Superoppløsningsmikroskopi kan gi et detaljert innblikk i organiseringen av komponenter i det synaptonemale komplekset i meiose. Her demonstrerer vi en protokoll for å løse individuelle proteiner i Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleks.
Under meiose må homologe kromosomer gjenkjenne og holde seg til hverandre for å tillate riktig segregering. En av de viktigste hendelsene som sikrer samspillet mellom homologe kromosomer er samlingen av det synaptonemale komplekset (SC) i meiotisk profase I. Selv om det er lite sekvens homologi mellom proteinkomponenter i SC blant forskjellige arter, har den generelle strukturen til SC blitt svært bevart under evolusjonen. I elektronmikrografier fremstår SC som en tredelt, stigelignende struktur sammensatt av laterale elementer eller akser, tverrgående filamenter og et sentralt element.
Imidlertid er det fortsatt utfordrende å nøyaktig identifisere lokaliseringen av individuelle komponenter i komplekset ved elektronmikroskopi for å bestemme molekylstrukturen til SC. I motsetning til dette tillater fluorescensmikroskopi identifisering av individuelle proteinkomponenter i komplekset. Men siden SC bare er ~ 100 nm bred, kan dens understruktur ikke løses ved diffraksjonsbegrenset konvensjonell fluorescensmikroskopi. Bestemmelse av den molekylære arkitekturen til SC krever således superoppløsningslysmikroskopiteknikker som strukturert belysningsmikroskopi (SIM), STIMULERT utslippsuttømming (STED) mikroskopi eller enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM).
For å opprettholde strukturen og samspillet mellom individuelle komponenter i SC, er det viktig å observere komplekset i et miljø som er nær sitt opprinnelige miljø i kimcellene. Derfor demonstrerer vi en immunhistokjemi- og avbildningsprotokoll som gjør det mulig å studere substrukturen til SC i intakt, ekstrudert Caenorhabditis elegans germline vev med SMLM og STED-mikroskopi. Direkte festing av vevet til dekselet reduserer bevegelsen av prøvene under avbildning og minimerer avvik i prøven for å oppnå den høye oppløsningen som er nødvendig for å visualisere understrukturen til SC i sin biologiske sammenheng.
Å redusere antall kromosomer med halvparten under meiose er nøkkelen til å generere sunne avkom i seksuelt reproduserende organismer. For å oppnå denne reduksjonen i kromosomantall, må homologe kromosomer parre og segregere under meiose I. For å sikre nøyaktig segregering av homologe kromosomer, gjennomgår kimceller en utvidet profase I, hvor homologe kromosomer parrer, synapser og rekombinerer for å generere fysiske koblinger mellom homologer1. SC har dukket opp som den sentrale strukturen som er nøkkelen til å regulere riktig progresjon gjennom meiotisk profase2.
SC er et kompleks hvis generelle struktur er evolusjonært bevart, selv om det er lite homologi mellom proteinkomponentene. SC ble først identifisert i elektronmikrografier som en tredelt, stigelignende struktur bestående av to laterale elementer eller akser, en sentral region dannet av tverrgående filamenter og et sentralt element 3,4. Å bestemme organisasjonen av individuelle komponenter i komplekset er nøkkelen til å fremme vår forståelse av SCs rolle under meiotisk profase.
Modellorganismen C. elegans er ideell til å studere strukturen og funksjonen til SC siden dens kimlinjer inneholder et stort antall meiotiske kjerner med fullt montert SCs5. Genetiske og biokjemiske studier har vist at kromosomaksene dannes av tre forskjellige kohesinkomplekser6,7 og fire HORMA-domeneproteiner kalt HTP-1/2/3 og HIM-3 7,8,9,10,11 i C. elegans. I den sentrale regionen av SC har seks proteiner som inneholder spoledomener blitt identifisert til dags dato 12,13,14,15,16,17. For å bygge bro over avstanden mellom de to aksene, dimeriserer SYP-1, -5 og -6 på en head-to-head måte (figur 1), mens tre ekstra proteiner stabiliserer samspillet i det sentrale elementet16,17,18,19.
Å få detaljert innsikt i organiseringen av disse proteinene er avgjørende for å forstå SCs mange funksjoner under meiose. Siden bredden på den sentrale regionen av SC er bare ~ 100 nm, kan dens understruktur ikke løses ved diffraksjonsbegrenset fluorescensmikroskopi. Imidlertid er visualisering av komponenter i en struktur av denne størrelsen lett oppnåelig ved superoppløsningsmikroskopi. Faktisk har strukturert belysningsmikroskopi (SIM), ekspansjonsmikroskopi 20, STIMUTTØMMING (STED) mikroskopi 21 og enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM)22,23 dukket opp som viktige verktøy for å studere den molekylære arkitekturen til SC på tvers av arter 16,24,25,26,27,28,29, 30.
For å overvinne oppløsningsgrensen er STED-mikroskopi avhengig av å overlegge det diffraksjonsbegrensede stedet for utslippslyset med en smultringformet stråle fra STED-laseren, som teoretisk innsnevrer punktspredningsfunksjonen ned til molekylære dimensjoner31,32. Imidlertid forblir oppløsningen som praktisk kan oppnås av STED innen biologiske prøver i området noen få titalls nanometer i xy33.
Enda høyere oppløsning i biologiske prøver kan oppnås med SMLM-teknikker. SMLM utnytter de blinkende egenskapene til spesifikke fluoroforer for å løse objekter på subdiffraksjonsnivå ved å separere romlig overlappende fluoroforer i tide. Prøven blir deretter avbildet gjentatte ganger for å fange forskjellige undergrupper av fluoroforer. Plasseringen av fluoroforene i prøven bestemmes deretter ved å tilpasse punktspredningsfunksjonen (PSF) til de oppnådde signalene på tvers av alle bilder, som kan løse strukturer ned til 15 nm23,34.
Samlet koder de lokaliserte bildene posisjonene til alle fluoroforene. Oppløsningen til SMLM bestemmes av merketettheten og de blinkende egenskapene til fluoroforen. I henhold til Nyquist-Shannon-kriteriet er det umulig å løse objekter som er mindre enn dobbelt så mange som gjennomsnittlig etikett-til-etikett-avstand. Dermed er det nødvendig med en høy merketetthet for høyoppløselig bildebehandling. For SC i C. elegans kan en høy merkingstetthet oppnås ved å bruke epitopkoder festet til bestemte steder av endogene proteiner ved hjelp av genomredigering. Epitopmerkene kan deretter farges med høy tetthet ved bruk av spesifikke monoklonale antistoffer med høy affinitet19,30. Samtidig må syklusen til individuelle fluoroforer være kort nok til å sikre at romlig overlappende fluoroforer ikke fanges opp samtidig35.
På grunn av disse to kravene krever løsning av strukturen til store makromolekylære komplekser som SC å avbilde et tilstrekkelig stort antall bilder, og kan dermed ta flere timer. Fallgruven med lange bildetider er at prøver har en tendens til å drive på grunn av bevegelse av scenen eller små strømmer i prøvebufferen; Selv små bevegelser i størrelsesorden 10 nm er skadelige ved NM-oppløsning og må korrigeres for. Avdriftskorreksjonsmetodene som vanligvis brukes, er imidlertid ikke robuste nok til å nøyaktig legge over bilder av to kanaler som er avbildet sekvensielt36. Dette er problematisk fordi biologiske spørsmål ofte ber om presis deteksjon og lokalisering av flere mål innenfor samme prøve. For å omgå disse problemene har metoder som ratiometrisk avbildning blitt utviklet. Ratiometrisk avbildning muliggjør samtidig avbildning av flere fluoroforer med overlappende eksitasjons- og emisjonsspektra, med en påfølgende tildeling av hvert detektert signal til dets respektive fluorofor basert på forholdet mellom intensiteter i spektralt distinkte kanaler37,38.
I tillegg krever studier av organisering av makromolekylære komplekser som SC tredimensjonal (3D) informasjon. For å oppnå superoppløsning i tre dimensjoner (3D-SMLM), er en sylindrisk linse innlemmet i den optiske banen til det utstrålede lyset som forvrenger formen på PSF av en fluorofor, avhengig av avstanden fra fokalplanet. Derfor kan den nøyaktige posisjonen til en fluorofor i z-planet ekstrapoleres ved å analysere formen på utslippssignalet35,39. Kombinere disse fremskrittene i SMLM muliggjør avbildning av 3D-organisasjonen av makromolekylære komplekser, inkludert SC.
Den stigelignende organisasjonen av SC, som er avgjørende for riktig rekombinasjon og segregering av homologe kromosomer, ble først observert for nesten 70 år siden i elektronmikroskopi 3,4. Mens den overordnede organisasjonen av SC lett løses i elektronmikroskopi, krever lokalisering av individuelle komponenter i dette komplekset en mer målrettet tilnærming. Med sin bredde på bare ~ 100 nm, kan understrukturen til SC ikke løses ved konvensjonell fluorescensmikroskopi. Imidlertid har superoppløsningsmikroskopi blitt en viktig driver for nye funn om strukturen og funksjonen til det synaptonemale komplekset 16,19,24,25,26,27,28,29,30. For å lette denne forskningen har vi demonstrert en monteringsprosedyre som gjør det mulig å studere arkitekturen til SC i C. elegans gonadvev med SMLM og STED-mikroskopi.
Et kritisk skritt for å optimalisere oppløsningen i SMLM-avbildning er direkte kryssbinding av germlinevevet til en poly-L-lysinbelagt deksel (trinn 4). Den kovalente festingen av vevet til dekselet er viktig for å redusere bevegelser i prøven som vil resultere i store drifter og gjøre avbildning over lange perioder for SMLM umulig. I tillegg fører selv et suboptimalt vedlegg som etterlater kjernene som inneholder SCs i avstand fra dekselet, til et betydelig fall i den oppnåelige oppløsningen som følge av sfæriske avvik (figur 4). Alternativt til det kovalente vedlegget som brukes her, kan farget kimlinjevev også immobiliseres mellom to forseglede deksler i en liten dråpe bildebuffer19,30. Imidlertid reduserer denne immobiliseringsmetoden volumet av bildebuffer i prøven sterkt fra 1 ml som brukes i den optimaliserte protokollen her til bare noen få μL, noe som vil resultere i en forsuring av bildebufferen og redusere tiden som prøven kan avbildes 38,53,54 for alvorlig.
Lang innsamlingstid for både SMLM- og STED-mikroskopi begrenser bruken av disse metodene til avbildning av kjemisk faste prøver. Her sikrer paraformaldehydfiksering at strukturen til SC blir bevart under prøvepreparering og avbildning. Til tross for forholdsreglene som er tatt her for å avbilde SC i intakt vev, er den resulterende strukturen til SC etter fiksering ikke nødvendigvis identisk med strukturen i sin opprinnelige tilstand i en levende organisme. Videre, siden et enkelt bilde av den faste SC representerer et enkelt “øyeblikksbilde” av den biologiske strukturen, forblir denne tilnærmingen blind for dynamikken i den opprinnelige strukturen in vivo.
Imidlertid kan informasjon om dynamikken og variabiliteten til makromolekylære strukturer også oppnås ved å skaffe seg ikke bare en enkelt, men mange “øyeblikksbilder”. Selv om denne tilnærmingen kan løse endringer i strukturen til SC under pachyten19, er det flere faktorer som begrenser antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt prøve utarbeidet ved hjelp av denne protokollen. For det første fører de høye laserkreftene som brukes under bildeoppkjøp til permanent bleking av fluoroforene og utelukker avbildning av tilstøtende områder av interesse eller flere z-plan, og reduserer dermed antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt prøve. For det andre er prøven / vevstettheten på dekselet fremstilt ved denne metoden lav, noe som betydelig begrenser antall bilder som kan anskaffes fra en enkelt coverslip. Den lave prøvetettheten forbyr også bruk av automatiserte bildeinnsamlingsrørledninger som bidro til å kaste lys over andre biologiske spørsmål 34,55,56,57,58,59. Prøvetettheten kan imidlertid økes litt av en erfaren bruker.
Protokollen som presenteres her er optimalisert for å oppnå en høy merketetthet som er nødvendig for å oppnå optimal oppløsning i SMLM35. Mens tidligere protokoller kovalent fester vevet til dekselet før immunostaining16, kryssbinder denne nye protokollen vevet til dekselet først etter at prøvene ble farget i oppløsning. Denne modifikasjonen gjør at antistoffene som brukes til immunmerking, fritt kan få tilgang til vevet fra alle sider, mens den kovalente festingen av vevet til dekselet kan begrense antistoffer fra å nå kjernene nærmest dekselet, og dermed redusere graden av merking. Sammen forbedrer modifikasjonene beskrevet her oppløsningen fra 40-50 nm (FRC-oppløsning) 16 til 30-40 nm (denne protokollen).
Det er viktig at mens en høy merketetthet og en høy konsentrasjon av antistoffer er avgjørende for SMLM, fant vi at bedre STED-mikroskopibilder oppnås ved bruk av lavere antistoffkonsentrasjoner (trinn 3). Ved en oppløsning på titalls nanometer blir størrelsen på molekylene som brukes til å merke proteinet av interesse stadig viktigere. Vi benyttet derfor F(ab’)2-fragmenter som er halvparten så store som antistoffer i full lengde. Forbedringen i lokal kontrast på grunn av en mindre signalkilde, og derfor oppløsning oppnådd ved denne modifikasjonen sammenlignet med bruk av sekundære antistoffer i full lengde, tillot oppløsning av de to C-termini av SYP-5 i den sentrale regionen av TauSTED, som ikke løses ved konvensjonell STED ved bruk av fulllengde antistoffer (16 og data ikke vist). Vi forventer at denne optimaliserte protokollen for avbildning av SC-er i intakte C. eleganskimlinjer vil gjøre det lettere å undersøke struktur-funksjonsforholdet mellom SC under meiose.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jonas Ries og Ries-laboratoriet for deling av bildebuffere for SMLM-bildebehandling. Vi takker også Yumi Kim for C. elegans stammen som brukes i denne protokollen og Abby F. Dernburg for kylling-anti-HTP-3 antistoff. Vi takker Marko Lampe og Stefan Terjung fra Advanced Light Microscopy Facility ved EMBL Heidelberg for deres støtte i bruk av Olympus iXplore SPIN SR konfokalmikroskop. Dette arbeidet ble støttet av European Molecular Biology Laboratory og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation – 452616889, SK). Vi anerkjenner tilgangen og tjenestene som tilbys av Imaging Centre ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), sjenerøst støttet av Boehringer Ingelheim Foundation.
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |