Summary
昆虫有一个最佳的环境温度范围，它们试图保持在其中，许多外部和内部因素可以改变这种偏好。在这里，我们描述了一种经济高效且简单的方法来研究温度选择，该方法允许昆虫自由地展示其自然行为。
Abstract
大多数昆虫和其他变温动物的最佳温度窗口相对较窄，偏离其最佳状态会对它们的适应性以及其他特征产生重大影响。因此，许多这样的变温设备寻求其最佳温度范围。尽管蚊子和其他昆虫的温度偏好已经得到了很好的研究，但传统的实验设置是在高度封闭的空间中使用铝表面上的温度梯度进行的。在某些情况下，这种设备会限制许多自然行为，例如飞行，这在偏好选择中可能很重要。
本研究的目的是通过使用具有足够飞行空间的两室装置来观察昆虫对空气温度的偏好。两个腔室由独立的温控培养箱组成，每个培养箱都有一个大孔径。培养箱通过这些孔使用短亚克力桥连接。孵化器内有两个网笼， 通过 孔径和桥连接，允许昆虫在不同的条件之间自由飞行。丙烯酸桥还充当两个培养箱之间的温度梯度。
由于笼子中的空间宽敞且易于构造，该方法可用于研究任何可能改变温度偏好的小变温温和/或任何操作，包括感觉器官操作、饮食、肠道菌群和生物安全级别 1 或 2（BSL 1 或 2）的内共生体存在。此外，该设备可用于使用BSL 3的进一步遏制（例如，在生物安全柜内部）来研究病原体感染。
Introduction
生物体只能在其热耐受范围内生活和繁殖。由于季节变化和全球变暖，环境温度会发生变化，物种必须相应地适应和应对，以确保其生存。这包括变温，其中体温与环境平衡1。因此，每只昆虫都有自己的最佳环境温度范围，它们试图保持在2 以内。
温度是预测昆虫分布和范围的重要因素之一3，4，5，观察病原虫关系6，7以及外部因素对变温动物适应性的影响，如成虫寿命，繁殖力和摄食率8，9。
以前的研究已经调查了具有不同设置的变温管的首选温度。最常见的是使用带有冷却或热水浴10，冰浴和可编程加热器元件11，冷板和热板12，13，热调节板14，15或热袋和冰袋16在两端的大型铝块以创建温度梯度。此外，其他研究还使用温度梯度培养箱来研究所选细菌17的生长，并将铝棒安装在热电装置上（在末端加热和冷却）以观察黑腹果蝇18，19的热偏好。
然而，这里提出的替代方法对于某些昆虫应用具有显着的优势。首先，其他解决方案需要从头开始使用基本材料进行完整的构建，包括铝板，为昆虫建造亚克力室，通常还需要相机设置和专业软件;设置起来可能既昂贵又耗时。其次，许多替代设备依赖于表面上的温度梯度（而不是空气温度）。因此，研究昆虫的房间通常非常狭窄（例如，24厘米长的梯度，只有2厘米宽和1厘米深16），这可能会阻止自然行为，例如飞行，这对于昆虫的正常活动至关重要，因此在选择首选温度时势在必行。一些研究确实测量了空气温度;然而，选择的评分仍然涉及计算降落在佩尔帖元件上的蚊子数量，而不是在笼子里自由飞行的昆虫数量20.
在这项研究中，我们描述了一种更简单的设置，它使用最低限度修改的标准设备，并为昆虫提供足够的空间，在标准尺寸的蜂群维护笼中相对不受阻碍地飞行和导航。此外，该协议不是依赖于梯度，而是利用两个相对较大的内部温度一致的部分，允许昆虫在它们喜欢的温度下自然漫游和简单的二进制评分。因此，这里描述的设备和协议提供了一种低成本和简单的方法，可以在较少阻碍和更现实的环境中研究蚊子的温度偏好。
该方案涉及在实验前准备昆虫，然后进行两室设备设置。进一步的步骤包括将昆虫放入设备中，以允许选择温度和结果评分。为了说明这里的方法，我们选择了昆虫的最佳（标准饲养）温度， 埃及伊蚊为27°C，黑 腹果蝇为25°C，两种昆虫的驱虫温度分别为30°C和28°C。给昆虫30分钟的时间选择首选的房间。发现这段时间是足够的，更长的持续时间并没有改变结果;但是，这可能会根据需要根据物种/温度/其他变量进行扩展。
Protocol
注意：此协议是为 BSL 1 或 2 编写的;对于BSL 3工作，请在3类生物安全柜（手套箱）内执行整个协议。
1. 昆虫准备
- 准备两个空蚊笼（17.5厘米x 17.5厘米x 17.5厘米），袖子开口为12厘米（图1）。在进行实验之前，请确保蚊笼没有孔或其他损坏。
- 使用机械吸气器（带有收集室的简单便便器），将30只昆虫（例如埃及 伊蚊 ;这里使用出苗后3-5天的雌性）转移到单独的笼子中，以便在实验后更容易处理和处置。
注意：建议每个实验总共30只昆虫，因为它易于管理和计数，没有蚊子逃逸的高风险。可以使用的昆虫数量进行调整以适应实验目标。
2. 双室设备设置
- 按照培养箱制造商的说明将培养箱设置为所需温度。
- 让培养箱在特定温度下加热并稳定，对于25-30°C范围内的温度，该温度为<30分钟。 使用温度探头检查培养箱中的空气温度，以确保培养箱设置为预期温度。
- 在每个培养箱中放置一个空蚊笼（图2A）。
- 通过培养箱的前孔将笼子的套筒送入。用胶带准备一个可打开的盖子（翻盖），并将其放在丙烯酸管的孔上（图2B）。
- 将丙烯酸管插入培养箱孔顶部一个笼子的套筒中。管的直径大于培养箱前面的孔，使其完全覆盖孔。
- 用橡皮筋或可重复使用的扎带拧紧管周围的套管网（图2C）。确保亚克力管在培养箱之间没有松动和悬空;如果是，请拉动笼套以去除笼子和橡皮筋之间的多余材料。
- 将两个培养箱面对面放置，并用另一个培养箱的套筒重复步骤2.5和2.6。两个保持架现在都通过丙烯酸管牢固地连接（图2D）。
3. 蚊子插入
- 打开胶带盖以插入蚊子。将漏斗放入孔中。将昆虫倒入已放入丙烯酸管中的漏斗中。
注意：如果需要/需要：对于蚊子，在将蚊子放入漏斗21 之前，请使用CO 2 笔敲除所有蚊子;对于果蝇，用冰将昆虫击倒22. - 拆下漏斗并用胶带翻盖盖住管中的孔。静置30分钟，让昆虫选择首选的房间。
注意：如果使用CO2 或冰，请在几分钟后轻轻敲击管桥以唤醒昆虫。
4. 蚊子计数
- 30分钟后，目视观察并写下在桥（丙烯酸管）中发现了多少昆虫。
- 将桥上的昆虫轻拍/吹到培养箱的两侧。记录以后从昆虫总数中扣除。
注意：通过将CO 2释放到桥中来敲除设备中的所有30种昆虫（对所有昆虫使用CO2，因为冰不会击倒笼子中的昆虫）。另外，请注意桥上飞向孵化器两侧的昆虫数量。 - 从两侧的亚克力管上捏紧并关闭套筒，用结快速固定以关闭笼子，并确保橡皮筋仍然完好无损，以防止任何昆虫逃脱。
- 从孵化器中取出笼子，目视计数每个笼子中的昆虫（如果需要，从桥上扣除昆虫的数量）。
- 用另一个保持架重复步骤4.4。确保两个孵化器和桥的数量加起来为 30（或使用的昆虫数量，如果不同）。
- 如果这些数字加起来不等于步骤 1.2 中使用的昆虫总数，请在笼套中寻找剩余的昆虫。
5. 复制
- 进行实验时，请务必考虑可能的外部偏差，例如光的方向、环境气味等。例如，通过反转笼子、培养箱方向和重复之间的组合。
Representative Results
为了测试该实验装置的有效性和有效性，在两个培养箱中以相同的温度在四个重复中测试了30只蚊子（图3）。当两个室均设置为蚊子最佳温度27 °C时，室偏好间无显著差异（P = 0.342;威尔科克森签名等级测试）。然而，当一个腔室设置为27°C的有吸引力的最佳温度，而另一个室设置为30°C的次优温度时，蚊子始终表现出对最佳状态的积极偏好（P = 0.029;威尔科克森符号等级测试;27 °C 和 30 °C 的平均值分别为 78.2% 和 21.8%）。我们还使用 果蝇 进行了测试，以确定与另一种变温模型的适用性，并观察到类似的结果。
保持架内的温度均匀性
图4 显示了双室装置的温度均匀性。组装完成后，将两侧设置为27°C和30°C，并按照此处给出的说明进行平衡。培养箱和桥的所有部件都在中心温度的0.4°C以内，除了（始终）一个角落。请注意，左前角左下角（从正面看）是27°C和30°C下的一致热点。 这可能是由于培养箱对照的电子设备位于培养箱的该部分下方，而不是执行的操作;因此，它可能是特定于孵化器模型的。这表明，对培养箱的操作和添加对温度均匀性的影响很小。此外，两个腔室之间的桥梁温度是中间的，确保昆虫不会面对它们必须飞过的温度槽。
图1：蚊笼说明。 蚊笼（17.5 厘米 x 17.5 厘米 x 17.5 厘米），袖口为 12 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：设置过程中设备的图片和示意图 。 （A）将空的昆虫笼放置在培养箱中。（B） 带有由胶带制成的可打开盖（翻盖）的亚克力管。（C） 带有示意图的设置侧视图。套筒的网眼用橡皮筋在丙烯酸管周围拧紧。在这些实验中，使用了3-5天大的交配雌性 埃及伊蚊 。（D） 完成设置。两个面对面的培养箱通过丙烯酸管连接。 请点击此处查看此图的大图。
图3：昆虫的温度偏好。按照说明组装两室装置。按照协议插入昆虫并放置30分钟以选择其喜欢的腔室（温度），然后计数。黑点表示单个仿行，蓝色表示均值。（A）两个培养箱设置为相同的温度（27°C），并观察埃及 伊蚊 的温度偏好。（B）将培养箱设置为不同的温度（27°C与30°C）和Ae的温度偏好 。观察到埃及伊蚊 。（C）将培养箱设置为不同的温度（25 °C与28 °C），并观察 黑腹果蝇 的温度偏好。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：腔室和电桥内的温度均匀性。 如前所述，按照说明组装了两个孵化器、两个笼子和桥。两个培养箱的温度均调节至27°C，中心温度调节至30°C。使用温度探头测量笼子中心、培养箱所有八个角和桥内的温度。此处显示了测量的温度。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
该研究描述了一种观察蚊子温度偏好的新方法。在这种方法中，蚊子被释放到连接到两个温度独立可控的培养箱的管子中。通过这种方式，蚊子可以在两种温度之间自由选择，而不会破坏它们的自然行为和表达这种选择的机制（例如，飞行）。
我们的第一个代表性实验在两个房间中使用了27°C的蚊子最佳温度。在重复该实验期间，观察到蚊子在整个30分钟内在两个笼子之间自由飞行，并且在所有重复中，两个腔室中每个室的数量几乎相等。这证实了允许蚊子在展示其自然行为（飞行）的同时在笼子之间自由选择的能力的实验意图。相反，第二个代表性实验在一个腔室中使用了27°C的有吸引力的最佳温度，在第二个腔室中使用了次优的排斥温度30°C。正如预期的那样，蚊子始终选择具有高意义的最佳温度室，即使我们更换了培养箱以避免偏差。
我们还测试了另一种昆虫D . melanogaster （果蝇）的设置，它代表了另一种变温模式生物。将一个腔室设置为黑 腹果蝇的最佳温度25°C，另一个室设置为高3°C，28°C。 与蚊子类似，果蝇也喜欢它们的最佳温度并避开温暖的房间。这表明该协议适用于一系列变温。
协议中关键步骤的描述
协议中的主要关键步骤是昆虫处理，因为它产生了昆虫逃逸的可能性。可以通过确定所使用的笼子中没有足够大的孔来防止这种情况，用于将网套固定在桥上的橡皮筋/电缆扎带是否牢固，并且桥上昆虫插入孔的盖子牢固地连接和密封。
确保昆虫在实验之前或之后不会逃逸也很重要，特别是当下游实验或各种温度选择的后期时间点需要昆虫时。这可以通过在将昆虫放入丙烯酸桥之前麻醉昆虫来完成（对果蝇使用冰，对蚊子使用CO 2），并在实验后将CO2释放到桥中以击倒昆虫，然后再计算。CO2的使用非常适合蚊子，因为它不会影响行为结果21。在苍蝇中，暴露于CO2会改变它们的飞行行为23，因此建议使用冰22。
昆虫计数也是一个关键步骤，以确保实验前后昆虫数量相等以获得准确的结果。为了做到这一点，我们建议在实验完成后使用CO2 笔击倒位于桥上的昆虫。这将有助于将昆虫移动到房间的两侧，从而减少逃生者的数量。我们还在协议中强调，在笼子分离过程中，昆虫可以捕获在笼子的袖子里;因此，请确保在计数过程中彻底检查这些。
技术的潜在修改和故障排除
这种技术的主要困难是笼套的柔性网眼导致间隙或藏身之处，从而昆虫逃脱或诱捕。如果需要，有一些潜在的修改来改进技术。我们建议使用两个或多个橡皮筋，以确保桥梁正确固定在腔室之间，而不会为昆虫留下任何潜在的空间（松散的网状物为昆虫创造了隐藏空间）。我们还建议在组装设备时特别注意拉紧网套，如步骤2.6中所述。
小型培养箱通常仅加热（即没有主动冷却），就像这里使用的培养箱一样。因此，使用接近或低于环境室温的温度将需要在冷藏室中进行实验，以确保为培养箱设置的温度将尽可能低。
此外，此设置还可用于需要三级生物安全柜（手套箱）的BSL 3。在这种情况下，手套箱需要足够大以容纳整个设备。本协议中描述的实验非常适合在手套箱中进行实验，因为所需的一切都将包含在手套箱中，重要的是，昆虫逃逸的可能性很小。
最后，孵化器中有足够的空间来添加外部光或湿度源，而不会影响笼子中的昆虫。根据昆虫种类或实验设计，一个或两个培养箱内的笼子顶部可以很容易地将 1 cm 厚的 LED 灯放置在笼子顶部。对于某些光敏实验设计，为两者提供光并提供温度选择可能是更现实的方案，或者仅向一个腔室提供光（或湿度）是对评估光/湿度选择的方案的可能修改。
该技术在双选温度偏好测定中的优势
这里描述的方法提供了先前研究10，13，14，16中描述的传统温度梯度方法的替代方法。在大多数这些研究中，使用具有热梯度的大型水平铝块，而产生这种梯度的机制各不相同，包括加热/冷却块、水浴等。在这些情况下，温度梯度是在铝块的表面上产生的（而不是笼子中的空气温度）。因此，大多数（但不是全部）替代技术确实比该协议更能限制昆虫的飞行能力。在这里，昆虫可以在笼子之间相对自由地飞行，从而可以更真实地表达选择的自然行为。甚至可以使用更大的笼子和孵化器来扩大这种实验装置的规模，例如，对于较大的昆虫。
除了自然行为优势外，我们还在两个腔室内表现出非常高的温度均匀性，因此可以简单地划线并明确选择两个大型单温室。使用这样的二元大腔室设计可以减少数据中的噪声，例如在梯度设备上，昆虫的任何偶然运动都会改变梯度上的位置，从而改变它们感知的温度偏好。
这里描述的技术也非常简单且成本低。该技术不需要额外的设备来设置温度（即水浴10和/或热板11，12，13，14，15），除了切割丙烯酸管和钻孔外，不需要专业设备，也没有相机18，19或复杂的软件19 进行分析。其他技术中使用的此类组件可能很昂贵和/或需要大量的专业知识和测试才能开始实验。
如果没有外部电源，这种技术也可以复制到使用电池的不同设备上，使系统成为在现场进行实验的理想选择。此外，可以对同一设备进行轻微修改，以研究实验室或现场的其他二元选择偏好情况，例如明暗，高/低湿度等。
协议中的全尺寸设备明显小于温度梯度设置，如上所述，可以更轻松地安装在BSL 3手套箱内。此外，昆虫更容易控制，因为它们可以在实验结束时用CO2 击倒，并且在与桥分离后可以快速重新密封笼子。这些密闭优势是BSL 3工作的理想选择。
然而，我们承认，我们的设备只允许二元决策，而不是沿着梯度自由选择，根据应用的不同，可能需要额外的运行来确定最佳温度。
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
AHR感谢Majlis Amanah Rakyat（MARA）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
References
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