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Developmental Biology

CRISPR/Cas9介导的胚胎干细胞中的高效基因靶向,用于开发基因操纵的小鼠模型

Published: August 24, 2022 doi: 10.3791/64385
* These authors contributed equally

Summary

在这里,我们提出了一种使用胚胎干细胞开发转基因小鼠模型的方案,特别是对于大DNA敲入(KI)。该协议使用CRISPR / Cas9基因组编辑进行调整,与传统的同源重组介导的线性DNA靶向方法相比,KI效率显着提高。

Abstract

CRISPR / Cas9系统使得通过使用受精受精卵的直接基因组编辑来开发转基因小鼠成为可能。然而,尽管通过诱导小插入缺失突变来开发基因敲除小鼠的效率就足够了,但胚胎基因组编辑用于制造大尺寸DNA敲入(KI)的效率仍然很低。因此,与胚胎中的直接KI方法相比,使用胚胎干细胞(ESCs)进行基因靶向,然后进行胚胎注射以发育嵌合体小鼠仍然具有几个优点(例如, 体外高通量靶向,多等位基因操作,以及可以在短时间内进行 Cre flox 基因操作)。此外,体 外难以处理胚胎的菌株,如BALB/c,也可用于ESC靶向。该协议描述了ESC中大尺寸DNA(几kb)KI的优化方法,方法是应用CRISPR / Cas9介导的基因组编辑,然后进行嵌合体小鼠生产以开发基因操纵的小鼠模型。

Introduction

生产转基因小鼠并分析其表型使我们能够在体内详细了解特定的基因功能。在生命科学领域使用基因修饰动物模型发现了许多重要发现。此外,自从使用CRISPR / Cas91的基因组编辑技术报道以来,使用转基因小鼠的研究已迅速扩展到许多实验室23。通过 CRISPR/Cas9 对小鼠受精卵进行基因组编辑在开发短 DNA 修饰方面达到了可接受的效率,例如插入缺失突变导向基因敲除4、单核苷酸替代或使用单链寡核苷酸 (ssODN) 作为敲入 (KI) 供体的短肽标签插入5。另一方面,与短尺寸DNA修饰67相比通过基因组编辑将大DNA片段转化为受精卵的KI效率仍然较低。此外,很难使用诸如BALB / c之类的小鼠品系,这是免疫学等特定研究领域的重要菌株,用于基于受精卵的基因组编辑,因为它们的植入前胚胎容易受到体外操作。

开发转基因小鼠模型的另一种方法是使用胚胎干细胞(ESC)靶向技术,然后将ESC注射到植入前胚胎中以产生嵌合体8910这仍然是常规方法。虽然在传统的ESC靶向方法中,获得准确KI-ESC克隆的采集率不是很高,但与受精卵基因组编辑相比,ESC靶向具有一些优势,特别是对于长DNA KI。例如,长DNA片段(>几kb)进入受精卵基因组的KI效率不太明显67,甚至需要许多受精卵才能发育出一个系的KI小鼠,这在目前的动物实验角度是不可取的。与受精卵基因组编辑相比,长DNA靶向ESC然后产生嵌合体所需的胚胎明显少于受精卵基因组编辑。此外,即使来自BALB / c的植入前胚胎容易受到体外操作,其ESCs也可以像其他感受态129或F1背景ESC一样在体11中维持和处理,因此适用于嵌合生产。然而,即使靶向载体包含5'和3'同源臂和耐药基因盒进行正向或阴性选择,由于随机基因组整合810的频率较高,ESC的常规KI效率普遍不足因此需要一种具有精确ESC靶向效率的改进方法。最近,我们报道了一种经过优化的ESC KI方法,该方法使用基于CRISPR / Cas9的基因组编辑来实现比传统靶向方法更高的KI效率11。我们在这里描述的方法基于该程序,该程序使长DNA(>几到10 kb)KI到ESC具有可接受的效率,无需选择药物即可进行常规工作;因此,载体构建过程将容易得多,并且需要更短的时间,或者细胞培养时间也会明显缩短。

Protocol

所有小鼠实验均由东京大学(批准号PA17-63)和大阪大学(批准号Biken-AP-H30-01)的机构动物护理和使用委员会批准,并根据其指南以及ARRIVE指南(https://arriveguidelines.org)进行。

1. 靶向载体构建

  1. 通过 PCR 扩增 KI 盒(此处为 CreERT,PCR 的模板 DNA 最初来自一家商业基因合成公司)和大约 1 kb 的 5'-或 3'-同源臂片段。对于DNA克隆(步骤1.3),在每个PCR引物的5'末端添加15-mer重叠序列。通过琼脂糖凝胶电泳纯化 PCR DNA 片段,然后使用 DNA 纯化试剂盒提取 DNA 片段。
  2. 使用适当的限制性内切酶对骨架质粒(例如 pUC19 或 pBS)进行线性化,该限制性内切酶在多克隆位点的某个位置进行克隆。然后,使用DNA纯化试剂盒纯化消化的质粒。
  3. 根据制造商的说明,使用DNA克隆试剂盒将每个PCR片段(例如,5'同源臂,3'同源臂)和KI序列同时克隆到消化的质粒中。
  4. 通过在水浴中在42°C下加热1分钟,使用构建的质粒(步骤1.3)转化感受态细胞,然后将它们接种在含有适当浓度的抗生素如氨苄西林或卡那霉素的LB板上。培养它们过夜以进行抗性克隆选择。
  5. 使用 200 μL 移液器吸头拾取几个(4 至 8 个)单独的菌落,并将吸头转移到含有适当抗生素(100 μg/mL 氨苄西林或 20 μL/mL 卡那霉素)的 3 mL 液体 LB 中,并在 37 °C 下振荡培养过夜。
  6. 第二天,根据制造商的说明,使用无内毒素级商业质粒纯化试剂盒纯化质粒。通过Sanger测序确认质粒中的克隆序列。使用无核酸酶水将质粒浓度调节在 1 μg DNA/μL。使用质粒作为基因靶向载体。

2. 制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为ESC的饲养细胞

  1. 通过颈椎脱位处死8-10周龄怀孕ICR雌性小鼠(后14.5天)。用70%(v/v)乙醇消毒好擦拭腹部,用眼眶剪刀和镊子切开腹部,恢复含胎儿的子宫。
  2. 将子宫放入含有 10 mL 磷酸盐牛血清 (PBS) 的 100 mm 培养皿中,该培养皿含有 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。使用眼眶剪刀和镊子从胎儿身上取出胎盘和胚胎外组织。使用眼眶剪刀切碎胎儿,并将含有切碎胎儿细胞的PBS溶液转移到50 mL锥形管中。
  3. 在4°C下以280× g 离心5分钟,并通过抽吸弃去上清液。加入10mL的0.25%(w / v)胰蛋白酶-EDTA溶液,通过移液充分混合,然后使用水浴在37°C下孵育10分钟用于胰蛋白酶消化。
  4. 加入 20 mL MEF 培养基(含有 10% (v/v) 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM)以停止酶促反应,通过温和倒置充分混合,并在 4 °C 下以 280 x g 离心 5 分钟。 抽吸弃去上清液,加入 10 mL MEF 培养基,并通过移液充分混合。
  5. 将细胞悬液接种在几个新的 100 mm 培养皿中(为一个 100 mm 培养皿准备与胎儿数量相同数量的培养皿,用 10 mL MEF 培养基制备)。接种后4至5小时更换培养基以去除未附着的细胞并让附着的MEF生长。当细胞达到~80%汇合时,使用胰蛋白酶传代细胞。
  6. 将含有增殖 MEF 的培养皿放入 MEF 培养基中,接种后约 12-15 天,放入 X 射线照射装置中。根据制造商的说明,用50 Gy的X射线(总计)曝光MEF,以停止细胞周期。
  7. 通过在37°C下为一个100mm培养皿中加入2mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA来胰蛋白酶消化辐照的MEF,然后加入4mL的MEF培养基以停止胰蛋白酶消化并将细胞悬液收集在新的50mL管中。
  8. 用新鲜的MEF培养基在4°C下以280× g 离心5分钟洗涤MEF,使用台盼蓝染色的细胞计数器计数细胞数,并在细胞冷冻培养基中以1.6 x 106 个细胞/管冷冻。储存直至使用;细胞可以在液氮中稳定储存数年。

3. Cas9-RNP-DNA混合物制备

  1. 通过移液将tracrRNA和crisprRNA溶解在稀释缓冲液中(每个RNA浓度为200μM)。混合tracrRNA溶液,crisprRNA溶液和稀释缓冲液(体积比为2:2:5),方法是使用热循环仪在95°C下轻轻敲击和退火每个RNA,10分钟,然后1°C / min降压循环,直到温度达到4°C。
    注意:gRNA序列是使用CRISPOR,http://crispor.tefor.net 设计的。
  2. 将退火的RNA,10μg/ μL Cas9核酸酶和电穿孔缓冲液在37°C下以5:3:2的体积比混合20分钟以形成Cas9-RNP复合物。在常规工作中,混合并孵育 1.25 μL 退火 RNA、0.75 μL Cas9 核酸酶和 0.5 μL 电穿孔缓冲液,以进行一个位点基因组编辑。
  3. 在 1.5 mL 管中混合以下材料:10 μL 电穿孔缓冲液、1 μL Cas9-RNP 复合物(步骤 3.2)和 1 μL 圆形靶向载体(1 μg/μL,步骤 1.6)。Cas9-RNP-DNA混合物的总量为12μL.将Cas9-RNP-DNA混合物保持在冰上直至电穿孔。
    注意:为防止 KI 后 gRNA 重新切割,请将 gRNA 设计在 gRNA 识别序列通过 KI 供体整合分裂的位置。如果gRNA不能在这样的位置设计,则在KI供体的质粒中包含几个核苷酸沉默突变,其中氨基酸序列不会改变。

4. ESC的基因靶向

  1. 为了制备明胶包被的细胞培养皿,在 60 mm 培养皿中加入 2 mL 的 0.1% (w/v) 明胶溶液,在 24 孔板中加入 500 μL,在 96 孔板中加入 100 μL,并在潮湿的培养箱中孵育 2 小时。取出明胶溶液,用等量的PBS洗涤两次,并在室温下储存直至使用。
  2. 使用37°C水浴解冻有丝分裂灭活的冷冻MEF储备液(步骤2.2)1分钟,并将MEF置于明胶包被的60mm培养皿上(一个含有1.6 x 106 细胞的MEF冷冻原液管,用于两个60mm培养皿,步骤2.2)在ESC播种前1天。
  3. 使用37°C水浴解冻冷冻的ESC储备管(以2 x 10 5 ESC /管储存;使用细胞计数器进行细胞计数)1分钟,并将1 x 105 ESC置于含有预接种MEF的60mm培养皿上(步骤4.1)。
  4. 在 4 mL ESC 培养基(ESCM,基于 DMEM 的改性培养基,含 15% (v/v) 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺底物、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.1 mM 2-巯基乙醇、白血病抑制因子和 t2i(0.2 μM PD0325901 和 3 μM CHIR99021)中培养,保持 ESC11 的多能性)在 37 °C 和 5% CO2 中培养,直到 ESC 达到 50% 至 70% 汇合。
    注意:我们使用三种不同的电调线:JM8。B6N的A3,B6-129 F1的V6.5,以及内部开发的BALB / c ESC。本手稿中相同的 KI 协议用于所有 ESC 线路。
  5. 用4mL PBS洗涤培养的ESC,然后用800μL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在37°C下处理5分钟以进行消化。加入 1 mL ESCM 使胰蛋白酶失活,并通过移液将 ESC 解离为单个细胞。
  6. 将含ESC的溶液以280 x g 离心5分钟,弃去上清液,将ESC重悬于新鲜的1 mL ESCM中,并使用台盼蓝染色的细胞计数器计数细胞数。将 1 x 10 5 个 ESC 转移到新的1.5 mL 管中,并在 500 x g、4 °C 下离心,用 PBS 洗涤 3 次。
  7. 将 ESC 沉淀重悬于 12 μL Cas9-RNP-DNA 混合物中(步骤 3.3),并通过轻柔移液充分混合以避免冒泡。将重悬的电调用于电穿孔。电穿孔系统使用 1,400 V 和 30 ms 的单个脉冲进行 Cas9-RNP-DNA 转导(图 1)。
  8. 在含有 4 mL ESCM 的 60 mm 培养皿中培养电穿孔的 ESC,并带有有丝分裂灭活的 MEF(第 4.2 节)。每天更换培养基。
  9. 电穿孔后3至5天用4mL PBS洗涤ESC,然后用800μL0.25%胰蛋白酶-EDTA处理,并在37°C下在潮湿的培养箱中培养5分钟以进行消化。加入 2 mL ESCM 以停止胰蛋白酶消化,并以 280 x g 离心细胞混合物 5 分钟。
  10. 弃去上清液,将ESC重悬于1 mL新鲜ESCM中,并使用台盼蓝染色的细胞计数器计数细胞浓度。以每 60 毫米培养皿 1 x 103 个电调通过电调,其中包含 ESCM 和进料器 MEF。每天更换培养基,直到菌落恢复。
    注意:ESC在拾取前通过一次的原因是ESC分裂后基因组编辑可能会继续发生,因此在许多情况下,第一个菌落并不总是克隆。因此,在菌落拾取之前首次通过ESC是拾取单个克隆的重要步骤。

5. 靶向电调的PCR基因分型

  1. 在第一次传代后 5 至 7 天(步骤 4.9)从 ESC 培养皿中吸出 ESCM,并加入 4 mL PBS。在体视显微镜下(30 倍至 40 倍放大倍率)下使用 20 μL 移液器拾取含有 5 μL PBS 的单个 ESC 菌落。将各个菌落置于含有 15 μL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液的圆底 96 孔板的孔中。
  2. 将96孔板放在冰上,直到拾取48个单独的菌落。将 96 孔板在 37 °C 潮湿的 5% CO2 培养箱中孵育 5 分钟,然后加入 80 μL ESCM 以停止胰蛋白酶消化并通过移液将 ESC 集落解离成单细胞。
    注意:由于这种方法的KI效率通常为10%-50%,我们通常会选择48个克隆,并首先使用其中的24个进行基因分型。如果此时无法获得多个 KI 克隆,我们将使用剩余的 24 个克隆进一步筛选 KI。
  3. 将 40 μL ESC 悬浮液(步骤 5)转移到不含明胶包衣的 96 孔饲养层板中,每孔含有 50 μL ESCM 进行 PCR 基因分型。将剩余的 60 μL ESC 悬浮液转移到含有 500 μL ESCM 和饲养层 MEF 的明胶包被的 24 孔板中的孔中,以制备冷冻的 ESC 原液。
  4. 储存在24孔板(步骤5.3)中培养的单个ESC克隆,直到它们达到60%至80%的汇合度。如上所述,通过胰蛋白酶消化回收单个ESC克隆,将细胞收集在新的1.5 mL管中,并以280 x g 离心5分钟。弃去上清液,将细胞重悬于500μL细胞冷冻培养基中,并使用-80°C深冰箱冷冻。
  5. 对于PCR基因分型,在96孔无饲养层的平板(步骤5.3)中培养ESC克隆,直到ESC达到90%以上的汇合度。通过抽吸从每个孔中取出ESCM,并用100μLPBS洗涤两次。
  6. 吸出 PBS 并加入 100 μL 含有蛋白酶 K 的裂解缓冲液,充分混合,然后将 ESC 裂解物转移到新的 1.5 mL 管中。使用加热室在65°C下加热ESC裂解物至少1小时。使用常规的苯酚-氯仿 DNA 纯化方法提取和纯化基因组 DNA,然后进行乙醇沉淀。
  7. 将沉淀的 DNA 溶解在 20 μL 无 DNase 的水中,并使用分光光度计测定 DNA 的纯度和浓度。使用基因座特异性引物集进行基因组PCR以扩增目标区域。然后,检查序列并选择具有所需 KI 序列的 ESC 克隆。

6.八细胞期胚胎的制备和ESC的显微注射

  1. 将 5 IU 妊娠母马血清促性腺激素 (PMSG) 腹腔注射到成年 ICR 女性体内。48小时后,将5IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射到相同的雌性中,然后将激素处理的雌性与ICR雄配。第二天检查阴道中的交配栓(胚胎日0.5,ED0.5)。
    注意:要通过毛色比评估嵌合体,请使用来自ICR菌株的囊胚作为具有黑色或刺鼠毛色背景的ESC的受体,或使用来自C57BL / 6菌株的囊胚作为具有白化背景的ESC的受体。
  2. 收集 ED1.5 的输卵管并将其放入 HEPES 缓冲培养基 (FHM) 滴中。通过使用插入漏斗体的冲洗针用FHM冲洗输卵管来恢复两细胞或四细胞阶段胚胎。
  3. 使用口移液管将收集的胚胎移动到几滴新鲜的FHM滴中来洗涤收集的胚胎。在 37 °C、5% CO2 培养箱下,在 35 μL KSOM 滴中用矿物油覆盖的 35 mm 细胞培养皿中培养胚胎 1 天,直到达到八细胞或桑葚阶段 (ED2.5)。
  4. 如果在下一个收集日不使用胚胎,则根据CARD方案(http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html)通过玻璃化冷冻,并将其储存在液氮中直至使用。
  5. 使用拉拔器和微锻准备用于固定胚胎(外径80-100μm)和ESC注射(约13μm直径)的玻璃移液器。
  6. 将包含FHM的保持移液器集成到连接到显微注射器的毛细管支架中,并设置在显微操纵器的左侧。将注射移液器连接到另一个微量注射器并将其安装在右侧。将两个移液器在显微镜视野中笔直对齐。
  7. 将 5 μL 滴 12% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 滴入 FHM 培养基和 5 μL 滴 FHM 并排分配到 60 mm 培养皿的同一盖子上,并用矿物油覆盖液滴。将胚胎转移到 5 μL FHM 滴中,并将 1-5 μL ESC 悬浮液添加到包含胚胎的 FHM 液滴中。
    注意:在滴剂制备之前,将ESC和MEF悬浮液在60mm培养皿上的4mL ESM中放置30分钟。由于 MEF 比 ESC 更快地粘附在底部,因此这种 30 分钟的孵育允许在上清液中浓缩未连接的 ES 细胞。
  8. 用PVP在注射移液管内清洗,然后移至包含胚胎和ESC的液滴中。
  9. 在进样移液器中拾取三个刚刚完成细胞分裂(六个细胞)的ECS双联体。用吸液管握住已完成压实的八细胞或桑葚期胚胎。用压电脉冲(强度:3;速度:3)在透明带上打一个洞。 排出透明带内的六细胞ESC,并将移液器从胚胎中拉出。
  10. 使用口移液管用几滴KSOM轻轻洗涤ESC注射的胚胎,并将它们在覆盖有矿物油的新50μL KSOM滴剂中孵育,温度为37°C,5%CO2 ,直到胚胎发育到囊胚阶段。
  11. 将10个ESC注射的囊胚转移到假性怀孕雌性小鼠的每个子宫角中(后2.5天,每头20个囊胚)。
  12. 代孕母亲分娩后,选择至少两个嵌合比最高的雄性嵌合体(毛色确认为70%或更高),然后将它们与适当的品系雌配以获得F1杂合KI。
  13. 与适当的伴侣繁殖单个KI小鼠,以获得具有适合研究的理想基因型或遗传背景的小鼠。

Representative Results

根据我们之前的手稿11,我们在ESC中靶向特定基因,然后进行嵌合体生产,以开发基因操纵的小鼠生产。ESC基因分型(如第4节所述)通常通过使用引物的PCR进行。引物设计在同源臂外的基因组序列和KI DNA片段中的特定序列上(图2A)。在这种情况下,没有野生型等位基因被扩增,而只有当靶向外源DNA在靶位点为KI时,才会检测到特定大小的PCR扩增子。代表性基因分型PCR结果如图2B所示。在这种情况下,22个克隆中有9个(40.9%)显示出KI特异性条带。表1显示了三个具有代表性的定位结果,包括图2所示的结果。这些结果表明,此处所示的方法对于基因KI是有效且可重复的,无需任何药物选择。

ESC在注射移液管中拾取,然后使用压电加号在透明带上开一个孔,并在胚胎细胞之间释放ESC(图3)。从技术上讲,这种将ESC注射到八细胞或桑葚期胚胎中的方案类似于许多小鼠设施中常用的ESC注射到囊胚中的方案。代表性嵌合小鼠如图 4所示。对于嵌合体的毛色评估,ICR菌株(白化,白发)的胚胎被用作B6或B6-129 F1 ESC的受体,B6胚胎用作BALB / c ESC的受体(图4)。

Figure 1
图 1:CRISPR/Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 介导的环状质粒整合到 ESC 基因组特定位点的示意图。 电穿孔将环状质粒作为靶向载体引入具有Cas9-RNP的ESC中。缩写:GOI = 目的基因,HA = 同源臂。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2:用于靶向 ESC 克隆 的 KI 筛选的基因组 PCR 分析。 (A) KI 特异性 PCR 引物设计在同源臂外的基因组序列(向前)和 KI DNA 片段中的特定序列(反向)上。(B)具有代表性的基因分型PCR结果。野生型基因组被用作阴性对照。缩写:GOI = 目的基因,HA = 同源臂。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3:八细胞期胚胎注射的代表性图像 。 (A)对于显微注射,拾取三个ESC(六个细胞,箭头)的双峰。(B)用压电脉冲在透明带上开一个孔,并在每个卵裂球之间排出ESC。显示的比例尺为 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4:嵌合体小鼠的代表性图像 。 (A,B)ESC源自C57BL / 6N(JM8。A3,刺豚鼠头发;A) 或 B6-129 F1(刺豚鼠头发;B)被注射到ICR(白化病,白发)胚胎中,然后将胚胎转移到母体代孕者身上。(C)将源自BALB / c(白化,白发)的ESC注射到C57BL / 6J(黑毛)胚胎中,然后将胚胎移植给母亲代孕者。 请点击此处查看此图的大图。

项目编号 脉络体 5'公顷长度(bp) 3'公顷长度(bp) 刀片尺寸 (bp) 分析的克隆数 KI 克隆数 效率 (%) 言论
R26-CC* Chr6 965 1006 5321 23 2 8.7% -
R4-03* Chr8 1000 997 3070 22 6 27.3% -
P4-01* Chr15 1000 1000 2569 22 9 40.9% 如图 2 所示

表1:ESC中三个独立基因组位点的KI效率。 *这些项目迄今尚未发布。这些基因的名称将在未来的独立手稿中披露。

Discussion

ESC的基因靶向随后的嵌合体生产已被常规用于开发基因操纵的小鼠。然而,即使靶向载体包含长(通常为>几kb)同源臂,具有阳性或阴性药物选择基因盒,基因敲入效率仍然很低。我们的协议引入了一种经过调整的ESC KI长外源DNA方法,该方法使用没有任何药物选择盒的环状质粒作为靶向载体,并伴有Cas9-RNP介导的基因组编辑,其常规工作的效率可接受。因此,与传统的ESC靶向相比,该协议可以帮助大大减少生产转基因嵌合小鼠所需的时间。

在该协议中,我们使用CRISPR / Cas9-RNP诱导基因组中的位点特异性双链断裂,并且使用环状质粒作为靶向载体而不是线性化载体。线性化质粒通常用作基因KI的靶向载体,因为它们提高了基因组整合的效率8910。然而,即使载体包含同源臂9,许多基因组整合也是非特异性的。另一方面,环状质粒很少用作靶向载体,因为它们难以整合到ESC12或成纤维细胞13的基因组中。因此,应用环状质粒作为靶向载体并伴有CRISPR / Cas9介导的基因组编辑可能会最大限度地减少非特异性随机整合,但最大限度地提高与ESC基因组的位点特异性整合。值得注意的是,CRISPR/Cas9对双链断裂的诱导效率非常重要14,因此必须使用gRNA以高效率诱导双链断裂。当KI效率太低时,应考虑重新设计gRNA。在图2所示的情况下,40.9%的ESC克隆显示出KI特异性条带。事实上,作为该研究所的核心实验室,我们通常通过此处描述的方法使用ESC进行基因靶向,并且对于1-2 kb序列(如Cre,CreERT或荧光报告基因)实现了10%-50%的KI效率,尽管根据基因位点存在一些差异。我们使用这种方法成功KI的最长DNA序列是Rosa26位点的约11.2 kb,效率为12.2%(41个分析菌落中的5个KI菌落)。

还需要注意的是,该方案使用八细胞或桑葚期胚胎作为ESC显微注射的接受者,而不是囊胚期胚胎。虽然我们没有在本文中进行比较实验,但一些报告表明,与将ESC注射到囊胚中相比,将ESC注射到八细胞或桑葚期胚胎中显着提高了ESC对嵌合后代的贡献效率15161718.事实上,各种ESC系的ESC注射,包括C57BL / 6,B6-129 F1和BALB / c,通常会导致一些(但不是全部)后代的高毛色嵌合体发展(见图4)。该方法的局限性在于注射到植入前胚胎中的ESC不能总是在嵌合体1920中对生殖细胞做出贡献。ESC的种系传播将取决于每个ESC克隆的质量19。因此,开发多个ESC克隆系作为稳定嵌合小鼠生产的备份将是有利的。总之,这里介绍的方案使用简单的靶向载体,其中仅包括KI的每个同源臂和目的基因,而没有任何耐药盒。因此,与传统的ESC靶向技术相比,载体构建将容易得多,并且培养时间可以缩短。这将有助于快速、便利地生产各种类型的转基因小鼠,以供生命科学的未来分析。

Disclosures

作者没有竞争利益需要披露。

Acknowledgments

我们感谢大阪大学生物技术研究与开发(非营利组织)的Saki Nishioka,以及东京大学医学科学研究所的菊池澪和坂本玲子的出色技术援助。这项工作得到了以下机构的支持:文部科学省(MEXT)/日本科学促进会(JSPS)KAKENHI向MI(JP19H05750,JP21H05033)和MO(20H03162)提供的赠款;进化科学与技术核心研究(CREST),日本科学技术振兴机构(JST)授予MI(JPMJCR21N1);尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所到MI(R01HD088412);比尔和梅琳达·盖茨基金会到MI(大挑战探索资助INV-001902);大阪大学微生物病害研究所对MI和MO的共同研究项目资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c ESC - - ESC developed from BALB/c strain
Bambanker Nippon Genetics CS-02-001 Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere
Cas9 Nuclease V3 IDT 1081059 Section 3.2 and elsewhere.
CHIR99021 FUJIFILM Wako 038-23101 Section 4.3
CreERT gene fragment GeneWiz Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA IDT crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.
CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072534 tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.
DMEM Nacalai 08458-45 MEF medium. Section 2.3 and elsewhere
Duplex buffer IDT 1072534 RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.
FastGene Gel/PCR Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Section 1.1 and 1.2.
GlutaMax Thermo Fisher 35-050-061 L-glutatime substrate
hCG ASKA Animal Health Section 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit Clontech 639648 DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere
JM8.A3 ESC EuMMCR - ESC developed from C57BL/6N strain
Knock-out DMEM Thermo Fisher 10829018 Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.
KSOM Merck MR-121-D Section 6.3 and 6.9.
Leukemia inhibitory factor FUJIFILM Wako 125-05603 Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.
Neon Electroporation system Thermo Fisher MPK5000 Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade Takara U0490B Section 1.6.
PD0325901 FUJIFILM Wako 162-25291 Section 4.3
PMSG ASKA Animal Health Section 6.1.
Tail lysis buffer Nacalai 06169-95 Section 5.5.
Trypsin-EDTA Nacalai 32777-15 Section 2.2 and elsewhere
V6.5 ESC - - ESC developed from B6J-129 F1 strain
X-ray irradiation device Hitachi MBR-1618R-BE Section 2.6.

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References

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CRISPR/Cas9介导的胚胎干细胞中的高效基因靶向,用于开发基因操纵的小鼠模型
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Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models. J. Vis. Exp. (186), e64385, doi:10.3791/64385 (2022).More

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models. J. Vis. Exp. (186), e64385, doi:10.3791/64385 (2022).

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