Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

צור רגישות יתר כמודל מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD). CHS מבוסס על רגישות עם hapten תגובתי על ידי צביעת העור המגולח של החזה והבטן, עם אתגר עור אוזן לאחר מכן עם hapten מדולל, הגורם לתגובת נפיחות כי הוא מוערך בדרכים שונות.

Abstract

רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD) שניתן לחקור בעכברים. מחקר זה נועד להציג שיטת מעבדה אובייקטיבית שעשויה לסייע בחקר תגובת CHS בעכברים, אותה ניתן למדוד ולכמת על ידי בדיקות שונות. כדי לגרום ל-CHS, ביום "0", עכברים היו רגישים לנקודה מגולחת קודם לכן על ידי צביעת עור בטן עם תערובת הפטן 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן (TNCB) בתערובת אצטון-אתנול, בעוד שעכברי בקרה שלילית היו רגישים לתערובת אצטון-אתנול לבדה ברכב. ביום "4", עובי האוזן הבסיסי נמדד במיקרומטר לפני ההתעוררות של CHS (אתגר) על ידי צביעת שתי האוזניים עם TNCB מדולל הן בקבוצות הבדיקה והן בקבוצות הביקורת. לאחר 24 שעות נמדדה נפיחות האוזן במיקרומטר. CHS הוא דוגמה לתגובה חיסונית בתיווך תאי T הגורמת לנפיחות ברקמה מודלקת, המגיעה לשיא של 24 שעות לאחר אתגר העור עם אותו הפטן. עלייה בצקת אוזניים מתואמת עם משקל אוזניים מוגבר, פעילות מיאלופרוקסידאז (MPO), ריכוז ציטוקינים פרו-דלקתיים בתמציות האוזניים, עיבוי מוגבר של הדרמיס האדמטי בבדיקה ההיסטולוגית וחדירות כלי הדם באוזן. כמו כן, נרשמה עלייה בריכוז נוגדני IgG1 ספציפיים ל-TNP בסרה של קבוצת הבדיקה בהשוואה לעכברי הביקורת. בנוסף, ניתן להעביר CHS בהצלחה עם תאי CHS-effector המתקבלים מתורמים שהיו רגישים בעבר ל-TNCB. התאים המשפיעים על CHS ניתנו תוך ורידי לעכברים נמענים תמימים, אשר לאחר מכן אותגרו עם אותו הפטן מדולל. נפיחות באוזן נמדדה במיקרומטר 24 שעות לאחר מכן.

Introduction

דרמטיטיס במגע אלרגי (ACD) היא מחלה דלקתית נפוצה בעור במדינות מתועשות הנגרמת על ידי תגובת רגישות יתר מסוג IV הנובעת מחשיפה לכימיקלים במשקל מולקולרי נמוך הנקראים הפטנס. החומרים הגורמים לרגישות למגע בבני אדם כוללים יוני מתכות כבדות (כרום, ניקל, ברזל, קובלט), טרפנטין, חומרי ריח, צבעים וחומרים משמרים הנמצאים במוצרי קוסמטיקה (למשל, p-פנילנדיאמין), תרופות מסוימות (למשל, ניאומיצין, בנזוקאין), אנטיביוטיקה β-לקטם (כלומר, פניצילין), כימיקלים המיוצרים על ידי צמחים (pentadecacatechol, חומר הנמצא בקיסוס רעיל), כמו גם הידרוקינון המשמש בתעשיית הצילום 1,2 . חומרים אטיולוגיים ACD גבוהים מאוד מכיוון שיותר מ-100,000 כימיקלים משמשים בתעשייה בלבד, ו-2,000 כימיקלים חדשים מסונתזים מדי שנה. עד כה זוהו יותר מ-3,700 מולקולות שעשויות להיות מגע עם הפטנים/אלרגנים3. תגובת רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של ACD שניתן לחקור בעכברים, שרקנים וחולדות וניתן לגרום לה על ידי יישום עור מקומי של הפטנים כימיים תגובתיים המומסים בממסים אורגניים 4,5,6. מחקר זה נועד לתאר שיטת מעבדה אובייקטיבית שעשויה לסייע בחקר תגובת CHS בעכברים, אותה ניתן למדוד ולכמת על ידי בדיקות שונות.

ה-CHS מורכב משלבי רגישות (אינדוקציה) ואפקטור (אתגר). במודלים של בעלי חיים, הפטנים נקשרים תחילה באופן קוולנטי לחלבונים בגוף כדי ליצור ניאו-אנטיגנים. במהלך שלב הרגישות, קרטינוציטים מופעלים מקדמים את הנדידה וההבשלה של תאים דנדריטיים בעור (sDCs) על ידי ייצור ציטוקים פרו-דלקתיים-נמק סרטניים α (TNF-α) ואינטרלוקין 1β (IL-1β)7. תאי לנגרהנס אפידרמליים (LCs) מציגים אנטיגנים במהלך אינדוקציה CHS ושלבי אפקטור8. LCs שנחשפו להפטן במהלך הרגישות מקדמים את האינדוקציה של תאי הוויסות והאפקט9. עדויות הולכות וגוברות ממספר מחקרים מצביעות על כך שתגובות CHS ניתנות לתיווך על ידי תאי Th1 מוגבלים מסוג CD4+ MHC Class II, המשחררים באופן מקומי אינטרפרון-γ (IFN-γ) כדי להשתמש בהחדרה דלקתית אופיינית, לימפוציטים מוגבלים ב-Tc1 מסוג CD8+ MHC מסוג I שיכולים גם לשחרר Γ IFN אך בעיקר לתווך נזק ציטוטוקסי לקרטינוציטים, וכעת גם אינטרלוקין 17 (IL-17)-המייצרים תאי Th1710, 11.

פותחו מספר מודלים שונים של CHS המשתמשיםבמינים שונים 1 2,13,14 והפטנים (השוואה מפורטת של הפטנים, ממסים שונים וזמן היישום מסוכמת בטבלה 1). העכבר, מין מעבדה הנפוץ, מציע כמה יתרונות בחקר CHS. ישנם יותר זנים, נוקאאוטים (KO) ובעלי חיים מהונדסים בקרב עכברים בהשוואה למינים אחרים, מה שהופך אותם לחיה מושכת מאוד15. בנוסף, מודל CHS דורש בעלי חיים רבים, ועכברים הם חסכוניים יותר כאן. מודלים של בעלי חיים אינם מחקים ACD בכל ההיבטים; בפרט, הם מראים קרום ו desquamation, אשר אינו נפוץ עבור בני אדם 16,17. המאפיינים של מחלה כרונית הם מאתגרים להתרבות, בעיקר משום המודל המתואר אינו מניח את היישום של hapten במשך תקופה ארוכה של זמן. עם זאת, אושר כאן כי רבים מההיבטים המשמעותיים של ACD משוחזרים. כמו כן הוכח כי, כמו בבני אדם, תכונות אלה קשורות לתגובות אלרגיות מקומיות. הבחירה של hapten, הממס שלה, ואת היישום שלה המתואר בפרוטוקול זה הוכתבו על ידי העובדה כי התוצאות אושרו על ידי בדיקות מבחנה רבות וכי הוא נבדק ושונה במעבדה במשך שנים רבות עד הגרסה הנוכחית הוקמה. מודלים של מורין מאפשרים ניתוח של תת-קבוצות תאים או ציטוקינים המעורבים בפיתוח ACD וחיוניים להערכות פרה-קליניות של טיפולים חדשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שהוצגו במאמר זה נערכו על פי הנחיות הוועדה האתית המקומית הראשונה לניסויים בבעלי חיים בקרקוב. כל ההליכים שתוארו בוצעו על פי ההמלצות המקומיות, במיוחד לגבי שימוש בקטמין/קסילאזין כחומר הרדמה, שימוש בשני צידי האוזניים למריחת החומר/הפטן, חיתוך האוזן ואיסוף דם על ידי הסרת גלגל העין. BALB/c (הפלוטיפ H-2d), CBA/J (H-2k) ו-C57BL/6 (H-2b) עכברים זכרים ונקבות, בני 6-12 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי (ראו טבלת חומרים). עבור מובהקות סטטיסטית, עדיף שכל קבוצת עכברים מורכבת מ-10-12 בעלי חיים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. נקו את שולחן הניתוחים עם תמיסת אתנול של 70% לפני ואחרי כל ההליכים. אם אתם משתמשים בעכברים הדורשים תנאים סטריליים, בצעו את כל הפעולות בארון בטיחות ביולוגית.

2. סימון עכברים לצורך זיהוי

  1. תייג את העכברים על ידי גילוח העור עם סכין גילוח: #0 - לא מסומן, #2 - על הכפה הקדמית הימנית, #3 - בצד ימין, #4 - על הכפה האחורית הימנית, #5 - בבסיס הזנב, #6 - על הכפה האחורית השמאלית, #7 - בצד שמאל, #8 - על הכפה הקדמית השמאלית.
    הערה: בשל התגובה המושרה, לא ניתן לסמן עכברים באופן קלאסי על ידי ניקוב או תיוג אוזניים. העכברים לא הורדו בעת התיוג.

3. אינדוקציה של CHS

הערה: הליך זה מתואר באיור 1.

  1. בצע את הרגישות (אינדוקציה) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. ביום "0", לגלח עכברים על החזה והבטן (מרובע 2 ס"מ x 2 ס"מ) על ידי מריחת סבון אפור עם מים וגילוח עם סכין גילוח.
      הערה: לפני מריחת hapten, יש להמתין 6 שעות כדי שהעור לא יהיה מגורה.
    2. הכן 5% hapten: 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB, ראה טבלת חומרים) בתערובת אצטון-אתנול (יחס 1:3) או רכב בלבד (אצטון-אתנול). הכינו תמיסות ממש לפני השימוש בבקבוקון זכוכית והגנו עליו מפני אור על ידי כיסוי הבקבוקון ברדיד אלומיניום.
    3. באותו יום, הרגישו את העכברים על ידי מריחת 150 μL של 5% hapten על הנקודה המגולחת בעבר. בקבוצת עכברי הביקורת, יש למרוח את הרכב לבדו כדי להעריך את התגובה הדלקתית הלא ספציפית. לפני שאתם מחזירים את החיה לכלוב, חכו 30 שניות, ותנו להפטן להתייבש.
      אזהרה: השתמש בכפפות; TNCB גורם לתגובה אלרגית קשה אצל רוב האנשים.
  2. בצעו את ההתעוררות (אתגר) ואת מדידת הנפיחות באוזן.
    1. ביום "4", הכינו 0.4% hapten: TNCB בתערובת אצטון-אתנול (יחס 1:1). הכינו את התמיסה ממש לפני השימוש בבקבוקון זכוכית והגנו עליו מפני אור על ידי כיסוי הבקבוקון ברדיד אלומיניום.
    2. מרדימים את העכברים בהזרקה תוך-צפקית (i.p.) של תערובת של קטמין (90-120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים) להרדמה עמוקה. ודא שהעכבר מורדם במלואו למשך 5 דקות לפחות על ידי צביטה בבוהן.
    3. מדוד את עובי האוזן (מדידה של 0 שעות, קו בסיס) באמצעות מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) על ידי צופה שאינו מודע לקבוצות הניסוי.
    4. יש למרוח 10 μL של 0.4% hapten על שני צידי האוזניים בשתי הקבוצות (בדיקה ובקרה). לפני שאתם מחזירים את החיה לכלוב, חכו 30 שניות ותנו להפטן להתייבש.
    5. ביום "5", 24 שעות לאחר יישום הפטן, חזור על שלבים 3.2.2-3.2.3 למדידת 24 שעות.
    6. הערך את תגובת ה- CHS על ידי חישוב ההבדל בעובי האוריקל לפני ואחרי האתגר עם הפטן: עובי אוזן 24 שעות (μm) - עובי אוזן 0 שעות (μm). ספרו כל אוזן כמדידה נפרדת. לאחר מכן, ביטאו את נפיחות האוזן במיקרומטרים (μm) ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) (טבלה 2, איור 3).

4. ביופסיות אוזניים

  1. מיד לאחר המדידה של 24 שעות של עובי האוזן (כאשר העכבר עדיין נמצא בהרדמה עמוקה), חתכו את האוזניים קרוב ככל האפשר לגולגולת עם מספריים. אספו את הביופסיות מהצד הדיסטלי של האוזניים על ידי יצירת אגרוף בקוטר 6 מ"מ באמצעות אגרוף ביופסיה (ראו טבלת חומרים).
    1. מדוד את משקל האוזן (שלב 4.2) ובנוסף בצע אחת מהבדיקות הבאות על אותה ביופסיה של האוזן: בדיקת מיאלופרוקסידאז (MPO) (שלב 4.3) או מדידה במבחנה של ריכוז הציטוקינים בתמציות האוזן (למשל, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [שלב 4.4]).
      הערה: חתכו את האוזניים לפני איסוף הדם. לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  2. מדוד את המשקל של כל ביופסיה של אוזן על המאזן האנליטי ובטא אותו במיליגרם (מ"ג) (איור 4).
  3. בצע בדיקת MPO בהתאם לשלבים הבאים.
    1. הכן מאגר הומוגניזציה על ידי המסת 0.5% הקסאדצילטרימתילמוניום ברומיד ב 50 mmol זרחן חיץ KH2PO4/Na2HPO4 והתאמת ה- pH ל- 6.0 (השתמש בטמפרטורת החדר, RT).
    2. הומוגניזציה של הביופסיות בצינורות מיקרו-צנטריפוג' של 2 מ"ל עם 500 μL של חיץ מוכן למשך 10 דקות באמצעות הומוגנייזר עם חרוזי נירוסטה בקוטר 5 מ"מ (הוסף שני חרוזים/בקבוקון) (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, קררו את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והומוגניים אותה למשך 10 דקות נוספות.
      הערה: לצינורות Microcentrifuge יש תחתית עגולה כך שהחרוזים יכולים לנוע בקלות.
    3. להקפיא את ההומוגנאטים ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הפשרה ומערבולת (יש לוודא שהדגימות מופשרות). חזור על הליך זה 3x.
    4. צנטריפוגה ההומוגנטים ב 3,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F). קוצרים את הסופרנאטים עם פיפטה. להביע את פעילות ה- MPO ביחידות (U) לכל 1 מ"ג חלבון.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. הדגימות יציבות בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך 3 חודשים.
    5. כדי למדוד את פעילות ה-MPO, בצעו תגובה אנזימטית על ידי ערבוב של 20 μL של סופרנטנט ו-200 μL של מצע MPO (0.167 מ"ג/מ"ל של אורתו-דיאניסין דיהידרוכלוריד ב-50 מילימול של KH2PO4/Na2HPO4 buffer עם 5 x 10−4% H202) והוסיפו ל-96 צלחות שטוחות-תחתית שטוחות. דגירה של הצלחות למשך 20 דקות ב- RT.
    6. הכן את העקומה הסטנדרטית על ידי שימוש ב- 20 μL של תקן MPO בריכוזים מ- 0.008 U עד 0.5 U ב- 200 μL של מצע ה- MPO. הכן את הדגימה הריקה עם מצע ה- MPO בלבד.
      אזהרה: השתמשו במסכה תוך כדי עבודה עם אורתו-דיאניסין דיהידרוכלוריד.
      הערה: הלוחות חייבים להיות עשויים מפוליפרופילן, בעל יכולת קשירה נמוכה יותר כך שחלבונים או DNA לא ייקשרו.
    7. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) באורך גל של λ = 460 ננומטר. התגובה האנזימטית יציבה במשך 10 דקות. קרא את פעילות ה- MPO בדגימות שנבדקו מהעקומה הסטנדרטית.
    8. כדי למדוד את ריכוז החלבון, השתמשו ב-20 μL של ה-supernatant, ערכו בדיקה עם ערכת חומצה ביצינכונינית לקביעת חלבונים (ראו טבלת חומרים), ומדדו את ה-OD ב-λ = 562 ננומטר (איור 5).
  4. לבצע מדידה במבחנה של ציטוקינים בתמצית האוזן.
    1. הומוגניזציה של ביופסיות האוזן ב-RT בצינורות מיקרו-צנטריפוג' של 2 מ"ל עם ריאגנט מיצוי חלבון רקמה (T-PER) של 500 μL למשך 10 דקות באמצעות הומוגנייזר עם חרוזי נירוסטה בקוטר 5 מ"מ (הוסיפו שני חרוזים/בקבוקון). לאחר מכן, קררו את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והומוגניים אותה למשך 10 דקות נוספות.
      הערה: לצינורות Microcentrifuge יש תחתית עגולה כך שהחרוזים יכולים לנוע בקלות.
    2. צנטריפוגה ההומוגנטים ב 3,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (64 °F).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. הדגימות יציבות בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
    3. הערך את רמות הציטוקינים באמצעות ערכת ELISA הזמינה מסחרית (לדוגמה, IFN-γ) (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן (איור 6).

5. היסטולוגיה של רקמת האוזן

  1. מיד לאחר המדידה של 24 שעות של עובי האוזן, כאשר העכבר עדיין מורדם עמוקות, חתכו את האוזניים קרוב ככל האפשר לגולגולת עם המספריים (שלב 4.1).
    הערה: לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  2. בצע הטבעת פרפין של בלוקי הרקמה בהתאם לשלבים הבאים.
    1. מיד לאחר ההסרה, מכניסים את האוזן לכ-10 מ"ל של 10% פורמלין למשך 24 שעות.
    2. מכניסים את האוזניים לקלטת עיבוד רקמות. שים את הקסטות במעבד אוטומטי (ראה טבלת חומרים) למחזורי התייבשות (אלכוהול 70%, 90%, 100%, 30 דקות כל אחד ב- RT), מחזורי ניקוי (קסילן 3x, 30 דקות כל אחד ב- RT), ומחזורי חדירת שעווה (פרפין 3x, 30 דקות כל אחד ב- 56 °C).
    3. הסר את הקלטות מהמעבד האוטומטי, והחזק את לוחית החימום עד שתידרש. ממלאים את תבנית השעווה בשעווה חמה (מהמתקן).
    4. הסר את החלקים מהקלטת עם מלקחיים מחוממים והניח אותם בתבנית; לאחר מכן, מניחים את בסיס הקלטת בחלק העליון של התבנית ולאחר מכן ממלאים בשעווה נוספת. מניחים אותו במים צוננים על צלחת קרה למשך 30 דקות, כך שהפרפין מתמצק ויוצר גוש המכיל את הדגימה.
    5. השתמש במיקרוטום סיבובי (ראה טבלת חומרים) כדי לחתוך מקטעים בעובי של כ-5 מיקרומטר. צפו את החלקים באמבטיה חמה כדי לשטח אותם. הרימו את החלקים על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. אפשרו להם להתייבש ב-RT כדי לוודא שהמקטעים נצמדים לשקופית.
      הערה: השתמש בשקופיות המבטלות את הצורך ליישם חומרי דבק או ציפויי חלבון כדי למנוע אובדן של חלקי רקמה במהלך הכתמה.
  3. בצעו צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E).
    1. הכינו 17 כלים מכתימים עם הדברים הבאים: קסילן (ארבע מנות), 100% אתנול (אלכוהול מוחלט) (ארבע מנות), 90% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול, 50% אתנול, PBS (שלוש מנות), תמיסת המטוקסילין, תמיסת אאוזין. העבר את השקופיות ממנה אחת לאחרת בהתאם לשלבים הבאים, ובצע את הכל ב- RT.
      הערה: ניתן לחזור על ההליך בכל מנה בערך פי 10 (למשל, אם משתמשים במנה של 20 שקופיות, ניתן להכין 200 כתמים מבלי לשנות את הנוזלים).
    2. Deparaffinize את החלקים על ידי דגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 30 דקות באינקובטור. טבלו את השקופיות בקסילן למשך 30 דקות. חוזרים על 1x בקסילן חדש למשך 30 דקות.
    3. טבלו את השקופיות ב-100% אתנול למשך 5 דקות. חזרו על 1x ב-100% אתנול חדש למשך 5 דקות. טבלו את השקופיות בשורת האתנול, 90%, 80%, 70% ו-50%, למשך 2 דקות בכל דילול.
    4. יש לטבול את השקופיות במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) למשך 5 דקות. נגבו את עודפי הנוזלים מסביב לרקמה ומהצד האחורי של המגלשות.
    5. הכתימו את החלקים בתמיסת המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 7-8 דקות. יש לשטוף במים זורמים במשך 30 שניות מהצד האחורי כדי לא לפגוע בקטעים. חזור על שלב 5.3.4.
    6. הכתימו את החלקים בתמיסת eosin (ראו טבלת חומרים) למשך 30 שניות. יש לשטוף כאמור בשלב 5.3.5 ולאחר מכן חזור על שלב 5.3.4.
    7. טבלו את השקופיות ב-100% אתנול (אלכוהול מוחלט) למשך 2 דקות. יש לחזור על 1x ב-100% אתנול חדש למשך 2 דקות.
    8. טבלו את השקופיות בקסילן למשך 5 דקות. חזרו על 1x בקסילן חדש למשך 5 דקות.
    9. תנו למקטעים להתייבש באוויר במשך 15 דקות ב-RT. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה (ראו טבלת חומרים) על מכסה ואז הניחו אותה בראש המקטע.
  4. בחנו את הקטע תחת מיקרוסקופ אור תחת הגדלה של פי 20 או 40x, וצלמו תמונות (איור 7).

6. בדיקת חדירות כלי דם

הערה: לחלופין למדידת עובי האוזן, ניתן לבצע בדיקת חדירות כלי דם.

  1. הרגישו את העכברים ביום "0" (שלבים 3.1.1-3.1.3), ולאחר מכן, ביום "4", הרימו את העכברים (שלב 3.2.2) והחלו ישירות את הפטן על האוזניים (שלב 3.2.4), תוך השמטת מדידת האוזן של 0 שעות.
  2. בשעה 23 שעות לאחר האתגר, הרדמה את העכברים (שלב 3.2.2).
  3. הזריקו תוך ורידי (כלומר) 8.3 μL/g משקל גוף של 1% צבע כחול של אוונס (ראו טבלת חומרים) ב-Dulbecco′s S S פוספט-בופר מלוחים (DPBS).
  4. הרדמה את העכברים בהרדמה עמוקה שוב (שלב 3.2.2)-1 שעה לאחר הזרקה כחולה של אוונס.
  5. אסוף ביופסיות אוזניים (שלב 4.1).
    הערה: לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  6. מוציאים את הצבע מהרקמה, מניחים אגרופי אוזניים לתוך הצינורות המכילים 1 מ"ל של פורמיד, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% CO2 למשך 18 שעות.
  7. צנטריפוגה את הביופסיות ב 3,000 x g במשך 3 דקות ב RT. לאסוף את supernatants עם פיפטה.
  8. מדוד את ה-OD באורך גל של λ = 565 ננומטר בלוחות בעלי תחתית שטוחה של 96 היטב כנגד ריק המכיל פורמיד. הצבע יציב במשך 24 שעות. קראו את ריכוז דגימות הבדיקה מהעקומה הסטנדרטית (השתמשו בריכוזים של כחול אוונס הנעים בין 0.2-30 מיקרוגרם של צבע/מ"ל פורמיד) (איור 8).
    הערה: הלוחות חייבים להיות עשויים מפוליפרופילן, בעל יכולת קשירה נמוכה יותר כך שחלבונים או DNA לא ייקשרו.

7. איסוף סרום ומדידת נוגדנים נגד אימונוגלובולין (IgG1)

  1. לאחר איסוף ביופסיות אוזניים (שלב 4.1), כאשר העכבר עדיין נמצא בהרדמה עמוקה, הסר את גלגל העין עם פינצטה, הפעיל לחץ עדין על העכבר ואסף דם מהסינוס הרטרו-מסלולי לתוך הצינור (בקבוקון עם ג'ל להשגת סרום, ראה טבלת חומרים). שיטה חלופית לאיסוף דם עשויה להיות לנקב את הלב עם מזרק ולאסוף את הדם.
    הערה: יש לאסוף את הדם לאחר הסרת האוזניים. יש להשתמש באותה שיטה של דימום לאורך מחקר שלם בשל הבדלים פוטנציאליים בפרמטרים של הדם18. לאחר הליך זה, יש להרדים עכברים (למשל, על ידי פריקה של צוואר הרחם).
  2. הפוך מינימום של 6x, המתן 30 דקות עד שהדם ייקרע, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,300-2,000 x g במשך 10 דקות ב- RT.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. המדגם יציב ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
  3. מצפים צלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 היטב עם 50 μL של אלבומין בסרום בקר מצומד עם 2,4,6-טריניטרופניל (TNP-BSA) מומס ב-DPBS בקונצרט של 10 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר מכן, מצפים את הצלחת השנייה באלבומין סרום בקר (BSA) בלבד המומס ב-DPBS (רקע) בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: סרום העכבר מכיל נוגדנים (Abs) נגד BSA, ולכן יש לבדוק את הדגימות בשתי הצלחות, ולאחר מכן, יש לבצע חישוב (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. לשטוף את הצלחות עם 300 μL של DPBS המכיל 0.05% Tween 20. חזור על 3x.
  5. הכן מדולל בדיקה (AD): DPBS המכיל 1% BSA. חסום את הבארות עם AD למשך שעה אחת ב- RT. שטפו שוב (שלב 7.4).
  6. הכינו תקן פנימי (iSTD): הרגישו את העכברים עם TNCB (שלבים 3.1.1-3.1.3), ו-10 ימים לאחר הרגישות, אספו ושאלו את הסרום מכל התורמים (שלב 7.1 ושלב 7.2).
  7. הוסף לצלחת 50 μL של ריכוזים מדורגים של iSTD מדולל עם AD ליצירת העקומה הסטנדרטית (המתוארת בטבלה 3). הוסיפו לצלחת 50 μL של דגימות סרום. בדוק כל דגימה ועקומה סטנדרטית בשתי הלוחות (TNP-BSA ו- BSA מצופה). דגירה למשך 2 שעות ב- RT. לשטוף את הצלחות (שלב 7.4).
  8. הוסף 50 μL של נוגדן חד שבטי נגד עכבר IgG1 שעבר ביוטינילציה (mAb, ראה טבלת חומרים) מדולל 1:250 עם AD ודגירה למשך שעה אחת ב- RT. שטפו שוב (שלב 7.4).
  9. הוסיפו 50 μL של סטרפטווידין פרוקסידאז חזרתי (HRD streptavidin, ראו טבלת חומרים) מדולל 1:2000 עם AD, ודגירה למשך 30 דקות ב-RT בחושך. שטפו את הצלחת (שלב 7.4).
  10. הוסף 50 μL של מצע TMB (ראה טבלת חומרים) ודגירה למשך 30 דקות ב- RT בחושך.
  11. לעצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 25 μL של 1 M H2SO4; התגובה יציבה במשך 30 דקות.
  12. מדוד את ה-OD באורך גל של λ = 450 ננומטר וברקע של 570 ננומטר (יש להפחית את הרקע מכל מדידה של 450 ננומטר). בעת הצגת התוצאות, הפחת את מדידות BSA מה- TNP-BSA עבור דגימות ועקומת התקן. לאחר מכן, חשב את היחידה (U) של נוגדנים לפי העקומה הסטנדרטית (איור 9).

8. העברה מאמצת של תאי CHS-effector

הערה: הליך זה מתואר באיור 2.

  1. תורמים (ביחס של אחד מתורם:1 מקבל): רגישים לעכברים עם TNCB ביום "0" (שלבים 3.1.1-3.1.3).
  2. ביום "4", הרדמה את ההרדמה העמוקה של העכברים (שלב 3.2.2).
  3. לבודד עם מלקחיים את בלוטות הלימפה בבית השחי ובמפשעה (ALNs) וטחולים (SPLs). אגד את ה-ALNs בבקבוקון אחד ואת ה-SPLs בבקבוקון אחר.
    הערה: יש בלוטת לימפה אקסילרית אחת מאחורי שריר החזה בכל בית השחי. בלוטת לימפה מפשעתית אחת באזור הירך ממוקמת ליד שלושה כלי דם. הטחול ממוקם בצד שמאל של הגוף מאחורי המעי והקיבה19. עבוד עם כלים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על תנאים סטריליים. לאחר הליך זה, יש להרדים את העכברים (למשל, על ידי נקע צוואר הרחם).
  4. רסקת רקמה בין הקצוות הקפואים של שתי שקופיות מיקרוסקופ. מעבירים את תרחיף התא דרך מסננת תאים בגודל נקבובית של 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
  5. שטפו את התאים עם DPBS בתוספת 1% סרום בקר עוברי (FBS). צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C. דקאנט את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא הנותר ב-1-5.0 מ"ל של DPBS.
  6. ספרו את התאים החיים באמצעות המוציטומטר20 עם כחול טריפאן, וערבבו 10 μL של תרחיף התא עם 90-990 μL (תלוי במספר התא) של כחול טריפאן. קחו בחשבון את הדילול בעת חישוב מספר התא (10x-100x).
  7. הכינו תערובת של ALNs ו-SPLs (יחס 1:1): 8.0 x 106 עד 7.0 x 107/עכבר ב-200 μL של DPBS.
  8. נמענים (עכברים סינגניים נאיביים): מרדימים עכברים נימים (שלב 3.2.2) ומזריקים ל-i.v. תערובת מוכנה של התאים בעלי אפקט CHS (שלב 8.7). בקבוצת הביקורת של העכברים, אין להזריק תאים.
  9. מדוד את עובי האוזן לפני (0 שעות) ואחרי (24 שעות) את האתגר (שלבים 3.2.1-3.2.6) (איור 10).
  10. בנוסף, בצע בדיקות על תאים מבודדים של CHS-effector (למשל, פנוטיפ תאי או מדידת ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי CHS-effector על ידי ציטומטריה של זרימה). ניתן גם לבסס תרביות תאים, וניתן להעריך את יכולתם של התאים בעלי אפקט CHS להתרבות בנוכחות האנטיגן או את כמות הציטוקינים המופרשים בסופרנאטים של התרבית21,22 (נתונים שלא הוצגו).
    הערה: ביצוע בדיקות נוספות דורש בהתאמה יותר תורמי תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבור אינדוקציה CHS, החיות היו רגישות באמצעות צביעת עור (בטן) עם 150 μL של 5% TNCB או sham רגיש עם הרכב בלבד. ביום "4", תגובות הנפיחות באוזן של שתי האוזניים הושרו על ידי צביעת מגע (אתגר) עם 10 μL של 0.4% TNCB בשני העכברים שהיו בעבר במגע עם TNCB (קבוצת בדיקה) והן בעכברים של קבוצת הביקורת (רגישות ל-sham). הנתונים שהוצגו מראים שהעכברים הרגישו ל-TNCB וקראו תיגר 4 ימים לאחר מכן פיתחו נפיחות מוגברת באופן משמעותי באוזן בהשוואה לעכברים בעלי רגישות דומה (איור 3, טבלה 2, קבוצת בדיקה לעומת קבוצת ביקורת). תוצאות הנפיחות באוזן אומתו לחלוטין במחקרים נוספים, והדגישו כי עלייה בבצקת האוזן שנקבעה באמצעות מיקרומטר מוסכם עם משקל אוזן מוגבר (איור 4), פעילות MPO (איור 5), ריכוז Γ IFN בתמציות האוזניים (איור 6), עיבוי מוגבר של הדרמיס האדמטי בבדיקה ההיסטולוגית (איור 7) וחדירות כלי הדם באוזן (איור 8) וחדירות כלי הדם באוזן (איור 8 ). עלייה בריכוז של נוגדני IgG1 ספציפיים ל-TNP נמצאה גם בסרה של עכברי הבדיקה בהשוואה לחיות הביקורת (איור 9).

כדוגמה לתגובה חיסונית בתיווך תאי T, CHS יכול להיות מועבר גם לעכברים ניזונים סינגניים נאיביים. התורמים היו רגישים על ידי יישום TNCB, ולאחר מכן, התאים של CHS-effector ניתנו i.v. לעכברים המקבלים הנאיבים, אשר אותגרו עם ההפטן ונבדקו ל-CHS 24 שעות מאוחר יותר (איור 10). בעלי החיים שקיבלו את התאים המשפיעים CHS מתורמים שהיו רגישים בעבר ל-TNCB הראו נפיחות מוגברת באופן משמעותי באוזן בהשוואה לבעלי חיים שהיו מאותגרים בלבד (לא קיבלו תאים).

לתגובת CHS יש מנגנון מורכב והיא מערבת תאים שונים. הצגת אנטיגן והפעלת תאי T/B מתרחשים באיברי הלימפה ההיקפיים (למשל, ALNs ו-SPL). נקבע כי תאים בעלי אפקט CHS שהתרוקנו מתאי CD4+ אך לא מסוג CD8+ לפני העברת התאים המאמצים גרמו להיעדר תגובת CHS בעכברים המקבלים. תאים אלה נמצאו חיוביים ל-IFN-γ (גורם שעתוק תיבת T TBX21, Tbet+) ול-IL-17A (גמא קולטן גרעיני יתום הקשור לקולטן חומצה רטינואית, RORγT+) (איור משלים 1).

התוצאות שהוצגו מהניסויים הייצוגיים בוצעו ב-C57BL/6 וב-CBA/J בעכברים זכרים ונקבות בגיל 8-12 שבועות. בעקבות כללי 3R בשימוש בבעלי חיים23, במיוחד הפחתה, לצורך מאמר זה, תוצאות הניסויים מוצגות על קבוצות קטנות של בעלי חיים. הנתונים בגרפים מוצגים כממוצע ± SEM. המובהקות הסטטיסטית נקבעה על p < 0.05. הגרפים צוירו באמצעות תוכנת פריזמה (ראו טבלת חומרים).

Figure 1
איור 1: אינדוקציה של CHS. רגישות, אתגר ומדידת אוזניים. קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: העברה מאמצת של התאים בעלי אפקט CHS. קיצורים: ALNs =בלוטות לימפה אקסילריות ומפשעות; CHS = תגובת רגישות יתר למגע; i.v. = תוך ורידי; SPLs = טחולים; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הערכה מייצגת של CHS עד TNCB על ידי מדידת נפיחות באוזן באמצעות מיקרומטר. עכברים היו TNCB (קבוצת בדיקה) או sham (קבוצת ביקורת) רגישים ולאחר מכן מאותגרים. עובי האוריקל נמדד לפני ואחרי האתגר, וההבדלים בנפיחות האוזן חושבו על ידי הפחתת עובי האוזן של 0 שעות (μm) מעובי האוזן של 24 שעות (μm). נפיחות באוזן באה לידי ביטוי כממוצע ± SEM, ****p < 0.0001, n = 10 עכברים/קבוצה (נתונים מטבלה 2). קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הערכה מייצגת של CHS על ידי מדידת משקל האוזן. משקל האוזן הוא אחד הפרמטרים המתאימים לנפיחות באוזן. עכברים היו TNCB (קבוצת בדיקה) או sham (קבוצת ביקורת) רגישים ולאחר מכן מאותגרים. בשעה 24 שעות לאחר האתגר נלקחו אגרופים בקוטר 6 מ"מ מהאוזניים שהוסרו. האגרופים הושקעו באיזון מעבדה אנליטי. משקל האוזן התבטא במיליגרם (מ"ג) כממוצע ± SEM, ***p < 0.001, n = 10 עכברים/קבוצה. קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הערכה מייצגת של פעילות MPO. פעילות MPO מוגברת בתמציות רקמות מתואמת עם דלקת באוזן. עכברים רגישים ל-TNCB (קבוצת בדיקה) ועכברים רגישים לשון (קבוצת ביקורת) אותגרו. בשעה 24 שעות לאחר האתגר, האוזניים הוסרו, ואגרופים בקוטר 6 מ"מ של האוזן הוצאו ועובדו. פעילות MPO מתבטאת בתכולת U לכל חלבון (U/g של חלבון). התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM, **p < 0.01, n = 5-6 עכברים / קבוצה. קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; MPO = מיאלופרוקסידאז; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן; U = יחידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: הערכה מייצגת של ריכוז ייצור ציטוקינים-IFN-γ בתמציות אוזניים. עכברים היו TNCB (קבוצת בדיקה) או sham (קבוצת ביקורת) רגישים ולאחר מכן מאותגרים. בשעה 24 שעות לאחר האתגר, האוזניים הוסרו, ונלקחו אגרופים בקוטר 6 מ"מ של האוזן. הריכוז של IFN-γ נקבע בהומוגנטים של רקמות על ידי ELISA. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM, *p < 0.05, n = 5 עכברים/קבוצה. קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; IFN-γ = אינטרפרון גמא; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: היסטולוגיה מייצגת של רקמת האוזן. המטוקסילין וכתמי אאוזין. עכברים היו TNCB (קבוצת בדיקה) או sham (קבוצת ביקורת) רגישים ולאחר מכן מאותגרים. (א-ג) בדיקה היסטולוגית בקבוצת הבדיקה התבטאה בריכוז מוגבר באופן משמעותי של תאים דלקתיים (תאים מונונוקלאריים ופולימורפונוקליאריים), בעיקר בדרמיס, עם היווצרות מיקרואבסס באפידרמיס. כמו כן נצפו עיבוי של הדרמיס האדמטי ואפידרמיס מעובה והיפרפלסטי. (ד-ה) קבוצת ביקורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: בדיקת חדירות כלי דם מייצגת. בצקת רקמת האוזן הנצפית היא תוצאה של חדירות מוגברת של כלי הדם. כדי לקבוע שינויים בחדירות כלי הדם, העכברים היו TNCB (קבוצת בדיקה) או sham (קבוצת ביקורת) רגישים ואז מאותגרים 4 ימים לאחר מכן. בשעה 23 שעות לאחר האתגר, הוזרק כחול אוונס, ושעה אחת לאחר ההזרקה הכחולה של אוונס, החיות הומתו, ואגרופים בקוטר 6 מ"מ של האוזן נעשו. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM, **p < 0.01, n = 5 עכברים/קבוצה. קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: מדידת נוגדנים מייצגת נגד TNP IgG1. ריכוז הנוגדנים נגד TNP IgG1 בסרום נמדד 24 שעות לאחר האתגר עם הפטן TNCB בעכברים רגישים (בקרה) ובעכברים רגישים ל-TNCB (קבוצת בדיקה). הסרה שנאספה נבדקה לריכוז נוגדנים על ידי ELISA. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM, ***p < 0.001, n = 10 עכברים/קבוצה. קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; IgG1 = אימונוגלובולין G תת-מחלקה 1; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: העברה מאמצת מייצגת של תאי CHS-effector. התאים המשפיעים על CHS התקבלו מתורמים שהיו רגישים ל-TNCB. לאחר מכן, תאי החיסון שנאספו הוזרקו, כלומר, למושתלים סינגניים נאיביים, אשר אותגרו על מנת לעורר את שלב אפקטור CHS. קבוצת הביקורת של העכברים לא קיבלה תאים לפני האתגר. עובי האוריקל נמדד לפני ואחרי האתגר. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM, ***p < 0.001, n = 7 עכברים/קבוצה. קיצורים: CHS = תגובת רגישות יתר של מגע; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

זן עכבר תמיסת רגישות (מינון)
על בטן מגולחת		 תמיסת הבהרה (מינון)
משני צידי האוזן		 יום הרגישות / ההתעוררות רפרנסים
BALB/c (H-2d); C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (H-2u background)		 25 μL של 0.5 % DNFB בתערובת שמן אצטון-זית (יחס 4:1) 5 μL של 0.1 % DNFB בתערובת אצטון-שמן זית (יחס 4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) 50 μL של 0.5 % DNFB בתערובת שמן אצטון-זית (יחס 4:1) 25 μL של 0.2 % DNFB בתערובת שמן אצטון-זית (יחס 4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b); IL-17A-/- (רקע C57BL/6) 150 μL של 5% TNCB בתערובת אצטון-אתנול (יחס 1:3) 10 μL של 0.4 % TNCB בתערובת שמן זית-אצטון (יחס 1:1) 0 / 4 33
CBA/J (H-2k); C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (רקע C57BL/6)		 150 μL של 5% TNP-Cl (TNCB) בתערובת אצטון-אתנול (יחס 1:3) 10 μl של 0.4 % TNP-Cl (TNCB) בתערובת שמן זית-אצטון (יחס 1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b); BALB/c (H-2d) 25 μL של 1 % TNCB באצטון 10 μL של 0.1 או 0.2 % TNCB באצטון (ומעלה עד 1 %) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b); TLR2-/-/ TLR4-/-
(עכברים עם נוקאאוט כפול על רקע C57BL/6)		 100 μL של 3 % TNCB באצטון 20 μL של 1 % TNCB באצטון (רק בצד האחורי של האוזניים) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
עכברים עם מחסור ב-MHC מחלקה II (רקע C57BL/6)		 100 μL של 3% TNCB בתערובת שמן אצטון-זית (יחס 4:1) 20 μL של 0.5 או 1 % TNCB בתערובת שמן אצטון-זית (יחס 4:1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) 100 μL של 7 % TNCB באצטון 20 μL 1 % TNCB באצטון 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) 100 μL 3 % OX באתנול 20 μL 1 % OX באתנול 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (רקע C57BL/6) 25 μL של 0.5 % DNFB בשמן אצטון-זית (יחס 4:1) 10 μL של 0.2 % DNFB בשמן אצטון-זית (יחס 4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (רקע C57BL/6) 150 μL של 3% OX באלכוהול-אצטון (יחס 3:1) 10 μL 1% OX באלכוהול-אצטון (יחס 3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); C3H/HeN (H-2k); TLR4-/- (רקע C3H/HeJ); MyD88-/- (רקע C57BL/6) 100 מ"ג/ אוזן של 10% NiCl2 בדלק לבן בצד הגבי של שתי האוזניים 10% NiCl2 בדלק לבן 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (רקע NOD) 400 μL של 0.5 % FITC באצטון ודיבוטיל פתלט 10 μL של 0.1 % FITC באצטון ודיבוטיל פתלט 0 / 5 25

טבלה 1: השוואה בין מודל CHS במחקרים שונים. קיצורים: DNFB = 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט; NiCl2 = ניקל (II) כלוריד; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן; TNP-Cl = טריניטרופניל כלוריד; OX = אוקסזולון. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קבוצת ביקורת (שלילית) קבוצת בדיקה (תגובת CHS)
עכבר # אוזן: L, R 0 שעות עובי האוזן [μm] עובי האוזן 24 שעות [μm] 24 שעות – 0 שעות עובי האוזן [μm] עכבר # אוזן: L, R 0 שעות עובי האוזן [μm] עובי האוזן 24 שעות [μm] 24 שעות – 0 שעות עובי האוזן [μm]
1 ל' 365 380 15 1 ל' 345 427.5 82.5
1 ר 335 380 45 1 ר 340 455 115
2 ל' 345 355 10 2 ל' 355 475 120
2 ר 327.5 352.5 25 2 ר 342.5 457.5 115
3 ל' 340 370 30 3 ל' 340 460 120
3 ר 325 355 30 3 ר 345 495 150
4 ליטר 335 380 45 4 ליטר 357.5 432.5 75
4 ר 340 350 10 4 ר 335 402.5 67.5
5 ל' 350 380 30 5 ל' 335 387.5 52.5
5 ר 337.5 360 22.5 5 ר 335 425 90
6 ל' 335 365 30 6 ל' 350 430 80
6 ר 340 375 35 6 ר 342.5 405 62.5
7 ל' 345 337.5 0 7 ל' 340 502.5 162.5
7 ר 345 335 0 7 ר 327.5 447.5 120
8 ל' 370 380 10 8 ל' 327.5 515 187.5
8 ר 375 355 0 8 ר 327.5 540 212.5
9 ל' 385 370 0 9 ל' 330 415 85
9 ר 342.5 362.5 20 9 ר 327.5 390 62.5
10 ליטר 307.5 340 32.5 10 ליטר 337.5 445 107.5
10 R 325 350 25 10 R 352.5 455 102.5
התכוון 20.75 התכוון 108.5
± SEM 3.245 ± SEM 9.565

טבלה 2: דוגמה מייצגת לחישוב ההפרש בעובי האוזן בשלב האפקט של CHS. חישוב ההפרש בעובי של auricle לפני ואחרי האתגר עם hapten: 24 שעות עובי האוזן (μm) - 0 h עובי האוזן (μm). כל אוזן נחשבת כמדידה נפרדת. נפיחות באוזן המתבטאת במיקרומטרים (μm) ± SEM, n = 20. קיצורים: L = שמאל; R = נכון. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דילול iSTD עם AD אנטי-TNP IgG1 Ab (U/mL)
100x 250
200x 125
400x 62.5
800x 31.25
1600x 15.63
3200x 7.8
רק לספירה 0

טבלה 3: הכנת הריכוזים השונים של iSTD עבור העקומה הסטנדרטית למדידת anti-TNP IgG1 Ab. ההנחה היא שדילול ה-iSTD 100x הוא 250 U של אנטי-TNP IgG1 Ab. קיצורים: Ab = נוגדן; AD = מדולל בדיקה; iSTD = תקן פנימי; IgG1 = אימונוגלובולין G תת-מחלקה 1; TNP = 2,4,6-טריניטרופניל; U = יחידות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים 1: הפנוטיפ של תאים בעלי אפקט CHS. התאים המשפיעים על CHS התקבלו מ-ALNs ו-SPLs של התורמים, שבעבר היו רגישים ל-TNCB. (A) באמצעות טכניקת MACS, תאי ה-CHS-effector (ALNs ו-SPLs שלמים) התרוקנו מתאי CD4+ או CD8+. לאחר מכן, מתבצעת העברת תאים מאמצת לפני ההתעוררות של שלב אפקטור CHS. נפיחות באוזן באה לידי ביטוי כממוצע ± SEM. (B-E) באמצעות טכניקת ציטומטריה של זרימה, תאי CHS-effector ונאיביים (שהתקבלו מעכברים תמימים) הוכתמו עבור IFN-γ, Tbet, IL-17A ו- RORγt לפני הניתוח. התאים היו מגודרים עבור אוכלוסיית TCRβ+CD4+. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM, ***p < 0.001, **p < 0.01, * p < 0.05, n = 4-6 עכברים/קבוצה. קיצורים: ALNs = בלוטות לימפה בית השחי והמפשעתיות; CD4 = אשכול של הבחנה 4; CHS = תגובת רגישות יתר למגע; IFN-γ = אינטרפרון גמא; IL = interleukin; MACS = מיון תאים המופעלים מגנטית; ns = לא משמעותי; RORγt = גמא קולטן גרעיני יתום הקשור לקולטן רטינואי-חומצה; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; SPLs = טחולים; Tbet = גורם שעתוק תיבת T TBX21; TCRβ = בטא קולטן תא T; TNCB = 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CHS מושרה באמצעות haptens, אשר נקשרים לאנטיגנים של חלבון עצמי בעור, ויוצרים ניאו-אנטיגנים. CHS מתווך על ידי גיוס חוץ-וסקולרי מקומי של תאי T ספציפיים לאנטיגן, מה שגורם לנפיחות ברקמה המאותגרת, המגיעה לשיא של 24 שעות לאחר חשיפת העור המשני לאותו הפטן6. הנפיחות של הרקמה נגרמת בעיקר על ידי חדירה של לויקוציטים ותצהיר פיברין תלוי לויקוציטים24. ניתן לזהות שינויים אלה באמצעות מיקרומטר המודד את נפיחות האוזן של עכברים רגישים ומאותגרים על ידי הפטן לעומת עכברים רגישים ומאותגרים.

CHS יכול להיקבע גם על ידי השוואת משקל האוזן. לאחר מכן, ניתן להשתמש באגרופי האוזן המשמשים לקביעת משקל האוזן לבדיקות נוספות. התא מסתנן לאוזניים המודלקות מורכב מלימפוציטים T המייצרים ציטוקינים ונייטרופילים חיוביים ל-MPO. בהומוגנטים של רקמת האוזן ניתן למדוד פרמטרים שונים, כגון פעילות MPO או ריכוז הציטוקינים הפרו-דלקתיים (למשל, TNF-α, IFN-γ, IL-17A או אחרים) באמצעות בדיקת ELISA או ביטוי של mRNA ציטוקיני בעור באמצעות בדיקת qPCR25. בנוסף, ניתן להעריך את שינויי חדירות כלי השיט באמצעות המבחן הכחול של אוונס21,26.

ברקמת האוזן המודלקת, ניתן להשלים את השינויים שנצפו גם בבדיקות מבחנה, המדגישות את התפשטות תאי T וייצור ציטוקינים. ניתן להשיג זאת בקלות על ידי culturing ALNs בנוכחות אנטיגנים של חלבון מצומד hapten22,27. ההערכה של הפרשת ציטוקינים על ידי ALNs שבודדו מעכברים רגישים אך לא מאותגרים מספקת פרטים לגבי ייצור ציטוקינים על ידי תאי CHS-effector במקום האינדוקציה שלהם.

מגבלות
מיקרומטרים רבים מודדים נפיחות באוזן בדיוק שונה. לדוגמה, הלחץ הנמוך ביותר מופעל על ידי קליפר קפיץ, כך שנראה כי התוצאות ישקפו בצורה הטובה ביותר את מדידת עובי האוזן בפועל. עם זאת, מיקרומטרים המפעילים לחץ רב יותר, כגון Mitutoyo, צפויים לדחוס חזק יותר את הנוזל המצטבר באוזניים בשלב המוקדם של היווצרות בצקת. ניתן לדמיין בצורה ברורה יותר את האופי הדו-פאזי של CHS באמצעות מיקרומטרים כאלה מכיוון שמופעל יותר לחץ. זה קשה יותר בעת שימוש בקליפר קפיץ עם לחץ קל28. עם זאת, בכמה מחקרים נמדד עובי האוזניים בקליפר29. כמו כן, הניסיון של הצופה מבטיח מדידות מדויקות, אשר יכול להיות מושפע על ידי רגשות סובייקטיביים, גם אם הצופה אינו מודע לקבוצות הניסוי.

שיטות חלופיות תוארו כאן שיכולות לעזור לאשר את המדידות של נפיחות האוזן עם מיקרומטר, מה שהופך את הנתונים המוצגים לאמינים יותר ופחות סובייקטיביים. עם זאת, ניתן להשתמש באסטרטגיות חלופיות אלה להערכת CHS רק בנקודת זמן אחת. מדידות מיקרומטר יכולות לחזור על עצמן בנקודות זמן שונות, מה שמאפשר ללמוד את הקינטיקה של CHS.

שינויים
הפרוטוקול לחקר תגובת CHS בה אנו משתמשים במעבדה שלנו שונה באופן משמעותי מאלו המשמשים במעבדות אחרות, כולל המינון של הפטן והרכב הממס המשמש הן להתעוררות והן לרגישות, כמו גם נקודת הזמן שבה התגובה מוערכת. ניתן למדוד את עובי האוזן בנקודות זמן שונות (למשל, 2 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר האתגר)10,30. טבלה 1 מציגה מודלים ניסיוניים שונים, במיוחד ההבדלים בזן החי, הפטן, וזמני הרגישות/אתגר המשמשים במחקרים שונים 10,21,22,26,31,32,33,34,35,36,37 . פרוטוקול CHS עשוי להתבצע גם ללא גילוח קודם של הבטן של העכברים.

ההבדל הבא נוגע לביצוע ההתעוררות (האתגר) עצמה. כמקובל, הרגישות נעשית על ידי צביעת עור הבטן של עכברים מגולחים עם הפטן או הרכב בלבד. לאחר מכן, בשתי הקבוצות, אוזן אחת מאותגרת עם הפטן מדולל בכל צד אוזן. כבקרה, האוזן הנגדית צבועה בכמות זהה של כלי רכב בלבד10,31.

שלבים קריטיים
הרגע הקריטי ביותר הוא להפעיל את CHS, שכן תוצאות הבדיקה תלויות בו. (1) תמיסת Hapten היא נדיפה מאוד ורגישה לאור, ולכן יש לסגור אותה היטב ולהגן עליה מפני אור, וכאשר היא בשימוש, יש למרוח אותה במהירות על עורם של בעלי החיים כדי שלא תתנדף. (2) לאחר מריחת הפטן על עור הבטן, יש לייבש אותו לפני שהחיה חוזרת לכלוב מכיוון שעכברים יכולים למרוח אותו על המצעים או למרוח אותו על האוזניים עם כפותיהם (אז מדידת עובי האוריקל עשויה להיות לא מספקת). (3) ידועות גם שיטות שונות לתיוג בעלי חיים, כגון סימון זנבות עכברים בסמן עמיד בפני ממסים. עם זאת, הצבעים הקיימים בסמן עשויים (שלא נחקרו) להפוך להפטן ולהפעיל CHS. לכן, במחקר זה, נבחרה שיטת סימון שאינה משפיעה על התגובה. (4) בחירת שיטת גילוח חשובה מאוד מכיוון שהיא עלולה לגרות את העור. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בסבון אפור משום שיש לו תכונות מרגיעות; הוא מאיץ את הטיפול בחתכים קלים ובפצעי גישוש, אשר נעזרים בהשפעות האנטי-בקטריאליות שלו. זה מרגיע נפיחות ודלקת של העור.

נדרשים חקירות נוספות וסטנדרטיזציה של נהלי הניסוי, כולל השימוש בבעלי חיים (זן ומין), כדי להשוות את התוצאות ממחקרים שונים.

גורמים סביבתיים רבים ושונים וחומרים חדשים עם פונקציות ביולוגיות יכולים להיבדק במודל CHS. מודל זה יכול להיות שימושי אם חוקרים רוצים להראות אם גורמים שנבדקו מווסתים את התגובות החיסוניות התלויות בתאי T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי SUBZ subvention. A020.22.060 של האוניברסיטה הרפואית בוורוצלב, פולין, ועל ידי מענקים ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה N N401 545940 לטרשת נפוצה ו- IP2012 0443 72 ל- MMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 187 מודל מורין דרמטיטיס של מגע אלרגי (ACD) רגישות יתר למגע (CHS) נפיחות באוזן חדירות כלי דם מיאלופרוקסידאז (MPO) ציטוקינים 2,4,6-טריניטרוכלורובנזן (TNCB) הפטן

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

צור רגישות יתר כמודל מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zemelka-Wiacek, M.,… More

Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter