在这里,我们提出了一种使用胚胎干细胞开发转基因小鼠模型的方案,特别是对于大DNA敲入(KI)。该协议使用CRISPR / Cas9基因组编辑进行调整,与传统的同源重组介导的线性DNA靶向方法相比,KI效率显着提高。
CRISPR / Cas9系统使得通过使用受精受精卵的直接基因组编辑来开发转基因小鼠成为可能。然而,尽管通过诱导小插入缺失突变来开发基因敲除小鼠的效率就足够了,但胚胎基因组编辑用于制造大尺寸DNA敲入(KI)的效率仍然很低。因此,与胚胎中的直接KI方法相比,使用胚胎干细胞(ESCs)进行基因靶向,然后进行胚胎注射以发育嵌合体小鼠仍然具有几个优点(例如, 体外高通量靶向,多等位基因操作,以及可以在短时间内进行 Cre 和 flox 基因操作)。此外,体 外难以处理胚胎的菌株,如BALB/c,也可用于ESC靶向。该协议描述了ESC中大尺寸DNA(几kb)KI的优化方法,方法是应用CRISPR / Cas9介导的基因组编辑,然后进行嵌合体小鼠生产以开发基因操纵的小鼠模型。
生产转基因小鼠并分析其表型使我们能够在体内详细了解特定的基因功能。在生命科学领域使用基因修饰动物模型发现了许多重要发现。此外,自从使用CRISPR / Cas91的基因组编辑技术报道以来,使用转基因小鼠的研究已迅速扩展到许多实验室2,3。通过 CRISPR/Cas9 对小鼠受精卵进行基因组编辑在开发短 DNA 修饰方面达到了可接受的效率,例如插入缺失突变导向基因敲除4、单核苷酸替代或使用单链寡核苷酸 (ssODN) 作为敲入 (KI) 供体的短肽标签插入5。另一方面,与短尺寸DNA修饰6,7相比,通过基因组编辑将大DNA片段转化为受精卵的KI效率仍然较低。此外,很难使用诸如BALB / c之类的小鼠品系,这是免疫学等特定研究领域的重要菌株,用于基于受精卵的基因组编辑,因为它们的植入前胚胎容易受到体外操作。
开发转基因小鼠模型的另一种方法是使用胚胎干细胞(ESC)靶向技术,然后将ESC注射到植入前胚胎中以产生嵌合体8,9,10,这仍然是常规方法。虽然在传统的ESC靶向方法中,获得准确KI-ESC克隆的采集率不是很高,但与受精卵基因组编辑相比,ESC靶向具有一些优势,特别是对于长DNA KI。例如,长DNA片段(>几kb)进入受精卵基因组的KI效率不太明显6,7,甚至需要许多受精卵才能发育出一个系的KI小鼠,这在目前的动物实验角度是不可取的。与受精卵基因组编辑相比,长DNA靶向ESC然后产生嵌合体所需的胚胎明显少于受精卵基因组编辑。此外,即使来自BALB / c的植入前胚胎容易受到体外操作,其ESCs也可以像其他感受态129或F1背景ESC一样在体外11中维持和处理,因此适用于嵌合体生产。然而,即使靶向载体包含5’和3’同源臂和耐药基因盒进行正向或阴性选择,由于随机基因组整合8,10的频率较高,ESC的常规KI效率普遍不足,因此需要一种具有精确ESC靶向效率的改进方法。最近,我们报道了一种经过优化的ESC KI方法,该方法使用基于CRISPR / Cas9的基因组编辑来实现比传统靶向方法更高的KI效率11。我们在这里描述的方法基于该程序,该程序使长DNA(>几到10 kb)KI到ESC具有可接受的效率,无需选择药物即可进行常规工作;因此,载体构建过程将容易得多,并且需要更短的时间,或者细胞培养时间也会明显缩短。
ESC的基因靶向随后的嵌合体生产已被常规用于开发基因操纵的小鼠。然而,即使靶向载体包含长(通常为>几kb)同源臂,具有阳性或阴性药物选择基因盒,基因敲入效率仍然很低。我们的协议引入了一种经过调整的ESC KI长外源DNA方法,该方法使用没有任何药物选择盒的环状质粒作为靶向载体,并伴有Cas9-RNP介导的基因组编辑,其常规工作的效率可接受。因此,与传统的ESC靶向相比,该协议可以帮助大大减少生产转基因嵌合小鼠所需的时间。
在该协议中,我们使用CRISPR / Cas9-RNP诱导基因组中的位点特异性双链断裂,并且使用环状质粒作为靶向载体而不是线性化载体。线性化质粒通常用作基因KI的靶向载体,因为它们提高了基因组整合的效率8,9,10。然而,即使载体包含同源臂9,许多基因组整合也是非特异性的。另一方面,环状质粒很少用作靶向载体,因为它们难以整合到ESC12或成纤维细胞13的基因组中。因此,应用环状质粒作为靶向载体并伴有CRISPR / Cas9介导的基因组编辑可能会最大限度地减少非特异性随机整合,但最大限度地提高与ESC基因组的位点特异性整合。值得注意的是,CRISPR/Cas9对双链断裂的诱导效率非常重要14,因此必须使用gRNA以高效率诱导双链断裂。当KI效率太低时,应考虑重新设计gRNA。在图2所示的情况下,40.9%的ESC克隆显示出KI特异性条带。事实上,作为该研究所的核心实验室,我们通常通过此处描述的方法使用ESC进行基因靶向,并且对于1-2 kb序列(如Cre,CreERT或荧光报告基因)实现了10%-50%的KI效率,尽管根据基因位点存在一些差异。我们使用这种方法成功KI的最长DNA序列是Rosa26位点的约11.2 kb,效率为12.2%(41个分析菌落中的5个KI菌落)。
还需要注意的是,该方案使用八细胞或桑葚期胚胎作为ESC显微注射的接受者,而不是囊胚期胚胎。虽然我们没有在本文中进行比较实验,但一些报告表明,与将ESC注射到囊胚中相比,将ESC注射到八细胞或桑葚期胚胎中显着提高了ESC对嵌合后代的贡献效率15,16,17,18.事实上,各种ESC系的ESC注射,包括C57BL / 6,B6-129 F1和BALB / c,通常会导致一些(但不是全部)后代的高毛色嵌合体发展(见图4)。该方法的局限性在于注射到植入前胚胎中的ESC不能总是在嵌合体19,20中对生殖细胞做出贡献。ESC的种系传播将取决于每个ESC克隆的质量19。因此,开发多个ESC克隆系作为稳定嵌合小鼠生产的备份将是有利的。总之,这里介绍的方案使用简单的靶向载体,其中仅包括KI的每个同源臂和目的基因,而没有任何耐药盒。因此,与传统的ESC靶向技术相比,载体构建将容易得多,并且培养时间可以缩短。这将有助于快速、便利地生产各种类型的转基因小鼠,以供生命科学的未来分析。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢大阪大学生物技术研究与开发(非营利组织)的Saki Nishioka,以及东京大学医学科学研究所的菊池澪和坂本玲子的出色技术援助。这项工作得到了以下机构的支持:文部科学省(MEXT)/日本科学促进会(JSPS)KAKENHI向MI(JP19H05750,JP21H05033)和MO(20H03162)提供的赠款;进化科学与技术核心研究(CREST),日本科学技术振兴机构(JST)授予MI(JPMJCR21N1);尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所到MI(R01HD088412);比尔和梅琳达·盖茨基金会到MI(大挑战探索资助INV-001902);大阪大学微生物病害研究所对MI和MO的共同研究项目资助。
BALB/c ESC | – | – | ESC developed from BALB/c strain |
Bambanker | Nippon Genetics | CS-02-001 | Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere |
Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081059 | Section 3.2 and elsewhere. |
CHIR99021 | FUJIFILM Wako | 038-23101 | Section 4.3 |
CreERT gene fragment | GeneWiz | Section 1.1. | |
CRISPR-Cas9 crisprRNA | IDT | crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072534 | tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere. |
DMEM | Nacalai | 08458-45 | MEF medium. Section 2.3 and elsewhere |
Duplex buffer | IDT | 1072534 | RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere. |
FastGene Gel/PCR Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Section 1.1 and 1.2. |
GlutaMax | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutatime substrate |
hCG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
In-Fusion HD Cloning Kit | Clontech | 639648 | DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere |
JM8.A3 ESC | EuMMCR | – | ESC developed from C57BL/6N strain |
Knock-out DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium. |
KSOM | Merck | MR-121-D | Section 6.3 and 6.9. |
Leukemia inhibitory factor | FUJIFILM Wako | 125-05603 | Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol. |
Neon Electroporation system | Thermo Fisher | MPK5000 | Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2. |
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade | Takara | U0490B | Section 1.6. |
PD0325901 | FUJIFILM Wako | 162-25291 | Section 4.3 |
PMSG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
Tail lysis buffer | Nacalai | 06169-95 | Section 5.5. |
Trypsin-EDTA | Nacalai | 32777-15 | Section 2.2 and elsewhere |
V6.5 ESC | – | – | ESC developed from B6J-129 F1 strain |
X-ray irradiation device | Hitachi | MBR-1618R-BE | Section 2.6. |