Summary
Los insectos tienen un rango óptimo de temperatura ambiental en el que buscan permanecer, y muchos factores externos e internos pueden alterar esta preferencia. Aquí, describimos un método rentable y simple para estudiar la elección de la temperatura, que permite a los insectos exhibir libremente sus comportamientos naturales.
Abstract
La mayoría de los insectos y otros ectotermos tienen una ventana de temperatura óptima relativamente estrecha, y la desviación de su óptimo puede tener efectos significativos en su estado físico, así como en otras características. En consecuencia, muchos de estos ectotermos buscan su rango de temperatura óptimo. Aunque las preferencias de temperatura de los mosquitos y otros insectos han sido bien estudiadas, la configuración experimental tradicional se realiza utilizando un gradiente de temperatura en una superficie de aluminio en un espacio muy cerrado. En algunos casos, este equipo restringe muchos comportamientos naturales, como volar, que pueden ser importantes en la selección de preferencias.
El objetivo de este estudio es observar la preferencia de los insectos por la temperatura del aire mediante el uso de un aparato de dos cámaras con suficiente espacio para volar. Las dos cámaras consisten en incubadoras independientes de temperatura controlada, cada una con una gran apertura. Las incubadoras están conectadas por estas aberturas mediante un puente acrílico corto. Dentro de las incubadoras hay dos jaulas de red, unidas a través de las aberturas y el puente, lo que permite a los insectos volar libremente entre las diferentes condiciones. El puente acrílico también actúa como un gradiente de temperatura entre las dos incubadoras.
Debido a la amplitud de la jaula y a su fácil construcción, este método se puede utilizar para estudiar cualquier pequeño ectotermo y/o cualquier manipulación que pueda alterar la preferencia de temperatura, incluida la manipulación de órganos sensoriales, la dieta, la flora intestinal y la presencia endosimbionte en los niveles de bioseguridad 1 o 2 (BSL 1 o 2). Además, el aparato se puede utilizar para el estudio de la infección por patógenos utilizando una mayor contención (por ejemplo, dentro de un gabinete de bioseguridad) en BSL 3.
Introduction
Los organismos pueden vivir y reproducirse solo dentro de su rango de tolerancia térmica. Como la temperatura ambiental varía debido al cambio de estaciones y al calentamiento global, las especies deben adaptarse y responder en consecuencia para garantizar su supervivencia. Esto incluye los ectotermos, donde la temperatura corporal está en equilibrio con el medio ambiente1. Por lo tanto, cada insecto tiene su propio rango de temperatura ambiental óptimo que buscan permanecer dentro de2.
La temperatura es uno de los factores importantes utilizados para predecir la distribución y el rango de los insectos 3,4,5, observando las relaciones patógeno-insecto6,7 y el efecto de factores externos sobre la aptitud de los ectotermos, como su vida adulta, fecundidad y tasa de alimentación 8,9.
Estudios previos han investigado la temperatura preferida de los ectotermos con diferentes configuraciones. El más común es usar un bloque de aluminio grande con un baño de agua enfriado o caliente10, un baño de hielo y un elemento calentador programable11, placas frías y calientes12,13, placas reguladoras térmicas14,15, o un paquete de calor y paquete de hielo 16 en cada extremo para crear un gradiente de temperatura. Además, otros estudios también han utilizado una incubadora de gradiente de temperatura para estudiar el crecimiento de bacterias seleccionadas17 y montado una varilla de aluminio en un dispositivo termoeléctrico (calentado y enfriado en los extremos) para observar la preferencia térmica de Drosophila melanogaster18,19.
Sin embargo, la metodología alternativa propuesta aquí tiene ventajas significativas para ciertas aplicaciones de insectos. En primer lugar, otras soluciones requieren una construcción completa desde cero con materiales básicos, incluidas láminas de aluminio, la construcción de cámaras de acrílico para los insectos y, a menudo, una configuración de cámara y un software especializado; Esto puede ser costoso y llevar mucho tiempo de configurar. En segundo lugar, muchos aparatos alternativos se basan en un gradiente de temperatura en una superficie (a diferencia de la temperatura del aire). En consecuencia, la cámara en la que se estudian los insectos es a menudo muy estrecha (por ejemplo, gradientes de 24 cm de largo con solo 2 cm de ancho y 1 cm de profundidad16), lo que puede evitar comportamientos naturales, como el vuelo, que son esenciales para la movilidad normal de los insectos y, por lo tanto, imperativos para seleccionar una temperatura preferida. Algunos estudios miden la temperatura del aire; sin embargo, la puntuación de elección todavía implica contar el número de mosquitos que aterrizan en los elementos Peltier en lugar de insectos que vuelan libremente en las jaulas20.
En este estudio, describimos una configuración más simple, que utiliza equipos estándar mínimamente modificados y proporciona a los insectos suficiente espacio para volar y navegar relativamente sin obstáculos en una jaula de mantenimiento de colonias de tamaño estándar. Además, en lugar de depender de un gradiente, el protocolo utiliza dos secciones de tamaño relativamente grande de temperatura interna constante, lo que permite la itinerancia natural de los insectos a su temperatura preferida y una puntuación binaria simple. Por lo tanto, el aparato y el protocolo descritos aquí proporcionan un medio simple y de bajo costo para estudiar la preferencia de temperatura de los mosquitos en un entorno menos obstructivo y más realista.
El protocolo implica la preparación de los insectos antes del experimento seguido de la configuración del aparato de dos cámaras. Otros pasos incluyen la colocación de insectos en el aparato para permitir la elección de la temperatura y la puntuación de los resultados. Para una ilustración del método aquí, elegimos la temperatura óptima (crianza estándar) de los insectos, 27 ° C para Aedes aegypti, 25 ° C para Drosophila melanogaster, y una temperatura repelente más alta para ambas especies de insectos, 30 ° C y 28 ° C, respectivamente. A los insectos se les da 30 minutos para seleccionar una cámara preferida. Este tiempo se consideró suficiente, y una duración más larga no cambió los resultados; Sin embargo, esto puede extenderse dependiendo de la especie / temperatura / otras variables según sea necesario.
Protocol
NOTA: Este protocolo está escrito para BSL 1 o 2; para el trabajo BSL 3, realice todo el protocolo dentro de un gabinete de bioseguridad de clase 3 (guantera).
1. Preparación de insectos
- Prepare dos jaulas para mosquitos vacías (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) con 12 cm de aberturas en las mangas (Figura 1). Antes de continuar con los experimentos, asegúrese de que no haya agujeros u otros daños en las jaulas de mosquitos.
- Usando un aspirador mecánico (un simple pooter con una cámara de recolección), transfiera 30 insectos (por ejemplo, mosquitos Aedes aegypti ; aquí, se usaron hembras de 3 a 5 días después de la emergencia), a una jaula separada para facilitar el manejo y la eliminación después del experimento.
NOTA: Se sugiere un total de 30 insectos por experimento, ya que es fácil de manejar y contar sin un alto riesgo de escape de mosquitos. El número de insectos utilizados se puede ajustar para adaptarse al objetivo del experimento.
2. Configuración del aparato de dos cámaras
- Ajuste las incubadoras a las temperaturas deseadas, según las instrucciones del fabricante de la incubadora.
- Permita que las incubadoras se calienten y se estabilicen a las temperaturas específicas, que son <30 min para temperaturas en el rango de 25-30 ° C. Verifique la temperatura del aire en la incubadora con una sonda de temperatura, para asegurarse de que la incubadora esté configurada a la temperatura deseada.
- Coloque una jaula de mosquitos vacía en cada incubadora (Figura 2A).
- Alimente las mangas de la jaula a través del orificio frontal de la incubadora. Prepare una tapa que se pueda abrir (solapa) con cinta adhesiva y colóquela sobre el orificio del tubo acrílico (Figura 2B).
- Inserte el tubo de acrílico en la manga de una jaula en la parte superior del orificio de la incubadora. El diámetro del tubo es mayor que el orificio en la parte frontal de las incubadoras para que cubra completamente el agujero.
- Apriete la malla del manguito alrededor del tubo con una banda elástica o una brida de cable reutilizable (Figura 2C). Asegúrese de que el tubo de acrílico no esté suelto y colgando entre las incubadoras; Si es así, tire de las mangas de la jaula para eliminar el exceso de material entre la jaula y la banda elástica.
- Coloque ambas incubadoras una frente a la otra y repita los pasos 2.5 y 2.6 con la funda de la otra incubadora. Ambas jaulas ahora están unidas de forma segura a través del tubo de acrílico (Figura 2D).
3. Inserción de mosquitos
- Abra la solapa de cinta adhesiva para la inserción del mosquito. Coloque un embudo en el agujero. Vacíe los insectos en el embudo que se ha colocado en el tubo de acrílico.
NOTA: Si lo desea/requiere: para los mosquitos, use una pluma deCO2 para eliminar todos los mosquitos antes de colocarlos en el embudo21; para Drosophila, use hielo para derribar insectos22. - Retire el embudo y cubra el orificio en el tubo con la solapa de cinta adhesiva. Dejar actuar durante 30 minutos para que los insectos seleccionen la cámara preferida.
NOTA: Si se usóCO2 o hielo, golpee ligeramente el puente del tubo para despertar a los insectos después de un par de minutos.
4. Conteo de mosquitos
- Después de 30 minutos, observe visualmente y anote cuántos insectos se encontraron en el puente (el tubo de acrílico).
- Golpee/sople los insectos en el puente a ambos lados de la incubadora. Registro para deducir del número total de insectos más adelante.
NOTA: Noquee a los 30 insectos en el aparato liberandoCO2 en el puente (use CO2 para todos los insectos ya que el hielo no derribará insectos en las jaulas). Además, tome nota de la cantidad de insectos en el puente que vuelan a ambos lados de la incubadora. - Pellizque y cierre las mangas del tubo de acrílico en ambos lados, sujete rápidamente con un nudo para cerrar las jaulas y asegúrese de que la banda elástica aún esté intacta para evitar que se escapen insectos.
- Retire las jaulas de la incubadora y cuente visualmente los insectos en cada jaula (deduzca el número de insectos del puente si es necesario).
- Repita el paso 4.4 con la otra jaula. Asegúrese de que los números de las dos incubadoras y el puente sumen 30 (o el número de insectos utilizados, si es diferente).
- Si los números no suman el número total de insectos utilizados en el paso 1.2, busque los insectos restantes en la manga de la jaula.
5. Replicación
- Al realizar experimentos, asegúrese de tener en cuenta los posibles sesgos externos, como la dirección de la luz, los olores ambientales, etc. Por ejemplo, invirtiendo las jaulas, la orientación de la incubadora y las combinaciones entre réplicas.
Representative Results
Para probar la eficacia y efectividad de esta configuración experimental, se probaron 30 mosquitos con la misma temperatura en ambas incubadoras en cuatro réplicas (Figura 3). Cuando ambas cámaras se ajustaron a la temperatura óptima del mosquito de 27 °C, no hubo diferencia significativa entre la preferencia de cámara (P = 0,342; Prueba de rango con signo de Wilcoxon). Sin embargo, cuando una cámara se ajustó a la temperatura óptima atractiva de 27 °C y la otra cámara a una temperatura subóptima de 30 °C, los mosquitos demostraron consistentemente una preferencia activa hacia su óptimo (P = 0,029; Prueba de rango con signo de Wilcoxon; valor medio de 78,2% y 21,8% para 27 °C y 30 °C, respectivamente). También probamos el uso de Drosophila para determinar la aplicabilidad con otro modelo de ectotermo y se observaron resultados similares.
Uniformidad de temperatura dentro de las jaulas
La figura 4 muestra la uniformidad de temperatura del aparato de dos cámaras. Una vez ensamblados, los dos lados se ajustaron a 27 ° C y 30 ° C y se dejaron equilibrar según las instrucciones dadas aquí. Todas las partes de la incubadora y el puente están dentro de 0,4 ° C de la temperatura central, excepto (consistentemente) para una esquina. Tenga en cuenta que la esquina inferior izquierda frontal (vista desde el frente) es un punto caliente constante tanto a 27 ° C como a 30 ° C. Esto se debe probablemente a que la electrónica de los controles de la incubadora está situada justo debajo de esa sección de la incubadora, en lugar de las manipulaciones realizadas; Por lo tanto, es probable que sea específico del modelo de incubadora. Esto demuestra que la manipulación y la adición a la incubadora tienen un efecto mínimo en la uniformidad de la temperatura. Además, la temperatura del puente era intermedia entre las dos cámaras, asegurando que los insectos no se enfrentaran a un canal de temperatura por el que tendrían que volar.
Figura 1: Descripción de la jaula para mosquitos. Jaula para mosquitos (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) con aberturas de manga de 12 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes y diagrama del aparato durante la configuración . (A) Jaula de insectos vacía colocada en la incubadora. (B) Tubo de acrílico con una cubierta que se puede abrir (solapa) hecha de cinta adhesiva. (C) Vista lateral de la configuración con un diagrama esquemático. La malla de la manga se apretó alrededor del tubo de acrílico con una banda elástica. Para estos experimentos, se utilizaron mosquitos hembra Ae. aegypti de 3-5 días de edad, apareados. (D) Configuración completa. Dos incubadoras enfrentadas están conectadas por un tubo de acrílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preferencia de temperatura en insectos. El aparato de dos cámaras se ensambló según las instrucciones. Los insectos se insertaron según el protocolo y se dejaron durante 30 minutos para seleccionar su cámara preferida (temperatura) y luego se contaron. Los puntos negros representan réplicas individuales y el azul representa la media. (A) Ambas incubadoras se ajustaron a la misma temperatura (27 ° C) y se observó la preferencia de temperatura de Ae. aegypti. (B) Las incubadoras se ajustaron a diferentes temperaturas (27 °C vs. 30 °C) y la preferencia de temperatura de Ae. Aegypti fue observado. (C) Las incubadoras se ajustaron a diferentes temperaturas (25 °C vs. 28 °C) y se observó preferencia de temperatura de D. melanogaster. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Uniformidad de temperatura dentro de las cámaras y el puente. Como se describe, dos incubadoras, dos jaulas y el puente se ensamblaron según las instrucciones. La temperatura se ajustó a 27 °C en ambas incubadoras y a 30 °C en el centro. Se utilizó una sonda de temperatura para medir la temperatura en el centro de la jaula, las ocho esquinas de la incubadora y el interior del puente. Las temperaturas medidas se muestran aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El estudio describe un nuevo método para observar la preferencia de temperatura en mosquitos. En este método, los mosquitos se liberan en un tubo que está conectado a dos incubadoras con temperaturas controlables independientemente. De esta manera, a los mosquitos se les permite elegir libremente entre dos temperaturas sin interrumpir sus comportamientos naturales y el mecanismo de expresar esta elección (por ejemplo, volar).
Nuestro primer experimento representativo utilizó la temperatura óptima del mosquito de 27 °C en ambas cámaras. Durante las repeticiones de este experimento, se observó que los mosquitos volaban libremente entre ambas jaulas durante los 30 minutos completos, y en todas las réplicas, había números casi iguales en cada una de las dos cámaras. Esto confirmó la intención experimental de permitir a los mosquitos la capacidad de elegir libremente entre jaulas mientras exhiben sus comportamientos naturales (volar). Por el contrario, el segundo experimento representativo utilizó la atractiva temperatura óptima de 27 °C en una cámara y una temperatura subóptima y, por lo tanto, repelente de 30 °C en la segunda cámara. Como era de esperar, los mosquitos seleccionaron consistentemente la cámara de temperatura óptima en alta importancia, incluso cuando cambiamos las incubadoras para evitar sesgos.
También probamos la configuración de un insecto diferente, D. melanogaster (moscas de la fruta), que representa otro organismo modelo ectotérmico. Una cámara se ajustó a la temperatura óptima de D. melanogaster, 25 °C, y la otra se ajustó a 3 °C más alta, 28 °C. Al igual que los mosquitos, las moscas de la fruta también favorecieron su temperatura óptima y evitaron la cámara más cálida. Esto demuestra que el protocolo es adecuado para una variedad de ectotermos.
Descripción de los pasos críticos en el protocolo
El principal paso crítico en el protocolo es el manejo de insectos, ya que genera la posibilidad de que los insectos escapen. Esto se puede prevenir determinando que no hay agujeros lo suficientemente grandes como para escapar en las jaulas utilizadas, que las bandas de goma / bridas utilizadas para asegurar los manguitos de malla al puente están apretadas y que la cubierta para el orificio de inserción de insectos en el puente está firmemente unida y sellada.
También es crucial asegurarse de que los insectos no escapen antes o después del experimento, particularmente cuando los insectos son necesarios para la experimentación aguas abajo o puntos de tiempo posteriores para varias opciones de temperatura. Esto se puede hacer anestesiando a los insectos antes de colocarlos en el puente acrílico (usando hielo para Drosophila y CO 2 para mosquitos) y liberando CO2 en el puente para derribar a los insectos después de los experimentos, antes de calcular. El uso deCO2 es ideal para los mosquitos, ya que no afectará los resultados de comportamiento21. En las moscas, la exposición al CO2 puede alterar su comportamiento de vuelo23, por lo que se recomienda el uso de hielo22.
El conteo de insectos también es un paso crítico, para garantizar que el número de insectos sea igual antes y después del experimento para obtener resultados precisos. Para ello, recomendamos el uso de una pluma deCO2 una vez finalizado el experimento para derribar los insectos que se encuentran en el puente. Esto ayudará a mover los insectos a ambos lados de la cámara, reduciendo así el número de escapados. También destacamos en el protocolo que los insectos pueden ser atrapados en las mangas de las jaulas durante la separación de la jaula; Por lo tanto, asegúrese de que estos se revisen minuciosamente durante el conteo.
Posibles modificaciones y solución de problemas de la técnica
La principal dificultad con esta técnica es la malla flexible de las mangas de la jaula que resulta en huecos o escondites y, por lo tanto, escape o trampa de insectos. Hay algunas modificaciones potenciales, si es necesario, para mejorar la técnica. Sugerimos usar dos o más bandas de goma para garantizar que el puente esté asegurado correctamente entre las cámaras sin dejar ningún espacio potencial para los insectos (la malla suelta crea un espacio oculto para los insectos). También aconsejamos especial cuidado tirar de la manga de malla tensa, como se describe en el paso 2.6, al montar el aparato.
Las incubadoras de factor de forma pequeño generalmente se calientan solo (es decir, no tienen enfriamiento activo), como fue el caso de las incubadoras utilizadas aquí. En consecuencia, el uso de temperaturas alrededor o por debajo de la temperatura ambiente requerirá que el experimento se realice en una habitación fría para garantizar que las temperaturas establecidas para las incubadoras sean tan bajas como se desee.
Además, esta configuración también se puede utilizar para BSL 3, donde se necesita un gabinete de bioseguridad de clase tres (guantera). En este caso, la guantera debe ser lo suficientemente grande como para caber en todo el aparato. El experimento descrito en este protocolo es ideal para experimentos en una guantera porque todo lo requerido estará contenido dentro de la guantera y, lo que es más importante, la posibilidad de que los insectos escapen es mínima.
Finalmente, hay suficiente espacio en las incubadoras para agregar luz externa o una fuente de humedad sin afectar a los insectos en las jaulas. Dependiendo de la especie de insecto o del diseño experimental, una lámpara LED con 1 cm de espesor se puede colocar fácilmente en la parte superior de la jaula dentro de una o ambas incubadoras. Proporcionar luz a ambos y ofrecer una opción de temperatura puede ser un protocolo más realista para algunos diseños experimentales fotosensibles, o solo proporcionar luz (o humedad) a una cámara es una posible modificación del protocolo para evaluar la elección de luz / humedad.
Ventajas de esta técnica en el contexto de los ensayos de preferencia de temperatura de doble elección
El método descrito aquí presenta una alternativa al método tradicional de gradiente de temperatura descrito en estudios previos10,13,14,16. En la mayoría de estos estudios, se utiliza un gran bloque horizontal de aluminio con un gradiente térmico, mientras que el mecanismo de generación de este gradiente varía, incluidos bloques de calefacción / refrigeración, baños de agua, etc. En estos casos, el gradiente de temperatura se produce en la superficie del bloque de aluminio (en lugar de la temperatura del aire en una jaula). En consecuencia, la mayoría (pero no todas) las técnicas alternativas restringen la capacidad de vuelo de los insectos más que este protocolo. Aquí, los insectos pueden volar con relativa libertad entre jaulas, lo que permite una expresión más realista de los comportamientos naturales en la elección. Incluso sería posible ampliar este aparato experimental utilizando jaulas e incubadoras más grandes, por ejemplo, para insectos más grandes.
Además de la ventaja del comportamiento natural, también demostramos una uniformidad de temperatura muy alta dentro de las dos cámaras, lo que permite una puntuación simple y una selección clara de dos cámaras de temperatura individuales grandes. El uso de un diseño binario de cámara grande como este puede reducir el ruido en los datos, donde, por ejemplo, en un aparato de gradiente, cualquier movimiento incidental de los insectos alterará la posición en el gradiente y, por lo tanto, su preferencia de temperatura percibida.
La técnica descrita aquí también es muy simple y de bajo costo. Esta técnica no necesita aparatos adicionales para ajustar las temperaturas (es decir, un baño de agua10 y / o una placa caliente 11,12,13,14,15), ningún equipo especializado además de un tubo de acrílico cortado y agujeros perforados, y ninguna cámara 18,19 o software sofisticado 19 para el análisis. Tales componentes utilizados en otras técnicas pueden ser costosos y / o requieren una experiencia y pruebas significativas para comenzar los experimentos.
Esta técnica también se puede replicar con diferentes dispositivos que utilizan baterías si no hay una fuente de alimentación externa, lo que hace que el sistema sea ideal para realizar experimentos en el campo. Además, el mismo aparato podría modificarse ligeramente para estudiar otras situaciones de preferencia de elección binaria, como luz versus oscuridad, humedad alta / baja, etc., ya sea en el laboratorio o en el campo.
El aparato de tamaño completo en el protocolo es significativamente más pequeño que las configuraciones de gradiente de temperatura, lo que permite un ajuste más fácil dentro de una guantera BSL 3 como se describió anteriormente. Además, los insectos son más fáciles de contener, ya que pueden ser derribados conCO2 al final del experimento, y las jaulas se pueden volver a sellar rápidamente después de la separación del puente. Estas ventajas de contención son ideales para el trabajo BSL 3.
Sin embargo, reconocemos que nuestro aparato solo permite una decisión binaria en lugar de una elección libre a lo largo de un gradiente, que, dependiendo de la aplicación, puede requerir recorridos adicionales para identificar las temperaturas óptimas.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
AHR reconoce el apoyo financiero de Majlis Amanah Rakyat (MARA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
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