Summary
昆虫は、彼らが内にとどまろうとする最適な環境温度範囲を持っており、多くの外的および内的要因がこの好みを変える可能性があります。ここでは、昆虫が自然の行動を自由に発揮できるようにする、温度選択を研究するための費用効果が高く簡単な方法について説明します。
Abstract
ほとんどの昆虫および他の外温動物は比較的狭い最適温度ウィンドウを有し、そしてそれらの最適からの逸脱はそれらの適応度および他の特性に重大な影響を及ぼし得る。その結果、そのような外温線の多くは、最適な温度範囲を求めます。蚊や他の昆虫の温度選好はよく研究されていますが、従来の実験セットアップは、高度に密閉された空間でアルミニウム表面の温度勾配を使用して実行されます。場合によっては、この機器は飛行などの多くの自然な行動を制限し、好みの選択に重要になる可能性があります。
本研究の目的は,飛行に十分な余裕のある2室装置を用いて,昆虫の気温選好を観察することである。2つのチャンバーは独立した温度制御されたインキュベーターで構成されており、それぞれに大きな開口部があります。インキュベーターは、短いアクリルブリッジを使用してこれらの開口部によって接続されています。インキュベーター内には、開口部とブリッジ を介して リンクされた2つの網状のケージがあり、昆虫が異なる条件の間を自由に飛ぶことができます。アクリルブリッジは、2つのインキュベーター間の温度勾配としても機能します。
ケージ内の広々としたエリアと簡単な構造により、この方法は、感覚器官の操作、食事、腸内細菌叢、およびバイオセーフティレベル1または2(BSL 1または2)での内部共生生物の存在など、温度の好みを変える可能性のある小さな外温および/または操作を研究するために使用できます。さらに、この装置は、BSL 3のさらなる封じ込め(例えば、バイオセーフティキャビネットの内部)を使用して病原体感染の研究に使用することができる。
Introduction
生物は、その熱許容範囲内でのみ生き、繁殖することができます。季節の変化や地球温暖化によって環境温度が変化するため、種は生存を確保するために適応し、それに応じて対応する必要があります。これには、体温が環境と平衡状態にある外温が含まれます1。したがって、各昆虫には独自の最適な環境温度範囲があり、2以内にとどまろうとしています。
温度は、昆虫の分布と範囲を予測するために使用される重要な要素の1つです3,4,5、病原体と昆虫の関係を観察する6,7、および成虫の寿命、繁殖力、摂食率などの外温線の適応度に対する外的要因の影響8,9。
以前の研究では、さまざまなセットアップで外温線の好ましい温度を調査してきました。最も一般的なのは、冷却または加熱された水浴10、氷浴およびプログラム可能なヒータエレメント11、冷板およびホットプレート12、13、温度調節プレート14、15、または温度勾配を作成するために両端にヒートパックおよびアイスパック16のいずれかを有する大きなアルミニウムブロックを使用することである。さらに、他の研究では、温度勾配インキュベーターを使用して選択された細菌17の増殖を研究し、熱電装置(両端で加熱および冷却)にアルミニウム棒を取り付けて、ショウジョウバエメラノガスター18,19の熱的好みを観察しました。
ただし、ここで提案する代替方法論は、特定の昆虫用途に大きな利点があります。第一に、他のソリューションでは、アルミニウムシート、昆虫用のアクリルチャンバーの構築、多くの場合カメラのセットアップと専門ソフトウェアなどの基本的な材料を使用して、ゼロから完全に構築する必要があります。これは、セットアップに費用と時間がかかる可能性があります。第二に、多くの代替装置は、(気温とは対照的に)表面上の温度勾配に依存している。その結果、昆虫が研究される部屋はしばしば非常に狭く(例えば、幅2cm、深さ1cmの24cmの長さの勾配16)、昆虫の正常な移動に不可欠であり、したがって好ましい温度を選択する上で不可欠な飛行などの自然な行動を妨げる可能性がある。いくつかの研究は気温を測定します。しかしながら、選択のスコアリングは、ケージ20内を自由に飛んでいる昆虫とは対照的に、ペルチェ素子に着陸する蚊の数を数えることを含む。
本研究では、最小限の標準装備を使用し、標準サイズのコロニー維持ケージで比較的妨げられることなく飛行およびナビゲートするのに十分なスペースを昆虫に提供する、より単純なセットアップについて説明します。さらに、このプロトコルは、勾配に依存するのではなく、一貫した内部温度の2つの比較的大きなサイズのセクションを利用し、昆虫の好ましい温度での自然なローミングと単純なバイナリスコアリングを可能にします。したがって、ここで説明する装置およびプロトコルは、より邪魔が少なく、より現実的な設定で蚊の温度選好を研究するための低コストで簡単な手段を提供する。
プロトコルには、実験前の昆虫の準備とそれに続く2室装置のセットアップが含まれます。さらなるステップは、温度の選択および結果のスコアリングを可能にするために装置内に昆虫を配置することを含む。ここでの方法の例として、昆虫の最適(標準飼育)温度、 ネッタイシマカは27°C、ショ ウジョウバエメラノガスターは25°C、両種の昆虫の忌避温度は30°Cと28°Cと高く選択しました。昆虫は、好ましい部屋を選択するために30分与えられる。この時間は十分であることが判明し、より長い期間は結果を変えませんでした。ただし、これは必要に応じて種/温度/その他の変数に応じて拡張できます。
Protocol
注: このプロトコルは BSL 1 または 2 用に記述されています。BSL 3作業の場合は、クラス3バイオセーフティキャビネット(グローブボックス)内でプロトコル全体を実行します。
1.昆虫の準備
- 12 cmのスリーブ開口部を備えた2つの空の蚊帳(17.5 cm x 17.5 cm x 12 cm)を準備します(図1)。実験を進める前に、蚊かごに穴やその他の損傷がないことを確認してください。
- 機械式吸引器(収集チャンバーを備えた単純なプーター)を使用して、30匹の昆虫(例: ネッタイシマカ ;ここでは、出現後3〜5日の雌を使用)を別のケージに移し、実験後の取り扱いと処分を容易にします。
注:蚊が逃げるリスクが高くなく、管理とカウントが簡単であるため、実験ごとに合計30匹の昆虫が推奨されます。使用する昆虫の数は、実験の目的に合わせて調整できます。
2. 2室装置のセットアップ
- インキュベーターメーカーの指示に従って、インキュベーターを希望の温度に設定します。
- インキュベーターを加熱し、特定の温度(25〜30°Cの範囲の温度では<30分)で安定させます。 温度プローブでインキュベーター内の気温をチェックし、インキュベーターが意図した温度に設定されていることを確認します。
- 空の蚊かごを各インキュベーターに置きます(図2A)。
- ケージの袖をインキュベーターの前穴に通します。ダクトテープで開閉可能なカバー(フラップ)を準備し、アクリルチューブの穴の上に置きます(図2B)。
- アクリルチューブをインキュベーターの穴の上にある1つのケージのスリーブに挿入します。チューブの直径はインキュベーターの前面の穴よりも大きいので、穴を完全に覆います。
- チューブの周りのスリーブのメッシュを輪ゴムまたは再利用可能なケーブルタイで締めます(図2C)。アクリルチューブが緩んでインキュベーターの間にぶら下がっていないことを確認してください。そうである場合は、ケージスリーブを引っ張って、ケージと輪ゴムの間の余分な材料を取り除きます。
- 両方のインキュベーターを向かい合わせに置き、もう一方のインキュベーターのスリーブで手順2.5と2.6を繰り返します。これで、両方のケージがアクリルチューブを介してしっかりとリンクされました(図2D)。
3.蚊の挿入
- 蚊を入れるためにダクトテープフラップを開きます。漏斗を穴に入れます。アクリルチューブに入れられた漏斗に昆虫を空にします。
注:必要に応じて:蚊の場合は、漏斗21に入れる前に、CO2ペンを使用してすべての蚊をノックアウトします。ショウジョウバエの場合は、氷を使って昆虫を倒します22。 - 漏斗を取り外し、チューブの穴をダクトテープフラップで覆います。昆虫が好みの部屋を選択するために30分間放置してください。
注意: CO2 または氷を使用した場合は、チューブブリッジを軽くたたいて、数分後に昆虫を起こします。
4.蚊のカウント
- 30分後、橋(アクリル管)で見つかった昆虫の数を目視で観察して書き留めます。
- インキュベーターの両側にある橋の昆虫をタップ/吹き飛ばします。後で昆虫の総数から差し引くために記録します。
注:CO30 をブリッジに放出して、装置内の2匹の昆虫すべてをノックアウトします(氷はケージ内の昆虫をノックダウンしないため、すべての昆虫にCO2 を使用してください)。また、インキュベーターの両側に飛ぶ橋の中の昆虫の数に注意してください。 - 両側のアクリルチューブからスリーブをつまんで閉じ、結び目ですばやく固定してケージを閉じ、虫が逃げないように輪ゴムがまだ無傷であることを確認します。
- インキュベーターからケージを取り外し、各ケージ内の昆虫を視覚的に数えます(必要に応じてブリッジから昆虫の数を差し引きます)。
- もう一方のケージで手順4.4を繰り返します。2つのインキュベーターとブリッジからの数を合計すると30(または異なる場合は使用される昆虫の数)になることを確認してください。
- 手順1.2で使用した昆虫の総数に数字が合わない場合は、ケージスリーブに残っている昆虫を探します。
5. レプリケーション
- 実験を行うときは、光の方向、周囲の匂いなど、考えられる外部バイアスを必ず考慮してください。例えば、ケージ、インキュベーターの向き、反復の組み合わせを逆にすることによって。
Representative Results
この実験セットアップの有効性と有効性をテストするために、30匹の蚊を両方のインキュベーターで同じ温度で4回の反復でテストしました(図3)。両チャンバーを蚊の最適温度である27°Cに設定した場合、チャンバー選好間に有意差はなかった(P = 0.342;ウィルコクソン符号ランクテスト)。しかし、一方のチャンバーを27°Cの魅力的な最適温度に設定し、もう一方のチャンバーを30°Cの準最適温度に設定すると、蚊は一貫して最適温度に向かって積極的な好みを示しました(P = 0.029;ウィルコクソン署名ランクテスト;平均値は27°Cでそれぞれ78.2%、30°Cで21.8%)。また、ショ ウジョウバエ を用いて別の外温モデルでの適用性を判定した試験を行ったところ、同様の結果が観察された。
ケージ内の温度均一性
図4 は、2室装置の温度均一性を示す。組み立てたら、両側を27°Cと30°Cに設定し、ここの指示に従って平衡化させました。インキュベーターとブリッジのすべての部分は、(一貫して)1つのコーナーを除いて、中心温度から0.4°C以内です。前面の左下隅(正面から見て)は、27°Cと30°Cの両方で一貫したホットスポットであることに注意してください。 これは、実行された操作ではなく、インキュベーターコントロールの電子機器がインキュベーターのそのセクションのすぐ下に配置されていることが原因である可能性があります。したがって、インキュベーターモデル固有である可能性があります。これは、インキュベーターへの操作および添加が温度均一性に最小限の影響しか及ぼさないことを示している。さらに、橋の温度は2つのチャンバーの中間であり、昆虫が飛ばなければならない温度トラフに直面しないようにしました。
図1:蚊かごの説明。 蚊帳(17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm)12 cmの袖の開口部。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:セットアップ中の装置の写真と図。 (A)空の虫かごをインキュベーターに入れた。(B)ダクトテープで作られた開閉可能なカバー(フラップ)付きのアクリルチューブ。(C)概略図付きのセットアップの側面図。スリーブのメッシュは、輪ゴムでアクリルチューブの周りに締め付けられました。これらの実験のために、3〜5日齢の交配した、雌のAe.エジプト蚊を使用した。(D)セットアップを完了します。互いに向かい合っている2つのインキュベーターはアクリル管で接続されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:昆虫の温度選好。2室装置は指示に従って組み立てられた。昆虫をプロトコルに従って挿入し、30分間放置して好みのチャンバー(温度)を選択し、カウントしました。黒の点は個々の反復を表し、青は平均を表します。(a)両方のインキュベーターを同じ温度(27°C)に設定し、 Ae.エジプト の温度好みが観察された。(B)インキュベーターは、異なる温度(27°C対30°C)およびAeの温度好みに設定されました 。エジプトが観察され た。(C)インキュベーターを異なる温度(25°C対28°C)に設定し、 D.メラノガスター の温度選好が観察された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:チャンバーとブリッジ内の温度均一性。 説明したように、2つのインキュベーター、2つのケージ、およびブリッジは、指示に従って組み立てられました。温度は、両方のインキュベーターで27°C、中央で30°Cに調整した。温度プローブを使用して、ケージの中央、インキュベーターの8つの角すべて、およびブリッジ内の温度を測定しました。測定された温度がここに示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
この研究では、蚊の温度選好を観察するための新しい方法について説明しています。この方法では、蚊は独立して制御可能な温度を有する2つのインキュベーターに接続されたチューブに放出される。このようにして、蚊は、自然な行動やこの選択を表現するメカニズム(飛行など)を損なうことなく、2つの温度から自由に選択することができます。
我々の最初の代表的な実験では、両チャンバーで蚊の最適温度27°Cを使用しました。この実験の繰り返しの間、蚊は30分間ずっと両方のケージの間を自由に飛んでいることが観察され、すべての反復において、2つのチャンバーのそれぞれにほぼ等しい数がありました。これは、蚊が自然な行動(飛行)を示しながらケージを自由に選択できるようにするという実験的な意図を確認しました。逆に、第2の代表的な実験では、一方のチャンバーで27°Cの魅力的な最適温度を使用し、第2のチャンバーで最適ではないため反発温度30°Cを利用しました。予想通り、蚊はバイアスを避けるためにインキュベーターを交換した場合でも、一貫して最適な温度チャンバーを高い重要性で選択しました。
また、別の外温モデル生物を表す別の昆虫である D.メラノガスター (ショウジョウバエ)のセットアップをテストしました。一方のチャンバーは D.メラノガスターの最適温度である25°Cに設定され、もう一方は3°C高い28°Cに設定されました。 蚊と同様に、ショウジョウバエも最適な温度を好み、暖かい部屋を避けました。これは、プロトコルがさまざまな外温線に適していることを示しています。
プロトコルの重要なステップの説明
プロトコルの主な重要なステップは、昆虫が逃げる可能性を生み出すため、昆虫の取り扱いです。これは、使用するケージに逃げるのに十分な大きさの穴がないこと、メッシュスリーブをブリッジに固定するために使用される輪ゴム/ケーブルタイがきつく、ブリッジの昆虫挿入穴のカバーがしっかりと取り付けられて密閉されていることを決定することで防止できます。
また、実験の前後に昆虫が逃げないようにすることも重要であり、特に昆虫が下流の実験やさまざまな温度選択の後の時点に必要な場合は重要です。これは、昆虫をアクリルブリッジに入れる前に麻酔をかけ(ショウジョウバエには氷を使用し、蚊にはCO 2を使用)、計算する前に実験後に昆虫をノックダウンするためにブリッジにCO2を放出することによって行うことができます。CO2の使用は、行動結果に影響を与えないため、蚊にとって理想的です21。ハエでは、CO2への曝露は飛行行動を変える可能性があるため23、氷22を使用することをお勧めします。
昆虫のカウントも重要なステップであり、正確な結果を得るために実験の前後に昆虫の数が等しいことを確認するために重要です。これを行うには、実験が完了したら、橋にいる昆虫を倒すためにCO2 ペンを使用することをお勧めします。これは昆虫を部屋の両側に移動するのに役立ち、したがって逃亡者の数を減らすでしょう。また、プロトコルでは、ケージの分離中にケージの袖に昆虫が捕まる可能性があることを強調しています。したがって、カウント中にこれらが徹底的にチェックされていることを確認してください。
テクニックの潜在的な変更とトラブルシューティング
この技術の主な難点は、ケージスリーブの柔軟なメッシュにより、隙間や隠れ場所が発生し、昆虫の逃げや捕獲が発生することです。必要に応じて、テクニックを改善するためにいくつかの潜在的な変更があります。2つ以上の輪ゴムを使用して、昆虫のための潜在的なスペースを残さずに、チャンバー間でブリッジが適切に固定されるようにすることをお勧めします(緩いメッシュは昆虫の隠れスペースを作成します)。また、装置を組み立てるときは、ステップ2.6で説明されているように、メッシュスリーブをぴんと張って引っ張るように特に注意することをお勧めします。
スモールフォームファクタのインキュベーターは、ここで使用されるインキュベーターの場合のように、通常、加熱のみされます(つまり、アクティブな冷却はありません)。したがって、周囲室温付近またはそれ以下の温度を使用するには、インキュベーターに設定された温度が希望どおりに低くなるように、冷蔵室で実験を実行する必要があります。
さらに、この設定は、クラス3のバイオセーフティキャビネット(グローブボックス)が必要なBSL 3にも使用できます。この場合、グローブボックスは装置全体を収めるのに十分な大きさである必要があります。このプロトコルで説明されている実験は、必要なものがすべてグローブボックス内に含まれ、重要なことに、昆虫が逃げる可能性が最小限であるため、グローブボックスでの実験に最適です。
最後に、ケージ内の昆虫に影響を与えることなく、外光または湿度源を追加するのに十分なスペースがインキュベーターにあります。昆虫種または実験計画に応じて、厚さ1 cmのLEDランプを一方または両方のインキュベーター内のケージの上に簡単に配置できます。両方に光を提供し、温度の選択を提供することは、一部の感光性実験デザインにとってより現実的なプロトコルである場合もあれば、一方のチャンバーに光(または湿度)のみを提供することで、光/湿度の選択を評価するためのプロトコルを変更することもできます。
二重選択温度選好アッセイの文脈におけるこの技術の利点
ここで説明する方法は、以前の研究10、13、14、16に記載されている従来の温度勾配法に代わるものを提示します。これらの研究のほとんどでは、温度勾配を持つ大きな水平アルミニウムブロックが使用されますが、この勾配を生成するメカニズムは、加熱/冷却ブロック、水浴などによって異なります。これらの場合、温度勾配は(ケージ内の気温ではなく)アルミニウムブロックの表面に生成されます。その結果、ほとんどの(すべてではない)代替技術は、このプロトコルよりも昆虫の飛行能力を制限します。ここでは、昆虫はケージ間を比較的自由に飛ぶことができ、選択における自然な行動をよりリアルに表現することができます。例えば、より大きな昆虫のために、より大きなケージおよびインキュベーターを使用してこの実験装置をスケールアップすることさえ可能であるであろう。
自然な挙動の利点に加えて、2つのチャンバー内で非常に高い温度均一性も示し、簡単なスコアリングと2つの大きな単一温度チャンバーの明確な選択を可能にします。このようなバイナリラージチャンバー設計を使用すると、たとえば勾配装置では、昆虫の偶発的な動きによって勾配上の位置が変化し、したがって知覚される温度選好が変化するデータ内のノイズを低減できます。
ここで説明する手法も非常にシンプルで低コストです。この技術は、温度を設定するための追加の器具(すなわち、ウォーターバス10および/またはホットプレート11、12、13、14、15)、カットアクリルチューブおよびドリル穴以外の専門機器、およびカメラ18,19または高度なソフトウェア19を必要としない。 分析のために。他の技術で使用されるそのようなコンポーネントは高価であり得、および/または実験を開始するために重要な専門知識および試験を必要とする可能性がある。
この技術は、外部電源がない場合にバッテリーを使用するさまざまなデバイスで複製することもできるため、現場での実験に最適です。さらに、同じ装置をわずかに変更して、実験室または現場で、明対暗、高湿度/低湿度などの他の二者択一の好み状況を研究することができます。
プロトコルのフルサイズの装置は、温度勾配設定よりも大幅に小さく、上記のようにBSL 3グローブボックス内に簡単に収まります。さらに、昆虫は実験の終わりにCO2 でノックダウンすることができ、ケージは橋から分離した後に迅速に再密閉することができるので、封じ込めが容易である。これらの封じ込めの利点は、BSL 3の作業に最適です。
ただし、当社の装置は、勾配に沿った自由な選択ではなく、バイナリ決定のみを可能にし、アプリケーションによっては、最適な温度を特定するために追加の実行が必要になる場合があります。
Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
AHRは、Majlis Amanah Rakyat(MARA)からの資金援助を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
References
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