Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En metod för att studera korrelationen mellan lokal kollagenstruktur och mekaniska egenskaper hos fibrös vävnad mot aterosklerotisk plack

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 4, 1,3, 1,2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

Summary

Vi har utvecklat en pipeline för mekanoavbildning för att studera heterogena strukturella och mekaniska aterosklerotiska plackegenskaper. Denna pipeline möjliggör korrelation mellan den lokala dominerande vinkeln och dispersionen av kollagenfiberorientering, bristningsbeteendet och belastningsfingeravtrycken i den fibrösa plackvävnaden.

Abstract

Brottet av aterosklerotiska plack i kranskärl och halspulsåder är den främsta orsaken till dödliga kardiovaskulära händelser. Bristningsmekaniken hos den heterogena, mycket kollagenösa plackvävnaden, och hur detta är relaterat till vävnadens fibrösa struktur, är dock ännu inte kända. Befintliga rörledningar för att studera plackmekanik är begränsade till att endast erhålla grovmekaniska egenskaper hos plackvävnaden, baserat på antagandet om vävnadens strukturella homogenitet. Fibrös plackvävnad är emellertid strukturellt heterogen, förmodligen främst på grund av lokal variation i kollagenfiberarkitekturen.

Den mekano-avbildande rörledningen som beskrivs här har utvecklats för att studera de heterogena strukturella och mekaniska plackegenskaperna. I denna pipeline karakteriseras vävnadens lokala kollagenarkitektur med användning av multifotonmikroskopi (MPM) med andra harmoniska generationen (SHG), och vävnadens sviktbeteende karakteriseras under enaxliga dragprovningsförhållanden med hjälp av digital bildkorrelation (DIC) analys. Denna experimentella pipeline möjliggör korrelation mellan den lokala dominerande vinkeln och dispersionen av kollagenfiberorientering, bristningsbeteendet och stamfingeravtrycken hos den fibrösa plackvävnaden. Den erhållna kunskapen är nyckeln till att bättre förstå, förutsäga och förhindra aterosklerotiska plackbrott.

Introduction

Ischemisk stroke, ofta utlöst av aterosklerotisk plackbrott i halspulsådern, är en av de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet över hela världen1. De nuvarande kirurgiska dosplaneringsstrategierna för att förhindra carotid aterosklerosrelaterad stroke inkluderar emellertid inte riskbedömning av plackbrott2. Detta beror främst på att de tidigare föreslagna riskbiomarkörerna, såsom plaque cap tjocklek3 och lipidkärnstorlek4, har visat sig ha suboptimalt prediktivt värde för framtida kliniska händelser 5,6. En bättre förståelse av plackmekanik och rupturmekanismer är nödvändig för att optimera riskbedömning av plackbrott och identifiera nya riskmarkörer för aterosklerotiska plack.

Plackbrott är en lokal mekanisk händelse där den mycket fibrösa plackvävnaden inte tål den mekaniska belastning som blodtrycket utövar på den och förlorar sin strukturella integritet7. Trots detta är mekaniken för plackbrottet och dess länk till den underliggande mikrostrukturen dåligt förstådd8. De få experimentella studier som karakteriserade plackvävnadssvikt har 9,10,11,12,13 rapporterade grova mekaniska brottegenskaper (dvs. ultimat dragsviktstöjning och styrka), härledd med antagandet om vävnadens strukturella homogenitet. Den fibrösa plackvävnaden är emellertid strukturellt heterogen, förmodligen främst på grund av lokal variation i kollagenfiberarkitekturen14. Dessutom undersöktes kopplingen mellan plackvävnadens mekaniska felegenskaper och kollagenarkitekturen endast i en nyligen genomförd studie av Johnston et al. Författarna visade en interplaque skillnad i den dominerande fiberorienteringen och rapporterade högre ultimata spänningar och lägre ultimata stammar för fibrösa placklockprover med en övervägande omkretsfiberorientering 15. Studien var emellertid också begränsad till grova mekaniska och strukturella egenskaper.

För att belysa den väsentliga informationen om den lokala kollagenarkitekturen och lokala mekaniska egenskaper hos den fibrösa plackvävnaden har vi i den aktuella studien utvecklat en pipeline för mekanoavbildning. Denna ex vivo-pipeline möjliggör kvantifiering av den lokala kollagenfiberriktningen och dispersionen, såväl som lokal bristningsstam. Rörledningen innefattar MPM-avbildning med SHG för att avbilda kollagenfibrer i plackvävnaden, samt DIC och enaxlig dragprovning för att kvantifiera vävnadens bristningsegenskaper.

Multifotonmikroskopi-andra-harmonisk generation (MPM-SHG) har blivit en populär teknik för att studera kollagen i biologiska vävnader16. Tekniken har många fördelar jämfört med andra kollagenavbildningstekniker, såsom histologi17, diffusionstensoravbildning (DTI)14 och ljusspridning med liten vinkel (SALS)15. För det första är MPM-SHG-avbildning icke-förstörande, vilket gör den idealisk att kombinera med mekanisk testning18. För det andra är SHG-signalen specifik för kollagen, och därför är ingen färgning av vävnaden nödvändig. På grund av de långa excitationsvåglängderna (nära infraröd) är penetrationsdjupet större än med andra mikroskopitekniker16. Den höga upplösningen (μm-nivå) som uppnås med SHG-avbildning möjliggör också visualisering av enskilda fibrer. Detta erbjuder många möjligheter, såsom lokal kvantifiering av antalet kollagenfibrer, kollagenfiberorientering och distribution19.

Digital bildkorrelation (DIC) i kombination med mekanisk testning är en allmänt använd metod för att erhålla lokala mekaniska egenskaper hos biologiska vävnader20. Med DIC spåras förskjutningen av fläckar som appliceras på vävnadsytan genom att jämföra höghastighetskamerabilder som förvärvats under mekanisk testning20. Denna bildbehandlingsmetod används för att uppskatta ytstammarna i hela fältet för provet20 och kan också användas för att studera bristningsbeteendet hos vävnaden21.

Protocol

Alla metoder som beskrivs i detta dokument godkändes av den etiska forskningskommittén vid Erasmus Medical Center i Rotterdam; Informerat samtycke erhölls från patienter före plackprovinsamling. Ett arbetsflödesschema över protokollet ges i figur 1.

1. Vävnadsinsamling, mikrodatortomografi (μCT) avbildning och beredning av testprover

  1. Insamling och förvaring av vävnad
    1. Samla in färska humana halspulsådern aterosklerotiska plackprover från samtyckande patienter som genomgick carotid endarterektomikirurgi.
      OBS: Plackproverna som hämtats från denna operation består av det sjuka intima lagret i halspulsådern, inklusive ackumulering av fett (lipidpoolen) och förkalkningar22.
    2. Ta bort blodrester med fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) och torka provet med en gasväv.
    3. Placera provet i ett 15 ml rör med pincett. Snäppfrys vävnaden genom att placera röret i flytande kväve i 10 minuter.
    4. Efter snäppfrysning förvaras provet i en frys på -80 °C fram till dagen för μCT-avbildning.
      OBS: Snäppfrysning minimerar kristallbildning, vilket leder till mikrostrukturella skador i vävnaden. En tidigare studie på svinaortavävnad har visat att snap-frysning och lagring vid -80 °C inte hade någon signifikant inverkan på vävnadens mekaniska egenskaper23.
  2. μCT-avbildning
    1. På dagen för μCT-avbildning, ta ut plackprovet ur 15 ml-röret. Om vävnaden fastnar på röret, fyll röret med PBS vid rumstemperatur. Lämna vävnaden i PBS tills provet kan tas ut ur röret.
    2. Torka plackprovet noggrant med silkespapper.
    3. Slå på μCT-systemet genom att trycka på den gröna knappen. Tryck på värm upp i CT-programvaran längst ner på skärmen och vänta 15 minuter.
    4. Placera manuellt ett röntgenfilter på Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm i μCT-systemet.
    5. Välj den mapp där bilderna ska lagras.
    6. Välj parametrarna i den vänstra panelen. Använd rullgardinslistorna för att välja en skanningstid på 4 min, en upplösning på 172 μm, en spänning på 90 kV, en strömstyrka på 88 mA, ett synfält på 86 mm och en rotation på 360°.
    7. Öppna enhetens dörr. Dra ut plattformen manuellt.
    8. Sätt parafilm på plattformen och placera provet på plattformen (mot plattformens yttersta ände).
    9. Placera plattformen manuellt i enheten och stäng dörren.
    10. Aktivera live-läget (ögonikonen ). Flytta plattformen med pilarna i enheten för att centrera provet i synfältet.
    11. Starta avbildning (ikonen längst ned i mitten). När avbildningen är klar trycker du på dörrikonen längst ner (under knappen Avbryt ).
    12. Efter μCT-skanningen, snäppfrys plackprovet igen enligt beskrivningen i steg 1.1.3. Förvara den vid -80 °C fram till dagen för multifotonmikroskopiavbildning och mekanisk testning.
    13. Öppna de förvärvade DICOM-filerna för μCT-avbildningen i 3D Slicer-programvaran med öppen källkod24.
    14. Gå till Segmentredigerare . Välj skapa en ny segmentering | volymen som ska analyseras som en huvudvolym.
    15. Klicka på Lägg till för att lägga till ett segment. Tryck på dess namn och färg för att ändra dessa parametrar.
    16. För att definiera segmenten, klicka på effekter | tröskel i nedre delen av fönstret. Använd detta tröskelverktyg för att skilja mellan förkalkade (>450 HU) och icke-förkalkade (<450 HU) vävnadsregioner. När tröskeln har valts trycker du på Apply i den nedre delen.
    17. Tryck på Visa 3D (precis till höger om Lägg till) för att visualisera segmenteringen i 3D-vyn. Om det finns områden i segmenteringen som inte önskas, ta bort dem med saxeffekten .
    18. Ändra segmentens opacitet i segmenteringsmodulen genom att klicka på namnet på önskad segmentering.
      OBS: Om möjligt kan μCT-avbildning och granskning av μCT-bilderna utföras samma dag som resten av protokollet. Hoppa i så fall över steg 1.2.12. Tänk dock på att de efterföljande stegen i detta protokoll också är tidskrävande och bör utföras samma dag. Efter lite övning, och med de beskrivna inställningarna och vävnaden, bör μCT-avbildning ta ~ 45 minuter, granskning av μCT-bilderna ~ 15 min, provberedning av ett enda testprov ~ 1 h, mikroskopi ~ 4 h och enaxlig dragprovning ~ 2 h.
  3. Beredning av testprov
    1. På dagen för kollagenavbildning och mekanisk testning, tina plack genom nedsänkning i PBS vid rumstemperatur i cirka 10 minuter.
    2. Öppna 3D-konstruktionen av plaketten som skapades i steg 1.2.13-1.2.18 i 3D-utsnittsprogramvaran.
    3. Använd plackvävnadens naturliga landmärken för att identifiera vilka delar av 3D-rekonstruktionen som motsvarar det verkliga plackprovet. Identifiera vilket område av 3D-rekonstruktionen som inte innehåller förkalkningar och identifiera visuellt detta område i den verkliga placken.
    4. Skär placken öppen längs artärens längdaxel med kirurgisk sax och pincett. Om ett snitt redan finns från operationen, börja från detta snitt för optimal användning av vävnaden. Om provet inte har en rörform och det är svårt att definiera längdriktningen, uteslut provet från testning.
    5. Klipp ut rektangulära provexemplar från plackproverna. Se till att testproverna är så stora som möjligt samtidigt som du undviker vävnadsområden som innehåller tårar eller förkalkningar. Var försiktig under denna skärning, eftersom en liten reva eller spricka vid kanten av testprovet kan resultera i sprickutbredning från den befintliga sprickan under dragprovning.
    6. Se till att testproverna har ett bredd-till-längd-förhållande (WL) på <1 i mätarlängden när den är monterad i dragprovaren. Om provexemplaren uppfyller detta krav är de lämpliga för lämpliga dragprovningar med avseende på randvillkor25.
      OBS: Intervallet i provdimensionerna kan vara stort. Proverna som författarna testade hade en mätlängd som varierade mellan 3,4 och 12,9 mm och en bredd som varierade mellan 1,6 och 6,4 mm.

2. Multifotonmikroskopiavbildning

  1. Förberedelser
    1. Före dagen för kollagenavbildning och mekanisk testning, dela 40 g av en silikonelastomerbas över två 50 ml rör och tillsätt 2 g härdningsmedel till varje rör (förhållandet 1:10) med en pasteurpipet. Blanda de två komponenterna med pipeten.
    2. Centrifugera rören i 1 min vid 700 × g för att avlägsna så många luftbubblor som möjligt.
    3. Fyll en petriskål (10 cm i diameter) med ett tunt lager (ca 0,5-1 cm) kisel och inkubera den antingen i ugnen vid 65 °C i 3 timmar eller placera den i rumstemperatur i 48 timmar.
    4. Ta ett plackprov och fäst båda ändarna på kiseln genom att fästa nålar i vävnaden (figur 2A). Se till att provets luminala sida är vänd uppåt. Sätt in nålarna i det område av provet som kommer att finnas i klämmorna på dragprovningsanordningen under den mekaniska provningen.
    5. Sätt på skyddsglasögon. Använd en sidoskärare för att förkorta nålarna så att de sticker ut mindre än några millimeter ovanför provytan för att förhindra att de skadar mikroskopmålet. Fyll petriskålen med PBS tills provet är nedsänkt.
  2. Inställning av mikroskopi
    1. Se till att ett korrekt mål är monterat på multifotonmikroskopet. Använd ett mål optimerat för att överföra infrarött ljus, med en förstoring på 20x.
    2. Starta mikroskopsystemet. Öppna mikroskopets operativsystem.
    3. När du blir ombedd att initiera bildbordet, se till att mikroskopkondensorarmen skjuts tillbaka och målet är i lägsta läge.
    4. Aktivera multifotonlasern.
    5. Lägg petriskålen med testprovet under målet, som i figur 3. Var noga med att inte placera målet ovanför provet ännu eftersom laserinställningarna fortfarande behöver optimeras. Annars kan laserljusets möjliga höga effekt leda till skador på vävnaden.
    6. Se till att målet är något nedsänkt i PBS. Använd en pipett för att lägga till extra PBS om det behövs.
    7. Ställ in ljusvåglängden på 880 nm.
      OBS: Denna våglängd väljs eftersom SHG-emissionsfiltret i det använda tvåfotonsystemet har en mittvåglängd på cirka 440 nm. För andra mikroskop kan en annan våglängd vara mer tillämplig.
  3. Panelskanning och val av bildplatser
    1. Stäng av multifotonlasern och aktivera mikroskopets ljusfältläge . Slå sedan på liveskanningsläget .
    2. Placera scenen så att målet ligger ovanför provet och sätt provytan i fokus. Stäng av direktsökningsläget.
    3. Under förvärvsfliken , i den andra panelen, ändrar du zoomfaktorn till 1 genom att skjuta den avsedda stapeln.
      OBS: Denna zoomfaktor, tillsammans med förstoringsfaktorn för målet (20x), bestämmer storleken på den tagna bilden (739 μm x 739 μm).
    4. Under hämtningsfliken , i den andra panelen, ändrar du skanningshastigheten till 400 Hz, linjegenomsnittet till 1 och upplösningen till 128 x 128 pixlar per bild (pixelstorlek ~ 5,8 μm x 5,8 μm) med hjälp av listrutorna.
    5. Under förvärvsfliken , i den första panelen, klickar du på rastermönstersymbolen och väntar tills en kakelskanningspanel visas.
    6. Aktivera direktsökningsläget . Flytta målsättningen till ett hörn av exemplet med hjälp av rattarna på smartpanelen och klicka på markeringspositionssymbolen på panelen Panelskanning. Upprepa detta för varje hörn av provet. Om det utförs korrekt visas ett rutnät med alla valda paneler för avbildning i orange.
    7. Stäng av funktionen för automatisk sömnad .
    8. Klicka på start längst ned till höger på skärmen för att skapa en panelskanning av hela provytan för att få en översikt över exempelgeometrin.
      OBS: Baserat på de beskrivna inställningarna, vävnaden och mikroskopsystemet tar det ~ 10 minuter att få en kakelskanning av hela provytan.
    9. Efter panelskanningen, observera x- och y-koordinaterna för det övre vänstra hörnet av varje kakel i kakelskanningspanelen, som visas automatiskt av mikroskopisystemets programvara. Anteckna dessa koordinater i ett kalkylblad.
    10. I mikroskopprogramvaran, i kakelskanningspanelen, observera antalet brickor i x- och y-riktningarna i rutan som heter scanfield. Anteckna storleken på panelskanningen i kalkylbladet. Beräkna koordinaterna för de andra plattorna genom att addera/subtrahera storleken på plattan (739 μm).
      OBS: Dessa koordinater är nödvändiga för att identifiera den exakta platsen för plattorna som ska skannas med SHG-avbildning. Om den totala avbildningstiden inte är ett problem kan alla paneler avbildas utan att hoppa över någon panel.
    11. Från panelskanningen väljer du de paneler som ska avbildas med SHG-avbildning. För det här valet ska du undvika paneler som ska vara i klämmorna och lämna en panel mellan varje markerad panel i både längsgående och perifer riktning, som visas i figur 2B.
  4. Visualisera kollagen: SHG-avbildning
    1. Släck lamporna i rummet och täck mikroskopsteget med mörkläggningstyg så att inget ljus från rummet når detektorn.
      OBS: Minimera ljuset som når detektorerna kommer att minska bruset under bildinsamling.
    2. Slå på multifotonlasern (MP).
    3. Välj den icke-skannade detekteringsdetektorn (NDD) som är utrustad med ett 430-450 nm bandpassfilter.
    4. Identifiera platsen för panelerna som ska avbildas med hjälp av informationen som hämtades i steg 2.3.10. Fyll i koordinaterna i de angivna rutorna och klicka på enter, så att målet flyttas till rätt panel. Aktivera direktsökningsläget.
      OBS: Med andra mikroskop eller nyare versioner av operativsystemet kan flyttning till platser inom kakelskanningen göras automatiskt. I det här fallet är det inte nödvändigt att notera x- och y-koordinaterna för varje kakel (steg 2.3.10) och fylla i koordinaterna i operativsystemet (steg 2.4.4).
    5. Öka MP-lasereffekten genom att använda skjutreglaget i den övre panelen under strålbaneinställningar för att få högsta möjliga lasereffekt utan betydande blekning. Justera sedan detektorförstärkningen för att få ljusa bilder, men utan mättade pixlar, genom att använda ratten på den smarta panelen eller genom att klicka på detektorns namn under strålbaneinställningar | ytterligare kanaler. Typiska värden för detektorförstärkningen är mellan 500 och 800 V.
    6. Använd z-positionsratten på smartpanelen för att justera fokusplanet.
    7. Flytta till toppen av provet och ställ in positionerna för toppen av z-stacken genom att klicka på pilspetsen i z-stackpanelen (under förvärvsfliken | 3:e panelen).
    8. Fokusera sedan på provet tills SHG-signalen inte längre detekteras - det här är slutet på stacken. Klicka igen på pilspetsen i z-stack-panelen för att ställa in den här positionen. När du är klar stänger du av direktsökningsläget.
      OBS: Vävnaden kanske inte är helt platt. Därför kan provytan i olika regioner i vävnaden ha något olika positioner i z-riktningen.
    9. Under hämtningsfliken, i den andra panelen, behåll skanningshastigheten på 400 Hz, ställ in linjegenomsnittet till 2 och upplösningen till 512 x 512 pixlar per bild (pixelstorlek ~ 1,4 μm x 1,4 μm) med hjälp av listrutorna. Växla på den dubbelriktade X-skanningsknappen.
    10. Klicka på z-stegsstorlek i z-stackpanelen och fyll i en z-stegstorlek på 3 μm i rutan. Klicka på start längst ned till höger på skärmen för att skapa en z-stack. När du är klar, var noga med att spara koordinaterna för panelen i filnamnet eller ge varje kakel sitt eget nummer (som i figur 2B).
      OBS: Baserat på de beskrivna inställningarna, vävnaden och mikroskopsystemet tar förvärvet av en z-stack av en enda kakel ~ 10-15 min. Förberedelsestegen (steg 2.4.4–2.4.10) ingår i denna tidsuppskattning.

