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Immunology and Infection

Hipersensibilidad de contacto como modelo murino de dermatitis alérgica de contacto

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental murino de dermatitis alérgica de contacto (ACD). El CHS se basa en la sensibilización con hapteno reactivo mediante la pintura de la piel afeitada del pecho y el abdomen, con un posterior desafío de la piel del oído con un hapteno diluido, causando una reacción de hinchazón que se evalúa de varias maneras.

Abstract

La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental de dermatitis alérgica de contacto (ACD) que se puede estudiar en ratones. Este estudio tiene como objetivo presentar un método de laboratorio objetivo que pueda ayudar a estudiar la reacción chS en ratones, que puede medirse y cuantificarse mediante diversas pruebas. Para inducir CHS, en el día "0", los ratones fueron sensibilizados en un punto previamente afeitado por pintura de piel abdominal con el hapteno 2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB) en una mezcla de acetona-etanol, mientras que los ratones de control negativo fueron sensibilizados simuladamente con la mezcla de vehículo solo de acetona-etanol. En el día "4", el grosor basal del oído se midió con un micrómetro antes de la elicitación de CHS (desafío) pintando ambos oídos con TNCB diluido tanto en el grupo de prueba como en el de control. Después de 24 h, la hinchazón del oído se midió con un micrómetro. CHS es un ejemplo de una respuesta inmune mediada por células T que causa hinchazón en el tejido inflamado, alcanzando su punto máximo 24 horas después del desafío de la piel con el mismo hapteno. Un aumento en el edema del oído se correlacionó con el aumento del peso del oído, la actividad de la mieloperoxidasa (MPO), la concentración de citoquinas proinflamatorias en los extractos de oído, el aumento del engrosamiento de la dermis edematosa en el examen histológico y la permeabilidad vascular del oído. También hubo un aumento en la concentración de anticuerpos IgG1 específicos de TNP en los sueros del grupo de prueba en comparación con los ratones de control. Además, el CHS se puede transferir con éxito con las células efectoras de CHS obtenidas de donantes previamente sensibilizados con TNCB. Las células efectoras de CHS se administraron por vía intravenosa en ratones receptores ingenuos, que posteriormente fueron desafiados con el mismo hapteno diluido. La hinchazón del oído se midió con un micrómetro 24 h más tarde.

Introduction

La dermatitis alérgica de contacto (ACD) es una enfermedad inflamatoria común de la piel en los países industrializados causada por una reacción de hipersensibilidad tipo IV resultante de la exposición a sustancias químicas de bajo peso molecular llamadas haptenos. Las sustancias que causan sensibilización por contacto en los seres humanos incluyen iones de metales pesados (cromo, níquel, hierro, cobalto), trementina, fragancias, colorantes y conservantes presentes en cosméticos (por ejemplo, p-fenilendiamina), algunos medicamentos (por ejemplo, neomicina, benzocaína), antibióticos β-lactámicos (es decir, penicilina), productos químicos producidos por las plantas (pentadecacacecol, una sustancia presente en la hiedra venenosa), así como hidroquinona utilizada en la industria fotográfica 1,2 . Los agentes etiológicos acD son muy altos, ya que solo en la industria se utilizan más de 100,000 productos químicos, y se sintetizan 2,000 nuevos cada año. Hasta la fecha, se han identificado más de 3.700 moléculas que pueden ser haptenos/alérgenos de contacto3. La reacción de hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental de ACD que puede estudiarse en ratones, cobayas y ratas y puede ser inducida por la aplicación tópica en la piel de haptenos químicos reactivos disueltos en disolventes orgánicos 4,5,6. Este estudio tiene como objetivo describir un método de laboratorio objetivo que puede ayudar a estudiar la reacción chS en ratones, que puede medirse y cuantificarse mediante diversas pruebas.

El CHS consiste en fases de sensibilización (inducción) y efector (desafío). En modelos animales, los haptenos primero se unen covalentemente a las proteínas del cuerpo para crear neoantígenos. Durante la fase de sensibilización, los queratinocitos activados promueven la migración y maduración de las células dendríticas de la piel (sDC) mediante la producción de citoquinas proinflamatorias-factor de necrosis tumoral α (TNF-α) e interleucina 1β (IL-1β)7. Las células de Langerhans epidérmicas (LC) presentan antígenos durante las fases de inducción y efector del CHS8. Los LC expuestos al hapteno durante la sensibilización promueven la inducción de células reguladoras y efectoras9. La creciente evidencia de varios estudios sugiere que las respuestas de CHS pueden estar mediadas por células Th1 restringidas a CD4 + MHC clase II, liberando localmente interferón-γ (IFN-γ) para emplear un infiltrado inflamatorio característico, linfocitos Tc1 restringidos por CD8 + MHC clase I que también pueden liberar IFN-γ pero en su mayoría median daño citotóxico a los queratinocitos, y ahora también células Th17 productoras de interleucina 17 (IL-17)10, 11.

Se han desarrollado varios modelos diferentes de CHS que emplean variasespecies 1 2,13,14 y haptenos (una comparación detallada de diferentes haptenos, disolventes y tiempo de aplicación se resume en la Tabla 1). El ratón, una especie de laboratorio de uso frecuente, ofrece algunas ventajas en el estudio de CHS. Hay más cepas, knockouts (KO) y animales transgénicos entre los ratones en comparación con otras especies, lo que los convierte en un animal muy atractivo15. Además, el modelo CHS requiere muchos animales, y los ratones son más económicos aquí. Los modelos animales no imitan el ACD en todos los aspectos; en particular, muestran costras y descamación, lo que no es común para los humanos16,17. Las características de la enfermedad crónica son difíciles de reproducir, principalmente porque el modelo descrito no asume la aplicación del hapteno durante un largo período de tiempo. Sin embargo, se ha confirmado aquí que muchos de los aspectos significativos de ACD se reproducen. También se ha demostrado que, al igual que en los seres humanos, estas características están asociadas con reacciones alérgicas locales. La elección del hapteno, su disolvente y su aplicación descrita en este protocolo fueron dictadas por el hecho de que los resultados han sido confirmados por numerosas pruebas in vitro y que fue probado y modificado en el laboratorio durante muchos años hasta que se estableció la versión actual. Los modelos murinos permiten el análisis de los subconjuntos celulares o citoquinas que están involucradas en el desarrollo de ACD y son esenciales para las evaluaciones preclínicas de nuevos tratamientos.

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Protocol

Todos los experimentos presentados en este artículo se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del 1er Comité Ético Local de Pruebas con Animales en Cracovia. Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones locales, especialmente con respecto al uso de ketamina / xilazina como anestésico, el uso de ambos lados de las orejas para aplicar la sustancia / hapteno, el corte de la oreja y la recolección de sangre mediante la extracción del globo ocular. Para el presente estudio se utilizaron BALB/c (haplotipo H-2d), CBA/J (H-2k) y C57BL/6 (H-2b), ratones machos y hembras de 6-12 semanas de edad (ver Tabla de Materiales). Para la significación estadística, es mejor si cada grupo de ratones consta de 10-12 animales.

1. Preparación animal

  1. Limpie la mesa de operaciones con una solución de etanol al 70% antes y después de todos los procedimientos. Si utiliza ratones que requieren condiciones estériles, realice todas las operaciones en un gabinete de bioseguridad.

2. Marcado de ratones para su identificación

  1. Etiquete a los ratones afeitando la piel con una hoja de afeitar: # 0 - sin marcar, # 2 - en la pata delantera derecha, # 3 - en el lado derecho, # 4 - en la pata trasera derecha, # 5 - en la base de la cola, # 6 - en la pata trasera izquierda, # 7 - en el lado izquierdo, # 8 - en la pata delantera izquierda.
    NOTA: Debido a la reacción inducida, los ratones no pueden ser marcados clásicamente por golpes en las orejas o marcaje. Los ratones no fueron anestesiados durante el etiquetado.

3. Inducción de CHS

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 1.

  1. Realice la sensibilización (inducción) siguiendo los pasos a continuación.
    1. En el día "0", afeitar ratones en el pecho y el abdomen (cuadrado 2 cm x 2 cm) aplicando jabón gris con agua y afeitándose con una cuchilla de afeitar.
      NOTA: Antes de aplicar hapteno, espere 6 h para que la piel no se irrite.
    2. Preparar hapteno al 5%: 2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB, ver Tabla de Materiales) en una mezcla de acetona-etanol (relación 1:3) o solo en vehículo (acetona-etanol). Prepare las soluciones justo antes de usarlo en un vial de vidrio y protéjalo de la luz cubriendo el vial con papel de aluminio.
    3. El mismo día, sensibilizar a los ratones aplicando 150 μL de hapteno al 5% en el lugar previamente afeitado. En el grupo de ratones control, aplique el vehículo solo para evaluar la reacción inflamatoria inespecífica. Antes de volver a poner al animal en la jaula, espere 30 s, dejando que el hapteno se seque.
      PRECAUCIÓN: Use guantes; TNCB causa una reacción alérgica grave en la mayoría de las personas.
  2. Realizar elicitación (desafío) y medición de la hinchazón del oído.
    1. El día "4", prepare hapteno al 0,4%: TNCB en una mezcla de acetona-etanol (proporción 1: 1). Prepare la solución justo antes de usarla en un vial de vidrio y protéjala de la luz cubriendo el vial con papel de aluminio.
    2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (90-120 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg) (ver Tabla de Materiales) para anestesia profunda. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado durante al menos 5 minutos con un pellizco en el dedo del pie.
    3. Medir el grosor del oído (medición de 0 h, línea de base) con un micrómetro (ver Tabla de Materiales) por un observador que no conozca los grupos experimentales.
    4. Aplicar 10 μL de hapteno al 0,4% en ambos lados de las orejas en ambos grupos (prueba y control). Antes de volver a poner al animal en la jaula, espere 30 s y deje que el hapteno se seque.
    5. El día "5", 24 h después de la aplicación de hapteno, repita los pasos 3.2.2-3.2.3 para la medición de 24 h.
    6. Evalúe la respuesta de CHS calculando la diferencia en el grosor de la aurícula antes y después del desafío con el hapteno: 24 h de grosor del oído (μm) - 0 h de grosor del oído (μm). Cuente cada oreja como una medida separada. A continuación, exprese la hinchazón del oído en micrómetros (μm) ± error estándar de la media (SEM) (Tabla 2, Figura 3).

4. Biopsias de oído

  1. Inmediatamente después de la medición de 24 horas del grosor de la oreja (cuando el ratón todavía está bajo anestesia profunda), corte las orejas lo más cerca posible del cráneo con tijeras. Recoja las biopsias del lado distal de las orejas haciendo un punzón de 6 mm de diámetro utilizando un punzón de biopsia (ver Tabla de Materiales).
    1. Mida el peso del oído (paso 4.2) y, además, realice una de las siguientes pruebas en la misma biopsia de oído: ensayo de mieloperoxidasa (MPO) (paso 4.3) o medición in vitro de la concentración de citoquinas en los extractos de oído (por ejemplo, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [paso 4.4]).
      NOTA: Corte las orejas antes de la recolección de sangre. Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  2. Medir el peso de cada biopsia de oído en la balanza analítica y expresarlo en miligramos (mg) (Figura 4).
  3. Realice un ensayo de MPO siguiendo los pasos a continuación.
    1. Preparar tampón de homogeneización disolviendo bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 0,5% en tampón de fosforato de 50 mmol KH2PO4/Na2HPO4 y ajustando el pH a 6,0 (uso a temperatura ambiente, RT).
    2. Homogeneizar las biopsias en tubos de microcentrífuga de 2 ml con 500 μL de tampón preparado durante 10 min utilizando un homogeneizador con perlas de acero inoxidable de 5 mm de diámetro (añadir dos perlas/vial) (ver Tabla de Materiales). A continuación, enfríe la muestra durante 15 minutos a 4 °C y homogeneícela durante 10 minutos adicionales.
      NOTA: Los tubos de microcentrífuga tienen un fondo redondo para que las cuentas puedan moverse fácilmente.
    3. Congelar los homogeneizados a -20 °C durante 30 min. Descongelación y vórtice (asegúrese de que las muestras se descongelen). Repita este procedimiento 3x.
    4. Centrifugar los homogeneizados a 3.000 x g durante 30 min a 4 °C. Cosecha los sobrenadantes con una pipeta. Expresar la actividad MPO en unidades (U) por 1 mg de proteína.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras son estables a -20 °C durante 3 meses.
    5. Para medir la actividad de MPO, realice una reacción enzimática mezclando 20 μL de sobrenadante y 200 μL de sustrato MPO (0,167 mg/mL de diclorhidrato de orto-dianisina en 50 mmol de KH2PO4/Na2tampón HPO4 con 5 x 10−4% H202) y añadir en placas de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las placas durante 20 min en RT.
    6. Preparar la curva estándar utilizando 20 μL del estándar MPO a concentraciones desde 0.008 U hasta 0.5 U en 200 μL del sustrato MPO. Prepare la muestra en blanco solo con el sustrato MPO.
      PRECAUCIÓN: Use una máscara mientras trabaja con diclorhidrato de orto-dianisina.
      NOTA: Las placas deben estar hechas de polipropileno, que tiene una menor capacidad de unión para que las proteínas o el ADN no se unan.
    7. Mida la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de λ = 460 nm. La reacción enzimática es estable durante 10 min. Lea la actividad de MPO en muestras probadas de la curva estándar.
    8. Para medir la concentración de proteínas, use 20 μL del sobrenadante, realice una prueba con un kit de ácido bicinchonínico para la determinación de proteínas (ver Tabla de Materiales) y mida el OD a λ = 562 nm (Figura 5).
  4. Realizar medición in vitro de citoquinas en el extracto de oído.
    1. Homogeneizar las biopsias de oído en RT en tubos de microcentrífuga de 2 ml con 500 μL de reactivo de extracción de proteína tisular (T-PER) durante 10 min utilizando un homogeneizador con perlas de acero inoxidable de 5 mm de diámetro (añadir dos perlas/vial). A continuación, enfríe la muestra durante 15 minutos a 4 °C y homogeneícela durante 10 minutos adicionales.
      NOTA: Los tubos de microcentrífuga tienen un fondo redondo para que las cuentas puedan moverse fácilmente.
    2. Centrifugar los homogeneizados a 3.000 x g durante 30 min a 4 °C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras son estables a -80 °C durante 6 meses.
    3. Evalúe los niveles de citoquinas utilizando un conjunto ELISA disponible comercialmente (por ejemplo, IFN-γ) (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 6).

5. Histología del tejido auditivo

  1. Inmediatamente después de la medición de 24 horas del grosor de la oreja, cuando el ratón todavía está profundamente anestesiado, corte las orejas lo más cerca posible del cráneo con las tijeras (paso 4.1).
    NOTA: Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  2. Realice la incrustación de parafina de los bloques de tejido siguiendo los pasos a continuación.
    1. Inmediatamente después de la extracción, coloque la oreja en ~ 10 ml de formalina al 10% durante 24 h.
    2. Coloque las orejas en un cassette de procesamiento de tejidos. Coloque los casetes en un procesador automatizado (consulte la Tabla de materiales) para ciclos de deshidratación (alcohol 70%, 90%, 100%, 30 min cada uno en RT), ciclos de limpieza (xileno 3x, 30 min cada uno en RT) y ciclos de infiltración de cera (parafina 3x, 30 min cada uno a 56 °C).
    3. Retire los casetes del procesador automatizado y sujete la placa de calentamiento hasta que sea necesario. Llene el molde de cera con cera tibia (del dispensador).
    4. Retire las secciones del cassette con pinzas calentadas y colóquelas en el molde; a continuación, coloque la base del cassette en la parte superior del molde y luego llene con más cera. Colóquelo en agua fría en una placa fría durante 30 minutos para que la parafina se solidifique para formar un bloque que contenga la muestra.
    5. Utilice un microtomo rotativo (consulte la Tabla de materiales) para cortar secciones de ~5 μm de espesor. Flote las secciones en un baño tibio para aplanarlas. Recoja las secciones en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Deje que se sequen en RT para asegurarse de que las secciones se adhieran a la diapositiva.
      NOTA: Use portaobjetos que eliminen la necesidad de aplicar materiales adhesivos o recubrimientos de proteínas para evitar la pérdida de secciones de tejido durante la tinción.
  3. Realizar tinción de hematoxilina y eosina (H&E).
    1. Prepare 17 platos de tinción con lo siguiente: xileno (cuatro platos), 100% etanol (alcohol absoluto) (cuatro platos), 90% etanol, 80% etanol, 70% etanol, 50% etanol, PBS (tres platos), solución de hematoxilina, solución de eosina. Transfiera las diapositivas de un plato a otro según los pasos a continuación y realice todo en RT.
      NOTA: El procedimiento en cada plato se puede repetir aproximadamente 10 veces (por ejemplo, si se usa un plato de 20 diapositivas, se pueden hacer 200 manchas sin cambiar los líquidos).
    2. Desparafinar las secciones mediante incubación a 65 °C durante 30 min en la incubadora. Sumergir los portaobjetos en xileno durante 30 min. Repita 1x en xileno nuevo durante 30 min.
    3. Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min. Repita 1x en etanol nuevo 100% durante 5 min. Sumerja las diapositivas en la fila de etanol, 90%, 80%, 70% y 50%, durante 2 min en cada dilución.
    4. Sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min. Limpie el exceso de líquido alrededor del tejido y la parte posterior de los portaobjetos.
    5. Manche las secciones en solución de hematoxilina (ver Tabla de Materiales) durante 7-8 min. Lavar en agua corriente durante 30 s desde el reverso para no dañar las secciones. Repita el paso 5.3.4.
    6. Manche las secciones con solución de eosina (ver Tabla de Materiales) durante 30 s. Lave como se menciona en el paso 5.3.5 y luego repita el paso 5.3.4.
    7. Sumergir los portaobjetos en etanol al 100 % (alcohol absoluto) durante 2 min. Repita 1x en etanol nuevo 100% durante 2 min.
    8. Sumergir los portaobjetos en xileno durante 5 min. Repita 1x en xileno nuevo durante 5 min.
    9. Deje que las secciones se sequen al aire durante 15 minutos en RT. Agregue una gota de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) en un cubrecubiertas y luego colóquelo en la parte superior de la sección.
  4. Examine la sección bajo un microscopio de luz con un aumento de 20x o 40x, y capture imágenes (Figura 7).

6. Prueba de permeabilidad vascular

NOTA: Alternativamente a la medición del grosor del oído, se puede realizar una prueba de permeabilidad vascular.

  1. Sensibilizar a los ratones el día "0" (pasos 3.1.1-3.1.3), y luego, en el día "4", anestesiar a los ratones (paso 3.2.2) y aplicar directamente hapteno en las orejas (paso 3.2.4), omitiendo la medición del oído de 0 h.
  2. A las 23 h posteriores al desafío, anestesiar a los ratones (paso 3.2.2).
  3. Inyectar por vía intravenosa (i.v.) 8,3 μL/g de peso corporal de colorante azul Evans al 1% (ver Tabla de Materiales) en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  4. Anestesiar a los ratones de nuevo-anestesia profunda (paso 3.2.2)-1 h después de la inyección azul de Evans.
  5. Recoja biopsias de oído (paso 4.1).
    NOTA: Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  6. Extraiga el tinte del tejido, coloque punzones en los tubos que contienen 1 ml de formamida e incube a 37 °C en la atmósfera de 5% de CO2 durante 18 h.
  7. Centrifuga las biopsias a 3.000 x g durante 3 min en RT. Recoger los sobrenadantes con una pipeta.
  8. Mida el OD a una longitud de onda de λ = 565 nm en placas de fondo plano de 96 pocillos contra un espacio en blanco que contenga formamida. El color es estable durante 24 h. Lea la concentración de las muestras de prueba de la curva estándar (use las concentraciones de azul de Evans que van desde 0.2-30 μg de colorante/ml de formamida) (Figura 8).
    NOTA: Las placas deben estar hechas de polipropileno, que tiene una menor capacidad de unión para que las proteínas o el ADN no se unan.

7. Recolección de suero y medición de anticuerpos anti-TNP inmunoglobulina (IgG1)

  1. Después de recolectar biopsias de oído (paso 4.1), cuando el ratón todavía está bajo anestesia profunda, retire el globo ocular con pinzas, ejerza una presión suave sobre el ratón y recolecte sangre del seno retroorbital en el tubo (vial con gel para obtener suero, consulte la Tabla de materiales). Un método alternativo para recolectar sangre podría ser perforar el corazón con una jeringa y recolectar la sangre.
    NOTA: La sangre debe recogerse después de extraer las orejas. El mismo método de sangrado debe utilizarse en todo un estudio debido a las posibles diferencias en los parámetros sanguíneos18. Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  2. Invierta un mínimo de 6x, espere 30 minutos para que la sangre coagule y luego centríe a 1,300-2,000 x g durante 10 min a RT.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La muestra es estable a -20 °C durante 6 meses.
  3. Cubra una placa de fondo plano de 96 pocillos con 50 μL de albúmina sérica bovina conjugada con 2,4,6-trinitrofenilo (TNP-BSA) disuelto en DPBS a una concertación de 10 μg/ml. A continuación, cubra la segunda placa con albúmina sérica bovina (BSA) sola disuelta en DPBS (fondo) a una concentración de 10 μg/ ml. Incubar durante la noche a 4 °C.
    NOTA: El suero de ratón contiene anticuerpos (Abs) contra BSA, por lo que las muestras deben analizarse en ambas placas, y a continuación, se debe realizar un cálculo (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Lavar las placas con 300 μL de DPBS que contengan 0,05% Tween 20. Repita 3x.
  5. Preparar diluyente de ensayo (AD): DPBS que contiene 1% de BSA. Bloquee los pozos con AD durante 1 h en RT. Lavar de nuevo (paso 7.4).
  6. Preparar un estándar interno (iSTD): sensibilizar a los ratones con TNCB (pasos 3.1.1-3.1.3) y, 10 días después de la sensibilización, recolectar y sondear el suero de todos los donantes (paso 7.1 y paso 7.2).
  7. Añadir a la placa 50 μL de concentraciones graduadas de iSTD diluidas con AD para hacer la curva estándar (descrita en la Tabla 3). Añadir a la placa 50 μL de muestras de suero. Pruebe cada muestra y curva estándar en ambas placas (TNP-BSA y BSA recubiertas). Incubar durante 2 h en RT. Lavar las placas (paso 7.4).
  8. Añadir 50 μL de anticuerpo monoclonal igG1 biotinilado anti-ratón (mAb, ver Tabla de Materiales) diluido 1:250 con EA e incubar durante 1 h a RT. Lavar de nuevo (paso 7.4).
  9. Añadir 50 μL de estreptavidina peroxidasa de rábano picante (EStreptavidina HRD, ver Tabla de Materiales) diluida 1:2000 con EA, e incubar durante 30 min a RT en la oscuridad. Lavar la placa (paso 7.4).
  10. Añadir 50 μL de sustrato TMB (ver Tabla de Materiales) e incubar durante 30 min a RT en la oscuridad.
  11. Detener la reacción enzimática añadiendo 25 μL de 1 M H2SO4; la reacción es estable durante 30 min.
  12. Mida el OD a una longitud de onda de λ = 450 nm y un fondo de 570 nm (el fondo debe restarse de cada medición de 450 nm). Al presentar los resultados, reste las mediciones de BSA del TNP-BSA para muestras y la curva estándar. Luego, calcule la unidad (U) de anticuerpos de acuerdo con la curva estándar (Figura 9).

8. Transferencia adoptiva de las células efectoras de CHS

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 2.

  1. Donantes (en la proporción de un donante:1 receptor): sensibilizar a los ratones con TNCB el día "0" (pasos 3.1.1-3.1.3).
  2. En el día "4", anestesiar la anestesia profunda de los ratones (paso 3.2.2).
  3. Aislar con fórceps los ganglios linfáticos axilares e inguinales (ALN) y el bazo (SPL). Agrupe las ALN en un vial y las SPL en otro.
    NOTA: Hay un ganglio linfático axilar detrás del músculo pectoral en cada axila. Un ganglio linfático inguinal en la región de la cadera está situado junto a tres vasos sanguíneos. El bazo se encuentra en el lado izquierdo del cuerpo detrás del intestino y el estómago19. Trabaje con herramientas estériles en un gabinete de bioseguridad para mantener condiciones estériles. Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados (por ejemplo, por dislocación cervical).
  4. Triture el tejido entre los extremos esmerilados de dos portaobjetos de microscopio. Pase la suspensión celular a través de un colador celular con un tamaño de poro de 70 μm (ver Tabla de Materiales).
  5. Lave las células con DPBS suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y resuspendir el pellet celular restante en 1-5.0 mL de DPBS.
  6. Cuente las células vivas usando un hemocitómetro20 con azul de tripano, y mezcle 10 μL de la suspensión celular con 90-990 μL (dependiendo del número de células) de azul de tripano. Tenga en cuenta la dilución al calcular el número de celdas (10x-100x).
  7. Preparar una mezcla de ALNs y SPLs (ratio 1:1): 8.0 x 106 hasta 7.0 x 107/mouse en 200 μL de DPBS.
  8. Receptores (ratones singénicos ingenuos): anestesian ratones receptores ingenuos (paso 3.2.2) e inyectan i.v. con una mezcla preparada de las células efectoras chS (paso 8.7). En el grupo de control de ratones, no inyecte ninguna célula.
  9. Mida el grosor de la oreja antes (0 h) y después (24 h) del desafío (pasos 3.2.1-3.2.6) (Figura 10).
  10. Además, realice pruebas en células efectoras de CHS aisladas (por ejemplo, fenotipado celular o la medición de citoquinas producidas por las células efectoras de CHS mediante citometría de flujo). También se pueden establecer cultivos celulares, y se puede evaluar la capacidad de las células efectoras de CHS para proliferar en presencia del antígeno o la cantidad de citoquinas secretadas en los sobrenadantes de cultivo21,22 (datos no presentados).
    NOTA: La realización de pruebas adicionales requiere correspondientemente más donantes de células.

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Representative Results

Para la inducción de CHS, los animales fueron sensibilizados mediante pintura cutánea (abdominal) con 150 μL de TNCB al 5% o sensibilizados simuladamente con el vehículo solo. En el día "4", las respuestas de hinchazón del oído de ambos oídos fueron inducidas por pintura de contacto (desafío) con 10 μL de TNCB al 0,4% en ambos ratones previamente sensibilizados en contacto con TNCB (grupo de prueba) y en ratones del grupo control (sensibilizados simuladamente). Los datos presentados muestran que los ratones sensibilizados con TNCB y desafiados 4 días después desarrollaron un aumento significativo de la hinchazón del oído en comparación con los sensibilizados simuladamente desafiados de manera similar (Figura 3, Tabla 2, prueba vs. grupo de control). Los resultados de la hinchazón del oído fueron completamente validados en estudios posteriores, destacando que un aumento en el edema del oído determinado con un micrómetro concuerda con el aumento del peso del oído (Figura 4), la actividad MPO (Figura 5), la concentración de IFN-γ en los extractos de oído (Figura 6), el aumento del engrosamiento de la dermis edematosa en el examen histológico (Figura 7) y la permeabilidad vascular del oído (Figura 8 ). También se encontró un aumento en la concentración de anticuerpos IgG1 específicos de TNP en los sueros de los ratones de prueba en comparación con los animales de control (Figura 9).

Como ejemplo de respuesta inmune mediada por células T, chS también se puede transferir a ratones receptores singénicos ingenuos. Los donantes fueron sensibilizados por la aplicación de TNCB, y posteriormente, las células efectoras de CHS se administraron i.v. en los ratones receptores ingenuos, que fueron desafiados con el hapteno y probados para CHS 24 h más tarde (Figura 10). Los animales que recibieron las células efectoras de CHS de donantes previamente sensibilizados con TNCB mostraron un aumento significativo de la hinchazón del oído en comparación con los animales que fueron desafiados solo (no recibieron ninguna célula).

La reacción CHS tiene un mecanismo complejo e involucra a varias células. La presentación del antígeno y la activación de las células T/B ocurren en los órganos linfáticos periféricos (por ejemplo, ALN y SPL). Se determinó que las células efectoras de CHS agotadas de CD4 + pero no de células CD8 + antes de la transferencia de células adoptivas dieron lugar a la ausencia de la reacción chS en los ratones receptores. Se encontró que esas células eran positivas para IFN-γ (factor de transcripción T-box TBX21, Tbet +) e IL-17A (receptor nuclear huérfano relacionado con el receptor de ácido retinoico gamma, RORγT +) (Figura suplementaria 1).

Los resultados presentados de los experimentos representativos se realizaron en ratones machos y hembras C57BL/6 y CBA/J a las 8-12 semanas de edad. Siguiendo las reglas 3R en el uso de animales23, especialmente la reducción, para los fines de este artículo, los resultados de los experimentos se muestran en pequeños grupos de animales. Los datos de los gráficos se muestran como media ± SEM. La significación estadística se fijó en p < 0,05. Los gráficos se dibujaron utilizando el software Prism (ver Tabla de Materiales).

Figure 1
Figura 1: Inducción de CHS. Sensibilización, desafío y medición del oído. Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Transferencia adoptiva de las células efectoras de CHS. Abreviaturas: ALNs = ganglios linfáticos axilares e inguinales; CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; i.v. = por vía intravenosa; SPL = bazo; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación representativa de CHS a TNCB mediante la medición de la hinchazón del oído con un micrómetro. Los ratones fueron sensibilizados por TNCB (grupo de prueba) o simulados (grupo de control) y posteriormente desafiados. El grosor de la aurícula se midió antes y después del desafío, y las diferencias en la hinchazón del oído se calcularon restando el grosor del oído de 0 h (μm) del grosor del oído de 24 h (μm). La hinchazón del oído se expresó como media ± SEM, ****p < 0,0001, n = 10 ratones/grupo (datos de la Tabla 2). Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; SEM = error estándar de la media; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Evaluación representativa de chS mediante la medición del peso del oído. El peso del oído es uno de los parámetros que se corresponde con la hinchazón del oído. Los ratones fueron sensibilizados por TNCB (grupo de prueba) o simulados (grupo de control) y posteriormente desafiados. A las 24 horas después del desafío, se tomaron punzones de 6 mm de diámetro de las orejas extraídas. Los punzones se pesaron en una balanza analítica de laboratorio. El peso del oído se expresó en miligramos (mg) como media ± SEM, ***p < 0,001, n = 10 ratones/grupo. Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; SEM = error estándar de la media; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Evaluación representativa de la actividad de la MPO. El aumento de la actividad de MPO en extractos de tejido se correlaciona con la inflamación del oído. Los ratones sensibilizados con TNCB (grupo de prueba) y los ratones sensibilizados simulados (grupo de control) fueron desafiados. A las 24 horas después del desafío, se retiraron las orejas y se extrajeron y procesaron punzones de 6 mm de diámetro de la oreja. La actividad de MPO se expresa en U por contenido de proteína (U/g de proteína). Los resultados se muestran como media ± SEM, **p < 0,01, n = 5-6 ratones/ grupo. Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; MPO = mieloperoxidasa; SEM = error estándar de la media; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno; U = unidades. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Evaluación representativa de la producción de citoquinas-IFN-γ concentración en extractos de oído. Los ratones fueron sensibilizados por TNCB (grupo de prueba) o simulados (grupo de control) y posteriormente desafiados. A las 24 horas después del desafío, se retiraron las orejas y se tomaron punzones de 6 mm de diámetro de la oreja. La concentración de IFN-γ se determinó en homogeneizados tisulares mediante ELISA. Los resultados mostrados como media ± SEM, *p < 0,05, n = 5 ratones/grupo. Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; IFN-γ = interferón gamma; SEM = error estándar de la media; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Histología representativa del tejido auditivo. Tinción de hematoxilina y eosina. Los ratones fueron sensibilizados por TNCB (grupo de prueba) o simulados (grupo de control) y posteriormente desafiados. (A-C) El examen histológico en el grupo de prueba se manifestó en un aumento significativo de la concentración de células inflamatorias (células mononucleares y polimorfonucleares), principalmente en la dermis, con formación de microabscesos en la epidermis. También se notó engrosamiento de la dermis edematosa y una epidermis hiperplásica engrosada. (D-E) Grupo de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Prueba de permeabilidad vascular representativa. El edema del tejido auditivo observado es el resultado de una mayor permeabilidad vascular. Para determinar los cambios en la permeabilidad vascular, los ratones fueron sensibilizados con TNCB (grupo de prueba) o simulado (grupo de control) y luego desafiados 4 días después. A las 23 h después del desafío, se inyectó azul Evans y, 1 h después de la inyección azul Evans, los animales fueron sacrificados y se hicieron punzones de oreja de 6 mm de diámetro. Los resultados mostrados como media ± SEM, **p < 0,01, n = 5 ratones/grupo. Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; SEM = error estándar de la media; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Medición representativa de anticuerpos anti-TNP IgG1. La concentración de anticuerpos anti-TNP IgG1 en suero se midió 24 h después del desafío con hapteno TNCB en ratones sensibilizados simulados (control) y sensibilizados con TNCB (grupo de prueba). Los sueros recolectados fueron probados para la concentración de anticuerpos por ELISA. Los resultados mostrados como media ± SEM, ***p < 0,001, n = 10 ratones/grupo. Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; IgG1 = inmunoglobulina G subclase 1; SEM = error estándar de la media; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Transferencia adoptiva representativa de las células efectoras de CHS. Las células efectoras de CHS se obtuvieron de donantes sensibilizados con TNCB. A continuación, las células inmunes recolectadas se inyectaron, i.v., en receptores singénicos ingenuos, que fueron desafiados para la elicitación de la fase efectora de CHS. El grupo de control de ratones no recibió ninguna célula antes del desafío. El grosor de la aurícula se midió antes y después del desafío. Los resultados mostrados como media ± SEM, ***p < 0,001, n = 7 ratones/grupo. Abreviaturas: CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; SEM = error estándar de la media; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tensión del ratón Solución de sensibilización (dosis)
en el abdomen afeitado		 Solución de elicitación (dosis)
a ambos lados de la/s oreja/s		 Día de sensibilización / elicitación Árbitros
BALB/c (H-2d); C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (H-2u fondo)		 25 μL de DNFB al 0,5 % en mezcla de acetona y aceite de oliva (ratio 4:1) 5 μL de DNFB al 0,1 % en mezcla de acetona y aceite de oliva (ratio 4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) 50 μL de DNFB al 0,5 % en mezcla de acetona y aceite de oliva (ratio 4:1) 25 μL de DNFB al 0,2 % en mezcla de acetona y aceite de oliva (ratio 4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b); IL-17A-/- (fondo C57BL/6) 150 μL de TNCB al 5% en mezcla de acetona-etanol (relación 1:3) 10 μL de TNCB al 0,4 % en la mezcla de aceite de oliva y acetona (proporción 1:1) 0 / 4 33
CBA/J (H-2k); C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (fondo C57BL/6)		 150 μL de TNP-Cl al 5 % (TNCB) en una mezcla de acetona-etanol (relación 1:3) 10 μl de 0,4 % de TNP-Cl (TNCB) en mezcla de aceite de oliva y acetona (ratio 1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b); BALB/c (H-2d) 25 μL de TNCB al 1 % en una acetona 10 μL de 0,1 o 0,2 % de TNCB en una acetona (y superior hasta el 1 %) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b); TLR2-/-/ TLR4-/-
(ratones de doble knockout en fondo C57BL/6)		 100 μL de TNCB al 3 % en una acetona 20 μL de TNCB al 1 % en una acetona (justo en la parte posterior de las orejas) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
Ratones deficientes en MHC clase II (fondo C57BL/6)		 100 μL de TNCB al 3 % en mezcla de acetona y aceite de oliva (proporción 4:1) 20 μL de 0,5 o 1 % de TNCB en mezcla de acetona y aceite de oliva (ratio 4:1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) 100 μL de TNCB al 7 % en una acetona 20 μL 1 % TNCB en una acetona 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) 100 μL 3 % OX en etanol 20 μL 1 % OX en un etanol 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (fondo C57BL/6) 25 μL de DNFB al 0,5 % en aceite de acetona-oliva (ratio 4:1) 10 μL de DNFB al 0,2 % en aceite de acetona-oliva (ratio 4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (fondo C57BL/6) 150 μL de OX al 3 % en alcohol-acetona (ratio 3:1) 10 μL 1% OX en alcohol-acetona (proporción 3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); C3H/HeN (H-2k); TLR4-/- (fondo C3H/HeJ); MyD88-/- (fondo C57BL/6) 100 mg/oreja deNiCl 2 al 10 % en vaselina blanca en la cara dorsal de ambas orejas 10 % NiCl2 en vaselina blanca 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (fondo NOD) 400 μL de FITC al 0,5 % en acetona y ftalato de dibutilo 10 μL de FITC al 0,1 % en acetona y ftalato de dibutilo 0 / 5 25

Tabla 1: Comparación del modelo CHS en diversos estudios. Abreviaturas: DNFB = 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno; FITC = isotiocianato de fluoresceína; NiCl2 = cloruro de níquel (II); TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno; TNP-Cl = cloruro de trinitrofenilo; OX = oxazolona. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Grupo control (negativo) Grupo de prueba (reacción CHS)
Ratón # oreja: L, R 0 h de grosor de la oreja [μm] Grosor del oído 24 h [μm] 24 h – 0 h de grosor del oído [μm] Ratón # oreja: L, R 0 h de grosor de la oreja [μm] Grosor del oído 24 h [μm] 24 h – 0 h de grosor del oído [μm]
1 L 365 380 15 1 L 345 427.5 82.5
1 R 335 380 45 1 R 340 455 115
2 L 345 355 10 2 L 355 475 120
2 R 327.5 352.5 25 2 R 342.5 457.5 115
3 L 340 370 30 3 L 340 460 120
3 R 325 355 30 3 R 345 495 150
4 L 335 380 45 4 L 357.5 432.5 75
4 R 340 350 10 4 R 335 402.5 67.5
5 L 350 380 30 5 L 335 387.5 52.5
5 R 337.5 360 22.5 5 R 335 425 90
6 L 335 365 30 6 L 350 430 80
6 R 340 375 35 6 R 342.5 405 62.5
7 L 345 337.5 0 7 L 340 502.5 162.5
7 R 345 335 0 7 R 327.5 447.5 120
8 L 370 380 10 8 L 327.5 515 187.5
8 R 375 355 0 8 R 327.5 540 212.5
9 L 385 370 0 9 L 330 415 85
9 R 342.5 362.5 20 9 R 327.5 390 62.5
10 L 307.5 340 32.5 10 L 337.5 445 107.5
10 R 325 350 25 10 R 352.5 455 102.5
Significar 20.75 Significar 108.5
± SEM 3.245 ± SEM 9.565

Tabla 2: Ejemplo representativo de cálculo de la diferencia en el grosor del oído en la fase efectora de CHS. Cálculo de la diferencia en el grosor de la aurícula antes y después del desafío con el hapteno: 24 h de grosor del oído (μm) - 0 h de grosor del oído (μm). Cada oído cuenta como una medida separada. Hinchazón del oído expresada en micrómetros (μm) ± SEM, n = 20. Abreviaturas: L = izquierda; R = derecha. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Dilución de iSTD con AD anti-TNP IgG1 Ab (U/mL)
100x 250
200x 125
400x 62.5
800x 31.25
1600x 15.63
3200x 7.8
sólo AD 0

Tabla 3: Preparación de las diferentes concentraciones de iSTD para la curva estándar para la medición anti-TNP IgG1 Ab. Se asumió que la dilución 100x iSTD era de 250 U de anti-TNP IgG1 Ab. Abreviaturas: Ab = anticuerpo; AD = diluyente de ensayo; iSTD = estándar interno; IgG1 = inmunoglobulina G subclase 1; TNP = 2,4,6-trinitrofenilo; U = unidades. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: El fenotipo de las células efectoras de CHS. Las células efectoras de CHS se obtuvieron de alN y SPL de donantes, que previamente fueron sensibilizados con TNCB. (A) Empleando la técnica MACS, las células efectoras chS (ALN y SPL enteras) se agotaron de células CD4+ o CD8+. Posteriormente, se realizó la transferencia celular adoptiva antes de la elicitación de la fase efectora de CHS. La hinchazón del oído se expresó como media ± SEM. (B-E) Utilizando una técnica de citometría de flujo, las células CHS-efector y naïve (obtenidas de ratones naïve) se tiñeron para IFN-γ, Tbet, IL-17A y RORγt antes del análisis. Las células fueron cerradas para la población TCRβ+CD4+. Los resultados mostrados como media ± SEM, ***p < 0,001, **p < 0,01, * p < 0,05, n = 4-6 ratones/grupo. Abreviaturas: ALNs = ganglios linfáticos axilares e inguinales; CD4 = grupo de diferenciación 4; CHS = reacción de hipersensibilidad de contacto; IFN-γ = interferón gamma; IL = interleucina; MACS = clasificación celular activada magnéticamente; ns = no significativo; RORγt = receptor nuclear huérfano gamma relacionado con el receptor de ácido retinoico; SEM = error estándar de la media; SPL = bazo; Tbet = factor de transcripción T-box TBX21; TCRβ = receptor beta de células T; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El CHS se induce a través de haptenos, que se unen a antígenos autoproteicos en la piel, creando neoantígenos. El CHS está mediado por el reclutamiento extravascular local de células T efectoras chS específicas del antígeno circulante, lo que resulta en hinchazón en el tejido desafiado, alcanzando su punto máximo 24 h después de la exposición de la piel secundaria al mismohapteno 6. La hinchazón del tejido es causada principalmente por la infiltración de leucocitos y la deposición de fibrina dependiente de leucocitos24. Estos cambios se pueden detectar con un micrómetro que mide la hinchazón del oído de ratones sensibilizados y desafiados con hapteno versus simulados y desafiados.

CHS también se puede determinar mediante la comparación del peso del oído. Luego, los punzones para los oídos utilizados para la determinación del peso del oído se pueden usar para pruebas adicionales. Los infiltrados celulares en los oídos inflamados consisten en linfocitos T productores de citoquinas y neutrófilos positivos para MPO. En los homogeneizados del tejido auditivo, se pueden medir varios parámetros, como la actividad MPO o la concentración de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, TNF-α, IFN-γ, IL-17A u otras) utilizando la prueba ELISA o la expresión del ARNm de citoquinas en la piel mediante la prueba qPCR25. Además, los cambios en la permeabilidad de los vasos se pueden evaluar utilizando la prueba azul de Evans21,26.

En el tejido inflamado del oído, los cambios observados también se pueden complementar con pruebas in vitro, destacando la proliferación de células T y la producción de citoquinas. Esto se puede lograr fácilmente cultivando ALN en presencia de antígenos proteicos conjugados con hapteno22,27. La evaluación de la secreción de citoquinas por ALN aislados de ratones sensibilizados pero no desafiados proporciona detalles sobre la producción de citoquinas por las células efectoras de CHS en el lugar de su inducción.

Limitaciones
Muchos micrómetros miden la hinchazón del oído con diferente precisión. Por ejemplo, la presión más baja es ejercida por una pinza de resorte, por lo que parece que los resultados reflejarán mejor la medición real del grosor del oído. Sin embargo, es probable que los micrómetros que ejercen más presión, como Mitutoyo, compriman más firmemente el líquido que se acumula en los oídos en la fase temprana de la formación del edema. La naturaleza bifásica de CHS se puede visualizar más claramente utilizando tales micrómetros porque se ejerce más presión. Esto es más difícil cuando se usa una pinza de resorte con presión ligera28. Sin embargo, en algunos estudios, el grosor de las orejas se midió con un calibrador29. Además, la experiencia del observador garantiza mediciones precisas, que pueden verse influenciadas por sentimientos subjetivos, incluso si el observador no es consciente de los grupos experimentales.

Aquí se han descrito métodos alternativos que pueden ayudar a confirmar las mediciones de la hinchazón del oído con un micrómetro, lo que hace que los datos presentados sean más confiables y menos subjetivos. Sin embargo, estas estrategias alternativas para evaluar el CHS solo se pueden usar en un momento dado. Las mediciones de micrómetros se pueden repetir en varios puntos de tiempo, lo que permite estudiar la cinética de CHS.

Modificaciones
El protocolo para estudiar la reacción de CHS que utilizamos en nuestro laboratorio difiere significativamente de los utilizados en otros laboratorios, incluida la dosis de hapteno y la composición del disolvente utilizada tanto para la elicitación como para la sensibilización, así como el punto de tiempo en el que se evalúa la reacción. El grosor de la oreja se puede medir en diferentes puntos temporales (por ejemplo, 2 h, 24 h, 48 h y 72 h después del desafío)10,30. La Tabla 1 muestra diferentes modelos experimentales, particularmente las diferencias en la cepa animal, el hapteno y los tiempos de sensibilización/desafío utilizados en diversos estudios 10,21,22,26,31,32,33,34,35,36,37 . El protocolo CHS también podría llevarse a cabo sin un afeitado previo del abdomen de los ratones.

La siguiente diferencia se refiere a la ejecución de la elicitación (desafío) en sí. Como es típico, la sensibilización se realiza pintando la piel del abdomen de los ratones afeitados con el hapteno o vehículo solo. Posteriormente, en ambos grupos, un oído es desafiado con hapteno diluido en cada lado de la oreja. Como control, la oreja opuesta está pintada con una cantidad idéntica de vehículo solo10,31.

Pasos críticos
El momento más crítico es desencadenar CHS, ya que los resultados de la prueba dependen de ello. (1) La solución de hapteno es muy volátil y sensible a la luz, por lo que debe estar bien cerrada y protegida de la luz, y cuando esté en uso, debe aplicarse rápidamente a la piel de los animales para que no se evapore. (2) Después de aplicar el hapteno a la piel del abdomen, debe secarse antes de que el animal regrese a la jaula porque los ratones pueden untarlo contra la ropa de cama o aplicarlo a las orejas con sus patas (entonces la medición del grosor de la aurícula puede ser inadecuada). (3) También se conocen varios métodos de etiquetado de animales, como marcar las colas de ratón con un marcador resistente a los disolventes. Sin embargo, los colorantes presentes en el marcador podrían (no estudiados) convertirse en un hapteno y desencadenar CHS. Por lo tanto, en este estudio, se eligió un método de marcado que no afecta la reacción. (4) Elegir un método de afeitado es muy importante, ya que puede irritar la piel. En este protocolo, se utilizó un jabón gris porque tiene propiedades calmantes; acelera el tratamiento de cortes menores y heridas supurantes, lo que es ayudado por sus efectos antibacterianos. Alivia la hinchazón y la inflamación de la piel.

Se requieren más investigaciones y estandarización de los procedimientos experimentales, incluido el uso de animales (cepa y sexo), para comparar los resultados de diferentes estudios.

Muchos factores ambientales diferentes y nuevas sustancias con funciones biológicas se pueden probar en el modelo CHS. Este modelo puede ser útil si los investigadores quieren mostrar si los factores probados modulan las respuestas inmunes dependientes de las células T.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la subvención SUBZ. A020.22.060 de la Universidad de Medicina de Wroclaw, Polonia, y por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Educación Superior N N401 545940 a MS e IP2012 0443 72 a MMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

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References

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Inmunología e Infección Número 187 Modelo murino dermatitis alérgica de contacto (ACD) hipersensibilidad de contacto (CHS) hinchazón del oído permeabilidad vascular mieloperoxidasa (MPO) citoquinas 2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB) hapteno

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Hipersensibilidad de contacto como modelo murino de dermatitis alérgica de contacto
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Zemelka-Wiacek, M.,… More

Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

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