих крыс с фиксированной головой с использованием индивидуальных строп, трехмерных (3D) напечатанных головных имплантатов, головных колпачков и каркаса головы, который предлагает несколько преимуществ для легкого экспериментирования. 3D-имплантат головы легкий и покрывает небольшую часть черепа, необходимую для перефиксации. Головные имплантаты и колпачки, напечатанные на 3D-принтере, разработаны с использованием программного обеспечения для автоматизированного проектирования (САПР). Протоколы стимуляции усов, сбора данных, анализа данных и результатов анестезированных крыс были подробно описаны в предыдущей работе 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры соответствовали рекомендациям Национального института здравоохранения и были одобрены Калифорнийским университетом, Комитетом по уходу за животными и их использованию. В этом исследовании использовались семь самцов и одна самка крысы (Sprague-Dawley, вес: 185-350 г). После завершения исследования крысы были принесены в жертву с использованием передозировки углекислого газа.
1. Проектирование различных компонентов
- Конструкция головного имплантата:
- Сделайте головной имплантат с помощью программного обеспечения САПР (рис. 1C) и спроектируйте его так, чтобы он визуализировал область позади брегмы и прилегающую к средней линии, сосредоточенную на соматосенсорной коре. Убедитесь, что головной имплантат занимает область от 0,9 мм до 1,9 мм на черепе вдали от области визуализации.
- Используйте только три винта, чтобы закрепить головной имплантат на черепе крысы. Спроектируйте все отверстия для винтов так, чтобы они оставались на противоположной стороне средней линии в контралатеральной полусфере изображаемой полусферы.
- Поместите стержень, выдолбленный изнутри, в верхнюю часть головного имплантата, чтобы провода могли фиксировать головную крышку к головному имплантату, как показано на рисунке 1D.
- Конструкция крышки:
- Убедитесь, что головной колпачок полностью закрывает область визуализации и защищает ее от любых травм, как показано на рисунке 1A, B. Добавьте кривизну к головной шапке, чтобы она соответствовала форме головы, не создавая трудностей для повседневной деятельности животного в стандартных обогащенных клетках.
- Вырежьте внутреннюю сторону головного колпачка более широкой прямоугольной формы, чтобы верхняя часть головного имплантата могла поместиться в него, как показано на рисунке 1E. Перпендикулярно этому прямоугольнику вырежьте две другие прямоугольные области, чтобы закрепить головную крышку к головному имплантату.
- Пропустите одну проволоку через верхний выдолбленный стержень головного имплантата для фиксации головного колпачка на голове крысы, как показано на рисунке 1E-G. Таким же образом пропустите второй провод.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти провода можно легко удалить с помощью плоскогубцев или щипцов. Файлы для 3D-печати предоставляются (формат файла: STL) в виде дополнительного файла 1 и дополнительного файла 2.
- Конструкция рамы головы:
- Спроектируйте каркас головы таким образом, чтобы одна разрезанная часть могла перемещаться через верхнюю планку имплантата головки и фиксироваться с помощью зажима.
- Наклоните другую срезанную часть, чтобы обеспечить дополнительную прочность для фиксации головы крысы, чтобы сделать контралатеральную сторону полностью доступной для визуализации. Для целей этого исследования разрежьте стальную пластину оловянными ножницами, чтобы получить раму головы (рис. 1H, I).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта деталь также может быть напечатана на 3D-принтере.
2. Начальная дрессировка крыс
- Дайте крысам акклиматизироваться к среде вивария в своих клетках в течение 2-3 дней.
- Начните обращаться с крысой в тихой комнате. Откройте клетку и попросите экспериментатора поместить руку в клетку рядом с крысой на 15-20 минут, чтобы крыса привыкла.
- Как только крыса проявит спокойствие, не испугавшись и не убежав от рук экспериментатора, осторожно возьмите крысу на руки. Обрабатывайте крысу в течение 30-45 минут каждый день перед тренировкой слинга.
3. Обучение стропе
- Тренируйте крыс не менее 2-3 дней в стропах перед хирургической имплантацией головного имплантата и головной шапочки.
- Организуйте настройку стропы, как показано на рисунке 2A. Очистите стропу с помощью салфеток на этаноле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все стропы сшиты вручную и изготовлены из сетчатого материала либо снизу, либо с обеих сторон, как показано на рисунке 2A, B. - Для обучения слингу обезболивайте крыс, используя 4% изофлурана для индукции и 1% для поддержания до тех пор, пока не исчезнет рефлекс защемления задней лапы.
- Под изофлурановой анестезией поместите крыс на гибкий пластиковый лист размером 20 см х 8 см (длина х ширина), где 10 см х 8 см пластикового листа полностью покрыты более мягкой частью Velcro.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивание крыс для обучения слингу является необязательным шагом, в основном используемым для снижения стресса и беспокойства. - В течение первых 2 дней обучения плотно укладывайте крысу в детский носок (размер 0-3 месяца) головой наружу через небольшое отверстие, надрезанное на конце носка.
- Оберните небольшой кусочек впитывающей прокладки вокруг нижней части тела, чтобы крыса оставалась сухой и собирала экскременты.
- Заверните крысу в дышащую хлопчатобумажную ткань (размер: 25 см х 25 см). Поместите крысу на пластиковый лист, к которому приклеены Velcro полоски.
- Далее закрепите крысу к пластиковому листу с помощью Velcro полосок шириной 0,5 см на расстоянии 3-6 мм друг от друга.
- Закрепите крысу в слинге. Снимите газовую анестезию. Дайте крысе оправиться от газовой анестезии в слинге.
- Когда крыса начнет взбивать, предлагайте несколько капель 10% раствора сахарозы в качестве награды каждые 10-15 минут.
- Случайным образом представьте крысе сенсорные стимулы, которые будут использоваться во время визуализации (в данном случае стимуляция усов, каждые 15-25 минут), чтобы она привыкла к сенсорным стимулам. Вручную стимулируйте усы через случайные промежутки времени.
- Тренируйте крысу в слинге в течение 1 часа в 1-й день, 2 часа во 2-й день и 3 часа в 3-й день, как показано на рисунке 2C.
4. Предоперационная подготовка
- Распечатайте имплантат головы и головной колпачок с помощью 3D-принтера (рис. 1).
- Стерилизуйте все хирургические инструменты и головные уборы (имплантаты и колпачки), погрузив оборудование в бактерицид Metricide28 на 10 часов. Тщательно промойте инструменты стерильной водой непосредственно перед операцией.
- Подвергните крысу воздействию 4% изофлурана, а затем поддерживайте уровень 1-2% изофлурана до тех пор, пока не исчезнет рефлекс защемления задней лапы. Эта операция может быть выполнена под многими видами анестезии, такими как изофлуран, пентобарбитал натрия и кетамин-ксилазин.
- Вводите атропин (0,05 мг / кг) внутримышечно, чтобы уменьшить слизистые выделения и помочь в дыхании.
- Побрейте голову крысы на 5 мм по центру вокруг средней линии с помощью триммера для волос, начиная между глазами и заканчивая задней частью ушей.
- Контролируйте частичное насыщение кислородом и частоту сердечных сокращений с помощью пульсоксиметра и датчика сердечного ритма, прикрепленного к задней ноге крысы.
- Трижды протрите голову крысы и прилегающую область чередующимися салфетками бетадина и 70% спирта.
- Зафиксируйте крысу в стереотаксической системе.
- Вставьте ректальный зонд, смазанный вазелином, чтобы измерить температуру тела крысы и поддерживать ее через систему обратной связи нагревательного одеяла, чтобы избежать переохлаждения после введения анестетика.
- Вводят местный анестетик лидокаина гидрохлорид в концентрации 20 мг/мл, 0,07 мг/кг +/-0,2 массы тела подкожно в месте операции.
- Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание.
- Вводят 2% местный анестетик подкожно над местом операции.
- Введите 3 мл раствора лактата Рингера комнатной температуры подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание и обеспечить питание во время операции.
5. Хирургия
- Удалите часть кожи над местом операции (диаметр 4 мм по центру вокруг средней линии и центра головы) с помощью острых хирургических ножниц. Рассекают и удаляют часть кожи (диаметром ~ 2 мм, над левой соматосенсорной корой) между ухом и глазом на височной части головы.
- Удалите с помощью скальпеля подлежащую кожную ткань (перикраниум), чтобы обнажить череп. Очистите череп с помощью стерилизованной ватной марли.
- Втяните/резецируйте височную мышцу, чтобы обнажить желаемый размер области визуализации [7,5 мм на 7,5 мм для этого исследования].
- Обнажите череп на контралатеральном полушарии для имплантата головы. Поместите головной имплантат на череп, чтобы определить расположение крепежных винтов для имплантата, как показано на рисунке 2D-F.
- Отметьте череп для сверления винтов с помощью India Ink с помощью сверла 1. Просверлите отверстия для винтов с помощью стоматологического сверла 3. Прикрутите головку имплантата на место.
- Высушите череп, используя стерильную марлю. Нанесите тонкий слой тканевого клея вокруг и под головным имплантатом, чтобы приклеить его к черепу. Нанесите слой стоматологического цемента для дальнейшей поддержки головного имплантата на месте и дайте цементу высохнуть в течение 2-3 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тканевого клея в дополнение к стоматологическому цементу обеспечивает прочную фиксацию8. - С помощью бормашины 3 тонко нарежьте область размером 7,5 мм x 7,5 мм на левой стороне черепа чуть позади брегмы и латерально по отношению к средней линии. Утончите череп до ~50 мкм, как показано на рисунке 3A.
- Нанесите мазь с антибиотиком на место операции, а затем покройте ее тонким слоем силиконовой резины, чтобы защитить истонченный череп, как показано на рисунке 3B. Накройте место операции головным колпачком, как показано на рисунке 3C. Зафиксируйте его на месте двумя небольшими кусочками проводов, проходящими через имплантат головки и крышку головы, как показано на рисунке 3D, E. Нанесите силиконовую резину, чтобы покрыть голову и череп, чтобы стабилизировать голову на голове крысы, как показано на рисунке 3F.
ПРИМЕЧАНИЕ: Силиконовый каучук обеспечивает дополнительную защиту истонченного черепа. - Вводите крысе меглюмин флуниксин (2,5 мг / кг) подкожно для лечения боли и воспаления. Чтобы предотвратить инфекцию, введите антибиотик энрофлоксацин (22,7 мг / мл, 10 мг / кг +/- 0,01) внутрибрюшинно.
- Переместите крысу в камеру восстановления, чтобы поддерживать температуру ее тела с помощью согревающего одеяла и нагревательной лампы. Постоянно наблюдайте за крысой, пока она не придет в сознание и не сможет поддерживать лежачее положение на грудине.
- Верните крысу в отдельную клетку, как только она полностью выздоровеет.
- В течение следующих 3 дней вводите флуниксин и бупренорфин для облегчения воспаления и боли и энрозит для предотвращения инфекции два раза в день.
6. Визуализация бодрствования
- Обезболивайте крысу 4% изофлураном для индукции и 1% для поддержания, когда нет рефлекса защемления задней лапы. Вводят ацепромазин (0,3-0,5 мг/кг) подкожно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта концентрация ацепромазина ниже уровня умеренного седативного эффекта и помогает только сохранять спокойствие крыс на протяжении всего процесса визуализации. - Используя индивидуальные полоски Velcro, закрепите крысу на пластиковом листе, используемом во время тренировочных процедур. Оберните нижнюю часть тела с помощью впитывающей прокладки и плотно поместите крысу в слинг.
- Удалите силиконовую резину. Снимите крышку головки, сняв фиксирующие провода. Закрепите каркас головы в головном имплантате, как показано на рисунке 2G.
- Зафиксируйте головную раму зажимами, как показано на рисунке 2H, I.
- Снимите газовую анестезию. Промойте область визуализации физиологическим раствором 3x и очистите влажной марлей. Высушите область визуализации и сделайте лунку с помощью вазелина вокруг области визуализации. Заполните лунку стерилизованным физиологическим раствором и накройте предметным стеклом (рис. 2E).
- Обратитесь к процедурам сбора данных для оптической визуализации внутреннего сигнала, протоколу стимуляции усов, а также анализу и представлению данных, которые подробно обсуждались ранее 6,7.
- На протяжении всего эксперимента следите за крысами на наличие признаков возбуждения и беспокойства, которые можно дополнительно уменьшить, закрыв глаза крыс мягкой тканью или марлей (по желанию).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показаны репрезентативные сигналы оптической визуализации из одного исследования крысы, подвергшейся анестезии, и суммарный ответ (из 40 собранных испытаний) бодрствующей крысы (рис. 4). Интенсивность сигнала для стимуляции одним усом бодрствующей крысы может быть визуализирована при более высоком пороге, чем для анестезированной крысы, демонстрируя более сильный сигнал от бодрствующего животного. Усы С2 крыс стимулируют с частотой 5 Гц в течение 1 с, а функциональная реакция отображается в виде дробного изменения по сравнению с исходным уровнем. Более темные области (ниже отрицательного порога) являются основными областями активности нейронов, а яркие белые области (выше положительного порога) показывают насыщенный кислородом ответ крови на стимуляцию9. Изображения выровнены таким образом, чтобы слева направо — от рострального к каудальному (C), а сверху вниз — от медиального до латерального (L) направления, как показано стрелками.
Рисунок 1: Шапочка головы, имплантат головы и рама головы. (A) Шапка головы (вид сверху): сбоку от вида сверху показана кривизна для выравнивания по кривизне головы для защиты головы; Две полые прямоугольные части предназначены для того, чтобы металлические провода проходили через крышку головки. (B) На головке (вид снизу) показан более широкий прямоугольный разрез, подходящий к верхней планке имплантата головки, и два перпендикулярных разреза для перемещения проводов через имплантат и крышку головки для удержания их на месте. (C) Имплантат головки с тремя вырезанными отверстиями для анкерных винтов. Положение анкерных винтов на головном имплантате можно регулировать в соответствии с головой крысы. d) головной колпачок и имплантат головы (вид сбоку); Вид сбоку на головной имплантат показывает прямоугольный стержень, выдолбленный изнутри, чтобы проволока могла пройти, чтобы закрепить головную крышку к головному имплантату. (Э-Г) Вид головного имплантата, закрепленного в головном колпачке через один кусок проволоки; Вид снизу, вид сбоку и вид сверху, чтобы показать, как имплантат головы устанавливается внутри головного колпачка. (H) Каркас головы, (I) имплантат головы, закрепленный в раме головы. Расстояние между двумя линиями на шкале (как показано синим прямоугольником) составляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стропы, имплантат головы и фиксация рамы головы для визуализации в бодрствующем состоянии с фиксированной головой. (A, B) Индивидуальная стропа с сетчатым материалом только для дна или с обеих сторон; (C) крыса, помещенная на пластиковый лист, закрепленный Velcro полосками, во время тренировки пращи; (D-F) вид сверху и сбоку головного имплантата на черепе крысы над контралатеральным полушарием. Пунктирными линиями показана область изображения. На видах сверху и сбоку отчетливо видны три отверстия для крепления головного имплантата к черепу с помощью анкерного винта. (E) На виде сбоку показан полый стержень, через который проходит проволока для крепления головного колпачка к головному имплантату, когда крысы не изображены. Одна ножка каркаса головы прошла через полую часть головного имплантата для визуализации коры крысы. (G) Каркас головы через имплантат головы для бодрствующих крыс с фиксированной головой. (H) Каркас головы через имплантат головы с двумя зажатыми ногами для визуализации бодрствующих крыс с фиксированной головой (I) бодрствующих крыс с фиксированной головой во время сеансов визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Установка имплантата головы. (A) Подготовка тонкого черепа к бодрствующей визуализации с фиксированной головой. (B) Имплантат головы, закрепленный на черепе крысы, и область визуализации тонкого черепа, покрытая резиновым силиконом. (C) Головная шапочка, установленная на головном имплантате. (Д,Е) Головная крышка крепится к головному имплантату с помощью металлической проволоки с покрытием. (F) Головная шапка и окружающая область покрыты резиной-силиконом для дополнительной поддержки в фиксации и защите черепа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Функциональные реакции стимуляции усов С2. (A) Репрезентативный функциональный ответ в одном испытании стимуляции усов C2 с частотой 5 Гц в течение 1 с визуализации крысы в бодрствующем состоянии с фиксированной головой, при этом каждое испытание длилось 7 с с межпробным интервалом от 3 с ± 2 с. Порог представления дробного изменения в оттенках серого по сравнению с исходным уровнем (−3,5 × 10−3 до 3,5 × 10−3). (B) Репрезентативный функциональный ответ однократного испытания стимуляции усов C2 с частотой 5 Гц в течение 1 с крысы, подвергшейся анестезии (пентобарбитал натрия). Порог представления дробных изменений в градациях серого от исходного уровня (−2,5 × 10−4 до 2,5 × 10−4). Функциональная реакция бодрствующей крысы с фиксированной головой в 140 раз сильнее, чем у анестезированной крысы. Каждый кадр представляет собой кадр продолжительностью 0,5 с. Изображения выровнены таким образом, чтобы слева направо — от рострального к каудальному, а сверху вниз — от медиального к латеральному направлению, как показано стрелками. Более темные области (ниже отрицательного порога) являются основными областями активности нейронов, а яркие белые области (выше положительного порога) показывают насыщенную кислородом реакцию крови на стимуляцию. Масштабная линейка = 1 мм. Сокращения: C = каудальный; L = боковой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: файл для 3D-печати головного имплантата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: файл для 3D-печати головки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование визуализации крыс в бодрствующем состоянии с фиксированной головой дает много преимуществ с точки зрения простоты и настройки. Специально разработанные стропы позволяют обернуть крыс дышащим сетчатым материалом, устраняя необходимость помещать животных в закрытые пластиковые удерживающие камеры на длительные периоды времени10,11. Крысы сохраняют спокойствие и отсутствие стресса в течение длительных последовательных сеансов визуализации с использованием очень низкой дозы ацепромазина ниже уровня легкой седации у крыс (1,0-2,5 мг / кг)12. Чтобы удержать крысу в устойчивом состоянии и еще больше устранить артефакты движения во время сеансов визуализации, используются полоски Velcro. Полоски Velcro располагаются на расстоянии 3-6 мм друг от друга, чтобы избежать ненужного сужения тела в течение долгих часов. Крыс обучают и приучают к стропам в молодом возрасте, чтобы они оставались спокойными и комфортно отдыхали в своих слингах во время подготовки и сбора данных. Исходя из предварительных результатов, молодые крысы весом около 150-175 г легче и быстрее поддаются дрессировке, чем крысы старшего возраста.
Головной имплантат на голове крысы весит всего 0,174 г, а съемный колпачок на голове весит 1,483 г. Головной имплантат занимает площадь от 0,5 см до 1,5 см на одном полушарии, обеспечивая полный доступ к другому полушарию для нейровизуализации. Размер головного колпачка обеспечивает полный охват места операции. Вес головного имплантата и головной крышки, по-видимому, не препятствует подвижности и повседневной деятельности, и крысы могут быть размещены вместе в стандартных клетках. Используя этот метод фиксации головы и тела, крыс можно визуализировать в течение 2-3 ч каждый раз в разные дни для лонгитюдных исследований. С помощью этой установки можно проводить несколько сеансов визуализации на одной крысе в течение как минимум 3 месяцев. На 3D-печать головного имплантата и головной крышки уходит в общей сложности 25 минут. Детали легко настраиваются в зависимости от размера грызуна, а также могут быть настроены для использования в мышах. Для исследований, требующих дифференциации крыс, различные цвета и материалы могут обеспечить легкую идентификацию. Кроме того, верхняя часть колпачка может быть настроена для добавления символов, цифр или букв для облегчения идентификации.
Существует несколько важных шагов для успешной имплантации и визуализации, наиболее важным из которых является обучение и привыкание крыс. Крысам случайным образом предъявляются сенсорные стимулы, чтобы свести к минимуму потенциал ассоциативного обучения, которое может повлиять на результаты визуализации. Операция и все хирургические инструменты должны быть стерильными, чтобы предотвратить инфекцию, и использование местных антибиотиков является обязательным. Использование ацепромазина в начале визуализации важно для поддержания спокойствия и тишины животных, чтобы избежать ненужных движений во время сеансов визуализации. Череп крысы должен быть сухим для правильной фиксации, а слой отложенного зубного цемента должен быть достаточно тонким, чтобы головная шапочка поместилась в головном имплантате.
В текущем исследовании область изображения была сосредоточена на соматосенсорной коре. Истонченная область имеет размеры примерно 7,5 мм x 7,5 мм, что является протяженностью области, которая может быть изображена в текущем исследовании. Однако при необходимости область изображения может быть увеличена до 11 мм x 11 мм. Еще одним преимуществом этой конструкции является то, что она позволяет визуализировать всю истонченную область, несмотря на искривление коры.
Ранее сообщалось, что головные имплантаты требуют почти 7-12 анкерных винтов для фиксации головного имплантата на голове крысы13,14. Это исключает визуализацию большей области за счет истонченного препарирования черепа. Другой метод фиксации требует фиксации смоляного материала на большой площади с помощью винтов с головкой, что делает череп недоступным для визуализации14. Визуализация крыс в бодрствовании с использованием МРТ требует иммобилизации животных в цилиндрических трубках, что делает визуализацию стрессовой для животных11,15. В некоторых других установках головной имплантат выступает из головы и может запутаться в стандартных клетках16,17. Головной имплантат и головной колпачок исключают использование фиксации предметных стекол и уплощения тонкого черепа для хронической визуализации18,19. Размер головного имплантата и использование искривления головного колпачка устраняют необходимость внесения изменений в стандартные кейджи, как и при других хронических процедурах18,19. Головные имплантаты у мышей проще, потому что используется только одна конфигурация гайки и винта, что невозможно у крыс, так как крысы намного сильнее и их труднее поддерживать в устойчивомсостоянии 20.
Ограничением головного имплантата является то, что, несмотря на его небольшие размеры, он требует крепления имплантата к черепу с помощью винтов. Имплантат головы необходим для того, чтобы голова животного оставалась устойчивой, но ограничивает визуализацию всего мозга крысы. Однако преимущество использования этого головного имплантата заключается в том, что его можно использовать для визуализации более широкой области для вызванной сенсорной стимуляции с использованием различных методов нейровизуализации, таких как оптическая визуализация внутреннего сигнала, допплеровская оптическая когерентная томография и лазерная спекл-визуализация.
Корковые функциональные представления, основанные на внутренних сигналах бодрствующих крыс с фиксированной головой, как правило, сильнее по интенсивности, чем у анестезированных крыс, использующих тот же протокол стимуляции усов. Аналогичное увеличение силы вызванного внутреннего сигнального отклика было зарегистрировано у бодрствующих обезьян21,22. В настоящее время продолжается работа по улучшению конструкции головного имплантата и головной крышки для более сложных условий, таких как натуралистическая среда обитания23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Мы выражаем благодарность Кларе Джонс, Джеймсу Стирволту, Линь Хоангу, Янг Джун Ха и Амирсохейлу Заре за их помощь во время дрессировки крыс и подготовки пращ. Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (NIH, номер гранта: NS119852) и Фондом Leducq (номер гранта: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