3. Mekanisk provning

  1. Förberedelse av enaxlig dragprovningsinställning
    1. Gör den horisontella dragprovningsinställningen (figur 4) klar för användning, följ instruktionerna för dragprovaren (t.ex. slå på programvara, fäst klämmor, fäst lastcell).
    2. För att minimera glidningen av provet, fäst dubbelhäftande skumtejp (figur 4A,B-2) på insidan av klämmorna på dragprovaren och sandpapper på insidan av skumtejpen. Så småningom kommer sandpapperet att vara i kontakt med testprovet.
    3. Placera värmebadet (figur 4A, B-3) på plats. Fyll värmebadet med PBS upp till nivån på klämmornas bottenyta, så att det inte når sandpapperet ännu.
    4. Slå på värmebadets strömkälla och ställ in temperaturen på cirka 37 °C.
    5. Montera höghastighetskameran ovanför dragprovningssystemet (figur 4A-4), t.ex. med hjälp av ett laboratoriestativ, och montera ett objektiv med en brännvidd på 50 mm på kameran genom en förlängningsring.
    6. Se till att klämmorna är i fokus och att synfältet är tillräckligt stort för att registrera provet under hela sträckningsproceduren (synfältsbredd: ± provbredden; Synfältslängd: ± 2x provlängden).
    7. Montera belysningssystemet (figur 4A-5) ovanför dragprovningssystemet, t.ex. med hjälp av ett laboratoriestativ. Slå på belysningssystemet och justera ljusintensiteten och platsen så att det inte finns några reflektioner på PBS-ytan som ska observeras på kamerabilden.
    8. Justera kamerans exponeringstid och förstärkning för att få tydliga bilder.
    9. Ställ in bildinsamlingsprogrammet så att det tar 30 bilder/s med en upplösning på 5,2 MP.
      OBS: Denna höga bildhastighet behövs för att utföra den efterföljande DIC-analysen och studera bristningsbeteendet.
    10. Ställ in förskjutningshastigheten för en av klämmorna så att den globala tekniska töjningshastigheten under mekanisk testning liknar vävnadens fysiologiska töjningshastighet in vivo
      (5%/s för plackvävnad26).
  2. Generering av fläckmönster
    OBS: Detta speckle pattern protocol är baserat på tidigare arbete av Walsh et al.27.
    1. Torka provet genom att badda det lätt med silkespapper.
    2. Lägg det svarta vävnadsfärgämnet i den avsedda hinken på airbrushen.
    3. Anslut airbrush till kompressorn. Slå på airbrush-kompressorn och ställ in trycket på 25 PSI.
    4. Försök att skapa ett optimalt fläckmönster på papper innan du sprayar på vävnaden. Spraya några gånger tills ett svart/vitt förhållande på 50 :5028 är uppfyllt. Flytta airbrushens nål fram och tillbaka för att justera prickmönstrets grovhet tills storleken på en fläck liknar storleken på 3-5 pixlar på höghastighetskameran29.
      OBS: Fläckmönstret kommer att användas för två olika ändamål. Först mäts förskjutningen av dessa fläckar genom att jämföra höghastighetskamerabilder som förvärvats under mekanisk testning (DIC, steg 4.2). För det andra används detta fläckmönster för att identifiera bristningsplatsen på bilden av provets odeformerade tillstånd (steg 4.3.1).
    5. Håll airbrushen ca 30 cm från testprovet och spraya på luminalytan.
    6. Låt färgämnet bindas till provet i 1 min vid rumstemperatur innan provet sänks ned i PBS.
  3. Uniaxiell dragprovning
    1. Placera provet i dragprovarens klämmor, med provexemplarens omkretsriktning i linje med dragsträckningsriktningen och provets luminala sida vänd uppåt. Se till att den ursprungliga mätarlängden är inställd så att remsornas WL-förhållande är <1.
    2. Dra åt skruvarna på greppen genom att applicera ett vridmoment på 20 cNm med en momentskruvmejsel. Gör detta gradvis genom att applicera ett litet vridmoment på varje skruv innan du applicerar det slutliga vridmomentet.
    3. Inspektera visuellt om provet innehåller några tårar som kan påverka testerna.
    4. För in mer PBS i värmebadet tills provet är nedsänkt och vänta tills temperaturen på PBS har nått 37 °C igen.
    5. Hämta en kalibreringsbild med höghastighetskameran, där testprovet och linjalen ingår som referens. Se till att linjalen är på samma avstånd från kamerans objektiv som provets luminala yta.
    6. Tara lastcellen och börja registrera de globala kraft- och förskjutningsmätningarna från lastcellen och dragprovarens ställdon.
    7. Räta ut provet genom att applicera en försträckning på 0,05 N för att bli av med slacket i provet. Utför 10 cykler med förkonditionering med upp till 10 % töjning baserat på manöverdonets längdmätning efter applicering av försträckning.
    8. Starta den enaxliga dragprovningen tills provet är fullständigt fel, medan du spelar in en video av provdeformationen med höghastighetskameran. Efter vävnadssvikt, sluta registrera de globala kraft- och förskjutningsmätningarna.
      OBS: Vissa kommersiella dragprovare kan utföra steg 3.3.6-3.3.9 automatiskt. Det aktuella protokollet beskriver de manuella åtgärder som ska vidtas om detta automatiska alternativ inte ingår i dragprovaren som används.
    9. Ta bort provet från dragprovningsanordningen och kassera det på lämpligt sätt.
    10. När du testar nästa prov, byt ut sandpapper och skumtejp på klämmorna.

4. Analys av data

  1. Analys av kollagenorganisation
    1. Öppna z-stackarna som erhållits under MPM med SHG i ImageJ och skapa maximala intensitetsprojektioner (MIP) för varje z-stack.
    2. Analysera varje MIP med MATLAB-baserade FOA-verktyget (Fiber Orientation Analysis)30 med öppen källkod för att mäta orienteringsvinkeln för de enskilda kollagenfibrerna som finns i plattorna. Använd följande parametrar: Skalor: [3 4 5] eller [2 4 6], beroende på kärldiameter, och Kärltröskel: 0,999, 0,9995 eller 0,9999, beroende på SHG-signalens intensitet.
      Mer information om hur du använder det här verktyget finns i programvarans manual31.
    3. Använd ett annat MATLAB-baserat verktyg med öppen källkod, FibLab32, för att anpassa en gaussisk fördelning till histogrammet för vinkelfördelning.
      Mer information om hur du använder det här verktyget finns i programvarans manual32.
    4. Från den gaussiska fördelningsplanen erhållen med FibLab, extrahera följande strukturella parametrar från arbetsytan i MATLAB: den dominerande fibervinkeln (μ p), vilket är distributionssättet, standardavvikelsen (σ p) för fibervinkelfördelningen och den anisotropa fraktionen (Pani = 1 - Piso).
      OBS: Den isotropa fraktionen är arean under baslinjen i Gaussfördelningen, medan den anisotropa fraktionen innehåller toppens area ovanpå baslinjen33. Bådeσ p och Pani ger information om spridningen av fibrernas orientering i kakelområdet.
    5. För visuell inspektion ritar du μp med hjälp av orienterade linjer och σp och Panimed hjälp av färgkartor.
  2. Digital bildanalys och rupturanalys
    1. Utför visuell inspektion på kamerabilderna för att identifiera ramen där brottinitiering inträffar. På denna ram identifierar du brottplatsen visuellt.
    2. Utför visuell inspektion på kamerabilderna för att identifiera eventuella sprickor eller rivor på platsen för brott i början av mekanisk testning. Om en sådan tår är närvarande, uteslut provet från analys.
    3. Utför DIC-analysen med den MATLAB-baserade programvaran Ncorr (v1.2)34 med öppen källkod. Följ stegen i Ncorr-handboken35.
      1. Använd kamerabilderna som spelats in under dragprovet med höghastighetskameran för DIC. Välj den sista bildrutan före den sista sträckningen tills fel (efter förkonditionering) som referensbild. För de aktuella bilderna markerar du alla bilder från början av den sista sträckningen till den sista bildrutan före bildrutan där brottets initiering inträffade.
      2. Välj exempelytan som intresseområde (ROI). Uteslut de områden som ligger nära (ca 1 mm) klämmorna, eftersom påfrestningarna i dessa områden kommer att påverkas starkt av greppen.
      3. Utför DIC-analys med hjälp av följande parametrar: Delmängdsradie: 30 pixlar; Delmängdsavstånd: tre pixlar; Gräns för iteration: 50; Normen för skillnadsvektorns cutoff: 10-5; Töjningsradie: 5; Automatisk förökning, steg #: 5.
      4. Från DIC-analysen med Ncorr, erhåll Green-Lagrange-fördelningarna (eller Eulerian stam) av ROI. Använd dessa töjningsfördelningar för att beräkna den genomsnittliga Green-Lagrange-stammen för hela plackprovytan vid den sista ramen före brott. Beräkna Green-Lagrange-stammen vid brottplatsen.
  3. Korrelera strukturella och mekaniska data vid brottplatsen
    1. Identifiera brottets placering (identifierad i steg 4.2.1) på referensbilden med hjälp av de naturliga landmärkena i provet och de applicerade fläckarna på provet.
    2. Använd de naturliga landmärkena i testexemplet och gör ett överlägg av referensbilden och panelskanningen (steg 2.3) för att identifiera bristningsplatsen på panelskanningen. Identifiera MPM-SHG-panelen där brottet inträffade. Om brottet inte finns i en panel som skannats med MPM-SHG, identifiera panelen närmast brottets plats. Hämta de strukturella parametrarna som finns vid plattan där brott inträffade.

Representative Results

Vävnadsinsamling och beredning av provprover
Vävnadssamlingen ger plackfibrösa vävnadsprover som kan dissekeras i enskilda testprover för strukturell avbildning och enaxlig dragprovning. Helst innehåller ett uppsamlat fibröst vävnadsprov områden med små eller inga tårar (figur 5A) och makroförkalkningar (figur 5B). Ett överskott av dessa tårar och förkalkningar (figur 5C) kan leda till plackprover som inte uppfyller det tidigare nämnda provdimensionskravet i WL 1.

Multifotonmikroskopi avbildning
SHG-avbildning och efterbehandling av bilder tillhandahåller MIP från varje avbildad panel (figur 6A, B). Ytterligare efterbehandling genom fiberdetektion (figur 6C) ger histogram för fiberorientering (figur 6D) från vilka kollagenstrukturella parametrar kan extraheras (figur 6E). Dessutom kan färgkartor som visar de lokala strukturella kollagenparametrarna över hela plackprovet erhållas för visuell analys (figur 6F, G). För det representativa provet i figur 6 erhålls en stor variation inom provet i parametrarna för strukturellt kollagen (medelvärde ± SD på μp = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°, Pani = 0,49 ± 0,14, om omkretsriktningen definieras som 0°). Denna variation inom provet betonar vikten av att erhålla lokala strukturella parametrar istället för att anta homogenitet.

Mekanisk provning
Ruptur beteende
Höghastighetskameran ger bilder av deformations- och bristningsbeteendet hos plackproverna under mekanisk testning (figur 7). Från dessa bilder kan platsen för brottets initiering och brottets utbredningsväg identifieras. Bristningsidentifieringsresultaten är suboptimala om bubblor eller reflektioner finns i kamerabilderna, eller om brottet sprider sig för snabbt för att fångas med den valda bildhastigheten.

Lokala töjningsmönster
Digital bildkorrelationsanalys på kamerainspelningar som förvärvats under den enaxliga dragprovningen ger de lokala vävnadsdeformationskartorna, såsom Green-Lagrange-töjningskartorna som visas i figur 8. Dessa kartor visar de tre töjningskomponenterna (εxx, εxy och εyy) vid ramen innan brottet initieras. Från dessa stamkartor kan de genomsnittliga stammarna i en region av intresse och lokal belastning på en plats, såsom bristningsplats, extraheras.

För det representativa provet i figur 8 visar lokala stamdata en stor variation inom provet. För det representativa testprovet i figur 8 erhålls en stor variation inom provet i de lokala stammarna (intervallen för de observerade stammarna är följande: εxx = -0,30-0,17;ε xy = -0,13-0,20; εyy = 0-0,40). Detta betonar vikten av att erhålla lokala data istället för brutto, medelvärden erhållna med antagandet om vävnadshomogenitet.

Korrelerande mekanisk och strukturell vävnadsinformation
Ovan nämnda resultat möjliggör associering av vävnadens lokala deformation och bristningsbeteende till kollagenarkitekturen. När brottplatsen har identifierats på kamerainspelningarna (figur 9A) kan den mappas tillbaka till referenskamerabilden (figur 9B) och till mikroskopiplattans skanning (figur 9C). Detta ger MPM-SHG-panelen där brottet inträffade och de strukturella parametrarna som finns på denna kakel (bild 9D). De strukturella parametrarna som finns i plattan där brott inträffade i ett representativt prov, som visas i figur 9, ärμ p = 28 °, σp = 19 ° och Pani = 0,6. Samma procedur kan också tillämpas på de icke-brutna vävnadsplatserna. Det är viktigt att notera att kartläggning av brottets plats på referensbilden från brottramen kan vara utmanande vid ett dåligt fläckmönster och oklara naturliga landmärken. Dessutom, om vävnadens naturliga landmärken inte är tillräckligt tydliga, kan samregistrering av kakelskanningsöverlägget och höghastighetskamerabilderna vara svårt.

Figure 1
Bild 1: Arbetsflödesdiagram över det presenterade experimentella protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Val av paneler för SHG-avbildning från panelskanningen . (A) Testprov fäst i kisel. (B) Kakelskanning av testprovet erhållet genom ljusfältmikroskopi. Panelerna som väljs för SHG-avbildning markeras med blå fyrkanter. (C) Maximal intensitetsprojektion av MPM med SHG. Skalstapel = 140 μm (C). Förkortningar: SHG = andra harmoniska generationen; MPM = multifotonmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Plackprov placerat under multifotonmikroskopets syfte. Plackprovets placering säkras med en fosfatbuffrad saltlösningsfylld petriskål. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Specialdesignad enaxlig dragprovare med dess olika komponenter angivna . (A) Total översikt över systemet. Observera att sandpappersinsatserna i klämmorna är synliga eftersom endast bottenklämmorna är fastsatta. (B) Inzoomad bild av dragprovarens klämmor med provexemplaret klart för provning. Förkortningar: PVC = polyvinylklorid; LED = lysdiod. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Resultat av vävnadsinsamling och provberedning från representativa prover . (A) Färskt och intakt plackprov, hämtat från samtyckande patienter som genomgick carotid endarterektomikirurgi. (B) 3D-rekonstruktion från en μCT-skanning. Förkalkad vävnad visas i ljusblå och icke-förkalkad i rött. Ett optimalt prov utan förkalkad vävnad kunde erhållas från området mellan de blå linjerna. (C) 3D-rekonstruktion från μCT-skanningen som visar en suboptimal plack med ett överskott av förkalkad vävnad. Skalstång = 3 mm. Förkortning: μCT = mikrodatortomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: MPM-SHG-resultat från ett representativt urval. (A) Översikt över genomsökning av paneler; De valda panelerna för avbildning visas i blått. b) MIP från olika plattor. (C) Fiberdetektering av FOA-verktyget från en vald kakel # 1. (D) Histogram för fiberorientering från en markerad panel. (E) Fiberorienteringshistogram + Gaussisk passform, från vilken kollagenstrukturella parametrar kan extraheras från en vald kakel. (F) Representation av μ p (orientering svart linje) och σp (bakgrundsfärg) över hela plackprovet. (G) Representation av μp (orientering svart linje) och Pani (bakgrundsfärg) över hela plackprovet. Skalstänger = 140 μm (B,C). Förkortningar: MPM-SHG = multifotonmikroskopi-andra-harmonisk generation; MIP = prognoser för maximal intensitet, FOA = fiberorienteringsanalys; μp = dominerande fibervinkel; Pani = anisotrop fraktion; σp = fibervinkelfördelningens standardavvikelse; Piso = isotrop fraktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Initiering och utbredning av bristning i ett plackvävnadsprov under dragprovsförfarandet.1) Försträckt tillstånd, intakt vävnad. 2) Rupturinitiering-första ram där brott observeras. Platsen för brottets initiering är markerad med en röd fyrkant. 3 ) och 4) Rupturförökning. 5) Fullständig bristning av plackprovet. Skalstänger = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Töjningsmönster för Green-Lagrange för ett representativt prov (εxx, εxy och εyy) vid ramen före brott, erhållet med DIC-analys. Genomsnittlig och standardavvikelse över hela placket anges, tillsammans med belastningen vid bristningsplatsen. Förkortningar: DIC = digital bildkorrelation; εxx = längsgående töjning, εxy = skjuvning; εyy = dragspänning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Överläggsbild av bristningsplatsen (röd fyrkant) på bilder. (A) Bild av höghastighetskamera, där brott identifieras (brottram). (B) Bild av höghastighetskamera, där endast försträckning tillämpas (referensram). (C) Kakelskanningsbilden erhållen via mikroskopi. (D) En färgkodad karta som visar lokala kollagenstrukturella parametrar vid olika plattor. μp (orientering svart linje) och Pani (bakgrundsfärg) över hela plackprovet presenteras. Förkortningar: μp = dominerande fibervinkel; Pani = anisotrop fraktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Den aktuella studien fokuserade på att utveckla en pipeline för mekano-avbildning för att studera korrelationen mellan den lokala kollagenorienteringen och dispersionen, lokala mekaniska egenskaper och bristningsbeteende hos fibrös aterosklerotisk plackvävnad. Protokollet som beskrivs här är innovativt av flera skäl. För det första är detta första gången som digital bildkorrelation har tillämpats för att mäta den lokala deformationen av fibrös plackvävnad under mekanisk belastning. För det andra tillhandahåller detta protokoll nödvändig information för att analysera sambandet mellan det lokala deformationsmönstret och den lokala kollagenarkitekturen hos den fibrösa plackvävnaden. Betydelsen av den lokala bedömningen betonas av både stamdata och kollagendata som presenteras i resultatavsnittet, som visar vävnadens heterogena natur. Därför rekommenderas användning av tekniker som möjliggör lokal bedömning, såsom de som används i detta protokoll, för framtida studier av fibrösa plackegenskaper.

Testprovberedning är bland de kritiska stegen i detta protokoll. Carotisplack är huvudsakligen kollagenvävnader; De kan dock innehålla förkalkningar som anses påverka det övergripande plackmekaniska beteendet36,37. Eftersom studien fokuserar på den fibrösa vävnadskomponenten i placket undviks förkalkningar i testproverna med hjälp av μCT-avbildning38. Om μCT inte är tillgängligt kan andra avbildningstekniker såsom MRT eller OCT39 övervägas för att detektera de förkalkade områdena i placket. Att erhålla fibrösa vävnadstestprover som är fria från förkalkningar och är av tillräckligt stor storlek som är användbara för mekanisk testning kan vara en utmanande uppgift för plack som är kraftigt förkalkade eller innehåller dispergerade förkalkningar. En annan utmanande uppgift i protokollet är att generera ett optimalt fläckmönster för digital bildkorrelation. Optimal DIC kräver ett svart/vitt förhållande på 50:5028 och fläckar storleken på tre till fem pixlar29 för att säkerställa lämplig kvalitet. Underlåtenhet att uppfylla dessa krav kan leda till felaktiga lokala töjningsmätningar. Slutligen kan kartläggning av bristningsplatsen till SHG-bilderna vara utmanande om de naturliga landmärkena i en vävnad inte är tydliga. För sådana prover kommer applicering av flera fiduciella markörer på vävnaden före avbildning att vara till hjälp.

MPM-SHG-tekniken som används i det nuvarande protokollet är överlägsen många andra kollagenavbildningstekniker, eftersom det är en högupplöst och icke-destruktiv teknik med ett relativt stort penetrationsdjup. Ändå utgör penetrationsdjupet (<400 μm) för MPM-SHG en begränsning, eftersom det inte tillåter avbildning av hela tjockleken på testproverna, som varierade mellan 0,5 och 2 mm. I en nyligen genomförd studie med diffusionstensor magnetisk resonanstomografi (DT-MRI) har vi visat att den dominerande fiberorienteringen i de djupare delarna av plackvävnaden kan skilja sig från den i de mer ytliga, luminala delarna av vävnaden14. Därför är ytterligare studier motiverade för att undersöka den lokala kollagenarkitekturen i de djupare delarna av tjocka fibrösa plackvävnadsprover och dess relation till den lokala vävnadsmekaniken. För detta ändamål kan polariserad rumslig frekvensdomänavbildning (pSFDI) användas. Denna nyligen utvecklade optiska bildteknik rapporterades ha potential att mäta fiberorientering så djupt som 0,8 mm i mitralisklaffblad12. pSFDI erbjuder också en snabb förvärv, vilket också kan underlätta visualisering av hela provområdet istället för bara ett urval av brickor, vilket är fallet i det nuvarande protokollet. En annan begränsning i det nuvarande protokollet är att endast ytdeformation kunde identifieras. I framtida studier kan spegelassisterad multi-view DIC40 eller digital volymkorrelation (DVC)41 inkluderas i detta protokoll för att få ytterligare information om de volymetriska, underjordiska stammarna.

Det nuvarande experimentella protokollet kan utvidgas ytterligare eller modifieras på flera sätt för att få ytterligare information om plackbrottmekanik och dess relation till den underliggande mikrostrukturen. För det första innehåller det nuvarande protokollet enaxlig dragprovning i omkretsriktningen. Denna typ av mekanisk testning valdes eftersom placket övervägande upplever dragsträckning i omkretsriktningen in vivo. För mer omfattande mekanisk karakterisering kan detta protokoll utökas ytterligare för att inkludera inflationstestning, biaxial testning eller enaxlig dragprovning i längdriktningen. För det andra fokuserar det nuvarande protokollet endast på att erhålla lokala stammar genom DIC. En mer fullständig bild av det plackmekaniska beteendet kan dock erhållas genom att även inkludera lokal stressanalys i protokollet, men detta kräver karakterisering av lokal styvhet. Även om det för närvarande är utmanande kan detta uppnås med beräkningstekniker som den inversa finita elementmetoden 42,43 och den virtuella fältmetoden44. Förutom experimentell anpassning kan vissa ytterligare efterbehandlingssteg också läggas till i det nuvarande protokollet. För det första, istället för att bara identifiera brottets plats, kan sprickutbredningsvägen identifieras via de erhållna höghastighetskamerabilderna. Denna förökningsväg kan korreleras med lokala strukturella och mekaniska parametrar. För det andra identifierades brottets initieringsplats visuellt i det beskrivna protokollet. En tidigare studie på icke-biologiska vävnader har använt diskontinuiteter i DIC-stammätningar för att upptäcka bristning45. Att tillämpa sådan automatiserad brottdetektering på plackvävnader kan möjligen förbättra noggrannheten i brottdetekteringen. Slutligen är en stor fördel med MPM-SHG jämfört med andra kollagenavbildningstekniker att det visualiserar enskilda kollagenfibrer. Därför kan data som erhållits via detta protokoll också användas för att undersöka ytterligare lokala kollagenegenskaper, såsom kollageninnehållet.

Detta protokoll kan användas för att ge en bättre förståelse för de lokala egenskaperna hos fibrös plackvävnad, den komponent som mekaniskt misslyckas vid plackbrott in vivo. Denna information behövs för att etablera nya strukturella och funktionella bildmarkörer som förutsäger plackbrott hos patienter. Dessa nya markörer är nödvändiga, eftersom de tidigare föreslagna riskbiomarkörerna har visat sig ha suboptimalt prediktivt värde för framtida kliniska händelser 5,6. I framtiden kan OCT och ps-OCT möjligen identifiera och kvantifiera fibrös vävnad i artärsystemet46,47,48. Dessutom betraktades stam som en surrogatmarkör för lokal placksammansättning49. Således kan stammätningar in vivo 49 potentiellt hjälpa till att identifiera plackstabilitet hos patienter. Man bör dock vara försiktig med att direkt översätta de erhållna resultaten till in vivo plackbrott. För det första upplever den fibrösa plackvävnaden mer komplex belastning in vivo än den enkelriktade dragbelastningen som används i detta protokoll. För det andra är aterosklerotiska plack multikomponentstrukturer; Spännings- och töjningsfördelningarna in vivo i den fibrösa plackvävnaden kan påverkas av närvaron och placeringen av de andra plackkomponenterna, såsom förkalkningar37.

Denna mekano-imaging pipeline kan också användas för att studera andra kollagena vävnader. Global mekanisk testning och strukturell avbildning av kollagen används redan i stor utsträckning för biologiska vävnader. Lokal bedömning av pre-failure och felegenskaper, liksom kollagenarkitektur, är dock avgörande för noggrann mekanisk karakterisering av heterogena fibrösa vävnader. Vi förväntar oss att strukturen i detta nya protokoll kommer att ge ytterligare insikt i samspelet mellan mikrostrukturen och mekaniken hos flera biologiska vävnader.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av ett NWO-Vidi-bidrag (18360).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm extension ring Thorlabs Inc. CML10
15 mL tube VWR 525-0150
20x APO water immersion objective Leica 507701
3D Slicer software N/A Version 4.11
50 mL tubes VWR 525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm Conrad 4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating Thorlabs
Black tissue dye Polysciences inc 24113-2
Camera lens, focal length 50 mm Thorlabs Inc. MVL50M1
Camera stand VWR 241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser Coherent
Compressor + air hose JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62, 4016138577198
Excel Microsoft Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm Pattex
Heating bath N/A Custom made
High-speed camera + imaging software Pixelink-Navitar Inc. PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) N/A
Image J National Institute of Health N/A
LAS-AF Leica Version 2.3 Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II Leica Microscope used for SHG imaging
Lighting system AMZ instruments LED-60TB Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB MathWorks Version R2021A
MATLAB-based FibLab software Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based Ncorr software Georgia Institute of Technology Version 1.2
Needles Emerald BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter) VWR BRND452000
Parafilm VWR 291-1214
Pasteur Pipettes VWR ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm PerkinElmer CLS149276
Ruler Fine Science Tools 1800030
Sandpaper (P180) Conrad 4.00932E+12
Side cutter Conrad 4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184) VWR 634165S
Tensile tester + software + clamps N/A Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver Garant, Hoffman group 659906

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
  2. Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
  3. Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
  4. Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
  5. SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
  6. Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
  7. Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
  8. Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
  9. Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
  10. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
  11. Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
  12. Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
  13. Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
  14. Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
  15. Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
  16. Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
  17. Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
  18. Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
  19. Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
  20. Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
  21. Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
  22. Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
  23. Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
  24. Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
  25. Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
  26. Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
  27. Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
  28. Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
  29. Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
  30. Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
  31. Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
  32. FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
  33. van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  34. Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
  35. NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
  36. Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
  37. Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
  38. Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
  39. Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
  40. Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
  41. Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
  42. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
  43. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
  44. vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
  45. Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
  46. Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
  47. Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
  48. Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
  49. Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

Tags

Bioteknik utgåva 189
En metod för att studera korrelationen mellan lokal kollagenstruktur och mekaniska egenskaper hos fibrös vävnad mot aterosklerotisk plack
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crielaard, H., Guvenir Torun, S.,… More

Crielaard, H., Guvenir Torun, S., Wissing, T. B., de Miguel Muñoz, P., Kremers, G. J., Gijsen, F. J. H., Van Der Heiden, K., Akyildiz, A. C. A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue. J. Vis. Exp. (189), e64334, doi:10.3791/64334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter