Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Alerjik Kontakt Dermatitin Murin Modeli Olarak Kontakt Aşırı Duyarlılık

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

Kontakt aşırı duyarlılık (CHS), alerjik kontakt dermatitin (AKB) murin deneysel bir modelidir. CHS, göğüs ve karın bölgesinin traş edilmiş cildini boyayarak reaktif hapten ile hassaslaşmaya dayanır, daha sonra seyreltilmiş bir hapten ile kulak derisi meydan okuması ile çeşitli şekillerde değerlendirilen bir şişlik reaksiyonuna neden olur.

Abstract

Kontakt aşırı duyarlılık (CHS), farelerde incelenebilen deneysel bir alerjik kontakt dermatit (ACD) modelidir. Bu çalışma, farelerde CHS reaksiyonunu incelemeye yardımcı olabilecek, çeşitli testlerle ölçülebilen ve ölçülebilen objektif bir laboratuvar yöntemi sunmayı amaçlamaktadır. CHS'yi indüklemek için, "0" gününde, fareler bir aseton-etanol karışımında hapten 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB) ile abdominal cilt boyaması ile daha önce traş edilmiş bir noktaya duyarlılaştırılırken, negatif kontrol fareleri tek başına araç-aseton-etanol karışımı ile düzmece duyarlılaştırıldı. "4" gününde, temel kulak kalınlığı, CHS'nin (meydan okuma) ortaya çıkmasından önce, her iki kulağın hem test hem de kontrol gruplarında seyreltilmiş TNCB ile boyanmasıyla bir mikrometre ile ölçüldü. 24 saat sonra, kulak şişmesi bir mikrometre ile ölçüldü. CHS, iltihaplı dokuda şişmeye neden olan ve aynı hapten ile cilt mücadelesinden 24 saat sonra zirveye ulaşan T hücresi aracılı bir bağışıklık tepkisinin bir örneğidir. Kulak ödeminde artış, artmış kulak ağırlığı, miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, kulak ekstrelerinde pro-inflamatuar sitokin konsantrasyonu, histolojik incelemede ödemli dermisin kalınlaşmasının artması ve kulak vasküler geçirgenliği ile korelasyon gösterdi. Test grubunun serumlarında TNP-spesifik IgG1 antikorlarının konsantrasyonunda, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında bir artış vardı. Ek olarak, CHS, daha önce TNCB ile duyarlılaştırılmış donörlerden elde edilen CHS-efektör hücrelerle başarılı bir şekilde aktarılabilir. CHS-efektör hücreler, daha sonra aynı seyreltilmiş hapten ile zorlanan naif alıcı farelere intravenöz olarak uygulandı. Kulak şişmesi 24 saat sonra mikrometre ile ölçüldü.

Introduction

Alerjik kontakt dermatit (AKB), sanayileşmiş ülkelerde, hapten adı verilen düşük moleküler ağırlıklı kimyasallara maruz kalmaktan kaynaklanan tip IV aşırı duyarlılık reaksiyonunun neden olduğu yaygın bir deri enflamatuar hastalığıdır. İnsanlarda temas duyarlılaşmasına neden olan maddeler arasında ağır metal iyonları (krom, nikel, demir, kobalt), terebentin, kokular, boyalar ve kozmetiklerde bulunan koruyucular (örneğin, p-fenilendiamin), bazı ilaçlar (örneğin, neomisin, benzokain), β-laktam antibiyotikler (yani penisilin), bitkiler tarafından üretilen kimyasallar (pentadekakatekol, zehirli sarmaşıklarda bulunan bir madde) ve fotoğraf endüstrisinde kullanılan hidrokinonbulunur 1,2 . ACD etiyolojik ajanları çok yüksektir, çünkü sadece endüstride 100.000'den fazla kimyasal kullanılmaktadır ve her yıl 2.000 yenisi sentezlenmektedir. Bugüne kadar, temas haptenleri / alerjenleri olabilecek 3.700'den fazla molekül tanımlanmıştır3. Temas aşırı duyarlılık reaksiyonu (CHS), farelerde, kobaylarda ve sıçanlarda çalışılabilen deneysel bir ACD modelidir ve organik çözücülerde çözünmüş reaktif kimyasal haptenlerin topikal cilt uygulaması ile indüklenebilir 4,5,6. Bu çalışma, farelerde CHS reaksiyonunu incelemeye yardımcı olabilecek ve çeşitli testlerle ölçülebilen ve ölçülebilen objektif bir laboratuvar yöntemini tanımlamayı amaçlamaktadır.

CHS, sensitizasyon (indüksiyon) ve efektör (meydan okuma) aşamalarından oluşur. Hayvan modellerinde, haptenler ilk önce neoantijenler oluşturmak için vücuttaki proteinlere kovalent olarak bağlanır. Sensitizasyon aşamasında, aktive keratinositler, pro-inflamatuar sitokinler-tümör nekroz faktör α (TNF-α) ve interlökin 1β (IL-1β)7 üreterek deri dendritik hücrelerinin (sDC'ler) göçünü ve olgunlaşmasını teşvik eder. Epidermal Langerhans hücreleri (LC'ler) CHS indüksiyonu ve efektör fazları8 sırasında antijenler sunar. Duyarlılaşma sırasında hapten'e maruz kalan LC'ler hem düzenleyici hem de efektör hücrelerin indüksiyonunu teşvik eder9. Birkaç çalışmadan elde edilen kanıtların artması, CHS yanıtlarının CD4 + MHC sınıf II ile kısıtlanmış Th1 hücreleri tarafından aracılık edilebildiğini, karakteristik bir enflamatuar infiltrasyon kullanmak için lokal olarak interferon-γ (IFN-γ), IFN-γ serbest bırakabilen, ancak çoğunlukla keratinositlere sitotoksik hasara aracılık edebilen CD8 + MHC sınıf I-kısıtlı Tc1 lenfositleri ve şimdi de interlökin 17 (IL-17) üreten Th17 hücreleri10, 11.

Çeşitli türler 12,13,14 ve haptenleri kullanan birkaç farklı CHS modeli geliştirilmiştir (farklı haptenlerin, çözücülerin ve uygulama zamanlarının ayrıntılı bir karşılaştırması Tablo 1'de özetlenmiştir). Sık kullanılan bir laboratuvar türü olan fare, CHS'yi incelemede birkaç avantaj sunar. Fareler arasında diğer türlere kıyasla daha fazla suş, nakavt (KO) ve transgenik hayvan vardır, bu da onları çok çekici bir hayvan yapar15. Ek olarak, CHS modeli birçok hayvan gerektirir ve fareler burada daha ekonomiktir. Hayvan modelleri ACD'yi her açıdan taklit etmez; özellikle, insanlar için yaygın olmayan kabuklanma ve deskuamasyon gösterirler16,17. Kronik hastalığın özelliklerinin çoğaltılması zordur, çünkü tarif edilen model haptenin uzun süre uygulanmasını üstlenmez. Bununla birlikte, burada ACD'nin önemli yönlerinin çoğunun çoğaltıldığı doğrulanmıştır. İnsanlarda olduğu gibi, bu özelliklerin lokal alerjik reaksiyonlarla ilişkili olduğu da gösterilmiştir. Bu protokolde özetlenen hapten seçimi, çözücüsü ve uygulaması, sonuçların çok sayıda in vitro testle doğrulanması ve mevcut versiyon kurulana kadar uzun yıllar laboratuvarda test edilmesi ve modifiye edilmesi gerçeğiyle belirlendi. Murin modelleri, ACD'nin gelişiminde rol oynayan ve yeni tedavilerin klinik öncesi değerlendirmeleri için gerekli olan hücre alt kümelerinin veya sitokinlerin analizine izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu makalede sunulan tüm deneyler, Krakow'daki 1. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi'nin yönergelerine göre yürütülmüştür. Açıklanan tüm prosedürler, özellikle ketamin / ksilazinin anestezik olarak kullanılması, madde / hapten uygulamak için kulakların her iki tarafının kullanılması, kulağın kesilmesi ve göz küresinin çıkarılmasıyla kan toplanması ile ilgili olarak yerel önerilere göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada 6-12 haftalık BALB/c (haplotip H-2d), CBA/J (H-2k) ve C57BL/6 (H-2b) erkek ve dişi fareler kullanılmıştır (bkz. İstatistiksel anlamlılık için, her fare grubunun 10-12 hayvandan oluşması en iyisidir.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Tüm işlemlerden önce ve sonra ameliyat masasını% 70 etanol çözeltisi ile temizleyin. Steril koşullar gerektiren fareler kullanıyorsanız, tüm işlemleri bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

2. Tanımlama için fareleri işaretleme

  1. Cildi bir tıraş bıçağı ile tıraş ederek fareleri etiketleyin: #0 - işaretsiz, #2 - sağ ön pençede, #3 - sağ tarafta, #4 - sağ arka pençede, #5 - kuyruğun tabanında, #6 - sol arka pençede, #7 - sol tarafta, #8 - sol ön pençede.
    NOT: İndüklenen reaksiyon nedeniyle, fareler klasik olarak kulak delme veya etiketleme ile işaretlenemez. Fareler etiketlenirken anestezi yapılmadı.

3. CHS'nin İndüksiyonu

NOT: Bu yordam Şekil 1'de gösterilmiştir.

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek hassaslaştırmayı (indüksiyon) gerçekleştirin.
    1. "0" gününde, su ile gri sabun uygulayarak ve bir tıraş bıçağı ile tıraş ederek göğüs ve karın bölgesinde (kare 2 cm x 2 cm) fareleri tıraş edin.
      NOT: Hapten uygulamadan önce, cildin tahriş olmaması için 6 saat bekleyin.
    2. % 5 hapten hazırlayın: 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB, bakınız Malzeme Tablosu) bir aseton-etanol karışımında (oran 1: 3) veya tek başına araç (aseton-etanol). Bir cam şişede kullanmadan hemen önce çözeltiler hazırlayın ve şişeyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
    3. Aynı gün, daha önce tıraş edilen noktaya 150 μL% 5 hapten uygulayarak fareleri hassaslaştırın. Kontrol fareleri grubunda, spesifik olmayan enflamatuar reaksiyonu değerlendirmek için aracı tek başına uygulayın. Hayvanı tekrar kafese koymadan önce, haptenin kurumasına izin vererek 30 s bekleyin.
      DİKKAT: Eldiven kullanın; TNCB çoğu insanda ciddi bir alerjik reaksiyona neden olur.
  2. Uyarılma (meydan okuma) ve kulak şişmesi ölçümü yapın.
    1. "4" gününde,% 0.4 hapten hazırlayın: Bir aseton-etanol karışımında TNCB (oran 1: 1). Çözeltiyi bir cam şişede kullanmadan hemen önce hazırlayın ve şişeyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
    2. Derin anestezi için fareleri ketamin (90-120 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) karışımının intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Farenin ayak parmağını kıstırarak en az 5 dakika boyunca tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
    3. Kulak kalınlığını (0 saatlik ölçüm, taban çizgisi) deney gruplarından habersiz bir gözlemci tarafından bir mikrometre ile (bakınız Malzeme Tablosu) ölçün.
    4. Her iki grupta da kulakların her iki tarafına 10 μL% 0.4 hapten uygulayın (test ve kontrol). Hayvanı tekrar kafese koymadan önce, 30 s bekleyin ve haptenin kurumasına izin verin.
    5. "5" gününde, hapten uygulamasından 24 saat sonra, 24 saatlik ölçüm için 3.2.2-3.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    6. CHS yanıtını, hapten ile mücadeleden önce ve sonra kulak kepçesi kalınlığındaki farkı hesaplayarak değerlendirin: 24 saat kulak kalınlığı (μm) - 0 saat kulak kalınlığı (μm). Her kulağı ayrı bir ölçüm olarak sayın. Daha sonra, ortalamanın (SEM) standart hatası ± mikrometre (μm) cinsinden kulak şişmesini ifade edin (Tablo 2, Şekil 3).

4. Kulak biyopsileri

  1. Kulak kalınlığının 24 saatlik ölçümünden hemen sonra (fare hala derin anestezi altındayken), kulakları kafatasına mümkün olduğunca yakın makasla kesin. Biyopsi punch kullanarak 6 mm çapında bir punch yaparak kulakların distal tarafından biyopsileri toplayın (bkz.
    1. Kulak ağırlığını ölçün (adım 4.2) ve ayrıca aynı kulak biyopsisinde aşağıdaki testlerden birini yapın: miyeloperoksidaz (MPO) testi (adım 4.3) veya kulak ekstrelerindeki sitokin konsantrasyonunun in vitro ölçümü (örneğin, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [adım 4.4]).
      NOT: Kan toplanmadan önce kulakları kesin. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. Her bir kulak biyopsisinin ağırlığını analitik terazide ölçün ve miligram (mg) cinsinden ifade edin (Şekil 4).
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek bir MPO testi gerçekleştirin.
    1. 50 mmol fosforat tamponu KH 2 PO4/Na2HPO4 içinde %0,5 hekzadediltrimetilamonyum bromür çözerek ve pH'ı 6,0'a ayarlayarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın (oda sıcaklığında kullanın, RT).
    2. 5 mm çapında paslanmaz çelik boncuklu bir homojenizatör kullanarak 500 μL hazırlanmış tamponlu 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde biyopsileri 10 dakika boyunca homojenize edin (iki boncuk/şişe ekleyin) (bkz. Ardından, numuneyi 4 ° C'de 15 dakika soğutun ve 10 dakika daha homojenleştirin.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpleri, boncukların kolayca hareket edebilmesi için yuvarlak bir tabana sahiptir.
    3. Homojenatları −20 °C'de 30 dakika boyunca dondurun. Çözülme ve vorteks (numunelerin çözüldüğünden emin olun). Bu prosedürü 3 kat tekrarlayın.
    4. Homojenatları 3.000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantları bir pipetle hasat edin. MPO aktivitesini 1 mg protein başına birim (U) cinsinden ifade edin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numuneler 3 ay boyunca -20 ° C'de stabildir.
    5. MPO aktivitesini ölçmek için, 20 μL süpernatant ve 200 μL MPO substratını (50 mmol KH 2 PO 4 / Na2HPO4 tamponunda 0.167 mg / mL orto-dianisin dihidroklorür içinde 5 x 10−4% H 2 0 2) karıştırarak enzimatik bir reaksiyon gerçekleştirin ve 96 delikli düz tabanlı plakalara ekleyin. RT'de plakaları 20 dakika boyunca inkübe edin.
    6. MPO substratının 200 μL'sinde 0,008 U'dan 0,5 U'ya kadar konsantrasyonlarda MPO standardının 20 μL'sini kullanarak standart eğriyi hazırlayın. Boş numuneyi yalnızca MPO substratı ile hazırlayın.
      DİKKAT: Orto-dianisin dihidroklorür ile çalışırken bir maske kullanın.
      NOT: Plakalar, proteinlerin veya DNA'nın bağlanmaması için daha düşük bir bağlanma kapasitesine sahip polipropilenden yapılmalıdır.
    7. Optik yoğunluğu (OD) λ = 460 nm dalga boyunda ölçün. Enzimatik reaksiyon 10 dakika boyunca kararlıdır. Standart eğriden test edilen numunelerdeki MPO aktivitesini okuyun.
    8. Protein konsantrasyonunu ölçmek için, süpernatanın 20 μL'sini kullanın, protein tayini için bir Bicinchoninic asit kiti ile bir test yapın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve OD'yi λ = 562 nm'de ölçün (Şekil 5).
  4. Kulak ekstraktındaki sitokinlerin in vitro ölçümünü gerçekleştirin.
    1. RT'deki kulak biyopsilerini, 5 mm çapında paslanmaz çelik boncuklu bir homojenizatör kullanarak 500 μL doku protein ekstraksiyon reaktifi (T-PER) içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde 10 dakika boyunca homojenize edin (iki boncuk/flakon ekleyin). Ardından, numuneyi 4 ° C'de 15 dakika soğutun ve 10 dakika daha homojenleştirin.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpleri, boncukların kolayca hareket edebilmesi için yuvarlak bir tabana sahiptir.
    2. Homojenatları 3.000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numuneler 6 ay boyunca -80 ° C'de stabildir.
    3. Sitokin seviyelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir ELISA seti (örneğin, IFN-γ) kullanarak değerlendirin (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 6).

5. Kulak dokusunun histolojisi

  1. Kulak kalınlığının 24 saatlik ölçümünden hemen sonra, fare hala derin anestezi altındayken, kulakları makasla kafatasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde kesin (adım 4.1).
    NOT: Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek doku bloklarının parafin gömmesini gerçekleştirin.
    1. Çıkarıldıktan hemen sonra, kulağı 24 saat boyunca ~ 10 mL% 10 formalin içine yerleştirin.
    2. Kulakları bir doku işleme kasetine yerleştirin. Kasetleri, dehidrasyon döngüleri (RT'de her biri %70, %90, %100, 30 dakika alkol), temizleme döngüleri (RT'de her biri 30 dakika ksilen 3x, 30 dakika) ve balmumu infiltrasyon döngüleri (56 ° C'de her biri 3x, 30 dakika olmak üzere parafin 3x) için otomatik bir işlemciye ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
    3. Kasetleri otomatik işlemciden çıkarın ve gerekli olana kadar ısıtma plakasına tutun. Balmumu kalıbını ılık balmumu ile doldurun (dağıtıcıdan).
    4. Bölümleri ısıtılmış forseps ile kasetten çıkarın ve kalıba yerleştirin; Daha sonra, kaset tabanını kalıbın üstüne yerleştirin ve ardından daha fazla balmumu ile doldurun. 30 dakika boyunca soğuk bir tabak üzerinde soğutulmuş suya koyun, böylece parafin numuneyi içeren bir blok oluşturmak için katılaşır.
    5. ~5 μm kalınlığındaki bölümleri kesmek için döner bir mikrotom kullanın (bkz. Bölümleri düzleştirmek için ılık bir banyoda yüzdürün. Bölümleri bir cam mikroskop slaytına alın. Bölümlerin slayda yapışmasını sağlamak için RT'de kurumasını bekleyin.
      NOT: Boyama sırasında doku kesitlerinin kaybını önlemek için yapışkan malzemeler veya protein kaplamalar uygulama ihtiyacını ortadan kaldıran slaytlar kullanın.
  3. Hematoksilin ve eozin (H & E) boyama işlemini gerçekleştirin.
    1. Aşağıdakilerle 17 boyama kabı hazırlayın: ksilen (dört tabak),% 100 etanol (mutlak alkol) (dört tabak), % 90 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol,% 50 etanol, PBS (üç tabak), hematoksilin çözeltisi, eozin çözeltisi. Aşağıdaki adımlara göre slaytları bir çanaktan diğerine aktarın ve hepsini RT'de gerçekleştirin.
      NOT: Her bir çanaktaki prosedür yaklaşık 10x tekrarlanabilir (örneğin, 20 slaytlı bir tabak kullanılıyorsa, sıvıları değiştirmeden 200 leke yapılabilir).
    2. İnkübatörde 30 dakika boyunca 65 ° C'de inkübasyon yaparak bölümleri deparaffinize edin. Slaytları 30 dakika boyunca ksilene batırın. Yeni ksilende 30 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    3. Slaytları 5 dakika boyunca% 100 etanol içine batırın. Yeni% 100 etanolde 5 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın. Slaytları her seyreltmede 2 dakika boyunca etanol sırasına,% 90,% 80,% 70 ve% 50 batırın.
    4. Slaytları 5 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içine batırın. Fazla sıvıyı dokunun etrafından ve slaytların arka tarafından silin.
    5. Hematoksilin çözeltisindeki bölümleri 7-8 dakika boyunca sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Bölümlere zarar vermemek için ters taraftan 30 s akan suda yıkayın. Adım 5.3.4'ü yineleyin.
    6. Bölümleri 30 sn boyunca eozin çözeltisi ile sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Adım 5.3.5'te belirtildiği gibi yıkayın ve ardından adım 5.3.4'ü tekrarlayın.
    7. Slaytları 2 dakika boyunca %100 etanol (mutlak alkol) içine batırın. Yeni% 100 etanolde 2 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    8. Slaytları 5 dakika boyunca ksilene batırın. Yeni ksilende 5 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    9. Bölümlerin RT'de 15 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Bir kapak kapağına bir damla montaj ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından bölümün üstüne yerleştirin.
  4. Bölümü ışık mikroskobu altında 20x veya 40x büyütme altında inceleyin ve görüntüler yakalayın (Şekil 7).

6. Vasküler geçirgenlik testi

NOT: Kulak kalınlığı ölçümüne alternatif olarak, vasküler geçirgenlik testi yapılabilir.

  1. Fareleri "0" gününde (adım 3.1.1-3.1.3) hassaslaştırın ve ardından "4" gününde, fareleri uyuşturun (adım 3.2.2) ve 0 saatlik kulak ölçümünü atlayarak doğrudan kulaklara hapten uygulayın (adım 3.2.4).
  2. Meydan okuma sonrası 23 saatte, fareleri anestezi altına alın (adım 3.2.2).
  3. İntravenöz olarak (i.v.) 8.3 μL/g vücut ağırlığında% 1 Evans mavi boyası enjekte edin (bakınız Malzeme Tablosu) Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salinine (DPBS) enjekte edin.
  4. Evans mavi enjeksiyonundan 1 saat sonra fareleri tekrar derin anestezi (adım 3.2.2) ile anestezi altına alın.
  5. Kulak biyopsilerini toplayın (adım 4.1).
    NOT: Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  6. Boyayı dokudan çıkarın, kulak yumruklarını 1 mL formamid içeren tüplere yerleştirin ve 18 saat boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Biyopsileri RT'de 3 dakika boyunca 3.000 x g'de santrifüj edin.
  8. OD'yi, 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalarda λ = 565 nm dalga boyunda, formamid içeren boş bir formamide karşı ölçün. Renk 24 saat boyunca kararlıdır. Test numunelerinin konsantrasyonunu standart eğriden okuyun (Evans mavisinin 0.2-30 μg boya / mL formamid arasında değişen konsantrasyonlarını kullanın) (Şekil 8).
    NOT: Plakalar, proteinlerin veya DNA'nın bağlanmaması için daha düşük bir bağlanma kapasitesine sahip polipropilenden yapılmalıdır.

7. Serum toplama ve anti-TNP immünoglobulin (IgG1) antikor ölçümü

  1. Kulak biyopsilerini topladıktan sonra (adım 4.1), fare hala derin anestezi altındayken, göz küresini cımbızla çıkarın, fareye hafif bir baskı uygulayın ve retro-orbital sinüsten tüpe kan toplayın (serum elde etmek için jelli şişe , bkz. Kan toplamanın alternatif bir yöntemi, kalbi bir şırınga ile delmek ve kanı toplamak olabilir.
    NOT: Kulaklar çıkarıldıktan sonra kan toplanmalıdır. Kan parametrelerindeki potansiyel farklılıklar nedeniyle tüm çalışma boyunca aynı kanama yöntemi kullanılmalıdır18. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. En az 6x ters çevirin, kanın pıhtılaşması için 30 dakika bekleyin ve ardından RT'de 10 dakika boyunca 1.300-2.000 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numune 6 ay boyunca -20 ° C'de stabildir.
  3. DPBS'de 10 μg / mL'lik bir konçersiyonda çözünmüş 2,4,6-trinitrofenil (TNP-BSA) ile konjuge edilmiş 50 μL sığır serum albümini içeren 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakayı kaplayın. Daha sonra, ikinci plakayı DPBS'de (arka plan) 10 μg / mL'lik bir konsantrasyonda çözünmüş sığır serum albümini (BSA) ile kaplayın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Fare serumu BSA'ya karşı antikorlar (Abs) içerir, bu nedenle numunelerin her iki plakada da test edilmesi gerekir ve daha sonra bir hesaplama yapılmalıdır (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Plakaları% 0.05 Ara 20 içeren 300 μL DPBS ile yıkayın. 3x tekrarlayın.
  5. Tahlil seyrelticisini hazırlayın (AD): %1 BSA içeren DPBS. Kuyucukları RT'de 1 saat boyunca AD ile bloke edin. tekrar yıkayın (adım 7.4).
  6. Dahili bir standart (iSTD) hazırlayın: fareleri TNCB ile hassaslaştırın (adım 3.1.1-3.1.3) ve duyarlılaştırmadan 10 gün sonra, serumu tüm donörlerden toplayın ve yoklayın (adım 7.1 ve adım 7.2).
  7. Standart eğriyi yapmak için plakaya 50 μL derecelendirilmiş iSTD konsantrasyonları ekleyin ( Tablo 3'te açıklanmıştır). Tabağa 50 μL serum örnekleri ekleyin. Her numuneyi ve standart eğriyi her iki plakada da test edin (TNP-BSA ve BSA kaplamalı). RT'de 2 saat boyunca inkübe edin. plakaları yıkayın (adım 7.4).
  8. AD ile 1:250 seyreltilmiş 50 μL biyotinile anti-fare IgG1 monoklonal antikoru (mAb, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin. tekrar yıkayın (adım 7.4).
  9. AD ile 1:2000 seyreltilmiş 50 μL yaban turpu peroksidaz strepttavidin (HRD streptavidin, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı yıkayın (adım 7.4).
  10. 50 μL TMB substratı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  11. 1M H2S04'ün 25 μL'sini ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun; reaksiyon 30 dakika boyunca kararlıdır.
  12. OD'yi λ = 450 nm dalga boyunda ve 570 nm arka planda ölçün (arka plan her 450 nm ölçümden çıkarılmalıdır). Sonuçları sunarken, numuneler için BSA ölçümlerini TNP-BSA'dan ve standart eğriden çıkarın. Ardından, standart eğriye göre antikorların birimini (U) hesaplayın (Şekil 9).

8. CHS-efektör hücrelerin evlat edinilmiş transferi

NOT: Bu yordam Şekil 2'de gösterilmiştir.

  1. Donörler (bir donör oranında: 1 alıcı): "0" gününde TNCB ile fareleri hassaslaştırın (adım 3.1.1-3.1.3).
  2. "4" gününde, farelerin derin anestezisini anestezi altına alın (adım 3.2.2).
  3. Forseps ile aksiller ve inguinal lenf nodlarını (ALN'ler) ve dalakları (SPL'ler) izole edin. ALN'leri bir şişede ve SPL'leri başka bir şişede bir araya getirin.
    NOT: Her aksillada pektoral kasının arkasında bir aksiller lenf nodu vardır. Kalça bölgesindeki bir inguinal lenf nodu üç kan damarının yanında bulunur. Dalak, vücudun sol tarafında bağırsak ve midenin arkasında bulunur19. Steril koşulları korumak için bir biyogüvenlik kabininde steril aletlerle çalışın. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  4. İki mikroskop slaytının buzlu uçları arasındaki dokuyu püre haline getirin. Hücre süspansiyonunu gözenek boyutu 70 μm olan bir hücre süzgecinden geçirin (bkz.
  5. Hücreleri% 1 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DPBS ile yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatantı boşaltın ve kalan hücre peletini 1-5.0 mL DPBS içinde yeniden askıya alın.
  6. Trypan mavisi ile bir hemositometre20 kullanarak canlı hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun 10 μL'sini Trypan mavisinin 90-990 μL (hücre sayısına bağlı olarak) ile karıştırın. Hücre numarasını hesaplarken seyreltmeyi dikkate alın (10x-100x).
  7. ALN'ler ve SPL'lerin bir karışımını hazırlayın (oran 1:1): 200 μL DPBS'de 8,0 x 106'dan 7,0 x 107/fareye kadar.
  8. Alıcılar (naif sinjenik fareler): naif alıcı fareleri anestezi altına alın (adım 3.2.2) ve i.v.'yi CHS-efektör hücrelerinin hazırlanmış bir karışımı ile enjekte edin (adım 8.7). Farelerin kontrol grubunda, herhangi bir hücre enjekte etmeyin.
  9. Kulak kalınlığını meydan okumadan önce (0 saat) ve sonra (24 saat) ölçün (adım 3.2.1-3.2.6) (Şekil 10).
  10. Ek olarak, izole CHS-efektör hücreler üzerinde testler yapın (örneğin, hücre fenotiplemesi veya üretilen sitokinlerin CHS-efektör hücreler tarafından akış sitometrisi ile ölçülmesi). Hücre kültürleri de kurulabilir ve CHS-efektör hücrelerin antijen varlığında çoğalma kabiliyeti veya kültür süpernatantlarında salgılanan sitokinlerin miktarı21,22 olarak değerlendirilebilir (veriler sunulmamıştır).
    NOT: Ek testler yapmak, buna bağlı olarak daha fazla hücre bağışçısı gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CHS indüksiyonu için, hayvanlar cilt boyama (karın) yoluyla 150 μL% 5 TNCB ile hassaslaştırıldı veya sadece araçla hassaslaştırıldı. "4" gününde, her iki kulağın kulak şişmesi tepkileri, daha önce TNCB (test grubu) ve kontrol grubu fareleri (sahte duyarlılaştırılmış) ile daha önce temas halinde olan her iki farede de% 0.4 TNCB'nin 10 μL'si ile temas boyama (meydan okuma) ile indüklendi. Sunulan veriler, TNCB ile duyarlılaşan ve 4 gün sonra meydan okuyan farelerin, benzer şekilde meydan okunan sahte duyarlılaştırılmış olanlara kıyasla önemli ölçüde artmış kulak şişmesi geliştirdiğini göstermektedir (Şekil 3, Tablo 2, test ve kontrol grubu). Kulak şişmesi sonuçları, bir mikrometre ile belirlenen kulak ödemindeki artışın, artırılmış kulak ağırlığı (Şekil 4), MPO aktivitesi (Şekil 5), kulak ekstrelerinde IFN-γ konsantrasyonu (Şekil 6), histolojik incelemede ödemli dermisin kalınlaşmasının artması (Şekil 7) ve kulak vasküler geçirgenliği (Şekil 8) ile aynı fikirde olduğu vurgulanarak, kulak şişmesi sonuçları daha ileri çalışmalarda tamamen doğrulanmıştır. ). TNP-spesifik IgG1 antikorlarının konsantrasyonunda, kontrol hayvanlarıyla karşılaştırıldığında test farelerinin serumlarında da bir artış bulundu (Şekil 9).

T hücresi aracılı immün yanıtın bir örneği olarak, CHS ayrıca naif sinjenik alıcı farelere de aktarılabilir. Donörler TNCB uygulaması ile duyarlılaştırıldı ve daha sonra, CHS-efektör hücreleri, hapten ile zorlanan ve 24 saat sonra CHS için test edilen naif alıcı farelere i.v. uygulandı (Şekil 10). CHS-efektör hücrelerini daha önce TNCB ile hassaslaştırılmış donörlerden alan hayvanlar, yalnızca meydan okunan hayvanlara kıyasla (herhangi bir hücre almayan) önemli ölçüde artmış kulak şişmesi gösterdi.

CHS reaksiyonu karmaşık bir mekanizmaya sahiptir ve çeşitli hücreleri içerir. Antijen sunumu ve T/B hücre aktivasyonu periferik lenf organlarında (örneğin, ALN'ler ve SPL) meydana gelir. Evlat edinilmiş hücre transferinden önce CD4 + 'dan tükenen ancak CD8 + hücrelerini tüketmeyen CHS-efektör hücrelerin, alıcı farelerde CHS reaksiyonunun yokluğuna neden olduğu belirlenmiştir. Bu hücrelerin IFN-γ (T-box transkripsiyon faktörü TBX21, Tbet +) ve IL-17A (retinoik asit reseptörü ile ilişkili yetim nükleer reseptör gama, RORγT +) için pozitif olduğu bulundu (Ek Şekil 1).

Temsili deneylerden elde edilen sunulan sonuçlar, 8-12 haftalıkken C57BL / 6 ve CBA / J erkek ve dişi fareler üzerinde gerçekleştirildi. Hayvanların kullanımında 3R kurallarını takiben23, özellikle indirgeme, bu makalenin amaçları doğrultusunda, deneylerin sonuçları küçük hayvan grupları üzerinde gösterilmiştir. Grafiklerdeki veriler ortalama SEM ± gösterilmiştir. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak belirlenmiştir. Grafikler Prizma yazılımı kullanılarak çizilmiştir (bkz.

Figure 1
Resim 1: CHS indüksiyonu. Hassaslaşma, meydan okuma ve kulak ölçümü. Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CHS-efektör hücrelerin evlat edinilmiş transferi. Kısaltmalar: ALN'ler = aksiller ve inguinal lenf düğümleri; CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; i.v. = intravenöz olarak; SPL'ler = dalaklar; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Bir mikrometre ile kulak şişmesinin ölçülmesiyle CHS'nin TNCB'ye temsili olarak değerlendirilmesi. Fareler TNCB (test grubu) veya sahte (kontrol grubu) duyarlıydı ve daha sonra meydan okundu. Kulak kepçesinin kalınlığı meydan okumadan önce ve sonra ölçüldü ve kulak şişliğindeki farklılıklar, 0 saatlik kulak kalınlığı (μm) 24 saatlik kulak kalınlığından (μm) çıkarılarak hesaplandı. Kulak şişmesi ortalama SEM ±, ****p < 0.0001, n = 10 fare/grup olarak ifade edildi ( Tablo 2'den alınan veriler). Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; SEM = ortalamanın standart hatası; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: CHS'nin kulak ağırlığının ölçülmesiyle temsili olarak değerlendirilmesi. Kulak ağırlığı, kulak şişmesine karşılık gelen parametrelerden biridir. Fareler TNCB (test grubu) veya sahte (kontrol grubu) duyarlıydı ve daha sonra meydan okundu. Mücadeleden 24 saat sonra çıkarılan kulaklardan 6 mm çapında zımbalar alındı. Zımbalar analitik laboratuvar terazisinde tartıldı. Kulak ağırlığı ortalama SEM ± miligram (mg) cinsinden ifade edildi, ***p < 0.001, n = 10 fare / grup. Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; SEM = ortalamanın standart hatası; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: MPO faaliyetinin temsili değerlendirmesi. Doku ekstraktlarında artmış MPO aktivitesi kulak iltihabı ile ilişkilidir. TNCB'ye duyarlı fareler (test grubu) ve sahte duyarlılaştırılmış fareler (kontrol grubu) zorlandı. Meydan okuma sonrası 24 saatte kulaklar çıkarıldı ve kulağın 6 mm çapındaki yumrukları çıkarıldı ve işlendi. MPO aktivitesi, protein içeriği başına U cinsinden ifade edilir (U / g protein). Sonuçlar ortalama SEM, **p ± 0.01, n = 5-6 fare/grup < olarak görüntülenir. Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; MPO = miyeloperoksidaz; SEM = ortalamanın standart hatası; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen; U = birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Kulak ekstrelerinde sitokin üretimi-IFN-γ konsantrasyonunun temsili olarak değerlendirilmesi. Fareler TNCB (test grubu) veya sahte (kontrol grubu) duyarlıydı ve daha sonra meydan okundu. Meydan okuma sonrası 24 saatte kulaklar çıkarıldı ve kulağın 6 mm çapında yumrukları alındı. IFN-γ konsantrasyonu ELISA tarafından doku homojenatlarında belirlendi. Ortalama ± SEM olarak gösterilen sonuçlar, *p < 0.05, n = 5 fare/gruptur. Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; IFN-γ = interferon gama; SEM = ortalamanın standart hatası; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Kulak dokusunun temsili histolojisi. Hematoksilin ve eozin boyama. Fareler TNCB (test grubu) veya sahte (kontrol grubu) duyarlıydı ve daha sonra meydan okundu. (A-C) Test grubundaki histolojik inceleme, epidermiste mikroapse oluşumu ile birlikte, esas olarak dermiste önemli ölçüde artmış inflamatuar hücre konsantrasyonunda (mononükleer ve polimorfonükleer hücreler) ortaya çıkmıştır. Ödemli dermisin kalınlaşması ve kalınlaşmış, hiperplastik bir epidermisin de fark edildi. (D-E) Kontrol grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Temsili vasküler geçirgenlik testi. Gözlenen kulak dokusu ödemi, artmış vasküler geçirgenliğin bir sonucudur. Vasküler geçirgenlikteki değişiklikleri belirlemek için, fareler TNCB (test grubu) veya sahte (kontrol grubu) duyarlılaştırıldı ve 4 gün sonra meydan okundu. Meydan okumadan 23 saat sonra Evans mavisi enjekte edildi ve Evans mavi enjeksiyonundan 1 saat sonra hayvanlar ötenazi yapıldı ve kulağın 6 mm çapında yumrukları yapıldı. Ortalama ± SEM olarak gösterilen sonuçlar, **p < 0.01, n = 5 fare/grup. Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; SEM = ortalamanın standart hatası; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Temsili anti-TNP IgG1 antikor ölçümü. Serumdaki anti-TNP IgG1 antikorlarının konsantrasyonu, sahte duyarlılaştırılmış (kontrol) ve TNCB duyarlılaştırılmış (test grubu) farelerde hapten TNCB ile yapılan mücadeleden 24 saat sonra ölçüldü. Toplanan serumlar ELISA tarafından antikor konsantrasyonu açısından test edildi. Ortalama ± SEM olarak gösterilen sonuçlar, ***p < 0.001, n = 10 fare/grup. Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; IgG1 = immünoglobulin G alt sınıf 1; SEM = ortalamanın standart hatası; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: CHS-efektör hücrelerinin temsili evlat edinilmiş transferi. CHS-efektör hücreler TNCB ile sensitize edilen donörlerden elde edildi. Daha sonra, toplanan bağışıklık hücreleri, yani CHS efektör fazının uyarılması için zorlanan naif sinjenik alıcılara enjekte edildi. Kontrol grubu fareler, meydan okumadan önce herhangi bir hücre almadı. Kulak kepçesinin kalınlığı meydan okumadan önce ve sonra ölçüldü. Ortalama ± SEM olarak gösterilen sonuçlar, ***p < 0.001, n = 7 fare/grup. Kısaltmalar: CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; SEM = ortalamanın standart hatası; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Fare zorlanması Sensitizasyon çözeltisi (doz)
traşlı karın üzerinde		 Aspirasyon çözeltisi (doz)
kulağın her iki tarafında / s		 Hassaslaştırma / uyandırma günü Referanslar
BALB/c (H-2d); C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (H-2 u arka plan)		 Aseton-zeytinyağı karışımında 25 μL % 0.5 DNFB (oran 4:1) Aseton-zeytinyağı karışımında 5 μL % 0.1 DNFB (oran 4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) Aseton-zeytinyağı karışımında 50 μL % 0.5 DNFB (oran 4:1) Aseton-zeytinyağı karışımında 25 μL % 0.2 DNFB (oran 4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b); IL-17A-/- (C57BL/6 arka plan) Aseton-etanol karışımında 150 μL %5 TNCB (oran 1:3) Zeytinyağı-aseton karışımında 10 μL % 0.4 TNCB (oran 1:1) 0 / 4 33
CBA/J (H-2k); C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (C57BL/ 6 arka plan)		 Bir aseton-etanol karışımında %5 TNP-Cl'nin (TNCB) 150 μL'si (oran 1:3) Zeytinyağı-aseton karışımında 10 μl % 0.4 TNP-Cl (TNCB) (oran 1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b); BALB/c (H-2d) Bir asetonda %1 TNCB'nin 25 μL'si Bir asetonda 0,1 veya % 0,2 TNCB'nin 10 μL'si (ve % 1'e kadar daha yüksek) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b); TLR2-/-/ TLR4-/-
(C57BL/6 arka plan üzerinde çift nakavtlı fareler)		 Bir asetonda 100 μL % 3 TNCB Bir asetonda %1 TNCB'nin 20 μL'si (kulakların sadece arka tarafında) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
MHC sınıfı II eksikliği olan fareler (C57BL/6 arka plan)		 Aseton-zeytinyağı karışımında %3 TNCB'nin 100 μL'si (oran 4:1) Aseton-zeytinyağı karışımında 20 μL 0.5 veya % 1 TNCB (oran 4: 1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) Bir asetonda 100 μL % 7 TNCB Bir asetonda 20 μL %1 TNCB 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) Etanolde 100 μL %3 OX Bir etanolde 20 μL %1 OX 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/ 6 arka plan) Aseton zeytinyağında 25 μL % 0.5 DNFB (oran 4:1) Aseton zeytinyağında 10 μL % 0.2 DNFB (oran 4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/ 6 arka plan) Alkol-asetonda 150 μL % 3 OX (oran 3:1) Alkol-asetonda 10 μL %1 OX (oran 3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); C3H/HeN (H-2k); TLR4-/- (C3H/HeJ arka planı); MyD88-/- (C57BL/6 arka plan) Her iki kulağın dorsal tarafında beyaz petrolatum içinde %10 NiCl2'lik 100 mg/kulak Beyaz petrolatumda %10 NiCl2 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (NOD arka planı) Aseton ve dibütil ftalat içinde 400 μL % 0,5 FITC Aseton ve dibütil ftalat içinde %0,1 FITC'nin 10 μL'si 0 / 5 25

Tablo 1: CHS modelinin çeşitli çalışmalarda karşılaştırılması. Kısaltmalar: DNFB = 1-floro-2,4-dinitrobenzen; FITC = floresein izotiyosiyanat; NiCl2 = nikel (II) klorür; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen; TNP-Cl = trinitrofenil klorür; OX = oksazolon. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Kontrol grubu (negatif) Test grubu (CHS reaksiyonu)
Fare # kulak: L, R 0 saat kulak kalınlığı [μm] 24 saat kulak kalınlığı [μm] 24 saat – 0 saat kulak kalınlığı [μm] Fare # kulak: L, R 0 saat kulak kalınlığı [μm] 24 saat kulak kalınlığı [μm] 24 saat – 0 saat kulak kalınlığı [μm]
1 L 365 380 15 1 L 345 427.5 82.5
1 R 335 380 45 1 R 340 455 115
2 L 345 355 10 2 L 355 475 120
2 R 327.5 352.5 25 2 R 342.5 457.5 115
3 L 340 370 30 3 L 340 460 120
3 R 325 355 30 3 R 345 495 150
4 L 335 380 45 4 L 357.5 432.5 75
4 R 340 350 10 4 R 335 402.5 67.5
5 L 350 380 30 5 L 335 387.5 52.5
5 R 337.5 360 22.5 5 R 335 425 90
6 L 335 365 30 6 L 350 430 80
6 R 340 375 35 6 R 342.5 405 62.5
7 L 345 337.5 0 7 L 340 502.5 162.5
7 R 345 335 0 7 R 327.5 447.5 120
8 L 370 380 10 8 L 327.5 515 187.5
8 R 375 355 0 8 R 327.5 540 212.5
9 L 385 370 0 9 L 330 415 85
9 R 342.5 362.5 20 9 R 327.5 390 62.5
10 L 307.5 340 32.5 10 L 337.5 445 107.5
10 R 325 350 25 10 R 352.5 455 102.5
Demek 20.75 Demek 108.5
± SEM 3.245 ± SEM 9.565

Tablo 2: CHS'nin efektör fazındaki kulak kalınlığındaki farkın hesaplanmasına temsili örnek. Hapten ile mücadeleden önce ve sonra kulak kepçesinin kalınlığındaki farkın hesaplanması: 24 saat kulak kalınlığı (μm) - 0 saat kulak kalınlığı (μm). Her kulak ayrı bir ölçüm olarak sayılır. Mikrometre (μm) cinsinden ifade edilen kulak şişmesi SEM, n = 20 ±. Kısaltmalar: L = sol; R = sağ. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

AD ile iSTD seyreltme anti-TNP IgG1 Ab (U/mL)
100x 250
200x 125
400x 62.5
800x 31.25
1600x 15.63
3200x 7.8
sadece AD 0

Tablo 3: Anti-TNP IgG1 Ab ölçümü için standart eğri için farklı iSTD konsantrasyonlarının hazırlanması. 100x iSTD seyreltmesinin 250 U anti-TNP IgG1 Ab. Kısaltmaları olduğu varsayılıyordu: Ab = antikor; AD = tahlil seyreltici; iSTD = dahili standart; IgG1 = immünoglobulin G alt sınıf 1; TNP = 2,4,6-trinitrofenil; U = birimler. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: CHS-efektör hücrelerin fenotipi. CHS-efektör hücreler, daha önce TNCB ile duyarlılaştırılmış olan donörlerin ALN'lerinden ve SPL'lerinden elde edildi. (A) MACS tekniği kullanılarak, CHS-efektör hücreleri (tüm ALN'ler ve SPL'ler) CD4 + veya CD8 + hücrelerinden tükendi. Daha sonra, CHS efektör fazının uyarılmasından önce evlat edinilmiş hücre transferi gerçekleştirildi. Kulak şişmesi ortalama ± SEM olarak ifade edildi. (B-E) Bir akış sitometri tekniği kullanılarak, CHS-efektör ve naif (naif farelerden elde edilen) hücreler, analizden önce IFN-γ, Tbet, IL-17A ve RORγt için boyandı. Hücreler TCRβ+CD4+popülasyon için kapılıydı. Ortalama ± SEM olarak gösterilen sonuçlar, ***p < 0.001, **p < 0.01, * p < 0.05, n = 4-6 fare/grup. Kısaltmalar: ALN'ler = aksiller ve inguinal lenf düğümleri; CD4 = farklılaşma kümesi 4; CHS = temas aşırı duyarlılık reaksiyonu; IFN-γ = interferon gama; IL = interlökin; MACS = manyetik aktive hücre sıralama; ns = önemli olmayan; RORγt = retinoik-asit-reseptör ile ilişkili yetim nükleer reseptör gaması; SEM = ortalamanın standart hatası; SPL'ler = dalaklar; Tbet = T-box transkripsiyon faktörü TBX21; TCRβ = T hücre reseptörü beta; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CHS, derideki kendi kendine protein antijenlerine bağlanan ve neoantijenler yaratan haptenler yoluyla indüklenir. CHS, dolaşımdaki antijene özgü CHS-efektör T hücrelerinin lokal ekstravasküler alımı ile aracılık eder, bu da meydan okunan dokuda şişmeye neden olur ve sekonder cildin aynı hapten6'ya maruz kalmasından 24 saat sonra zirveye ulaşır. Dokunun şişmesi esas olarak lökositlerin infiltrasyonundan ve lökosit bağımlı fibrin birikiminden kaynaklanır24. Bu değişiklikler, hapten duyarlılaştırılmış ve meydan okunan farelere karşı sahte duyarlı ve meydan okunan farelerin kulak şişmesini ölçen bir mikrometre ile tespit edilebilir.

CHS, kulak ağırlığının karşılaştırılmasıyla da belirlenebilir. Daha sonra, kulak ağırlığı tayini için kullanılan kulak punchları daha ileri testler için kullanılabilir. İltihaplı kulaklara sızan hücre sitokin üreten T lenfositler ve MPO pozitif nötrofillerden oluşur. Kulak dokusu homojenatlarında, ELISA testi kullanılarak MPO aktivitesi veya pro-inflamatuar sitokinlerin konsantrasyonu (örneğin, TNF-α, IFN-γ, IL-17A veya diğerleri) veya qPCR testi25 kullanılarak derideki sitokin mRNA'nın ekspresyonu gibi çeşitli parametreler ölçülebilir. Ek olarak, damar geçirgenlik değişiklikleri Evans mavi testi21,26 kullanılarak değerlendirilebilir.

İltihaplı kulak dokusunda, gözlenen değişiklikler in vitro testlerle de tamamlanabilir, bu da T hücresi proliferasyonunu ve sitokin üretimini vurgular. Bu, ALN'lerin hapten konjuge protein antijenleri22,27 varlığında kültürlenmesiyle kolayca gerçekleştirilebilir. Sitokin sekresyonunun, duyarlılaştırılmış ancak zorlanmamış farelerden izole edilen ALN'ler tarafından değerlendirilmesi, indüksiyon yerine CHS-efektör hücreler tarafından sitokin üretimi ile ilgili ayrıntılar sağlar.

Sınırlama
Birçok mikrometre kulak şişmesini farklı doğrulukla ölçer. Örneğin, en düşük basınç bir yaylı kumpas tarafından uygulanır, bu nedenle sonuçların gerçek kalınlık kulak ölçümünü en iyi şekilde yansıtacağı görülmektedir. Bununla birlikte, Mitutoyo gibi daha fazla basınç uygulayan mikrometrelerin, ödem oluşumunun erken evresinde kulaklarda biriken sıvıyı daha sıkı sıkıştırması muhtemeldir. CHS'nin bifazik doğası, bu tür mikrometreler kullanılarak daha net bir şekilde görselleştirilebilir, çünkü daha fazla basınç uygulanır. Hafif basınçlı28 yaylı bir kaliper kullanıldığında bu daha zordur. Bununla birlikte, bazı çalışmalarda, kulakların kalınlığı bir kumpas29 ile ölçülmüştür. Ayrıca, gözlemcinin deneyimi, gözlemci deney gruplarından habersiz olsa bile, öznel duygulardan etkilenebilecek doğru ölçümler sağlar.

Burada, kulak şişmesi ölçümlerini bir mikrometre ile doğrulamaya yardımcı olabilecek alternatif yöntemler tanımlanmıştır, bu da sunulan verileri daha güvenilir ve daha az öznel hale getirir. Bununla birlikte, CHS'yi değerlendirmek için bu alternatif stratejiler yalnızca bir noktada kullanılabilir. Mikrometre ölçümleri çeşitli zaman noktalarında tekrarlanabilir ve CHS kinetiğinin incelenmesine izin verir.

Değişiklik
Laboratuvarımızda kullandığımız CHS reaksiyonunu incelemek için kullandığımız protokol, hapten dozu ve hem uyandırma hem de duyarlılaştırma için kullanılan çözücü bileşimi ve reaksiyonun değerlendirildiği zaman noktası dahil olmak üzere diğer laboratuvarlarda kullanılanlardan önemli ölçüde farklıdır. Kulak kalınlığı farklı zaman noktalarında ölçülebilir (örneğin, 2 saat, 24 saat, 48 saat ve meydan okumadan 72 saat sonra)10,30. Tablo 1, farklı deneysel modelleri, özellikle hayvan suşu, hapten ve çeşitli çalışmalarda kullanılan duyarlılaştırma / meydan okuma sürelerindeki farklılıkları göstermektedir 10,21,22,26,31,32,33,34,35,36,37 . CHS protokolü, farelerin karnının daha önce tıraş edilmeden de gerçekleştirilebilir.

Bir sonraki fark, ortaya çıkarmanın (meydan okumanın) kendisinin yürütülmesiyle ilgilidir. Tipik olduğu gibi, hassaslaştırma, traş edilmiş farelerin karın derisini sadece hapten veya araçla boyayarak yapılır. Daha sonra, her iki grupta da, her iki kulak tarafında seyreltilmiş hapten ile bir kulağa meydan okunur. Kontrol olarak karşı kulak aynı miktarda araç ile tek başına10,31 adet boyanır.

Kritik adımlar
En kritik an, test sonuçları buna bağlı olduğu için CHS'yi tetiklemektir. (1) Hapten çözeltisi çok uçucu ve ışığa duyarlıdır, bu nedenle sıkıca kapatılmalı ve ışıktan korunmalı ve kullanımdayken buharlaşmaması için hayvanların derisine hızlı bir şekilde uygulanmalıdır. (2) Hapteni karın derisine uyguladıktan sonra, hayvan kafese dönmeden önce kurutulmalıdır, çünkü fareler onu yataklara bulaştırabilir veya pençeleriyle kulaklara uygulayabilir (daha sonra kulak kepçesinin kalınlığının ölçülmesi yetersiz olabilir). (3) Fare kuyruklarını çözücüye dayanıklı bir işaretleyici ile işaretlemek gibi hayvanları etiketlemek için çeşitli yöntemler de bilinmektedir. Bununla birlikte, belirteçte bulunan boyalar (çalışılmamış) bir hapten haline gelebilir ve CHS'yi tetikleyebilir. Bu nedenle bu çalışmada reaksiyonu etkilemeyen bir işaretleme yöntemi seçilmiştir. (4) Bir tıraş yöntemi seçmek, cildi tahriş edebileceği için çok önemlidir. Bu protokolde, yatıştırıcı özelliklere sahip olduğu için gri bir sabun kullanılmıştır; antibakteriyel etkileriyle yardımcı olan küçük kesiklerin ve iltihaplı yaraların tedavisini hızlandırır. Cildin şişmesini ve iltihaplanmasını yatıştırır.

Farklı çalışmalardan elde edilen sonuçları karşılaştırmak için hayvan kullanımı (suş ve cinsiyet) dahil olmak üzere deneysel prosedürlerin daha ileri araştırmaları ve standardizasyonu gereklidir.

CHS modelinde birçok farklı çevresel faktör ve biyolojik fonksiyonlara sahip yeni maddeler test edilebilir. Bu model, araştırmacılar test edilen faktörlerin T hücresine bağımlı bağışıklık tepkilerini modüle edip etmediğini göstermek istiyorlarsa yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma subvention SUBZ tarafından desteklenmiştir. Polonya, Wroclaw'daki Tıp Üniversitesi'nin A020.22.060 ve Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı'ndan N N401 545940'tan MS'ye ve IP2012 0443 72'den MMS'ye hibelerle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 187 Murin modeli alerjik kontakt dermatit (AKB) kontakt aşırı duyarlılık (CHS) kulak şişmesi vasküler geçirgenlik miyeloperoksidaz (MPO) sitokinler 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB) hapten

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Alerjik Kontakt Dermatitin Murin Modeli Olarak Kontakt Aşırı Duyarlılık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zemelka-Wiacek, M.,… More

Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter