Summary
Die Synovialflüssigkeitsanalyse unter Durchlicht-, Polarisations- und Kompensationslichtmikroskopie wird verwendet, um die entzündliche oder nicht-entzündliche Natur einer Probe in einfachen Schritten zu bewerten. Es ist besonders nützlich bei Arthrose, um Kalziumkristalle zu erkennen und eine schwerere Untergruppe der Arthrose zu identifizieren.
Abstract
Die Analyse der Synovialflüssigkeit (SF) ist wichtig für die Diagnose von Arthrose (OA). Makroskopische und mikroskopische Merkmale, einschließlich der Gesamtzahl und der Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (WBC), tragen dazu bei, die nicht-entzündliche Natur der SF zu definieren, die ein Kennzeichen von Arthrose ist. Bei Patienten mit Arthrose überschreitet der Leukozytengehalt in SF-Proben in der Regel nicht 2000 Zellen pro Mikroliter, und der Anteil an Entzündungszellen, wie z. B. Neutrophilen, ist sehr gering oder fehlt. Kalziumkristalle sind häufig in SF von Arthrose-Patienten enthalten. Obwohl ihre Rolle in der Pathogenese der Arthrose noch unklar ist, wurden sie mit einem milden Entzündungsprozess und einem schwereren Krankheitsverlauf in Verbindung gebracht. In jüngster Zeit wurden Kalziumkristalle sowohl im Früh- als auch im Spätstadium der Arthrose beschrieben, was darauf hindeutet, dass sie eine wichtige Rolle bei der Diagnose verschiedener klinischer Untergruppen von Arthrose und der pharmakologischen Behandlung spielen können. Das übergeordnete Ziel der SF-Analyse bei Arthrose ist zweierlei: die Bestimmung des nicht-entzündlichen Grades der SF und die Hervorhebung des Vorhandenseins von Kalziumkristallen.
Introduction
Arthrose (OA) ist eine komplexe und multifaktorielle chronische Gelenkerkrankung mit einer geschätzten Gesamtprävalenz von 16 % bei Personen ab 15 Jahren und 23 % bei Personen ab 40 Jahren1. Es wird erwartet, dass die Inzidenz von Arthrose aufgrund einer alternden Bevölkerung und einer Zunahme von Risikofaktoren wie Fettleibigkeit und metabolischem Syndromzunehmen wird 2.
Zu den Hauptproblemen im Zusammenhang mit Arthrose gehören die Schwierigkeit, die Krankheit in ihren frühen Stadien zu diagnostizieren, und die derzeit verfügbaren Behandlungen, die sich auf die Schmerzbehandlung und symptomatische langsam wirkende Medikamente (SYSADOAs) wie Glykosaminoglykane beschränken. Die Diagnose einer Arthrose basiert auf klinischen Symptomen und bildgebenden Befunden. Die fehlende Korrelation zwischen den beiden Beurteilungen kann jedoch zu einer jahrelangen Verzögerung der OA-Diagnose und des Behandlungsbeginns führen2. Arthrose ist gekennzeichnet durch degenerative Prozesse und geringgradige Entzündungen, die durch eine Synovialflüssigkeitsanalyse (SF) leicht untersucht werden können. SF ist ein viskoses plasmatisches Dialysat, das reich an Hyaluronsäure ist, die den Gelenkspalt schmiert, den Knorpel mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt und Stoffwechselabfälle entfernt. SF wirkt auch als Stoßdämpfer und schützt so die Gelenke bei Belastung und Beanspruchung3.
Die SF-Analyse ist eine einfache und zuverlässige Methode, die bei der Erstabklärung von Patienten mit muskuloskelettalen Symptomen und Gelenkergüssen immer durchgeführt werden muss3. Zu den Empfehlungen des American College of Rheumatology, der British Society for Rheumatology und anderer gehört die SF-Analyse zu den diagnostischen Tests für rheumatische Erkrankungen, die hauptsächlich bei der Beurteilung der akuten Monoarthritis durchgeführt werden müssen 4,5. Die Gesamt- und Differentialleukozytenzahlen aus der SF-Analyse liefern eine Momentaufnahme des pathologischen Prozesses im Gelenk und klassifizieren so den Grad der Entzündung. Die Identifizierung von pathogenen Kristallen wie Mononatriumurat (MSU) und Calciumpyrophosphat (CPP)-Kristallen unter polarisiertem Licht ist für die Diagnose und Behandlung von Kristallarthritis (z. B. Gicht und Pseudogicht) von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus deutet das Vorhandensein von Mikroorganismen auf die Diagnose einer septischen Arthritis hin.
Kalziumkristalle sind häufig in Proben, die von Patienten mit Arthrose6 entnommen werden. Basische Calciumphosphat (BCP)-Kristalle und CPP wurden in etwa 22 % bzw. 23 % der SF-Proben von Patienten mit Arthrose6 berichtet. Obwohl ihre Rolle noch unklar ist, wurden diese Kristalle mit schwereren Formen von OA7 in Verbindung gebracht und gelten als Epiphänomen des pathologischen Prozesses selbst. Kalziumkristalle wurden in 100 % der Gewebeproben von OA-Patienten nachgewiesen, die sich einer Knieprothese unterzogen haben8. Darüber hinaus wurde die Hypothese aufgestellt, dass Kalziumkristalle aufgrund ihrer entzündlichen Wirkung an der Pathogenese der Arthrose beteiligt sein könnten, was durch mehrere Studien9 nachgewiesen und zumindest teilweise durch das NLRP3-Inflammasom10 vermittelt wurde.
In jüngerer Zeit wurden Kalziumkristalle sowohl im Früh- als auch im Spätstadium6 der Arthrose beschrieben, was darauf hindeutet, dass sie eine wichtige Rolle bei der Diagnose verschiedener klinischer Untergruppen von Arthrose und der pharmakologischen Behandlung spielen könnten.
Das übergeordnete Ziel der SF-Analyse ist zweierlei: die Bestimmung des Entzündungsgrades der SF und die Diagnose von Kristall- oder septischer Arthritis durch die Identifizierung spezifischer Kristalle oder Mikroorganismen. Es ist ein besonders nützliches, einfaches und zuverlässiges Werkzeug bei der Diagnose von Arthrose, da es ein typisches nicht-inflammatorisches Muster mit einem sehr geringen Prozentsatz oder Abwesenheit von Neutrophilen aufweist.
Vorteile gegenüber alternativen Techniken
Die SF-Analyse besteht aus einfachen Verfahren, die die Gesamt- und Differentialleukozytenzahl und die Kristallsuche umfassen. Die manuelle Zellzählung durch erfahrene Labortechniker 3,11 ist nach wie vor der Goldstandard für die zytologische Analyse von Synovialflüssigkeiten und anderen Körperflüssigkeiten. Aufgrund der zeitaufwändigen Beschränkung und der Variabilität zwischen und innerhalb der Beobachter dieser Methode haben automatisierte Zellzähler jedoch nach und nach die manuelle Zählung in großen klinischen Routinelabors ersetzt, in denen Blut- und Urinanalysatoren für die SF-Analyse angepasst wurden11,12. Nichtsdestotrotz bietet die manuelle Zählung in bestimmten Situationen einige Vorteile: (1) im ambulanten Bereich, um rechtzeitig einen Gesamt- und differentiellen Leukozytenwert zu erhalten; (2) Zelltypen wie zytophagozytäre mononukleäre (Reiter) Zellen oder nicht-hämatopoetische Zellen wie Synoviozyten zu identifizieren, die automatisierte Zähler nicht erkennen können; (3) wenn die Probe zu klein ist, um vom Gerät gehandhabt zu werden; (4) Einrichtung von lokalen Laborregistern, die für Forschungszwecke leicht zugänglich sind. Ein weiterer Vorteil der manuellen Zählung ist die Insupravital-Färbung, eine Methode, die eine sehr schnelle und unmittelbare Differenzierung von Zellen nach der Glasobjektträgerpräparation ermöglicht. Im Gegensatz dazu erfordern herkömmliche Färbeverfahren, wie z. B. das Wright- und das May-Grünwald-Giemsa-Verfahren, luftgetrocknete SF-Abstriche und Zeit zum Färben der Zellen13. Obwohl diese Färbemethoden nicht für zeitkritische Routineanalysen geeignet sind, zeigen sie detailliertere Zellpopulationen in der Probe, darunter Erythrozyten, Basophile, Eosinophile, polymorphkernige Leukozyten, Lymphozyten und Blutplättchen.
Schließlich wird die routinemäßige SF-Analyse für Kristalle mit einer einfachen Technik durchgeführt, die auf der Polarisationsmikroskopie basiert und schnelle Ergebnisse liefert14. Alternative Methoden wie Raster- und Elektronenmikroskopie liefern genauere und empfindlichere Ergebnisse, deren Einsatz im klinischen Alltag jedoch aufgrund der hohen Kosten und der zeitaufwändigen Probenvorbereitung und -analyse nicht realisierbar ist.
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Protocol
Das vorliegende Protokoll entspricht den Richtlinien der Ethikkommission des Universitätskrankenhauses Padua. SF wurde mit Einverständnis des Patienten aus den Kniegelenken von Patienten entnommen, die eine therapeutische Arthrozentese für Gelenkergüsse bei der Erstvorstellung in der Klinik oder als Reaktion auf einen arthritischen Schub erhielten. Kontraindikationen für den Eingriff waren: Gerinnungsstörungen, gerinnungshemmende Medikamente, Hautläsionen, Dermatitis oder Cellulitis über dem Gelenk. Alle SF-Proben wurden deidentifiziert.
1. Vorbereitung der Synovialflüssigkeit
- Die bei der Arthrozentese der geschwollenen Gelenke15 entnommenen SF-Proben werden in ein Röhrchen mit Antikoagulans (vorzugsweise EDTA; siehe Materialtabelle) und in ein zweites Röhrchen ohne Zusatzstoffe überführt (1).
- Bei Verdacht auf eine Infektion wird ein Teil der SF-Probe (~ 1 ml) zur mikrobiologischen Untersuchung aseptisch in Kulturflaschen umgefüllt.
HINWEIS: Der Verdacht auf eine Infektion kann sowohl aufgrund klinischer Merkmale (schwerer Tumor, Dolor, Calor, functio laesa und manchmal Fieber) als auch aufgrund des makroskopischen Erscheinungsbildes der SF (Trübung, Farbe) bestehen. In diesem Fall verordnet der Arzt eine mikrobiologische Analyse, die von einem mikrobiologischen Labor durchgeführt wird. - Führen Sie eine SF-Analyse (Schritte 2-5) durch, sobald die Probe entnommen ist.
2. Makroskopische Untersuchung
HINWEIS: Die makroskopische Bewertung von SF-Proben besteht aus subjektiven, qualitativen und semiquantitativen Bewertungen. Es gibt keine Referenzstandardskalen und es werden keine Kontrollproben verwendet.
- Kommentieren Sie das SF-Volumen, ausgedrückt in Millilitern. Definieren Sie die Farbe des Musters, die von blass bis dunkelgelb reichen kann. Zeichnen Sie das Vorhandensein von Blut auf.
- Definieren Sie den Grad der Klarheit, indem Sie die Probe im Gegenlicht beobachten und bestimmen, wie leicht eine gedruckte Seite durch den Flüssigkeitsschlauch gelesen werden kann (Abbildung 2A).
- Beurteilen Sie die Viskosität, indem Sie die Probe aus einer Einwegpipette tropfen lassen. Eine lange Faden- oder Tropfenbildung weist auf eine gute bzw. schlechte Viskosität hin (Abbildung 2B).
- Beurteilen Sie das Vorhandensein von partikulären Materialien, einschließlich Gewebefragmenten oder Fibrin, indem Sie die Probe durch das Röhrchen und im Gegenlicht beobachten.
3. Mikroskopische Untersuchung
HINWEIS: Die mikroskopische SF-Analyse besteht aus einer zytologischen Untersuchung, einschließlich der Gesamt- und Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) und der Suche nach Kristallen.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Leukozyten in der SF, die im EDTA-Röhrchen gesammelt wurden, mit einem Hämozytometer (siehe Materialtabelle).
- Entnahme von 0,5 μl SF aus dem EDTA-Röhrchen mit einer Malassez-Potain-Pipette (Markierung 0,5; siehe Materialtabelle) (ergänzende Abbildung 1). Entnehmen Sie mit derselben Pipette 9,5 μl 0,1%ige Methylenblaulösung (Markierung 11). Die Endverdünnung beträgt das 20-fache.
- Mischen Sie die Pipette durch sanfte Inversion, verwerfen Sie die ersten Tropfen und gießen Sie die Synovialflüssigkeit + Methylenblaulösung in die Zählkammer.
- Zählen Sie die Zellen in zwei aufeinanderfolgenden Quadraten von neun und multiplizieren Sie die erhaltene Zahl mit 100 (vereinfachte Formel; Ergänzende Abbildung 2). Drücken Sie Leukozyten als Anzahl der Leukozyten pro Kubikmillimeter aus.
HINWEIS: Vereinfachte Formel: Leukozyten (N/mm3) = die Anzahl der gezählten Zellen in zwei aufeinanderfolgenden Quadraten x 100. - Klassifizieren Sie die SF nach der Gesamtzahl der Leukozyten nach den zuvor veröffentlichten Berichten16,17 (Tabelle 1).
- Führen Sie eine differentielle Zellzählung durch.
- Bestimmen Sie den prozentualen Anteil an polymorphkernigen (PMN) Zellen, Monozyten und Lymphozyten mittels supravitaler oder herkömmlicher Färbung13,18.
- Für die supravitale Färbung geben Sie einen kleinen Tropfen SF in die Mitte eines gebrauchsfertigen Objektträgers, der mit Kresylviolett und Methylenblau vorbeschichtet ist (ergänzende Abbildung 3; siehe Materialtabelle).
- Mit einem Deckglas abdecken und einen Tropfen Mikroskop-Immersionsöl aufgeben.
- Bereiten Sie einen luftgetrockneten SF-Abstrich für die herkömmliche Färbung vor (weniger geeignet für die Routineanalyse). Geben Sie einen kleinen Tropfen SF an das Ende einer sauberen Folie. Verteilen Sie es mit einem zweiten Objektträger oder einem Deckglas mit einer Vorwärtsbewegung entlang des Objektträgers. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen.
- Färben Sie die Probe nach einem Standardverfahren von May-Grünwald-Giemsa18.
- Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Ölimmersionsobjektiv (1.000x).
- Zählen Sie 100 aufeinanderfolgende Zellen und unterscheiden Sie zwischen polymorphkernigen Zellen, Monozyten und Lymphozyten (Abbildung 3, ergänzende Abbildung 4).
- Geben Sie die Gesamtzahl in jeder Kategorie als Prozentsatz an.
Anmerkungen: Um genaue Ergebnisse zu erhalten, müssen zytologische Untersuchungen durchgeführt werden, sobald die SF entnommen wird, oder innerhalb von 24-48 Stunden nach der Arthrozentese, wenn sie ordnungsgemäß gelagert wird (4 °C).
4. Kristall-Detektion
- Bestimmen Sie das Vorhandensein pathologischer Kristalle mit einem Polarisationsmikroskop, das mit einem zusätzlichen Polarisationsfilter und einem Rotkompensator19 ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie die Objektträgervorbereitung für die Kristalldetektion durch.
- Reinigen Sie einen Objektträger vorsichtig mit optischem Papier oder weichem Papier, das mit Ethanol getränkt ist. Tragen Sie einen kleinen Tropfen SF auf den Objektträger auf.
- Decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab und legen Sie ihn unter das Mikroskop.
- Identifiziere die Kristalle.
- Fokussieren Sie den Objektträger unter dem Mikroskop mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung. Untersuchen Sie den Objektträger sorgfältig unter einem hellen Feld mit einem 40x-Objektiv. Schauen Sie innerhalb und außerhalb der Zellen.
- Identifizieren Sie die Kristalle anhand ihrer Größe und Form (z. B. rautenförmig, nadelförmig, stäbchenförmig).
- Setzen Sie den Polarisationsfilter zwischen der Lichtquelle und der Probe ein. Drehen Sie den Polarisator, bis seine optische Achse senkrecht zum Analysator steht (über den Objektiven), um einen dunklen Hintergrund zu erzeugen.
- Sobald ein doppelbrechender Kristall identifiziert wurde, setzen Sie den Kompensator zwischen Polarisator und Probe ein und bewegen Sie ihn parallel oder senkrecht zur optischen Achse des Kristalls.
- Beobachten Sie die Farbe, die der Kristall zeigt (Tabelle 2).
HINWEIS: MSU-Kristalle erscheinen nadelförmig, hell doppelbrechend im Dunkelfeld und zeigen eine gelbe/orange Farbe, wenn ihre Achse parallel zum Kompensator verläuft. Umgekehrt sind sie blau, wenn sie senkrecht positioniert sind (negatives Vorzeichen) (Tabelle 2; Abbildung 4). CPP-Kristalle sind stäbchen- oder rautenartige Kristalle, die unter polarisiertem Licht schwach doppelbrechend sind und eine blaue oder gelbe Farbe aufweisen, wenn sie parallel bzw. senkrecht zur Achse des Kompensators ausgerichtet sind (positives Vorzeichen) (Tabelle 2; Abbildung 5).
5. Alizarin-Rotfärbung
- Bereiten Sie eine 2%ige Lösung von Alizarinrot S (pH 4,1-4,3) vor, filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter und lagern Sie sie lichtgeschützt.
- Mischen Sie zur Vorbereitung des Objektträgers einen Tropfen SF mit dem gleichen Volumen Alizarinrotlösung (1:1) auf einem sauberen Objektträger. Mit einem Deckglas abdecken und bei 400-facher Vergrößerung untersuchen.
- Identifiziere die Kristalle unter dem Mikroskop.
Anmerkungen: Der Test ist positiv, wenn helle, dunkelrote Ausscheidungen unter Durchlicht mit runder Form und konzentrischen Schichten sichtbar sind. Unter polarisiertem Licht erscheinen sie stark doppelbrechend20 (Abbildung 6).
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Representative Results
Große Gelenke, die von Arthrose betroffen sind, sind oft geschwollen und produzieren erhebliche Mengen an SF, die über eine Arthrozentese abgeleitet werden15. Zu den makroskopischen Merkmalen der SF, die unmittelbar nach der Arthrozentese ausgewertet werden, gehören im Wesentlichen die Menge, Farbe, Klarheit und Viskosität17. Trotz ihrer geringen Spezifität liefern sie vorläufige Daten über den Grad der Entzündung. Die Farbe hängt von der SF-Zellularität und dem Grad der Fragmentierung der Makromoleküle der extrazellulären Matrix ab. Die SF von Patienten mit Arthrose ist blassgelb, ein Farbton, der im Allgemeinen mit nicht-entzündlichen Proben in Verbindung gebracht wird, während dunkelgelb mit entzündlichen Ergüssen in Verbindung gebracht wird (Abbildung 2). Das Vorhandensein geringer Blutmengen in der Probe, z. B. aufgrund von Kapillarrupturen, führt zu einer leicht orangefarbenen Farbe. Blutergüsse müssen sorgfältig abgewogen werden, da sie auf eine mögliche Hämarthrose hinweisen können. Klarheit ist ein Kennzeichen von SF, das von Patienten mit Arthrose erhoben wird. Tatsächlich ist die nicht-entzündliche SF arm an Zellen, Trümmern, Hyaluronsäure und Fibrinfragmenten, im Gegensatz zum trüben Erscheinungsbild der entzündlichen SF (Abbildung 2).
Die Viskosität stellt einen guten Entzündungsindex dar, da sie mit der Integrität von Matrixmakromolekülen, hauptsächlich Hyaluronsäure, verbunden ist (Abbildung 2). Diese Moleküle depolymerisieren während der Entzündung, was zu einer weniger viskosen SF führt. Je nach Krankheitsstadium und Schweregrad kann die Viskosität bei Arthrose erhalten oder leicht reduziert werden.
Die Anzahl der Leukozyten übersteigt bei der Arthrose nie 500-1.000 Zellen/mm3, und es handelt sich hauptsächlich um Monozyten (ergänzende Abbildung 5A) und andere mononukleäre Zellen wie Synoviozyten (ergänzende Abbildung 5B). Einer der relevantesten und häufigsten Befunde in OA SF betrifft CPP- und BCP-Kristalle. CPP-Kristalle lassen sich unter kompensierter Polarisationsmikroskopie leicht nachweisen (Abbildung 5), während die Identifizierung von BCP-Kristallen aufgrund ihrer submikroskopischen Größe erschwert wird (Abbildung 6). Tatsächlich beträgt die Länge eines einzelnen BCP-Kristalls weniger als 1 μm, und obwohl diese Kristalle Aggregate bilden, erscheinen die Klumpen als nicht doppelbrechende amorph aussehende Kügelchen. Obwohl unspezifisch, zeigt eine positive Alizarinrotfärbung im Allgemeinen das Vorhandensein von BCP-Kristallen.
Im Gegensatz zur Pseudogicht, bei der CPP-Kristalle zahlreich sind und mit hohen Leukozytenzahlen und entzündlichen klinischen Merkmalen assoziiert sind, ist die Anzahl der CPP-Kristalle bei SF bei Arthrose sehr gering und nicht mit einer veränderten humoralen Reaktion verbunden. Nichtsdestotrotz weisen SF-Proben mit CPP- oder BCP-Kristallen im Vergleich zu OA ohne Kristalle höhere Konzentrationen an inflammatorischen Zytokinen auf21. Unabhängig von der Leukozytenzahl sind SFs mit Kristallen auch mit einem erhöhten Prozentsatz an PMN-Zellen assoziiert5. Aus klinischer Sicht kann die Beziehung zwischen Kalziumkristallen und Entzündungen dazu beitragen, eine bestimmte Untergruppe von Patienten mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer schwereren Erkrankung zu definieren.
Abbildung 1: Gelenkaspiration eines geschwollenen Knies . (A) Die Arthrozentese wird nach sorgfältiger Desinfektion der Haut mit sterilen Materialien durchgeführt. Die SF wird in (B) EDTA-Röhrchen für die Gesamtzellzahl und (C) No-Additiv-Röhrchen für die differentielle Zellzahl und Kristallsuche gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Charakteristika von entzündlichen (links) und nicht-entzündlichen (rechts) SF-Proben. (A) Farbe und Klarheit von entzündlichen (links) und nicht-entzündlichen (rechts) SF-Proben. (B) Die Viskosität einer nicht-entzündlichen SF, die durch den "String"-Test bewertet wird. Der Laborator bewertet die Länge der "Schnur", die durch einen fallenden Tropfen SF aus einer Spritze oder einer Pipette gebildet wird. Das Beispiel in der Abbildung erzeugt eine lange Zeichenfolge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: SF-Zellen, die in einem vorgefärbten Objektträger beobachtet wurden . (A) Eine Gruppe von polymorphkernigen (PMN) Zellen mit mehrlappigen Kernen und zwei Monozyten mit ihren voluminösen Kernen in der unteren rechten Seite des Bildes. (B) PMN-Zellen und Monozyten (M) mit einer zytophagozytischen mononukleären (CPM) Zelle in der Bildmitte. Helles Feld; 1.000-fache Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Intrazellulärer MSU-Kristall. Der Kristall bildet eine typische Nadelform, die unter (A) transmittiertes, (B) polarisiertes und (C) kompensiertes polarisiertes Licht (400x) dargestellt ist. Der Pfeil zeigt die Ausrichtung des λ-Filters (Kompensator) an, die parallel zur Längsachse des Kristalls verläuft. In dieser Konfiguration erscheint der Kristall gelb/orange. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Intrazellulärer CPP-Kristall. Der Kristall ist unter (A) transmittiertes, (B) polarisiertes und (C) kompensiertes Licht (400x) dargestellt. Der Pfeil zeigt die Ausrichtung des λ-Filters (Kompensator) an, die parallel zur Längsachse des Kristalls verläuft. In dieser Konfiguration erscheint der Kristall blau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Positivität des Alizarin-Rot-Tests einer SF von OA, 400x. Rote Ausscheidungen sind unter Durchlicht (linkes Bild) und polarisiertem Licht (rechtes Bild) bei 400-facher Vergrößerung sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Entzündungsgrad der SF in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der Leukozyten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Farben von MSU- und CPP-Kristallen unter kompensiertem polarisiertem Licht und Anzeichen von Doppelbrechung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Blutverdünnende Pipetten nach Malassez-Potain für Leukozyten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Das Layout des Kammerrasters für die Leukozytenzählung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Vorgefärbte, gebrauchsfertige Objektträger für eine schnelle und einfache Beurteilung der differentiellen Leukozytenmorphologie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: May-Grünwald-Giemsa-Färbung eines SF-Abstrichs. Eosinophile Granula sind deutlich sichtbar (Pfeil), 1.000-fache Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 5: Monozyten und Synoviozyten aus einer SF-Probe. (A) Monozyten aus einer SF-Probe, die von einem Patienten mit Arthrose entnommen wurde (1.000x). (B) Synoviozyten aus einer SF-Probe, die von einem Patienten mit Arthrose entnommen wurde (1.000x). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Bei der Arthrose hilft die SF-Analyse bei der Definition von Krankheitsmerkmalen durch einfache Schritte: Gesamt- und Differentialleukozytenzahl und Suche nach Kristallen, einschließlich CPP und BCP. Darüber hinaus kann der Nachweis von MSU-Kristallen wichtige Komorbiditäten aufzeigen.
Trotz der geringen Kosten und der einfachen Ausführung kann die Sensibilität der Tests und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse durch unerfahrene Analysten beeinträchtigt werden - vor allem, wenn es um die Identifizierung von Kristallen geht. Ausbildung und Erfahrung des Analytikers sind entscheidend, um die Form und Doppelbrechung von CPP- und MSU-Kristallen zu unterscheiden und ihre Form an ihren Doppelbrechungsgrad anzupassen. Einige Studien haben über Diskrepanzen bei der Identifizierung von Kristallen zwischen verschiedenen Labors berichtet. Daher ist die Ausbildung von Laboranten unerlässlich, um zuverlässige und konsistente Ergebnisse zu erzielen14. Die Identifizierung von Kristallen wird auch durch die Fehlinterpretation von doppelbrechenden Partikeln beeinträchtigt, die mit pathogenen Kristallen verwechselt werden können. Diese können von externen Quellen (z. B. Staub oder Fasern) stammen oder in der Gelenkhöhle vorhanden sein (z. B. Kortikosteroide oder Lipide). Ersteres kann durch eine gründliche Reinigung des Objektträgers behoben werden, letzteres kann jedoch nur durch Training und Erfahrung überwunden werden14.
Eine weitere Einschränkung der SF-Analyse betrifft die Verwendung der Alizarinrot-Färbung zur BCP-Identifizierung. Wie bereits erwähnt, handelt es sich hierbei nicht um einen spezifischen Test, daher ist bei der Interpretation der Ergebnisse Vorsicht geboten. Der Analytiker muss in der Lage sein, rote Ausfällungen mit einer eigentümlichen Morphologie zu erkennen (Abbildung 11). Empfindlichere Techniken wie die Rasterelektronenmikroskopie (REM) können zur Identifizierung von BCP-Kristallen eingesetzt werden, werden aber bei Routineuntersuchungen von SF im klinischen Alltag nicht eingesetzt. Wichtig ist, dass sich gezeigt hat, dass die mit der Alizarinrot-Färbung erzielten Ergebnisse eine gute, wenn auch nicht optimale Übereinstimmung mit denen des SEM22 aufweisen, wodurch der Wert des ersteren erhöht wird.
Ein weiterer wichtiger Punkt, den es zu berücksichtigen gilt, ist, was zu tun ist, wenn die Arthrozentese sehr geringe Mengen an SF liefert, und wie die Probe zu lagern ist. Wenn nur wenige Tropfen SF aus kleinen Gelenken wie Inter- und Metakarpophalangealgelenken und dem Handgelenk entnommen werden, wird empfohlen, das Material in der Spritze zu belassen und direkt auf einen sauberen Objektträger zu verteilen. Mit einer Mikropipette und einigen Tricks ist es möglich, mehr als einen Objektträger vorzubereiten und eine vollständige Analyse durchzuführen. Im Detail zieht der Analytiker die SF mit der Zählpipette aus dem für die Kristallsuche vorbereiteten Objektträger und bereitet die Hämazytometerkammer vor, wobei einige Mikroliter für die supravitale Färbung abgesaugt werden können.
Was die Lagerung betrifft, so verschlechtern sich SF-Proben mit der Zeit, und ihre Analyse erfordert neue Präparationen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Alternativ kann SF bei 4 °C konserviert und innerhalb von 24 h, spätestens jedoch 48 h, zur zytologischen Untersuchung verwendet werden. Um Zellverklumpungen und SF-Gerinnung zu vermeiden, muss darauf geachtet werden, die Probe in mindestens einem EDTA-Röhrchen zu sammeln. Gefrorene SF-Proben, die über einen längeren Zeitraum bei -20 °C gelagert werden, können nur für die Kristallsuche verwendet werden.
Die SF-Analyse ist ein unersetzlicher pathognomonischer Test in der Rheumatologie, da sie nützlich, einfach durchzuführen und erschwinglich ist. Die größte Herausforderung für zukünftige Anwendungen der SF-Analyse ist eine genauere Diagnose rheumatischer Erkrankungen. Möglich wird dies durch die Integration dieser Methode mit fortschrittlicheren und innovativeren Technologien23, die es ermöglichen, die Zusammensetzung der SF zu charakterisieren und spezifische molekulare Biomarker und Proteomik am Ort der Entzündung zu identifizieren.
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Disclosures
Alle Autoren legen keine Interessenkonflikte offen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Professor Leonardo Punzi für seine wertvolle Betreuung auf dem Gebiet der Synovialflüssigkeitsanalyse und dem Universitätskrankenhaus Padua für seine Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red S | Merck | A5533 | For BCP crystal search |
| Burker chamber | Merck | BR718905 | For total white blood cell count |
| Cover glasses | Merck | C7931 | For microscopic examination |
| EDTA tubes | BD | 368861 | For SF collection |
| Glass slides | Merck | S8902 | For crystal search |
| Lambda filter (compensator) | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Malassez-Potain pipette | Artiglass | 54830000 | For dilution of synovial fluid |
| Methylene blue solution | Merck | 3978 | For total white blood cell count |
| Polarized microscope | Leica, Nikon, others | Depending on the model and company | For complete synovial fluid analysis |
| Polarizing lens | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Testsimplet | Waldeck | 14386 | Supravital staining for cell differentiation |
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