Superopløsningsmikroskopi kan give et detaljeret indblik i organiseringen af komponenter inden for det synaptonemale kompleks i meiose. Her demonstrerer vi en protokol til at løse individuelle proteiner af Caenorhabditis elegans synaptonemale kompleks.
Under meiose skal homologe kromosomer genkende og klæbe til hinanden for at muliggøre deres korrekte adskillelse. En af de vigtigste begivenheder, der sikrer interaktionen mellem homologe kromosomer, er samlingen af det synaptonemale kompleks (SC) i meiotisk profase I. Selvom der er lidt sekvenshomologi mellem proteinkomponenter inden for SC blandt forskellige arter, er SC’s generelle struktur blevet stærkt bevaret under evolutionen. I elektronmikrografer fremstår SC som en tredelt, stigelignende struktur sammensat af laterale elementer eller akser, tværgående filamenter og et centralt element.
Imidlertid er det fortsat udfordrende at identificere lokaliseringen af individuelle komponenter i komplekset ved elektronmikroskopi for at bestemme SC’s molekylære struktur. I modsætning hertil giver fluorescensmikroskopi mulighed for identifikation af individuelle proteinkomponenter i komplekset. Men da SC kun er ~ 100 nm bred, kan dens understruktur ikke løses ved diffraktionsbegrænset konventionel fluorescensmikroskopi. Således kræver bestemmelse af SC’s molekylære arkitektur superopløsningslysmikroskopiteknikker såsom struktureret belysningsmikroskopi (SIM), STED-mikroskopi (Stimulated-emission Depletion) eller enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM).
For at opretholde strukturen og interaktionerne mellem individuelle komponenter inden for SC er det vigtigt at observere komplekset i et miljø, der er tæt på dets oprindelige miljø i kimcellerne. Derfor demonstrerer vi en immunohistokemi og billeddannelsesprotokol, der muliggør undersøgelse af SC’s understruktur i intakt, ekstruderet Caenorhabditis elegans kimlinjevæv med SMLM- og STED-mikroskopi. Direkte fastgørelse af vævet til dækslippet reducerer prøvens bevægelse under billeddannelse og minimerer afvigelser i prøven for at opnå den høje opløsning, der er nødvendig for at visualisere SC’s understruktur i dens biologiske sammenhæng.
At reducere antallet af kromosomer med halvdelen under meiose er nøglen til at generere sunde afkom i seksuelt reproducerende organismer. For at opnå denne reduktion i kromosomantal skal homologe kromosomer parres og adskilles under meiose I. For at sikre nøjagtig adskillelse af homologe kromosomer gennemgår kimceller en udvidet profase I, hvor homologe kromosomer parres, synaps og rekombineres for at generere fysiske forbindelser mellem homologer1. SC er opstået som den centrale struktur, der er nøglen til at regulere den korrekte progression gennem meiotisk profase2.
SC er et kompleks, hvis generelle struktur er evolutionært bevaret, selvom der er lidt homologi mellem dets proteinkomponenter. SC blev først identificeret i elektronmikrografer som en tredelt, stigelignende struktur bestående af to laterale elementer eller akser, en central region dannet af tværgående filamenter og et centralt element 3,4. Bestemmelse af organisationen af individuelle komponenter inden for komplekset er nøglen til at fremme vores forståelse af SC’s rolle under meiotisk profase.
Modelorganismen C. elegans er ideel til at studere SC’s struktur og funktion, da dens kimlinjer indeholder et stort antal meiotiske kerner med fuldt samlede SC’er5. Genetiske og biokemiske undersøgelser har afsløret, at kromosomakserne er dannet af tre forskellige cohesinkomplekser6,7 og fire HORMA-domæneproteiner kaldet HTP-1/2/3 og HIM-3 7,8,9,10,11 i C. elegans. I den centrale region af SC er seks proteiner indeholdende spolede domæner blevet identificeret til dato 12,13,14,15,16,17. For at bygge bro over afstanden mellem de to akser dimeriserer SYP-1, -5 og -6 på en head-to-head måde (figur 1), mens tre yderligere proteiner stabiliserer deres interaktion i det centrale element16,17,18,19.
At opnå detaljeret indsigt i organiseringen af disse proteiner er afgørende for at forstå SC’s mange funktioner under meiose. Da bredden af det centrale område af SC kun er ~ 100 nm, kan dens understruktur ikke løses ved diffraktionsbegrænset fluorescensmikroskopi. Imidlertid kan visualisering af komponenter inden for en struktur af denne størrelse let opnås ved mikroskopi med superopløsning. Faktisk er struktureret belysningsmikroskopi (SIM), ekspansionsmikroskopi 20, STED-mikroskopi (stimuleret-emissionsudtømning) 21 og enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM)22,23 dukket op som vigtige værktøjer til at studere SC’s molekylære arkitektur på tværs af arter 16,24,25,26,27,28,29, 30.
For at overvinde opløsningsgrænsen er STED-mikroskopi afhængig af at overlejre det diffraktionsbegrænsede sted for emissionslyset med en doughnutformet stråle fra STED-laseren, som teoretisk indsnævrer punktspredningsfunktionen ned til molekylære dimensioner31,32. Den opløsning, der praktisk talt kan opnås af STED inden for biologiske prøver, forbliver imidlertid inden for et par titalls nanometer i xy33.
Endnu højere opløsning i biologiske prøver kan opnås med SMLM-teknikker. SMLM udnytter de blinkende egenskaber ved specifikke fluorophorer til at løse objekter på subdiffraktionsniveau ved at adskille rumligt overlappende fluorophorer i tide. Prøven afbildes derefter gentagne gange for at fange forskellige delmængder af fluorophorer. Fluoroforernes position i prøven bestemmes derefter ved at tilpasse punktspredningsfunktionen (PSF) til de opnåede signaler på tværs af alle billeder, som kan løse strukturer ned til 15 nm23,34.
Samlet set koder de lokaliserede billeder positionerne for alle fluorophorer. Opløsningen af SMLM bestemmes af mærkningstætheden og fluorophorens blinkende egenskaber. Ifølge Nyquist-Shannon-kriteriet er det umuligt pålideligt at løse objekter, der er mindre end det dobbelte af den gennemsnitlige etiket-til-etiket-afstand. Således er der brug for en høj mærkningstæthed til billeddannelse i høj opløsning. For SC i C. elegans kan en høj mærkningstæthed opnås ved at bruge epitopmærker knyttet til specifikke steder af endogene proteiner ved hjælp af genomredigering. Epitopmærkerne kan derefter farves ved en høj densitet ved hjælp af specifikke monoklonale antistoffer med høje affiniteter19,30. Samtidig skal on-cycle af individuelle fluorophorer være korte nok til at sikre, at rumligt overlappende fluorophorer ikke fanges på samme tid35.
På grund af disse to krav kræver løsning af strukturen af store makromolekylære komplekser som SC billeddannelse et tilstrækkeligt stort antal billeder og kan således tage flere timer. Faldgruben ved lange billeddannelsestider er, at prøver har tendens til at drive på grund af bevægelse af scenen eller små strømme inden for prøvebufferen; Selv små bevægelser i størrelsesordenen 10 nm er skadelige ved NM-opløsning og skal korrigeres for. De ofte anvendte driftkorrektionsmetoder er imidlertid ikke robuste nok til nøjagtigt at overlejre billeder af to kanaler, der er afbildet sekventielt36. Dette er problematisk, fordi biologiske spørgsmål ofte beder om præcis detektion og lokalisering af flere mål inden for samme prøve. For at omgå disse problemer er der udviklet metoder som ratiometrisk billeddannelse. Ratiometrisk billeddannelse muliggør samtidig billeddannelse af flere fluorophorer med overlappende excitations- og emissionsspektre med en efterfølgende tildeling af hvert detekteret signal til dets respektive fluorofor baseret på forholdet mellem intensiteter i spektralt forskellige kanaler37,38.
Derudover kræver undersøgelse af organiseringen af makromolekylære komplekser som SC tredimensionel (3D) information. For at opnå superopløsning i tre dimensioner (3D-SMLM) er en cylindrisk linse indbygget i den optiske bane for det udsendte lys, der forvrænger formen af PSF af en fluorophore afhængigt af dens afstand fra brændplanet. Derfor kan den præcise position af en fluorophore i z-planet ekstrapoleres ved at analysere formen på dets emissionssignal35,39. Kombination af disse fremskridt inden for SMLM giver mulighed for billeddannelse af 3D-organisationen af makromolekylære komplekser, herunder SC.
Den stigelignende organisation af SC, som er afgørende for korrekt rekombination og adskillelse af homologe kromosomer, blev først observeret for næsten 70 år siden i elektronmikroskopi 3,4. Mens den overordnede organisation af SC let løses i elektronmikroskopi, kræver lokaliseringen af individuelle komponenter inden for dette kompleks en mere målrettet tilgang. Med sin bredde på kun ~ 100 nm kan understrukturen af SC ikke løses ved konventionel fluorescensmikroskopi. Imidlertid er superopløsningsmikroskopi blevet en vigtig drivkraft for nye opdagelser om strukturen og funktionen af det synaptonemale kompleks 16,19,24,25,26,27,28,29,30. For at lette denne forskning har vi demonstreret en monteringsprocedure, der gør det muligt at studere arkitekturen af SC inden for C. elegans gonadvæv med SMLM og STED-mikroskopi.
Et kritisk skridt til at optimere opløsningen i SMLM-billeddannelse er direkte tværbinding af kimlinjevævet til en poly-L-lysinbelagt dækslip (trin 4). Den kovalente fastgørelse af vævet til dækslippet er afgørende for at reducere bevægelser i prøven, hvilket ville resultere i store drifter og gøre billeddannelse over lange perioder umulig for SMLM. Derudover fører selv en suboptimal fastgørelse, der efterlader kernerne indeholdende SC’er i en afstand fra dækslippet, til et betydeligt fald i den opnåelige opløsning som følge af sfæriske afvigelser (figur 4). Alternativt til den kovalente fastgørelse, der anvendes her, kan farvet kimlinjevæv også immobiliseres mellem to forseglede dækslips i en lille dråbe billedbuffer19,30. Imidlertid reducerer denne immobiliseringsmetode alvorligt mængden af billedbuffer i prøven fra 1 ml, der anvendes i den optimerede protokol her, til blot et par μL, hvilket vil resultere i en forsuring af billedbufferen og alvorligt reducere den tid, som prøven kan afbildes 38,53,54.
Lange anskaffelsestider for både SMLM- og STED-mikroskopi begrænser brugen af disse metoder til billeddannelse af kemisk fikserede prøver. Her sikrer paraformaldehydfiksering, at SC’s struktur bevares under prøveforberedelse og billeddannelse. På trods af de forholdsregler, der er taget her for at afbilde SC i intakt væv, er den resulterende struktur af SC efter fiksering ikke nødvendigvis identisk med strukturen i sin oprindelige tilstand i en levende organisme. Da et enkelt billede af den faste SC repræsenterer et enkelt “øjebliksbillede” af den biologiske struktur, forbliver denne tilgang desuden blind for dynamikken i den oprindelige struktur in vivo.
Imidlertid kan information om dynamikken og variabiliteten af makromolekylære strukturer også opnås ved at erhverve ikke kun en enkelt, men mange “snapshots”. Selvom denne tilgang kan løse ændringer i SC’s struktur under pachyten19, er der flere faktorer, der begrænser antallet af billeder, der kan erhverves fra en enkelt prøve udarbejdet ved hjælp af denne protokol. For det første fører de høje laserkræfter, der anvendes under billedoptagelse, til permanent blegning af fluorophorerne og udelukker billeddannelse af tilstødende områder af interesse eller flere z-planer, hvorved antallet af billeder, der kan erhverves fra en enkelt prøve, reduceres betydeligt. For det andet er prøve-/vævstætheden på den dækslip, der er udarbejdet ved denne metode, lav, hvilket væsentligt begrænser antallet af billeder, der kan erhverves fra en enkelt coverslip. Den lave prøvetæthed forbyder også brugen af automatiserede billedoptagelsesrørledninger, der hjalp med at kaste lys over andre biologiske spørgsmål 34,55,56,57,58,59. Prøvetætheden kan dog øges lidt af en erfaren bruger.
Protokollen, der præsenteres her, er optimeret til at opnå en høj mærkningstæthed, der er nødvendig for at opnå optimal opløsning i SMLM35. Mens tidligere protokoller kovalent binder vævet til dækslippet før immunostaining16, krydsbinder denne nye protokol vævet til dækslippet først, efter at prøverne blev farvet i opløsning. Denne ændring gør det muligt for de antistoffer, der anvendes til immunmærkning, frit at få adgang til vævet fra alle sider, mens vævets kovalente fastgørelse til dækslippet kan begrænse antistoffer fra at nå kernerne tættest på dækslippet og derved reducere graden af mærkning. Sammen forbedrer de ændringer, der er beskrevet her, opløsningen fra 40-50 nm (FRC-opløsning)16 til 30-40 nm (denne protokol).
Det er vigtigt, at mens en høj mærkningstæthed og en høj koncentration af antistoffer er afgørende for SMLM, fandt vi, at bedre STED-mikroskopibilleder opnås ved hjælp af lavere antistofkoncentrationer (trin 3). Ved en opløsning på snesevis af nanometer bliver størrelsen af de molekyler, der bruges til at mærke proteinet af interesse, stadig vigtigere. Vi anvendte derfor F(ab’)2 fragmenter, der er halvt så store som antistoffer i fuld længde. Forbedringen i lokal kontrast på grund af en mindre signalkilde og derfor opløsning opnået ved denne ændring sammenlignet med anvendelse af sekundære antistoffer i fuld længde tillod opløsningen af de to C-termini af SYP-5 inden for den centrale region af TauSTED, som ikke løses af konventionel STED ved hjælp af antistoffer i fuld længde (16 og data ikke vist). Vi forventer, at denne optimerede protokol til billeddannelse af SC’er i intakte C. eleganskimlinjer vil lette undersøgelsen af SC’s struktur-funktionsforhold under meiose.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Jonas Ries og Ries-laboratoriet for at dele billedbuffere til SMLM-billeddannelse. Vi takker også Yumi Kim for C. elegans-stammen, der anvendes i denne protokol, og Abby F. Dernburg for kylling-anti-HTP-3-antistoffet. Vi takker Marko Lampe og Stefan Terjung fra Advanced Light Microscopy Facility hos EMBL Heidelberg for deres støtte til brugen af Olympus iXplore SPIN SR konfokalmikroskop. Dette arbejde blev støttet af European Molecular Biology Laboratory og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation – 452616889, SK). Vi anerkender adgangen og tjenesterne fra Imaging Centre ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), generøst støttet af Boehringer Ingelheim Foundation.
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |