Summary
Synovialvæskeanalyse under transmitteret, polariseret og kompenseret lysmikroskopi bruges til at evaluere den inflammatoriske eller ikke-inflammatoriske karakter af en prøve gennem enkle trin. Det er især nyttigt i slidgigt at detektere calciumkrystaller og identificere en mere alvorlig delmængde af slidgigt.
Abstract
Synovialvæske (SF) analyse er vigtig ved diagnosticering af slidgigt (OA). Makroskopiske og mikroskopiske træk, herunder total og differentiel antal hvide blodlegemer (WBC), hjælper med at definere den ikke-inflammatoriske karakter af SF, som er et kendetegn ved OA. Hos patienter med OA overstiger WBC i SF-prøver normalt ikke 2000 celler pr. Mikroliter, og procentdelen af inflammatoriske celler, såsom neutrofiler, er meget lav eller fraværende. Calciumkrystaller er hyppige i SF indsamlet fra OA-patienter. Selvom deres rolle i patogenesen af OA forbliver uklar, har de været forbundet med en mild inflammatorisk proces og en mere alvorlig sygdomsprogression. For nylig er calciumkrystaller blevet beskrevet i både de tidlige og sene stadier af OA, hvilket indikerer, at de kan spille en afgørende rolle i diagnosticering af forskellige kliniske undergrupper af OA og farmakologisk behandling. Det overordnede mål med SF-analyse i OA er todelt: at fastslå den ikke-inflammatoriske grad af SF og at fremhæve tilstedeværelsen af calciumkrystaller.
Introduction
Slidgigt (OA) er en kompleks og multifaktoriel kronisk ledsygdom med en estimeret samlet global prævalens på 16% hos forsøgspersoner i alderen 15 år og derover og 23% hos forsøgspersoner i alderen 40 og derover1. Forekomsten af OA forventes at stige på grund af en aldrende befolkning og en stigning i risikofaktorer, såsom fedme og metabolisk syndrom2.
Blandt de største problemer forbundet med OA er vanskeligheden ved at diagnosticere sygdommen i sine tidlige stadier og aktuelt tilgængelige behandlinger begrænset til smertebehandling og symptomatiske langsomt virkende lægemidler (SYSADOA'er) såsom glycosaminoglycaner. Diagnosen OA er baseret på kliniske symptomer og billeddannelsesfund. Den manglende sammenhæng mellem de to vurderinger kan dog medføre flere års forsinkelse i OA-diagnose og behandlingsstart2. OA er kendetegnet ved degenerative processer og lavgradig inflammation, som let kan undersøges via synovialvæske (SF) analyse. SF er et tyktflydende plasmatisk dialysat rig på hyaluronsyre, som smører ledrummet, giver næringsstoffer og ilt til brusk og fjerner metabolisk affald. SF fungerer også som støddæmper og beskytter dermed leddene under belastning og belastning3.
SF-analyse er en enkel og pålidelig metode, der altid skal udføres under den indledende evaluering af patienter med muskuloskeletale symptomer og ledeffusioner3. Anbefalinger fra American College of Rheumatology, British Society for Rheumatology og andre inkluderer SF-analyse blandt de diagnostiske test for reumatiske sygdomme, der hovedsageligt skal udføres ved evaluering af akut monoarthritis 4,5. Totale og differentielle leukocyttællinger opnået ved SF-analyse giver et øjebliksbillede af den patologiske proces, der forekommer i leddet, og klassificerer således graden af inflammation. Identifikationen af patogene krystaller, såsom mononatriumurat (MSU) og calciumpyrophosphat (CPP) krystaller, under polariseret lys, er afgørende for diagnosticering og behandling af krystalgigt (fx gigt og pseudopodagra). Desuden antyder tilstedeværelsen af mikroorganismer en diagnose af septisk arthritis.
Calciumkrystaller er hyppige i prøver indsamlet fra patienter med OA6. Basiske calciumphosphatkrystaller (BCP) og CPP er blevet rapporteret i henholdsvis ca. 22% og 23% af SF-prøver fra patienter med OA6. Selvom deres rolle forbliver uklar, har disse krystaller været forbundet med mere alvorlige former for OA7 og betragtes som et epifænomen af selve den patologiske proces. Calciumkrystaller er blevet påvist i 100% af vævsprøver fra OA-patienter, der gennemgår knæalloplastik8. Desuden er det blevet antaget, at calciumkrystaller kan være involveret i patogenesen af OA på grund af deres inflammatoriske virkninger, påvist ved flere undersøgelser9 og medieret, i det mindste delvist, af NLRP3-inflammasom10.
For nylig er calciumkrystaller blevet beskrevet i både tidlige og senestadier 6 af OA, hvilket indikerer, at de kan spille en afgørende rolle i diagnosticering af forskellige kliniske undergrupper af OA og farmakologisk behandling.
Det overordnede mål med SF-analyse er todelt: at bestemme den inflammatoriske grad af SF og at diagnosticere krystal eller septisk arthritis ved at identificere specifikke krystaller eller mikroorganismer. Det er et særligt nyttigt, enkelt og pålideligt værktøj til diagnosticering af OA på grund af det typiske ikke-inflammatoriske mønster med en meget lav procentdel eller fravær af neutrofiler.
Fordele i forhold til alternative teknikker
SF-analyse består af enkle procedurer, der inkluderer totale og differentielle leukocyttællinger og krystalsøgning. Manuel celletælling udført af ekspertlaboranter 3,11 forbliver guldstandarden for cytologisk analyse af synoviale og andre kropsvæsker. På grund af den tidskrævende begrænsning og inter- og intraobservatørvariabiliteten af denne metode har automatiserede celletællere gradvist erstattet manuel tælling i store rutinemæssige kliniske laboratorier, hvor blod- og urinanalysatorer er blevet tilpasset for at muliggøre SF-analyse11,12. Ikke desto mindre giver manuel tælling nogle fordele i specifikke indstillinger: (1) i ambulatoriet for at opnå en total og differentiel WBC-værdi til tiden; (2) at identificere celletyper såsom cytofagocytiske mononukleære (Reiter) celler eller ikke-hæmatopoietiske celler såsom synoviocytter, som automatiserede tællere ikke kan genkende; 3) når prøven er for lille til at blive håndteret af instrumentet 4) at oprette lokale laboratorieregistre, der er let tilgængelige til forskningsformål. En anden fordel ved manuel tælling ses insupravital farvning, en metode, der tillader differentiering af celler meget hurtigt og umiddelbart efter glasglasforberedelse. I modsætning hertil kræver traditionelle farvninger, såsom Wright- og May-Grünwald-Giemsa-procedurerne, lufttørrede SF-udstrygninger og tid til at plette cellerne13. Selvom de ikke er egnede til tidsfølsomme rutineanalyser, afslører disse farvningsmetoder mere detaljerede cellepopulationer i prøven, herunder erythrocytter, basofiler, eosinofiler, polymorfonukleære leukocytter, lymfocytter og blodplader.
Endelig udføres rutinemæssig SF-analyse for krystaller ved hjælp af en simpel teknik baseret på polariseret lysmikroskopi, som giver hurtige resultater14. Alternative metoder, såsom scanning og elektronmikroskopi, giver mere nøjagtige og følsomme resultater, men deres anvendelse i daglig klinisk praksis er ikke mulig på grund af høje omkostninger og tidskrævende prøveforberedelse og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er i overensstemmelse med retningslinjerne fra den etiske komité på Padova Universitetshospital. SF blev indsamlet med patientens samtykke fra knæleddene hos patienter, der fik terapeutisk arthrocentese til ledeffusion ved deres første præsentation til klinikken eller som reaktion på en arthritisk opblussen. Kontraindikationer til proceduren var: koagulopati, antikoagulerende medicin, hudlæsioner, dermatitis eller cellulitis, der ligger over leddet. Alle SF-prøver blev afidentificeret.
1. Forberedelse af synovialvæske
- SF-prøverne indsamlet under arthrocentese af hævede led15 overføres til et rør, der indeholder antikoagulant (helst EDTA; se materialetabel) og til et andet rør, der ikke indeholder noget additiv (figur 1).
- I tilfælde af mistanke om infektion overføres aseptisk en del af SF-prøven (~ 1 ml) til dyrkningsflasker til mikrobiologisk testning.
BEMÆRK: Infektion kan mistænkes som følge af både kliniske træk (alvorlig tumor, dolor, calor, functio laesa og til tider feber) og makroskopisk udseende af SF (turbiditet, farve). I dette tilfælde ordinerer lægen en mikrobiologisk analyse, som udføres af et mikrobiologisk laboratorium. - Udfør SF-analyse (trin 2-5), så snart prøven er indsamlet.
2. Makroskopisk undersøgelse
BEMÆRK: Makroskopisk evaluering af SF-prøver består af subjektive, kvalitative og semikvantitative vurderinger. Der er ingen referencestandardskalaer, og der anvendes ingen kontrolprøver.
- Anmærk SF-volumenet udtrykt i milliliter. Definer prøvens farve, som kan variere fra lys til mørk gul. Optag tilstedeværelsen af blod.
- Definer graden af klarhed ved at observere prøven i baggrundsbelysningen og bestemme, hvor let det er at læse en trykt side gennem væskerøret (figur 2A).
- Vurder viskositeten ved at dryppe prøven fra en engangspipette. En lang streng- eller dråbedannelse indikerer henholdsvis god eller dårlig viskositet (figur 2B).
- Tilstedeværelsen af partikler, herunder vævsfragmenter eller fibrin, vurderes ved at observere prøven gennem røret og i baggrundsbelysningen.
3. Mikroskopisk undersøgelse
BEMÆRK: SF-mikroskopisk analyse består af cytologisk undersøgelse, herunder total- og differentialtælling af hvide blodlegemer (WBC) og søgning efter krystaller.
- Bestem det samlede celleantal ved at følge nedenstående trin.
- Bestem det samlede antal leukocytter i SF opsamlet i EDTA-røret ved hjælp af et hæmocytometer (se materialetabel).
- Træk 0,5 μL af SF ud af EDTA-røret ved hjælp af en Malassez-Potain-pipette (mærke 0,5; se materialetabel) (supplerende figur 1). Med den samme pipette tegnes 9,5 μL 0,1 % opløsning af methylenblåt (mærke 11). Den endelige fortynding er 20 gange.
- Bland pipetten ved forsigtig inversion, kassér de første dråber, og hæld synovialvæsken + methylenblåt opløsning i tællekammeret.
- Tæl cellerne i to på hinanden følgende firkanter ud af ni, og multiplicer det opnåede tal med 100 (forenklet formel; Supplerende figur 2). Express WBC'er som antallet af leukocytter pr. Kubikmillimeter.
BEMÆRK: Forenklet formel: Leukocytter (N / mm3) = antallet af tællede celler i to på hinanden følgende kvadrater x 100. - Strukturfondsfonden klassificeres efter det samlede antal WBC'er efter tidligere offentliggjorte rapporter16,17 (tabel 1).
- Udfør differentiel celletælling.
- Bestem procentdelen af polymorfonukleære (PMN) celler, monocytter og lymfocytter ved hjælp af supravital eller traditionel farvning13,18.
- Til supravital farvning anbringes en lille dråbe SF i midten af et brugsklart objektglas, der er forbelagt med cresylviolet og methylenblåt (supplerende figur 3; se materialetabel).
- Dæk med en dæksel, og læg en dråbe mikroskop nedsænkningsolie.
- Forbered et lufttørret SF-udstrygning til traditionel farvning (mindre egnet til rutineanalyse). Sæt en lille dråbe SF i slutningen af et rent dias. Brug et andet dias eller en dæksel til at sprede det langs diaset med en fremadgående bevægelse. Lad udtværingen lufttørre.
- Plet prøven efter en standardprocedure May-Grünwald-Giemsa18.
- Undersøg objektbilledet under olienedsænkningsmålet (1.000x).
- Tæl 100 på hinanden følgende celler og skeln mellem polymorfonukleære celler, monocytter og lymfocytter (figur 3, supplerende figur 4).
- Angiv det samlede antal i hver kategori i procent.
BEMÆRK: For at opnå nøjagtige resultater skal cytologiske undersøgelser udføres, så snart SF er opsamlet eller inden for 24-48 timer efter arthrocentese, når de opbevares korrekt (4 °C).
4. Krystal detektion
- Bestem tilstedeværelsen af patologiske krystaller ved hjælp af et polariseret lysmikroskop udstyret med et ekstra polariserende filter og en rød kompensator19 (se materialetabel).
- Udfør diasforberedelse til krystaldetektion.
- Rengør forsigtigt et glasglas med optisk papir eller blødt papir iført ethanol. Påfør en lille dråbe SF på glasrutschebanen.
- Dæk med et dæksel og læg diaset under mikroskopet.
- Identificer krystallerne.
- Fokuser diaset under mikroskopet ved hjælp af et mål med lav effektforstørrelse. Undersøg omhyggeligt diaset under et lyst felt med et 40x mål. Se inde i og uden for cellerne.
- Identificer krystallerne i henhold til deres størrelse og form (f.eks. rhomboid, nåleformet, stavformet).
- Indsæt polariseringsfilteret mellem lyskilden og prøven. Drej polarisatoren, indtil dens optiske akse er vinkelret på analysatoren (placeret over målene) for at skabe en mørk baggrund.
- Når en dobbeltbrydende krystal er blevet identificeret, indsættes kompensatoren mellem polarisatoren og prøven og flyttes parallelt eller vinkelret på krystallens optiske akse.
- Overhold farven afsløret af krystallen (tabel 2).
BEMÆRK: MSU-krystaller vises nåleformede, stærkt dobbeltbrydende i det mørke felt og viser en gul / orange farve, når deres akse er parallel med kompensatoren. Omvendt er de blå, når de er placeret vinkelret (negativt tegn) (tabel 2; Figur 4). CPP-krystaller er stav- eller romboidelignende krystaller, svagt dobbeltbrydende under polariseret lys og viser en blå eller gul farve, når de er justeret parallelt eller vinkelret på kompensatorens akse (positivt tegn) (tabel 2; Figur 5).
5. Alizarin rød farvning
- Forbered en 2% opløsning af alizarinrød S (pH 4,1-4,3), filtrer opløsningen gennem et 0,22 μm filter, og opbevar den væk fra lys.
- Til forberedelse af objektglasset blandes en dråbe SF med samme mængde alizarinrød opløsning (1:1) på et rent objektglas. Dæk med en dæksel og undersøg ved 400x forstørrelse.
- Identificer krystallerne under mikroskopet.
BEMÆRK: Testen er positiv, når lyse, mørkerøde bundfald er synlige under transmitteret lys med en rund form og koncentriske lag. Under polariseret lys fremstår de stærkt dobbeltbrydende20 (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Store led, der er påvirket af OA, er ofte hævede og producerer betydelige mængder SF, som drænes via arthrocentese15. De makroskopiske egenskaber ved SF evalueret umiddelbart efter arthrocentese indbefatter i det væsentlige mængde, farve, klarhed og viskositet17. På trods af deres lave specificitet giver de foreløbige data om graden af inflammation. Farven afhænger af SF-cellularitet og graden af fragmentering af ekstracellulære matrixmakromolekyler. SF indsamlet fra patienter med OA er lysegul, en nuance, der generelt er forbundet med ikke-inflammatoriske prøver, mens mørkegul er forbundet med inflammatoriske effusioner (figur 2). Tilstedeværelsen af små mængder blod i prøven, for eksempel på grund af kapillærbrud, resulterer i let orange farve. Blodige effusioner skal overvejes nøje, da de kan indikere en potentiel hæmarthrose. Klarhed er et kendetegn ved SF indsamlet fra patienter med OA. Faktisk er ikke-inflammatorisk SF fattig i celler, snavs, hyaluronsyre og fibrinfragmenter, i modsætning til det uklare udseende af inflammatorisk SF (figur 2).
Viskositet repræsenterer et godt inflammatorisk indeks, da det er forbundet med integriteten af matrixmakromolekyler, hovedsageligt hyaluronsyre (figur 2). Disse molekyler depolymeriserer under inflammation, hvilket resulterer i en mindre viskøs SF. Afhængigt af sygdomsstadiet og sværhedsgraden kan viskositeten bevares eller reduceres lidt i OA.
Antallet af leukocytter overstiger aldrig 500-1.000 celler / mm3 i OA, og de er for det meste monocytter (supplerende figur 5A) og andre mononukleære celler som synoviocytter (supplerende figur 5B). Et af de mest relevante og hyppige fund i OA SF vedrører CPP- og BCP-krystaller. CPP-krystaller detekteres let under kompenseret polariseret lysmikroskopi (figur 5), mens identifikationen af BCP-krystaller vanskeliggøres på grund af deres submikroskopiske størrelse (figur 6). Faktisk er længden af en enkelt BCP-krystal mindre end 1 μm, og selvom disse krystaller danner aggregater, fremstår klumperne som ikke-dobbeltbrydende amorfe udseende kugler. Selvom det er uspecifikt, afslører positiv alizarinrød farvning generelt tilstedeværelsen af BCP-krystaller.
I modsætning til pseudopodagra, hvor CPP-krystaller er talrige og forbundet med høje leukocyttal og inflammatoriske kliniske træk, er antallet af CPP-krystaller i SF i OA meget lavt og ikke forbundet med nogen ændret humoristisk respons. Ikke desto mindre viser SF-prøver med CPP- eller BCP-krystaller højere niveauer af inflammatoriske cytokiner sammenlignet med OA uden krystaller21. Uanset WBC-antal er SF'er med krystaller også forbundet med øgede procentdele af PMN-celler5. Fra et klinisk synspunkt kan forholdet mellem calciumkrystaller og inflammation hjælpe med at definere en bestemt delmængde af patienter med øget risiko for at udvikle mere alvorlig sygdom.
Figur 1: Fælles aspiration af et hævet knæ . (A) Arthrocentese udføres efter nøjagtig desinfektion af huden med sterile materialer. SF indsamles i (B) EDTA-rør til total celletælling og (C) ikke-additivrør til differentialcelletælling og krystalsøgning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakteristika for inflammatoriske (venstre) og ikke-inflammatoriske (højre) SF-prøver. (A) Farve og klarhed af inflammatoriske (venstre) og ikke-inflammatoriske (højre) SF-prøver. (B) Viskositeten af en ikke-inflammatorisk SF evalueret gennem "streng" -testen. Laboratoren vurderer længden af "strengen" dannet af en faldende dråbe SF fra en sprøjte eller en pipette. Prøven på billedet giver en lang streng. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: SF-celler observeret i et præfarvet dias . (A) En gruppe polymorfonukleære celler (PMN) med multilobede kerner og to monocytter med deres voluminøse kerner nederst til højre i billedet. (B) PMN-celler og monocytter (M) med en cytofagocytisk mononukleær (CPM) celle i midten af billedet. Lyst felt; 1.000x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Intracellulær MSU-krystal. Krystallen danner en typisk nåleform vist under (A) transmitteret, (B) polariseret og (C) kompenseret polariseret lys (400x). Pilen angiver orienteringen af λ-filteret (kompensatoren), som er parallelt med krystalens lange akse. I denne konfiguration vises krystallen gul/orange. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Intracellulær CPP-krystal. Krystallen er vist under (A) transmitteret, (B) polariseret og (C) kompenseret lys (400x). Pilen angiver orienteringen af λ-filteret (kompensatoren), som er parallelt med krystalens lange akse. I denne konfiguration vises krystallen blå. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Positivitet til den alizarinrøde test af en SF fra OA, 400x. Røde bundfald er synlige under transmitteret lys (venstre panel) og polariseret lys (højre panel), 400x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Grad af inflammation af SF i henhold til det samlede antal leukocytter. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Farver udstillet af MSU- og CPP-krystaller under kompenseret polariseret lys og tegn på dobbeltbrydning. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende figur 1: Blodfortyndende pipetter ifølge Malassez-Potain for leukocytter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Opstillingen af kammergitteret til WBC-tælling. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Farvede, brugsklare dias til hurtig og nem differentiel WBC-morfologievaluering. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: May-Grünwald-Giemsa-farvning af en SF-udtværing. Eosinofile granulater er tydeligt synlige (pil), 1.000x forstørrelse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: Monocytter og synoviocytter indsamlet fra en SF-prøve. (A) Monocyt fra en SF-prøve indsamlet fra en patient med slidgigt (1.000x). (B) Synoviocytter fra en SF-prøve indsamlet fra en patient med slidgigt (1.000x). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I OA hjælper SF-analyse med at definere sygdomskarakteristika gennem enkle trin: totale og differentielle leukocyttal og søgning efter krystaller, herunder CPP og BCP. Desuden kan påvisning af MSU-krystaller fremhæve vigtige comorbiditeter.
På trods af lave omkostninger og enkel udførelse kan testens følsomhed og pålideligheden af resultaterne blive påvirket på grund af uerfarne analytikere - hovedsageligt da det vedrører krystalidentifikation. Analytikerens uddannelse og erfaring er afgørende for at skelne formen og dobbeltbrydningen af CPP- og MSU-krystaller og matche deres form til deres grad af dobbeltbrydning. Nogle undersøgelser har rapporteret uoverensstemmelser i krystalidentifikation mellem forskellige laboratorier; Derfor er uddannelse af laboranter afgørende for at opnå pålidelige og konsistente resultater14. Krystalidentifikation påvirkes også af fejlfortolkning af dobbeltbrydende partikler, der kan forveksles med patogene krystaller. Disse kan stamme fra eksterne kilder (dvs. støv eller fibre) eller kan være til stede inde i ledhulen (dvs. kortikosteroider eller lipider). En grundig rengøring af rutsjebanen kan løse førstnævnte, men sidstnævnte kan kun overvindes gennem træning og erfaring14.
En anden begrænsning af SF-analyse vedrører brugen af alizarin rød farvning til BCP-identifikation. Som tidligere nævnt er dette ikke en specifik test, og der skal derfor udvises forsigtighed ved fortolkning af resultater. Analytikeren skal være i stand til at genkende røde bundfald med en ejendommelig morfologi (figur 11). Mere følsomme teknikker, såsom scanning elektronmikroskopi (SEM), kan bruges til at identificere BCP-krystaller, men de bruges ikke i rutinemæssige undersøgelser af SF i daglig klinisk praksis. Det er vigtigt, at det har vist sig, at resultater opnået med alizarin rød farvning viser en god, omend ikke optimal, overensstemmelse med dem, der opnås ved SEM22, hvilket øger værdien af førstnævnte.
Et andet fremtrædende spørgsmål at overveje er, hvad man skal gøre, når arthrocentese giver meget små mængder SF, og hvordan man opbevarer prøven. Når kun nogle få dråber SF opsamles fra små led, såsom inter- og metacarpophalangeale led og håndleddet, anbefales det at holde materialet i sprøjten og sprede det direkte på et rent glasglas. Ved hjælp af en mikropipette og nogle tricks er det muligt at forberede mere end et dias og udføre en komplet analyse. I detaljer tegner analytikeren SF med tællepipetten fra diaset, der er forberedt til krystalsøgning, og forbereder hæmacytometerkammeret, mens nogle mikroliter kan aspireres til den supravitale farvning.
Hvad angår opbevaring, nedbrydes SF-prøver over tid, og analysen heraf kræver friske præparater for at opnå pålidelige resultater. Alternativt kan SF konserveres ved 4 °C og anvendes inden for 24 timer og senest 48 timer til cytologisk undersøgelse. For at undgå celleklumpning og SF-koagulation skal man være opmærksom på at samle prøven i mindst et EDTA-rør. Frosne SF-prøver, der opbevares ved -20 °C i længere tid, kan kun anvendes til krystalsøgning.
SF-analyse er en uerstattelig patognomonisk test inden for reumatologi på grund af dens anvendelighed, enkelhed i udførelse og overkommelighed. Den største udfordring for fremtidige anvendelser af SF-analyse er en mere nøjagtig diagnose af reumatiske sygdomme. Dette vil være muligt ved at integrere denne metode med mere avancerede og innovative teknologier23, hvilket gør det muligt at karakterisere SF-sammensætning og identificere specifikke molekylære biomarkører og proteomics på inflammationsstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere afslører ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende professor Leonardo Punzi for hans dyrebare mentorskab inden for synovialvæskeanalyse og Padova Universitetshospital for dets støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red S | Merck | A5533 | For BCP crystal search |
| Burker chamber | Merck | BR718905 | For total white blood cell count |
| Cover glasses | Merck | C7931 | For microscopic examination |
| EDTA tubes | BD | 368861 | For SF collection |
| Glass slides | Merck | S8902 | For crystal search |
| Lambda filter (compensator) | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Malassez-Potain pipette | Artiglass | 54830000 | For dilution of synovial fluid |
| Methylene blue solution | Merck | 3978 | For total white blood cell count |
| Polarized microscope | Leica, Nikon, others | Depending on the model and company | For complete synovial fluid analysis |
| Polarizing lens | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Testsimplet | Waldeck | 14386 | Supravital staining for cell differentiation |
References
- Cui, A., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29, 100587 (2020).
- Hunter, D. J., Bierma-Zeinstra, S.
- Mandell, B. F. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. (2022).
- Schmerling, R. H. Guidelines for the initial evaluation of the adult patient with acute musculoskeletal symptoms. Arthritis & Rheumatism. 39 (1), 1-8 (1996).
- Coakley, G., et al. RCGP and BSAC guidelines for management of the hot swollen joint in adults. Rheumatology. 45 (8), 1039-1041 (2006).
- Frallonardo, P., et al. Basic calcium phosphate and pyrophosphate crystals in early and late osteoarthritis: relationship with clinical indices and inflammation. Clinical Rheumatology. 37 (10), 2847-2853 (2018).
- Nalbant, S., et al. Synovial fluid features and their relations to osteoarthritis severity: new findings from sequential studies. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 50-54 (2003).
- Fuerst, M., et al. Calcification of articular cartilage in human osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 60 (9), 2694-2703 (2009).
- Campillo-Gimenez, L., et al. Inflammatory potential of four different phases of calcium pyrophosphate relies on NF-κB activation and MAPK pathways. Frontiers in Immunology. 9, 2248 (2018).
- Pazár, B. Basic calcium phosphate crystals induce monocyte/macrophage IL-1β secretion through the NLRP3 inflammasome in vitro. The Journal of Immunology. 186 (4), 2495-2502 (2011).
- Martín, M. J. A., et al. Automated cell count in body fluids: a review. Advances in Laboratory Medicine. 2, 149-161 (2021).
- Seghezzi,, et al. Optimization of cellular analysis of synovial fluids by optical microscopy and automated count using the Sysmex XN body fluid mode. Clinica Chimica Acta. 462, 41-48 (2016).
- Reginato, A. J., Maldonado, I., Reginato, A. M., Falasca, G. F., O'Connor, C. R. Supravital staining of synovial fluid with Testsimplets. Diagnostic Cytopathology. 8 (2), 147-152 (1992).
- Lumbreras, B., et al. Analysis for crystals in synovial fluid: training of the analysts results in high consistency. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (4), 612-615 (2005).
- Tieng, A., Franchin, G.
- Punzi, L., Oliviero, F. Arthrocentesis and synovial fluid analysis in clinical practice: value of sonography in difficult cases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1154 (1), 152-158 (2009).
- Schumacher, H. R., Reginato, A. J. Atlas of Synovial Fluid Analysis and Crystal Identification. , Lea & Febiger. Philadelphia. (1991).
- Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A. Detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
- Oliviero, F., Punzi, L. Basics of Polarized Light Microscopy. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. 79-90 (2022).
- Paul, H., Reginato, A. J., Schumacher, H. R. Alizarin red S staining as a screening test to detect calcium compounds in synovial fluid. Arthritis & Rheumatism. 26 (2), 191-200 (1983).
- Favero, M., et al. Synovial fluid fetuin-A levels in patients affected by osteoarthritis with or without evidence of calcium crystals. Rheumatology. 58 (4), 729-730 (2019).
- Frallonardo, P., et al. Detection of calcium crystals in knee osteoarthritis synovial fluid: a comparison between polarized light and scanning electron microscopy. Journal of Clinical Rheumatology. 22 (7), 369-371 (2016).
- Peffers, M. J., Smagul, A., Anderson, J. R. Proteomic analysis of synovial fluid: current and potential uses to improve clinical outcomes. Expert Review of Proteomics. 16 (4), 287-302 (2019).
