Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एथेरोस्क्लेरोटिक प्लाक रेशेदार ऊतक के स्थानीय कोलेजन संरचना और यांत्रिक गुणों के बीच सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए एक विधि

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 4, 1,3, 1,2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

Summary

हमने विषम संरचनात्मक और यांत्रिक एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका गुणों का अध्ययन करने के लिए एक मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विकसित की है। यह पाइपलाइन कोलेजन फाइबर अभिविन्यास के स्थानीय प्रमुख कोण और फैलाव, टूटने के व्यवहार और रेशेदार पट्टिका ऊतक के तनाव फिंगरप्रिंट के सहसंबंध को सक्षम करती है।

Abstract

कोरोनरी और कैरोटिड धमनियों में एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े का टूटना घातक कार्डियोवैस्कुलर घटनाओं का प्राथमिक कारण है। हालांकि, विषम, अत्यधिक कोलेजनस पट्टिका ऊतक के टूटना यांत्रिकी, और यह ऊतक की रेशेदार संरचना से कैसे संबंधित है, अभी तक ज्ञात नहीं है। पट्टिका यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए मौजूदा पाइपलाइनें ऊतक की संरचनात्मक समरूपता की धारणा के आधार पर पट्टिका ऊतक की केवल सकल यांत्रिक विशेषताओं को प्राप्त करने तक सीमित हैं। हालांकि, रेशेदार पट्टिका ऊतक संरचनात्मक रूप से विषम है, यकीनन मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर आर्किटेक्चर में स्थानीय भिन्नता के कारण।

यहां वर्णित मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विषम संरचनात्मक और यांत्रिक पट्टिका गुणों का अध्ययन करने के लिए विकसित की गई है। इस पाइपलाइन में, ऊतक के स्थानीय कोलेजन आर्किटेक्चर को दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) के साथ मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी (एमपीएम) का उपयोग करके विशेषता है, और ऊतक की विफलता व्यवहार को डिजिटल छवि सहसंबंध (डीआईसी) विश्लेषण का उपयोग करके एकअक्षीय तन्यता परीक्षण स्थितियों के तहत विशेषता है। यह प्रयोगात्मक पाइपलाइन कोलेजन फाइबर अभिविन्यास के स्थानीय प्रमुख कोण और फैलाव, टूटने के व्यवहार और रेशेदार पट्टिका ऊतक के तनाव फिंगरप्रिंट के सहसंबंध को सक्षम करती है। प्राप्त ज्ञान एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका टूटने की घटनाओं को बेहतर ढंग से समझने, भविष्यवाणी करने और रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।

Introduction

इस्केमिक स्ट्रोक, अक्सर कैरोटिड धमनियों में एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका टूटने से शुरू होता है, दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता के प्रमुख कारणों में से एक है। हालांकि, कैरोटिड एथेरोस्क्लेरोसिस से संबंधित स्ट्रोक को रोकने के लिए वर्तमान सर्जिकल उपचार योजना रणनीतियों में पट्टिका टूटना जोखिम मूल्यांकन2 शामिल नहीं है। यह मुख्य रूप से है क्योंकि पहले सुझाए गए जोखिम बायोमार्कर, जैसे कि प्लेक कैप मोटाई3 और लिपिड कोर आकार4, को भविष्य की नैदानिक घटनाओं 5,6 के लिए उप-पूर्वानुमानित मूल्य दिखाया गया है। पट्टिका टूटना जोखिम मूल्यांकन को अनुकूलित करने और एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े के नए जोखिम मार्करों की पहचान करने के लिए पट्टिका यांत्रिकी और टूटना तंत्र की बेहतर समझ आवश्यक है।

पट्टिका टूटना एक स्थानीय यांत्रिक घटना है जहां अत्यधिक रेशेदार पट्टिका ऊतक रक्तचाप द्वारा उस पर लगाए गए यांत्रिक लोडिंग का सामना करने में विफल रहता है और अपनी संरचनात्मक अखंडता खोदेता है। इसके बावजूद, पट्टिका टूटने की घटना के यांत्रिकी और अंतर्निहित माइक्रोस्ट्रक्चर से इसके लिंक को खराबतरीके से समझा जाता है। पट्टिका ऊतक विफलता की विशेषता वाले कुछ प्रयोगात्मक अध्ययनों में 9,10,11,12,13 सकल यांत्रिक टूटना गुण (यानी, अंतिम तन्यता विफलता तनाव और ताकत) की सूचना दी गई, जो ऊतक की संरचनात्मक एकरूपता की धारणा के साथ प्राप्त हुई। हालांकि, रेशेदार पट्टिका ऊतक संरचनात्मक रूप से विषम है, यकीनन मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर आर्किटेक्चर14 में स्थानीय भिन्नता के कारण। इसके अलावा, पट्टिका ऊतक यांत्रिक विफलता विशेषताओं और कोलेजन वास्तुकला के बीच की कड़ी की जांच केवल जॉनसन एट अल द्वारा हाल के एक अध्ययन में की गई थी। लेखकों ने प्रमुख फाइबर अभिविन्यास में एक अंतर दिखाया और मुख्य रूप से परिधीय फाइबर अभिविन्यास 15 के साथ रेशेदार पट्टिका टोपी नमूनों के लिए उच्च अंतिम तनाव और कम अंतिमउपभेदों की सूचना दी। हालांकि, अध्ययन सकल यांत्रिक और संरचनात्मक गुणों तक भी सीमित था।

स्थानीय कोलेजन वास्तुकला और रेशेदार पट्टिका ऊतक के स्थानीय यांत्रिक गुणों के बारे में आवश्यक जानकारी पर प्रकाश डालने के लिए, वर्तमान अध्ययन में, हमने एक मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विकसित की है। यह पूर्व विवो पाइपलाइन स्थानीय कोलेजन फाइबर दिशा और फैलाव, साथ ही स्थानीय टूटना तनाव की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाती है। पाइपलाइन में पट्टिका ऊतक में कोलेजन फाइबर की छवि बनाने के लिए एसएचजी के साथ एमपीएम इमेजिंग शामिल है, साथ ही ऊतक की टूटने की विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए डीआईसी और एकअक्षीय तन्यता परीक्षण भी शामिल है।

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी-सेकंड-हार्मोनिक पीढ़ी (एमपीएम-एसएचजी) जैविकऊतकों में कोलेजन का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है। अन्य कोलेजन इमेजिंग तकनीकों की तुलना में तकनीक के कई फायदे हैं, जैसे कि हिस्टोलॉजी17, प्रसार टेंसर इमेजिंग (डीटीआई)14, और छोटे कोण प्रकाश प्रकीर्णन (एसएएलएस)15। सबसे पहले, एमपीएम-एसएचजी इमेजिंग गैर-विनाशकारी है, जो यांत्रिक परीक्षण18 के साथ गठबंधन करने के लिए आदर्श बनाता है। दूसरा, एसएचजी सिग्नल कोलेजन के लिए विशिष्ट है, और इसलिए ऊतक का कोई धुंधलापन आवश्यक नहीं है। लंबी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (निकट-अवरक्त) के कारण, प्रवेश गहराई अन्य माइक्रोस्कोपीतकनीकों की तुलना में अधिक है। एसएचजी इमेजिंग के साथ प्राप्त उच्च रिज़ॉल्यूशन (एसएम-स्तर) व्यक्तिगत फाइबर के विज़ुअलाइज़ेशन की भी अनुमति देता है। यह कई संभावनाएं प्रदान करता है, जैसे कोलेजन फाइबर की संख्या का स्थानीय परिमाणीकरण, कोलेजन फाइबर अभिविन्यास और वितरण19।

यांत्रिक परीक्षण के साथ संयुक्त डिजिटल छवि सहसंबंध (डीआईसी) जैविकऊतकों के स्थानीय यांत्रिक गुणों को प्राप्त करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। डीआईसी के साथ, ऊतक की सतह पर लागू झुकाव के विस्थापन को यांत्रिक परीक्षण20 के दौरान प्राप्त उच्च गति वाले कैमरा छवियों की तुलना करके ट्रैक किया जाता है। इस छवि पोस्टप्रोसेसिंग विधि का उपयोग नमूना20 के पूर्ण-क्षेत्र सतह उपभेदों का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है और इसका उपयोग ऊतक21 के टूटने के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

Protocol

इस पेपर में वर्णित सभी तरीकों को रॉटरडैम में इरास्मस मेडिकल सेंटर में एथिकल रिसर्च कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था; पट्टिका नमूना संग्रह से पहले रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चार्ट चित्र 1 में दिया गया है।

1. ऊतक संग्रह, माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (3सीटी) इमेजिंग, और परीक्षण नमूना तैयार करना

  1. ऊतक संग्रह और भंडारण
    1. कैरोटिड एंडोर्टेक्टॉमी सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से ताजा मानव कैरोटिड एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका नमूने एकत्र करें।
      नोट: इस सर्जरी से प्राप्त पट्टिका के नमूनों में कैरोटिड धमनी की रोगग्रस्त इंटिमा परत शामिल है, जिसमें वसा (लिपिड पूल) और कैल्सीफिकेशन22 का संचय शामिल है।
    2. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (1x PBS) का उपयोग करके रक्त अवशेषों को हटा दें और नमूने को धुंध पैड के साथ सुखाएं।
    3. नमूने को चिमटी का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में रखें। ट्यूब को 10 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में रखकर ऊतक को स्नैप-फ्रीज करें।
    4. स्नैप-फ्रीजिंग के बाद, नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 3सीटी इमेजिंग के दिन तक स्टोर करें।
      नोट: स्नैप-फ्रीजिंग क्रिस्टल गठन को कम करता है, जिससे ऊतक में सूक्ष्म-संरचनात्मक क्षति होती है। पोर्सिन महाधमनी ऊतक पर एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि -80 डिग्री सेल्सियस पर स्नैप-फ्रीजिंग और भंडारण का ऊतक केयांत्रिक गुणों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा।
  2. μCT इमेजिंग
    1. 3सीटी इमेजिंग के दिन, पट्टिका नमूना 15 एमएल ट्यूब से बाहर निकालें। यदि ऊतक ट्यूब से चिपक जाता है, तो कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ ट्यूब भरें। ऊतक को पीबीएस में छोड़ दें जब तक कि नमूना ट्यूब से बाहर नहीं निकाला जा सकता है।
    2. प्लाक नमूने को टिशू पेपर से अच्छी तरह से सुखाएं।
    3. हरे बटन को दबाकर 3सीटी सिस्टम चालू करें। स्क्रीन के निचले भाग में सीटी सॉफ्टवेयर में वार्म अप दबाएं और 15 मिनट प्रतीक्षा करें।
    4. मैन्युअल रूप से 3सीटी सिस्टम में क्यू 0.06 मिमी + एएल 0.5 मिमी का एक्स-रे फिल्टर रखें।
    5. उस फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें छवियों को संग्रहीत किया जाना है।
    6. बाएं पैनल में पैरामीटर चुनें। ड्रॉपडाउन सूचियों का उपयोग 4 मिनट के स्कैनिंग समय, 172 μm का रिज़ॉल्यूशन, 90 kV का वोल्टेज, 88 mA का एम्परेज, 86 मिमी का दृश्य क्षेत्र और 360° का घूर्णन चुनने के लिए करें।
    7. डिवाइस का दरवाजा खोलें। प्लेटफ़ॉर्म को मैन्युअल रूप से बाहर खींचें।
    8. प्लेटफ़ॉर्म पर पैराफिल्म रखें और नमूना को प्लेटफ़ॉर्म पर रखें (प्लेटफ़ॉर्म के आगे के चरम की ओर)।
    9. मैन्युअल रूप से प्लेटफ़ॉर्म को डिवाइस में रखें और दरवाजा बंद करें।
    10. लाइव मोड (नेत्र आइकन) को सक्रिय करें। एफओवी में नमूने को केंद्र में रखने के लिए डिवाइस में तीर के साथ मंच को स्थानांतरित करें।
    11. इमेजिंग शुरू करें (नीचे-मध्य में आइकन)। एक बार इमेजिंग समाप्त हो जाने के बाद, नीचे (गर्भपात बटन के तहत) दरवाजा आइकन दबाएं।
    12. 3सीटी स्कैन के बाद, चरण 1.1.3 में वर्णित के रूप में पट्टिका नमूने को फिर से स्नैप-फ्रीज करें। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और मैकेनिकल परीक्षण के दिन तक इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    13. ओपन-सोर्स 3 डी स्लाइसर सॉफ्टवेयर24 में 3सीटी इमेजिंग की अधिग्रहित DICOM फ़ाइलों को खोलें।
    14. सेगमेंट संपादक पर जाएँ. एक नया विभाजन बनाएं | वॉल्यूम को मास्टर वॉल्यूम के रूप में विश्लेषण किया जाना है।
    15. कोई सेगमेंट जोड़ने के लिए जोड़ें पर क्लिक करें. इन मापदंडों को बदलने के लिए इसका नाम और रंग दबाएँ.
    16. सेगमेंट को परिभाषित करने के लिए, विंडो के निचले भाग में प्रभाव | सीमा पर क्लिक करें। कैल्सीफाइड (>450 एचयू) और गैर-कैल्सीफाइड (<450 एचयू) ऊतक क्षेत्रों के बीच अंतर करने के लिए इस थ्रेशोल्ड टूल का उपयोग करें। एक बार दहलीज का चयन हो जाने के बाद, निचले भाग में लागू करें दबाएँ.
    17. 3 डी दृश्य में विभाजन की कल्पना करने के लिए 3 डी दिखाएँ (सिर्फ जोड़ें के दाईं ओर) दबाएँ। यदि विभाजन के ऐसे क्षेत्र हैं जो वांछित नहीं हैं, तो उन्हें कैंची प्रभाव से हटा दें।
    18. वांछित विभाजन के नाम पर क्लिक करके विभाजन मॉड्यूल में खंडों की अस्पष्टता को बदलें।
      नोट: यदि संभव हो, तो μCT इमेजिंग और μCT छवियों की समीक्षा उसी दिन की जा सकती है जिस दिन प्रोटोकॉल के बाकी हिस्सों का प्रदर्शन किया जा सकता है। उस स्थिति में, चरण 1.2.12 को छोड़ दें। हालांकि, ध्यान रखें कि इस प्रोटोकॉल के बाद के चरण भी समय लेने वाले हैं और उसी दिन किए जाने चाहिए। कुछ अभ्यास के बाद, और वर्णित सेटिंग्स और ऊतक के साथ, 3सीटी इमेजिंग को ~ 45 मिनट, 15 मिनट की समीक्षा, एकल परीक्षण नमूना ~ 1 एच, माइक्रोस्कोपी ~ 4 एच, और एकअक्षीय तन्यता परीक्षण ~ 2 घंटे की परीक्षण नमूना तैयारी में ~ 45 मिनट लगना चाहिए।
  3. परीक्षण नमूना तैयारी
    1. कोलेजन इमेजिंग और यांत्रिक परीक्षण के दिन, लगभग 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में जलमग्न करके पट्टिका को पिघलाएं।
    2. 3 डी स्लाइसर सॉफ्टवेयर में चरण 1.2.13-1.2.18 में बनाई गई पट्टिका का 3 डी निर्माण खोलें।
    3. 3 डी पुनर्निर्माण के कौन से हिस्से वास्तविक पट्टिका नमूने के अनुरूप हैं, यह पहचानने के लिए पट्टिका ऊतक के प्राकृतिक स्थलों का उपयोग करें। पहचानें कि 3 डी पुनर्निर्माण के किस क्षेत्र में कैल्सीफिकेशन नहीं है और वास्तविक पट्टिका में इस क्षेत्र की नेत्रहीन पहचान करें।
    4. सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग करके धमनी के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ पट्टिका को खोलें। यदि सर्जरी से पहले से ही एक कट मौजूद है, तो ऊतक के इष्टतम उपयोग के लिए इस कटौती से शुरू करें। यदि नमूने में ट्यूबलर आकार नहीं है और अनुदैर्ध्य दिशा को परिभाषित करना मुश्किल है, तो नमूने को परीक्षण से बाहर रखें।
    5. पट्टिका नमूनों से आयताकार परीक्षण नमूने काट लें। आँसू या कैल्सीफिकेशन वाले ऊतक क्षेत्रों से बचते हुए सुनिश्चित करें कि परीक्षण के नमूने जितना संभव हो उतना बड़े हैं। इस कटाई के दौरान सावधान रहें, क्योंकि परीक्षण नमूने के किनारे पर एक छोटे आंसू या दरार के परिणामस्वरूप तन्यता परीक्षण के दौरान मौजूदा दरार से दरार-प्रसार हो सकता है।
    6. सुनिश्चित करें कि परीक्षण नमूनों में तन्यता परीक्षक में एक बार लगाए जाने के बाद गेज लंबाई में <1 की चौड़ाई-से-लंबाई (डब्ल्यूएल) अनुपात है। यदि नमूने इस आवश्यकता को पूरा करते हैं, तो वे सीमा शर्तों के संदर्भ में उपयुक्त तन्यतापरीक्षणों के लिए उपयुक्त हैं।
      नोट: नमूना आयामों में सीमा बड़ी हो सकती है। लेखकों द्वारा परीक्षण किए गए नमूनों में एक गेज लंबाई थी जो 3.4 और 12.9 मिमी के बीच थी और चौड़ाई 1.6 और 6.4 मिमी के बीच थी।

2. मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

  1. तैयारी
    1. कोलेजन इमेजिंग और यांत्रिक परीक्षण के दिन से पहले, दो 50 एमएल ट्यूबों पर सिलिकॉन इलास्टोमेर बेस के 40 ग्राम को विभाजित करें और पाश्चर पाइप का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब (1: 10 का अनुपात) में 2 ग्राम इलाज एजेंट जोड़ें। पाइप के साथ दो घटकों को मिलाएं।
    2. जितना संभव हो उतने हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 700 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सिलिकॉन की एक पतली परत (लगभग 0.5-1 सेमी) के साथ एक पेट्री डिश (10 सेमी व्यास) भरें और या तो इसे ओवन में 3 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें या इसे 48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
    4. एक पट्टिका परीक्षण नमूना लें और ऊतक में सुइयों को पिन करके सिलिकॉन के लिए इसके दोनों सिरों को ठीक करें (चित्रा 2 ए)। सुनिश्चित करें कि नमूने का ल्यूमिनल पक्ष ऊपर की ओर है। नमूने के क्षेत्र में सुइयों को डालें जो यांत्रिक परीक्षण के दौरान तन्यता परीक्षण उपकरण के क्लैंप में होंगे।
    5. सुरक्षा चश्मा पहनें। सुइयों को छोटा करने के लिए एक साइड कटर का उपयोग करें ताकि वे माइक्रोस्कोप उद्देश्य को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए नमूना सतह से कुछ मिलीमीटर से कम चिपक जाएं। पेट्री डिश को पीबीएस के साथ भरें जब तक कि नमूना जलमग्न न हो जाए।
  2. माइक्रोस्कोपी सेटअप
    1. सुनिश्चित करें कि मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप पर एक उचित उद्देश्य लगाया गया है। 20x के आवर्धन के साथ, अवरक्त प्रकाश संचारित करने के लिए अनुकूलित उद्देश्य का उपयोग करें।
    2. माइक्रोस्कोप प्रणाली शुरू करें। माइक्रोस्कोप के ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
    3. जब इमेजिंग टेबल को शुरू करने के लिए कहा जाता है, तो सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप कंडेनसर आर्म को पीछे धकेल दिया गया है और उद्देश्य सबसे कम स्थिति में है।
    4. मल्टीफोटॉन लेजर को सक्रिय करें।
    5. पेट्री डिश को परीक्षण नमूने के साथ उद्देश्य के नीचे रखें, जैसा कि चित्र 3 में है। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य को अभी तक नमूने के ऊपर न रखें क्योंकि लेजर सेटिंग्स को अभी भी अनुकूलित करने की आवश्यकता है। अन्यथा, लेजर प्रकाश की संभावित उच्च शक्ति ऊतक को नुकसान पहुंचा सकती है।
    6. सुनिश्चित करें कि उद्देश्य पीबीएस में थोड़ा डूबा हुआ है। यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त पीबीएस जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    7. प्रकाश तरंग दैर्ध्य को 880 एनएम पर सेट करें।
      नोट: इस तरंग दैर्ध्य को चुना जाता है क्योंकि उपयोग किए गए दो-फोटॉन सिस्टम में एसएचजी उत्सर्जन फिल्टर में लगभग 440 एनएम का केंद्र तरंग दैर्ध्य होता है। अन्य माइक्रोस्कोप के लिए, एक अलग तरंग दैर्ध्य अधिक लागू हो सकता है।
  3. टाइल स्कैन और इमेजिंग स्थानों का चयन
    1. मल्टीफोटॉन लेजर को बंद करें और माइक्रोस्कोप के ब्राइटफील्ड मोड को सक्रिय करें। फिर, लाइव स्कैन मोड चालू करें।
    2. चरण को इस तरह रखें कि उद्देश्य नमूने के ऊपर स्थित है और नमूना सतह को फोकस में लाएं। लाइव स्कैन मोड बंद करें।
    3. अधिग्रहण टैब के तहत, दूसरे पैनल में, इच्छित पट्टी को स्लाइड करके ज़ूम कारक को 1 में बदलें।
      नोट: यह ज़ूम कारक, उद्देश्य (20x) के आवर्धन कारक के साथ, कैप्चर की गई छवि का आकार निर्धारित करता है (739 μm x 739 μm)।
    4. अधिग्रहण टैब के तहत, दूसरे पैनल में, ड्रॉपडाउन सूचियों का उपयोग करके स्कैन की गति को 400 हर्ट्ज, लाइन औसत को 1, और रिज़ॉल्यूशन को 128 x 128 पिक्सेल प्रति छवि (~ 5.8 μm x 5.8 μm का पिक्सेल आकार) में बदलें।
    5. अधिग्रहण टैब के तहत, पहले पैनल में, रास्टर पैटर्न प्रतीक पर क्लिक करें और टाइल स्कैन पैनल के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें।
    6. लाइव स्कैन मोड चालू करें। स्मार्ट पैनल पर नॉब्स का उपयोग करके उद्देश्य को नमूने के एक कोने में ले जाएं और टाइल स्कैन पैनल में मार्क स्थिति प्रतीक पर क्लिक करें। नमूने के प्रत्येक कोने के लिए इसे दोहराएं। यदि सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो इमेजिंग के लिए सभी चयनित टाइलों के साथ एक ग्रिड नारंगी रंग में दिखाई देगा।
    7. ऑटो-सिलाई फ़ंक्शन को बंद करें।
    8. नमूना ज्यामिति का अवलोकन प्राप्त करने के लिए संपूर्ण नमूना सतह का टाइल स्कैन बनाने के लिए स्क्रीन के निचले-दाएं कोने में प्रारंभ करें।
      नोट: वर्णित सेटिंग्स, ऊतक और माइक्रोस्कोप प्रणाली के आधार पर, पूरे नमूना सतह के टाइल स्कैन प्राप्त करने में ~ 10 मिनट लगते हैं।
    9. टाइल स्कैन के बाद, माइक्रोस्कोपी सिस्टम के सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से दिखाए गए टाइल स्कैन पैनल में प्रत्येक टाइल के ऊपरी बाएं कोने के एक्स- और वाई-निर्देशांक का निरीक्षण करें। स्प्रेडशीट में इन निर्देशांकों को नोट करें।
    10. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में, टाइल स्कैन पैनल में, स्कैनफील्ड नामक बॉक्स में एक्स- और वाई-दिशाओं में टाइलों की संख्या का निरीक्षण करें। स्प्रेडशीट में टाइल स्कैन का आकार नोट करें। टाइल के आकार (739 μm) को जोड़कर/घटाकर अन्य टाइलों के निर्देशांक की गणना करें।
      नोट: एसएचजी इमेजिंग के साथ स्कैन किए जाने वाले टाइलों के सटीक स्थान की पहचान करने के लिए ये निर्देशांक आवश्यक हैं। यदि कुल इमेजिंग समय चिंता का विषय नहीं है, तो सभी टाइलों को किसी भी टाइल को छोड़े बिना चित्रित किया जा सकता है।
    11. टाइल स्कैन से, एसएचजी इमेजिंग के साथ छवि बनाने के लिए टाइल्स का चयन करें। इस चयन के लिए, टाइलों से बचें जो क्लैंप में होंगे और प्रत्येक चयनित टाइल के बीच अनुदैर्ध्य और परिधीय दिशा दोनों में एक टाइल छोड़ दें, जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है।
  4. कोलेजन की कल्पना: एसएचजी इमेजिंग
    1. कमरे में रोशनी बंद करें और माइक्रोस्कोप चरण को ब्लैकआउट कपड़े से कवर करें कि कमरे से कोई प्रकाश डिटेक्टर तक नहीं पहुंचे।
      नोट: डिटेक्टरों तक पहुंचने वाले प्रकाश को कम करने से छवि अधिग्रहण के दौरान शोर कम हो जाएगा।
    2. मल्टीफोटॉन (एमपी) लेजर चालू करें।
    3. गैर-डिसकैंटेड डिटेक्शन (एनडीडी) डिटेक्टर का चयन करें जो 430-450 एनएम बैंडपास फिल्टर से लैस है।
    4. चरण 2.3.10 में प्राप्त जानकारी का उपयोग करके चित्रित की जाने वाली टाइलों के स्थान की पहचान करें। निर्दिष्ट बक्से में निर्देशांक भरें और दर्ज करें पर क्लिक करें, ताकि उद्देश्य दाईं टाइल पर चला जाए। लाइव स्कैन मोड चालू करें।
      नोट: अन्य माइक्रोस्कोप या ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर के नए संस्करणों के साथ, टाइल स्कैन के भीतर स्थानों पर जाना स्वचालित रूप से किया जा सकता है। इस मामले में, प्रत्येक टाइल (चरण 2.3.10) के x- और y- निर्देशांक को नोट करना और ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर (चरण 2.4.4) में निर्देशांक भरना आवश्यक नहीं है।
    5. महत्वपूर्ण विरंजन के बिना उच्चतम संभव लेजर शक्ति प्राप्त करने के लिए बीम पथ सेटिंग्स के तहत ऊपरी पैनल में स्लाइडर का उपयोग करके एमपी लेजर पावर बढ़ाएं। फिर, उज्ज्वल छवियों को प्राप्त करने के लिए डिटेक्टर लाभ को समायोजित करें, लेकिन संतृप्त पिक्सेल के बिना, स्मार्ट पैनल पर नॉब का उपयोग करके या बीम पथ सेटिंग्स के तहत डिटेक्टर के नाम पर क्लिक करके । डिटेक्टर लाभ के लिए विशिष्ट मान 500 और 800 वी के बीच हैं।
    6. फ़ोकस प्लेन को समायोजित करने के लिए स्मार्ट पैनल पर जेड-पोजिशन नॉब का उपयोग करें।
    7. नमूने के शीर्ष पर जाएं और जेड-स्टैक पैनल में एरोहेड पर क्लिक करके जेड-स्टैक के शीर्ष की स्थिति सेट करें ( अधिग्रहण टैब के तहत | 3आरडी पैनल)।
    8. फिर, नमूने पर ध्यान केंद्रित करें जब तक कि एसएचजी सिग्नल का अब पता नहीं लगाया जाता है-यह स्टैक का अंत है। फिर, इस स्थिति को सेट करने के लिए जेड-स्टैक पैनल में तीर पर क्लिक करें। समाप्त होने पर, लाइव स्कैन मोड बंद करें।
      नोट: ऊतक पूरी तरह से सपाट नहीं हो सकता है। इसलिए, ऊतक के भीतर विभिन्न क्षेत्रों की नमूना सतह में जेड-दिशा में थोड़ी अलग स्थिति हो सकती है।
    9. अधिग्रहण टैब के तहत, दूसरे पैनल में, ड्रॉपडाउन सूचियों का उपयोग करके स्कैन की गति 400 हर्ट्ज पर रखें, लाइन औसत को 2 पर सेट करें, और रिज़ॉल्यूशन को 512 x 512 पिक्सेल प्रति छवि (~ 1.4 μm x 1.4 μm का पिक्सेल आकार) पर सेट करें। द्विदिश एक्स स्कैनिंग बटन पर टॉगल करें।
    10. z-स्टैक पैनल में z-step आकार पर क्लिक करें और बॉक्स में 3 μm का z-step आकार भरें। z-stack बनाने के लिए स्क्रीन के निचले-दाएँ कोने में प्रारंभ क्लिक करें. समाप्त होने पर, फ़ाइल नाम में टाइल के निर्देशांक को सहेजना सुनिश्चित करें या प्रत्येक टाइल को अपनी संख्या दें (जैसा कि चित्रा 2 बी में है)।
      नोट: वर्णित सेटिंग्स, ऊतक और माइक्रोस्कोप प्रणाली के आधार पर, एक टाइल के जेड-स्टैक के अधिग्रहण में ~ 10-15 मिनट लगते हैं। तैयारी के चरण (चरण 2.4.4-2.4.10) इस समय अनुमान के भीतर शामिल हैं।

3. मैकेनिकल परीक्षण

  1. एकअक्षीय तन्यता परीक्षण सेटअप की तैयारी
    1. तन्यता परीक्षक के निर्देशों का पालन करते हुए क्षैतिज तन्यता परीक्षण सेटअप (चित्रा 4) को उपयोग के लिए तैयार करें (उदाहरण के लिए, सॉफ्टवेयर चालू करें, क्लैंप संलग्न करें, लोड सेल संलग्न करें)।
    2. परीक्षण नमूने के फिसलन को कम करने के लिए, तन्यता परीक्षक के क्लैंप के आंतरिक चेहरों पर दो तरफा फोम टेप (चित्रा 4 ए, बी -2) संलग्न करें और फोम टेप के आंतरिक पक्ष में सैंडपेपर जोड़ें। आखिरकार, सैंडपेपर परीक्षण नमूने के संपर्क में होगा।
    3. हीटिंग स्नान (चित्रा 4 ए, बी -3) को स्थिति में रखें। क्लैंप के निचले चेहरे के स्तर तक पीबीएस के साथ हीटिंग स्नान भरें, ताकि यह अभी तक सैंडपेपर तक न पहुंचे।
    4. हीटिंग स्नान के शक्ति स्रोत को चालू करें और तापमान को लगभग 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    5. उदाहरण के लिए, प्रयोगशाला स्टैंड का उपयोग करके तन्यता परीक्षण प्रणाली (चित्रा 4 ए -4) के ऊपर उच्च गति वाले कैमरे को माउंट करें, और एक विस्तार रिंग के माध्यम से कैमरे पर 50 मिमी की फोकल लंबाई के साथ एक लेंस माउंट करें।
    6. सुनिश्चित करें कि क्लैंप फोकस में हैं और यह कि दृश्य का क्षेत्र संपूर्ण स्ट्रेचिंग प्रक्रिया (एफओवी चौड़ाई: नमूना चौड़ाई ± के दौरान नमूना रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त बड़ा है; एफओवी लंबाई: ± 2 x नमूना लंबाई)।
    7. उदाहरण के लिए, प्रयोगशाला स्टैंड का उपयोग करके, तन्यता परीक्षण प्रणाली के ऊपर प्रकाश प्रणाली (चित्रा 4 ए -5) माउंट करें। प्रकाश प्रणाली को चालू करें और प्रकाश की तीव्रता और स्थान को समायोजित करें ताकि कैमरा छवि पर देखे जाने वाले पीबीएस सतह पर कोई प्रतिबिंब न हो।
    8. स्पष्ट छवियां प्राप्त करने के लिए कैमरे के एक्सपोज़र समय और लाभ को समायोजित करें।
    9. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर को 5.2 एमपी के रिज़ॉल्यूशन पर 30 फ्रेम / सेकंड पर कैप्चर करने के लिए सेट करें।
      नोट: बाद के डीआईसी विश्लेषण करने और टूटने के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस उच्च फ्रेम दर की आवश्यकता होती है।
    10. क्लैंप में से एक की विस्थापन गति को इस तरह सेट करें कि यांत्रिक परीक्षण के दौरान वैश्विक इंजीनियरिंग तनाव दर ऊतक की विवो शारीरिक तनाव दर के समान है
      (पट्टिका ऊतक26 के लिए 5%/
  2. झुकाव पैटर्न का उत्पादन
    नोट: यह झुकाव पैटर्न प्रोटोकॉल वाल्श एट अल.27 द्वारा पिछले काम पर आधारित है।
    1. नमूने को हल्के से टिशू पेपर से दबाकर सुखाएं।
    2. एयरब्रश की इच्छित बाल्टी में काले ऊतक डाई डालें।
    3. एयरब्रश को कंप्रेसर से कनेक्ट करें। एयरब्रश कंप्रेसर को चालू करें और दबाव को 25 पीएसआई पर सेट करें।
    4. ऊतक पर छिड़काव करने से पहले कागज पर एक इष्टतम झुकाव पैटर्न बनाने का प्रयास करें। 50:5028 का काला/सफेद अनुपात पूरा होने तक कुछ बार स्प्रे करें। बिंदु पैटर्न के खुरदरापन को समायोजित करने के लिए एयरब्रश की सुई को आगे और पीछे ले जाएं जब तक कि एक झुकाव का आकार हाई-स्पीड कैमरा29 के 3-5 पिक्सेल के आकार के समान न हो।
      नोट: बिंदु पैटर्न का उपयोग दो अलग-अलग उद्देश्यों के लिए किया जाएगा। सबसे पहले, इन झुकावों के विस्थापन को यांत्रिक परीक्षण (डीआईसी, चरण 4.2) के दौरान प्राप्त उच्च गति वाले कैमरा छवियों की तुलना करके मापा जाता है। दूसरा, इस झुकाव पैटर्न का उपयोग नमूने की अविकृत स्थिति (चरण 4.3.1) की छवि पर टूटने के स्थान की पहचान करने के लिए किया जाता है।
    5. परीक्षण नमूने से लगभग 30 सेमी दूर एयरब्रश रखें और ल्यूमिनल सतह पर स्प्रे करें।
    6. पीबीएस में नमूने को डुबोने से पहले कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए डाई बॉन्ड को नमूने में रहने दें।
  3. एकअक्षीय तन्यता परीक्षण
    1. नमूने को तन्यता परीक्षक के क्लैंप में रखें, जिसमें नमूने की परिधीय दिशा तन्यता खिंचाव दिशा और नमूने के ल्यूमिनल पक्ष के साथ संरेखित होती है। सुनिश्चित करें कि प्रारंभिक गेज लंबाई इस तरह से सेट की गई है कि स्ट्रिप्स का डब्ल्यूएल अनुपात <1 है।
    2. टॉर्क स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके 20 cNm का टॉर्क लगाकर ग्रिप्स के शिकंजे को कसें। अंतिम टोक़ लगाने से पहले प्रत्येक पेंच पर एक छोटा टोक़ लगाकर धीरे-धीरे ऐसा करें।
    3. नेत्रहीन निरीक्षण करें कि क्या नमूने में कोई आँसू है जो परीक्षणों को प्रभावित कर सकता है।
    4. हीटिंग स्नान में अधिक पीबीएस पेश करें जब तक कि नमूना जलमग्न न हो जाए और पीबीएस का तापमान फिर से 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें।
    5. उच्च गति वाले कैमरे के साथ एक अंशांकन छवि प्राप्त करें, जिसमें परीक्षण नमूना और एक शासक को संदर्भ के रूप में शामिल किया जाता है। सुनिश्चित करें कि शासक नमूने की ल्यूमिनल सतह के रूप में कैमरा उद्देश्य से समान दूरी पर है।
    6. लोड सेल को टार करें और लोड सेल और तन्यता परीक्षक के एक्ट्यूएटर से वैश्विक बल और विस्थापन माप को रिकॉर्ड करना शुरू करें।
    7. नमूने में शिथिलता से छुटकारा पाने के लिए 0.05 एन की प्रीस्ट्रेच लागू करके नमूने को सीधा करें। प्रीस्ट्रेच के आवेदन के बाद एक्ट्यूएटर द्वारा गेज लंबाई माप के आधार पर 10% तनाव तक पूर्व शर्त के 10 चक्र करें।
    8. उच्च गति कैमरे के साथ नमूना विरूपण का वीडियो रिकॉर्ड करते समय, नमूने की पूर्ण विफलता तक एकअक्षीय तन्यता परीक्षण शुरू करें। ऊतक विफलता के बाद, वैश्विक बल और विस्थापन माप को रिकॉर्ड करना बंद कर दें।
      नोट: कुछ वाणिज्यिक तन्यता परीक्षक चरण 3.3.6-3.3.9 स्वचालित रूप से कर सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल मैन्युअल चरणों का वर्णन करता है यदि यह स्वचालित विकल्प उपयोग किए जा रहे तन्यता परीक्षक में शामिल नहीं है।
    9. तन्यता परीक्षण डिवाइस से परीक्षण नमूना निकालें और इसे उचित रूप से छोड़ दें।
    10. अगले नमूने का परीक्षण करते समय, क्लैंप पर सैंडपेपर और फोम टेप को बदलें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. कोलेजन संगठन विश्लेषण
    1. इमेजजे में एसएचजी के साथ एमपीएम के दौरान प्राप्त जेड-स्टैक्स खोलें और प्रत्येक जेड-स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमान (एमआईपी) बनाएं।
    2. टाइल्स में मौजूद व्यक्तिगत कोलेजन फाइबर के अभिविन्यास कोण को मापने के लिए ओपन-सोर्स मैटलैब-आधारित एफओए (फाइबर ओरिएंटेशन एनालिसिस) टूल30 के साथ प्रत्येक एमआईपी का विश्लेषण करें। निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें : स्केल: [3 4 5] या [2 4 6], पोत व्यास के आधार पर, और वेसलनेस सीमा: 0.999, 0.9995, या 0.9999, एसएचजी सिग्नल की तीव्रता के आधार पर।
      नोट: इस उपकरण का उपयोग करने के तरीके के बारे में अधिक जानकारी सॉफ़्टवेयर के मैनुअल31 में पाई जा सकती है।
    3. गॉसियन वितरण को कोण वितरण हिस्टोग्राम में फिट करने के लिए एक और ओपन-सोर्स MATLAB-आधारित टूल, FibLab32 का उपयोग करें।
      नोट: इस उपकरण का उपयोग करने के तरीके के बारे में अधिक जानकारी सॉफ़्टवेयर के मैनुअल32 में पाई जा सकती है।
    4. फाइबलैब का उपयोग करके प्राप्त गॉसियन वितरण प्लॉट से, MATLAB के कार्यक्षेत्र से निम्नलिखित संरचनात्मक पैरामीटर निकालें: प्रमुख फाइबर कोण (μp), जो वितरण का तरीका है, फाइबर कोण वितरण का मानक विचलन (σp) और अनिसोट्रोपिक अंश (Pani = 1 − Piso)।
      नोट: आइसोट्रोपिक अंश गॉसियन वितरण में बेसलाइन के तहत क्षेत्र है, जबकि अनिसोट्रोपिक अंश में उस बेसलाइन33 के शीर्ष पर चोटी का क्षेत्र होता है। σपी और पी एनी दोनों टाइल क्षेत्र में तंतुओं के अभिविन्यास के फैलाव के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं।
    5. दृश्य निरीक्षण के लिए, उन्मुख लाइनों का उपयोग करके पीμप्लॉट करें और रंग मानचित्रों का उपयोग करके पी और पीएनीσ करें।
  2. डिजिटल छवि विश्लेषण और टूटना विश्लेषण
    1. उस फ्रेम की पहचान करने के लिए कैमरा छवियों पर दृश्य निरीक्षण करें जिसमें टूटना दीक्षा होती है। इस फ्रेम पर, नेत्रहीन रूप से टूटने के स्थान की पहचान करें।
    2. यांत्रिक परीक्षण की शुरुआत में टूटने के स्थान पर किसी भी अंतिम दरार या आंसू की पहचान करने के लिए कैमरे की छवियों पर दृश्य निरीक्षण करें। यदि ऐसा आंसू मौजूद है, तो विश्लेषण से नमूने को बाहर रखें।
    3. ओपन-सोर्स, MATLAB-आधारित सॉफ़्टवेयर Ncor (v1.2)34 के साथ DIC विश्लेषण निष्पादित करें। Ncorr मैनुअल35 में दिए चरणों का पालन करें।
      1. डीआईसी के लिए उच्च गति वाले कैमरे के साथ तन्यता परीक्षण के दौरान रिकॉर्ड की गई कैमरा छवियों का उपयोग करें। संदर्भ छवि के रूप में विफलता (पूर्व शर्त के बाद) तक अंतिम स्ट्रेचिंग से पहले अंतिम फ्रेम का चयन करें। वर्तमान छवियों के लिए, अंतिम स्ट्रेचिंग की शुरुआत से लेकर फ्रेम से पहले अंतिम फ्रेम तक सभी छवियों का चयन करें जिसमें टूटना दीक्षा हुई थी।
      2. रुचि के क्षेत्र (ROI) के रूप में नमूना सतह का चयन करें। उन क्षेत्रों को बाहर रखें जो क्लैंप के पास (लगभग 1 मिमी) हैं, क्योंकि इन क्षेत्रों में उपभेद ग्रिप्स से अत्यधिक प्रभावित होंगे।
      3. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके डीआईसी विश्लेषण करें: उप-समूह त्रिज्या: 30 पिक्सेल; उपसमुच्चय रिक्ति: तीन पिक्सेल; पुनरावृत्ति कटऑफ: 50; अंतर वेक्टर कटऑफ का मानदंड: 10-5; तनाव त्रिज्या: 5; ऑटो प्रचार, चरण #: 5.
      4. एनकोर्न के साथ डीआईसी विश्लेषण से, आरओआई के ग्रीन-लैग्रेंज (या यूलेरियन स्ट्रेन) वितरण प्राप्त करें। टूटने से पहले अंतिम फ्रेम पर पूरे पट्टिका नमूना सतह के औसत ग्रीन-लैग्रेंज तनाव की गणना करने के लिए इन तनाव वितरणों का उपयोग करें। टूटने वाले स्थान पर ग्रीन-लैग्रेंज तनाव की गणना करें।
  3. टूटने के स्थान पर संरचनात्मक और यांत्रिक डेटा को सहसंबंधित करना
    1. परीक्षण नमूने में प्राकृतिक स्थलों और परीक्षण नमूने पर लागू धब्बे का उपयोग करके, संदर्भ छवि (चरण 4.2.3.1) पर टूटना स्थान (चरण 4.2.1 में पहचाना गया) की पहचान करें।
    2. परीक्षण नमूने में प्राकृतिक स्थलों का उपयोग करके, टाइल स्कैन पर टूटने के स्थान की पहचान करने के लिए संदर्भ छवि और टाइल स्कैन (चरण 2.3) का एक ओवरले बनाएं। एमपीएम-एसएचजी टाइल की पहचान करें जहां टूटना हुआ था। यदि टूटना एमपीएम-एसएचजी के साथ स्कैन की गई टाइल में नहीं है, तो टूटने वाले स्थान के निकटतम टाइल की पहचान करें। टाइल पर पाए गए संरचनात्मक मापदंडों को प्राप्त करें जहां टूटना हुआ था।

Representative Results

ऊतक संग्रह और परीक्षण नमूना तैयार करना
ऊतक संग्रह से पट्टिका रेशेदार ऊतक नमूने उत्पन्न होते हैं जिन्हें संरचनात्मक इमेजिंग और एकअक्षीय तन्यता परीक्षण के लिए व्यक्तिगत परीक्षण नमूनों में विच्छेदित किया जा सकता है। आदर्श रूप से, एक एकत्रित रेशेदार ऊतक के नमूने में ऐसे क्षेत्र होते हैं जिनमें बहुत कम आँसू होते हैं (चित्रा 5 ए) और मैक्रोकैल्सीफिकेशन (चित्रा 5 बी)। इन आंसुओं और कैल्सीफिकेशन (चित्रा 5 सी) की अधिकता से पट्टिका के नमूने हो सकते हैं जो डब्ल्यूएल 1 की पहले उल्लिखित नमूना आयाम आवश्यकता को पूरा नहीं करते हैं।

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
एसएचजी इमेजिंग और इमेज पोस्टप्रोसेसिंग प्रत्येक छवि टाइल (चित्रा 6 ए, बी) से एमआईपी प्रदान करता है। फाइबर डिटेक्शन (चित्रा 6 सी) द्वारा आगे पोस्ट-प्रोसेसिंग फाइबर ओरिएंटेशन हिस्टोग्राम (चित्रा 6 डी) उत्पन्न करता है जिसमें से कोलेजन संरचनात्मक मापदंडों को निकाला जा सकता है (चित्रा 6 ई)। इसके अलावा, पूरे पट्टिका नमूने में स्थानीय संरचनात्मक कोलेजन मापदंडों को दिखाने वाले रंग मानचित्र दृश्य विश्लेषण के लिए प्राप्त किए जा सकते हैं (चित्रा 6 एफ, जी)। चित्रा 6 में प्रतिनिधि परीक्षण नमूने के लिए, संरचनात्मक कोलेजन मापदंडों में एक बड़ा इंट्रासैंपल भिन्नता पाई जाती है (μपी का औसत ± एसडी = -34 ° ± 32 ° ; σपी = 21 ° ± 4 ° ; पीएनी = 0.49 ± 0.14, यदि परिधीय दिशा को 0 ° के रूप में परिभाषित किया गया है)। यह इंट्रासैंपल भिन्नता समरूपता मानने के बजाय स्थानीय संरचनात्मक मापदंडों को प्राप्त करने के महत्व पर जोर देती है।

यांत्रिक परीक्षण
टूटना व्यवहार
उच्च गति कैमरा यांत्रिक परीक्षण के दौरान पट्टिका के नमूनों के विरूपण और टूटने के व्यवहार की छवियां प्रदान करता है (चित्रा 7)। इन छवियों से, टूटना दीक्षा और टूटना प्रसार पथ के स्थान की पहचान की जा सकती है। टूटना पहचान परिणाम उप-मानक हैं यदि कैमरे की छवियों में बुलबुले या प्रतिबिंब मौजूद हैं, या यदि टूटना चुने हुए फ्रेम दर द्वारा कैप्चर किए जाने के लिए बहुत तेजी से फैलता है।

स्थानीय तनाव पैटर्न
एकअक्षीय तन्यता परीक्षण के दौरान प्राप्त कैमरा रिकॉर्डिंग पर डिजिटल छवि सहसंबंध विश्लेषण स्थानीय ऊतक विरूपण मानचित्र प्रदान करता है, जैसे कि चित्रा 8 में दिखाए गए ग्रीन-लैग्रेंज स्ट्रेन मानचित्र। ये मानचित्र टूटने की शुरुआत से पहले फ्रेम पर तीन तनाव घटकों (εxx, εxy, और εyy) को प्रदर्शित करते हैं। इन तनाव मानचित्रों से, रुचि के क्षेत्र में औसत उपभेदों और एक स्थान पर स्थानीय तनाव, जैसे टूटना स्थान, निकाला जा सकता है।

चित्रा 8 में प्रतिनिधि नमूने के लिए, स्थानीय तनाव डेटा एक बड़ा इंट्रासैंपल भिन्नता दिखाता है। चित्रा 8 में प्रतिनिधि परीक्षण नमूने के लिए, स्थानीय उपभेदों में एक बड़ी इंट्रासैंपल भिन्नता पाई जाती है (देखे गए उपभेदों की श्रेणियां निम्नानुसार हैं: εxx = -0.30-0.17; εxy = -0.13-0,20; εyy = 0-0.40)। यह ऊतक समरूपता की धारणा के साथ प्राप्त सकल, औसत मूल्यों के बजाय स्थानीय डेटा प्राप्त करने के महत्व पर जोर देता है।

यांत्रिक और संरचनात्मक ऊतक जानकारी को सहसंबंधित करना
उपर्युक्त परिणाम कोलेजन वास्तुकला के लिए ऊतक के स्थानीय विरूपण और टूटने के व्यवहार के जुड़ाव की अनुमति देते हैं। एक बार कैमरा रिकॉर्डिंग (चित्रा 9 ए) पर टूटने के स्थान की पहचान हो जाने के बाद, इसे संदर्भ कैमरा छवि (चित्रा 9 बी) और माइक्रोस्कोपी टाइल स्कैन (चित्रा 9 सी) में वापस मैप किया जा सकता है। यह एमपीएम-एसएचजी टाइल प्रदान करता है जहां टूटना हुआ और इस टाइल पर पाए गए संरचनात्मक पैरामीटर (चित्रा 9 डी)। टाइल में पाए जाने वाले संरचनात्मक पैरामीटर जहां एक प्रतिनिधि नमूने में टूटना हुआ था, चित्र 9 में दिखाया गया है, μपी = 28 °, σपी = 19 ° और पीएनी = 0.6 हैं। एक ही प्रक्रिया को गैर-टूटे हुए ऊतक स्थानों पर भी लागू किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टूटना फ्रेम से संदर्भ छवि पर टूटना स्थान का मानचित्रण एक खराब झुकाव पैटर्न और अस्पष्ट प्राकृतिक स्थलों के मामले में चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, यदि ऊतक के प्राकृतिक स्थल पर्याप्त स्पष्ट नहीं हैं, तो टाइल स्कैन ओवरले और हाई-स्पीड कैमरा छवियों का सह-पंजीकरण मुश्किल हो सकता है।

Figure 1
चित्र 1: प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चार्ट. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: टाइल स्कैन से एसएचजी इमेजिंग के लिए टाइलों का चयन। (बी) ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त परीक्षण नमूने का टाइल स्कैन। एसएचजी इमेजिंग के लिए चुनी गई टाइल्स को नीले वर्गों द्वारा चिह्नित किया जाता है। (ग) स्वयं सहायता समूह के साथ एमपीएम का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। स्केल बार = 140 μm (C) संक्षेप: एसएचजी = दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी; एमपीएम = मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप के उद्देश्य के तहत रखा गया पट्टिका का नमूना। पट्टिका के नमूने का स्थान फॉस्फेट-बफर ्ड खारा-भरा पेट्री डिश द्वारा सुरक्षित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कस्टम-डिज़ाइन किए गए एकअक्षीय तन्यता परीक्षक अपने विभिन्न घटकों के साथ इंगित किया गया है। (A) सिस्टम का कुल अवलोकन। ध्यान दें कि क्लैंप में सैंडपेपर डालने वाले दिखाई देते हैं क्योंकि केवल नीचे के क्लैंप संलग्न होते हैं। (बी) परीक्षण के लिए तैयार परीक्षण नमूने के साथ तन्यता परीक्षक के क्लैंप की ज़ूम-इन छवि। संक्षिप्तीकरण: पीवीसी = पॉलीविनाइल क्लोराइड; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि नमूनों से ऊतक संग्रह और नमूना तैयार करने के परिणाम। (ए) ताजा और बरकरार पट्टिका नमूना, कैरोटिड एंडोर्टेक्टॉमी सर्जरी से गुजरने वाले सहमति वाले रोगियों से पुनर्प्राप्त किया गया। (बी) एक 3 डी स्कैन से 3 डी पुनर्निर्माण। कैल्सीफाइड ऊतक को हल्के नीले रंग में और गैर-कैल्सीफाइड को लाल रंग में दिखाया जाता है। कैल्सीफाइड ऊतक के बिना एक इष्टतम नमूना नीली रेखाओं के बीच के क्षेत्र से प्राप्त किया जा सकता है। (सी) 3 डी पुनर्निर्माण से 3 डी पुनर्निर्माण में कैल्सीफाइड ऊतक की अधिकता के साथ एक उप-मानक पट्टिका दिखाई देती है। स्केल बार = 3 मिमी। संक्षिप्त नाम: μCT = माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एमपीएम-एसएचजी एक प्रतिनिधि नमूने से परिणाम। इमेजिंग के लिए चयनित टाइलों को नीले रंग में दिखाया गया है। (बी) विभिन्न टाइलों से एमआईपी। (सी) चयनित टाइल (# 1) से एफओए उपकरण द्वारा फाइबर का पता लगाना। (डी) चयनित टाइल से फाइबर ओरिएंटेशन हिस्टोग्राम। (ई) फाइबर ओरिएंटेशन हिस्टोग्राम + गॉसियन फिट, जिसमें से कोलेजन संरचनात्मक मापदंडों को एक चयनित टाइल से निकाला जा सकता है। (एफ) पूरे पट्टिका नमूने में μपी (अभिविन्यास काली रेखा) और σपी (पृष्ठभूमि रंग) का प्रतिनिधित्व। (जी) पूरे पट्टिका नमूने मेंμ पी (अभिविन्यास काली रेखा) और पीएनी (पृष्ठभूमि रंग) का प्रतिनिधित्व। स्केल सलाखों = 140 μm (B, C)। संक्षेप: एमपीएम-एसएचजी = मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी-दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी; एमआईपी = अधिकतम तीव्रता अनुमान; एफओए = फाइबर अभिविन्यास विश्लेषण; μपी = प्रमुख फाइबर कोण; पीएनी = अनिसोट्रोपिक अंश; σपी = फाइबर कोण वितरण का मानक विचलन; पीआइसो = आइसोट्रोपिक अंश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: तन्यता परीक्षण प्रक्रिया के दौरान एक पट्टिका ऊतक के नमूने में टूटना दीक्षा और प्रसार । 2) टूटना दीक्षा-पहला फ्रेम जिसमें टूटना देखा जाता है। टूटना दीक्षा स्थान एक लाल वर्ग के साथ चिह्नित है। 3) और 4) टूटना प्रसार। 5) पट्टिका के नमूने का पूर्ण टूटना। स्केल पट्टियाँ = 1 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: टूटने से पहले फ्रेम पर एक प्रतिनिधि नमूने (εxx, εxy, और εyy) के ग्रीन-लैग्रेंज तनाव पैटर्न, डीआईसी विश्लेषण के साथ प्राप्त किए गए। टूटने वाले स्थान पर तनाव के साथ- साथ पूरे पट्टिका पर औसत और मानक विचलन दिया जाता है। संक्षेप: डीआईसी = डिजिटल छवि सहसंबंध; εxx = अनुदैर्ध्य तनाव; εxy = कतरनी; εyy = तन्यता तनाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र 9: छवियों पर टूटने के स्थान (लाल वर्ग) की ओवरले छवि। (ए) उच्च गति कैमरा छवि, जहां टूटना पहचाना जाता है (टूटना फ्रेम)। (बी) हाई-स्पीड कैमरा छवि, जहां केवल प्रीस्ट्रैच लागू किया जाता है (संदर्भ फ्रेम)। (सी) माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त टाइल स्कैन छवि। (डी) विभिन्न टाइलों पर स्थानीय कोलेजन संरचनात्मक मापदंडों को दिखाने वाला एक रंग-कोडित नक्शा। पूरे पट्टिकानमूने में μ पी (ओरिएंटेशन ब्लैक लाइन) और पीएनी (पृष्ठभूमि रंग) प्रस्तुत किए गए हैं। संक्षिप्तरूप: μपी = प्रमुख फाइबर कोण; पीएनी = अनिसोट्रोपिक अंश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान अध्ययन ने स्थानीय कोलेजन अभिविन्यास और फैलाव, स्थानीय यांत्रिक गुणों और रेशेदार एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका ऊतक के टूटने के व्यवहार के बीच सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए एक मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल कई कारणों से अभिनव है। सबसे पहले, यह पहली बार है कि यांत्रिक लोडिंग के तहत रेशेदार पट्टिका ऊतक के स्थानीय विरूपण को मापने के लिए डिजिटल छवि सहसंबंध लागू किया गया है। दूसरा, यह प्रोटोकॉल स्थानीय विरूपण पैटर्न और रेशेदार पट्टिका ऊतक के स्थानीय कोलेजन वास्तुकला के बीच संबंध का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है। परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत तनाव डेटा और कोलेजन डेटा दोनों द्वारा स्थानीय मूल्यांकन के महत्व पर जोर दिया जाता है, जो ऊतक की विषम प्रकृति को दर्शाता है। इसलिए, स्थानीय मूल्यांकन को सक्षम करने वाली तकनीकों का उपयोग, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले, रेशेदार पट्टिका गुणों के भविष्य के अध्ययन के लिए अनुशंसित हैं।

परीक्षण नमूना तैयारी इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। कैरोटिड सजीले टुकड़े मुख्य रूप से कोलेजनस ऊतक हैं; हालांकि, उनमें कैल्सीफिकेशन हो सकते हैं जिन्हें समग्र पट्टिका यांत्रिक व्यवहार36,37 को प्रभावित करने के लिए माना जाता है। जैसा कि अध्ययन पट्टिका के रेशेदार ऊतक घटक पर केंद्रित है,38 का उपयोग करके परीक्षण नमूनों में कैल्सीफिकेशन से बचा जाता है। यदि μCT उपलब्ध नहीं है, तो पट्टिका में कैल्सीफाइड क्षेत्रों का पता लगाने के लिए एमआरआई या OCT39 जैसी अन्य इमेजिंग तकनीकों पर विचार किया जा सकता है। रेशेदार ऊतक परीक्षण नमूने प्राप्त करना जो कैल्सीफिकेशन से मुक्त हैं और एक बड़े आकार के हैं जो यांत्रिक परीक्षण के लिए काम करने योग्य हैं, सजीले टुकड़े के लिए एक चुनौतीपूर्ण कार्य हो सकता है जो भारी कैल्सीफाइड होते हैं या छितरी हुई कैल्सीफिकेशन होते हैं। प्रोटोकॉल में एक और चुनौतीपूर्ण कार्य डिजिटल छवि सहसंबंध के लिए एक इष्टतम झुकाव पैटर्न उत्पन्न कर रहा है। इष्टतम डीआईसी को 50: 5028 के काले / सफेद अनुपात की आवश्यकता होती है और उचित गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए तीन से पांच पिक्सेल29 के आकार को दर्शाता है। इन आवश्यकताओं को पूरा करने में विफलता के परिणामस्वरूप गलत स्थानीय तनाव माप हो सकते हैं। अंत में, एसएचजी छवियों के टूटने के स्थान का मानचित्रण चुनौतीपूर्ण हो सकता है यदि ऊतक के प्राकृतिक स्थल स्पष्ट नहीं हैं। ऐसे नमूनों के लिए, इमेजिंग से पहले ऊतक के लिए कई फिड्यूशियल मार्करों का अनुप्रयोग सहायक होगा।

वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली एमपीएम-एसएचजी तकनीक कई अन्य कोलेजन इमेजिंग तकनीकों से बेहतर है, क्योंकि यह अपेक्षाकृत बड़ी प्रवेश गहराई के साथ एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन और गैर-विनाशकारी तकनीक है। फिर भी, एमपीएम-एसएचजी की प्रवेश गहराई (<400 μm) एक सीमा बनाती है, क्योंकि यह परीक्षण नमूनों की पूरी मोटाई की इमेजिंग की अनुमति नहीं देती है, जो 0.5 और 2 मिमी के बीच थी। प्रसार टेन्सर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (डीटी-एमआरआई) के साथ एक हालिया अध्ययन में, हमने दिखाया है कि पट्टिका ऊतक के गहरे हिस्सों में प्रमुख फाइबर अभिविन्यास ऊतक14 के अधिक सतही, ल्यूमिनल भागों में से एक से अलग हो सकता है। इसलिए, मोटी रेशेदार पट्टिका ऊतक नमूनों के गहरे हिस्सों में स्थानीय कोलेजन वास्तुकला और स्थानीय ऊतक यांत्रिकी के साथ इसके संबंध की जांच करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इस उद्देश्य के लिए, ध्रुवीकृत स्थानिक आवृत्ति डोमेन इमेजिंग (पीएसएफडीआई) का उपयोग किया जा सकता है। इस हाल ही में विकसित ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक में माइट्रल वाल्व पत्रक12 में 0.8 मिमी तक फाइबर अभिविन्यास को मापने की क्षमता बताई गई थी। पीएसएफडीआई एक तेजी से अधिग्रहण भी प्रदान करता है, जो केवल टाइलों के चयन के बजाय पूरे नमूना क्षेत्र के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा भी प्रदान कर सकता है, जैसा कि वर्तमान प्रोटोकॉल में होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि केवल सतह विरूपण की पहचान की जा सकती है। भविष्य के अध्ययनों में, मिरर-असिस्टेड मल्टी-व्यू डीआईसी40 या डिजिटल वॉल्यूम सहसंबंध (डीवीसी) 41 को वॉल्यूमेट्रिक, उपसतह उपभेदों पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है।

वर्तमान प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को पट्टिका टूटना यांत्रिकी और अंतर्निहित माइक्रोस्ट्रक्चर के संबंध के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए कई तरीकों से आगे बढ़ाया या संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, वर्तमान प्रोटोकॉल में परिधीय दिशा में एकअक्षीय तन्यता परीक्षण शामिल है। इस प्रकार के यांत्रिक परीक्षण को चुना गया था क्योंकि पट्टिका मुख्य रूप से विवो में परिधीय दिशा में तन्यता खिंचाव का अनुभव करती है। अधिक व्यापक यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए, इस प्रोटोकॉल को अनुदैर्ध्य दिशा में मुद्रास्फीति परीक्षण, द्विअक्षीय परीक्षण, या एकअक्षीय तन्यता परीक्षण को शामिल करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है। दूसरा, वर्तमान प्रोटोकॉल केवल डीआईसी के माध्यम से स्थानीय उपभेदों को प्राप्त करने पर केंद्रित है। हालांकि, प्रोटोकॉल में स्थानीय तनाव विश्लेषण को शामिल करके पट्टिका यांत्रिक व्यवहार का अधिक पूर्ण दृश्य प्राप्त किया जा सकता है, फिर भी इसके लिए स्थानीय कठोरता के लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है। हालांकि वर्तमान में चुनौतीपूर्ण है, यह कम्प्यूटेशनल तकनीकों जैसे व्युत्क्रम परिमित तत्व विधि42,43 और आभासी फ़ील्ड विधि 44 द्वारा प्राप्त किया जा सकताहै। प्रयोगात्मक अनुकूलन के अलावा, कुछ अतिरिक्त पोस्टप्रोसेसिंग चरणों को भी वर्तमान प्रोटोकॉल में जोड़ा जा सकता है। सबसे पहले, केवल टूटने के स्थान की पहचान करने के बजाय, प्राप्त उच्च गति कैमरा छवियों के माध्यम से दरार-प्रसार पथ की पहचान की जा सकती है। इस प्रसार पथ को स्थानीय संरचनात्मक और यांत्रिक मापदंडों से सहसंबद्ध किया जा सकता है। दूसरा, वर्णित प्रोटोकॉल में टूटना दीक्षा स्थान को नेत्रहीन रूप से पहचाना गया था। गैर-जैविक ऊतकों पर एक पिछले अध्ययन ने टूटने का पता लगाने के लिए डीआईसी तनाव माप में अंतर का उपयोग कियाहै। पट्टिका ऊतकों पर इस तरह के स्वचालित टूटने का पता लगाने को लागू करने से संभवतः टूटने का पता लगाने की सटीकता में सुधार हो सकता है। अंत में, अन्य कोलेजन इमेजिंग तकनीकों की तुलना में एमपीएम-एसएचजी का एक बड़ा लाभ यह है कि यह व्यक्तिगत कोलेजन फाइबर की कल्पना करता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त डेटा का उपयोग अतिरिक्त स्थानीय कोलेजन विशेषताओं, जैसे कोलेजन सामग्री की जांच के लिए भी किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग रेशेदार पट्टिका ऊतक की स्थानीय विशेषताओं की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए किया जा सकता है, वह घटक जो विवो में पट्टिका टूटने में यांत्रिक रूप से विफल रहता है। इस जानकारी को नए संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग मार्करों को स्थापित करने की आवश्यकता है जो रोगियों में पट्टिका टूटने की भविष्यवाणी करते हैं। ये नए मार्कर आवश्यक हैं, क्योंकि पहले सुझाए गए जोखिम बायोमाकर्स को भविष्य की नैदानिक घटनाओं के लिए उप-पूर्वानुमानित मूल्य दिखाया गया है। भविष्य में, ओसीटी और पीएस-ओसीटी संभवतः धमनी प्रणाली46,47,48 में रेशेदार ऊतक की पहचान और मात्रा निर्धारित कर सकते हैं। इसके अलावा, तनाव को स्थानीय पट्टिका संरचना49 के लिए एक सरोगेट मार्कर माना जाता था। इस प्रकार, विवो स्ट्रेन मापमें 49 संभावित रूप से रोगियों में पट्टिका स्थिरता की पहचान में सहायता कर सकता है। हालांकि, प्राप्त परिणामों को सीधे विवो पट्टिका टूटने में अनुवाद करने से सावधान रहना चाहिए। सबसे पहले, रेशेदार पट्टिका ऊतक इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले यूनिडायरेक्शनल तन्यता लोडिंग की तुलना में विवो में अधिक जटिल लोडिंग का अनुभव करता है। दूसरा, एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े बहुघटक संरचनाएं हैं; रेशेदार पट्टिका ऊतक में विवो तनाव और तनाव वितरण अन्य पट्टिका घटकों की उपस्थिति और स्थान से प्रभावित हो सकता है, जैसे कि कैल्सीफिकेशन37।

इस मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन का उपयोग अन्य कोलेजनस ऊतकों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। कोलेजन के वैश्विक यांत्रिक परीक्षण और संरचनात्मक इमेजिंग पहले से ही जैविक ऊतकों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, पूर्व-विफलता और विफलता गुणों के साथ-साथ कोलेजन वास्तुकला का स्थानीय मूल्यांकन, विषम रेशेदार ऊतकों के सटीक यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है। हम उम्मीद करते हैं कि इस नए प्रोटोकॉल की संरचना कई जैविक ऊतकों के माइक्रोस्ट्रक्चर और यांत्रिकी के बीच परस्पर क्रिया में और अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनडब्ल्यूओ-विडी अनुदान (18360) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm extension ring Thorlabs Inc. CML10
15 mL tube VWR 525-0150
20x APO water immersion objective Leica 507701
3D Slicer software N/A Version 4.11
50 mL tubes VWR 525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm Conrad 4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating Thorlabs
Black tissue dye Polysciences inc 24113-2
Camera lens, focal length 50 mm Thorlabs Inc. MVL50M1
Camera stand VWR 241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser Coherent
Compressor + air hose JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62, 4016138577198
Excel Microsoft Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm Pattex
Heating bath N/A Custom made
High-speed camera + imaging software Pixelink-Navitar Inc. PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) N/A
Image J National Institute of Health N/A
LAS-AF Leica Version 2.3 Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II Leica Microscope used for SHG imaging
Lighting system AMZ instruments LED-60TB Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB MathWorks Version R2021A
MATLAB-based FibLab software Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based Ncorr software Georgia Institute of Technology Version 1.2
Needles Emerald BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter) VWR BRND452000
Parafilm VWR 291-1214
Pasteur Pipettes VWR ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm PerkinElmer CLS149276
Ruler Fine Science Tools 1800030
Sandpaper (P180) Conrad 4.00932E+12
Side cutter Conrad 4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184) VWR 634165S
Tensile tester + software + clamps N/A Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver Garant, Hoffman group 659906

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
  2. Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
  3. Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
  4. Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
  5. SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
  6. Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
  7. Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
  8. Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
  9. Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
  10. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
  11. Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
  12. Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
  13. Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
  14. Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
  15. Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
  16. Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
  17. Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
  18. Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
  19. Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
  20. Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
  21. Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
  22. Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
  23. Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
  24. Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
  25. Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
  26. Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
  27. Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
  28. Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
  29. Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
  30. Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
  31. Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
  32. FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
  33. van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  34. Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
  35. NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
  36. Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
  37. Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
  38. Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
  39. Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
  40. Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
  41. Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
  42. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
  43. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
  44. vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
  45. Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
  46. Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
  47. Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
  48. Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
  49. Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 189
एथेरोस्क्लेरोटिक प्लाक रेशेदार ऊतक के स्थानीय कोलेजन संरचना और यांत्रिक गुणों के बीच सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए एक विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crielaard, H., Guvenir Torun, S.,… More

Crielaard, H., Guvenir Torun, S., Wissing, T. B., de Miguel Muñoz, P., Kremers, G. J., Gijsen, F. J. H., Van Der Heiden, K., Akyildiz, A. C. A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue. J. Vis. Exp. (189), e64334, doi:10.3791/64334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter