Her præsenterer vi en protokol for udvikling af genetisk modificerede musemodeller ved hjælp af embryonale stamceller, især til stor DNA-knock-in (KI). Denne protokol er indstillet ved hjælp af CRISPR / Cas9 genomredigering, hvilket resulterer i signifikant forbedret KI-effektivitet sammenlignet med den konventionelle homologe rekombinationsmedierede lineariserede DNA-målretningsmetode.
CRISPR/Cas9-systemet har gjort det muligt at udvikle genmodificerede mus ved direkte genomredigering ved hjælp af befrugtede zygoter. Men selvom effektiviteten i udviklingen af gen-knockout-mus ved at inducere små indelmutationer ville være tilstrækkelig nok, er effektiviteten af embryogenomredigering til fremstilling af stort DNA-knock-in (KI) stadig lav. I modsætning til den direkte KI-metode i embryoner har genmålretning ved hjælp af embryonale stamceller (ESC’er) efterfulgt af embryoinjektion til udvikling af kimærmus derfor stadig flere fordele (f.eks. kan høj gennemstrømningsmålretning in vitro, multi-allelmanipulation og Cre – og flox-genmanipulation udføres på kort tid). Derudover kan stammer med vanskelige at håndtere embryoner in vitro, såsom BALB / c, også bruges til ESC-målretning. Denne protokol beskriver den optimerede metode til storstørrelse DNA (flere kb) KI i ESC’er ved at anvende CRISPR / Cas9-medieret genomredigering efterfulgt af kimærmusproduktion til udvikling af genmanipulerede musemodeller.
At producere genetisk modificerede mus og analysere deres fænotype gør det muligt for os at forstå specifikke genfunktioner i detaljer in vivo. Talrige vigtige fund er blevet afdækket ved hjælp af genmodificerede dyremodeller inden for life science. Siden rapporten om genomredigeringsteknologi ved hjælp af CRISPR/Cas91 har forskning ved hjælp af genetisk modificerede mus desuden hurtigt spredt sig til mange laboratorier 2,3. Genomredigering af musezygoter af CRISPR/Cas9 har opnået acceptabel effektivitet til udvikling af kort DNA-modifikation, såsom indelmutationsorienteret genknockout 4, enkelt nukleotidudskiftning eller kort peptid-tag-indsættelse ved hjælp af enkeltstrengede oligonukleotider (ssODN’er) som knock-in (KI) donorer5. På den anden side forbliver KI for store DNA-fragmenter i zygoter ved genomredigering med en lav effektivitet sammenlignet med den korte DNA-modifikation 6,7. Derudover er det vanskeligt at bruge musestammer som BALB/c, som er en vigtig stamme for specifikke forskningsområder som immunologi, til zygotebaseret genomredigering, fordi deres præimplantationsembryoner er modtagelige for in vitro-manipulation.
En anden måde at udvikle genetisk modificerede musemodeller på er at bruge den embryonale stamcelle (ESC) målretningsteknik efterfulgt af ESC-injektion i præimplantationsembryoet til fremstilling af kimærer 8,9,10, som stadig rutinemæssigt anvendes som en konventionel metode. Selvom anskaffelsesraten for at opnå nøjagtige KI-ESC-kloner ikke er særlig høj i konventionelle ESC-målretningsmetoder, giver ESC-målretning nogle fordele sammenlignet med zygotegenomredigering, især for lang DNA KI. For eksempel er KI-effektiviteten af lange DNA-fragmenter (> flere kb) i zygotegenomet mindre tydelig6,7, og mange zygoter er nødvendige for at udvikle endnu en linje KI-mus, hvilket er uønsket i det nuværende perspektiv af dyreforsøg. I modsætning til zygotegenomredigering har lang DNA-målretning mod ESC’er efterfulgt af kimærproduktion brug for betydeligt færre embryoner end zygotegenomredigering. Selv om præimplantationsembryonerne fra BALB/c er modtagelige for in vitro-manipulation, kan deres økonomiske og sociale råd vedligeholdes og håndteres in vitro 11 som andre kompetente 129- eller F1-baggrunds-ESC’er, der derfor gælder for kimærproduktioner. Men selv om en målvektor indeholder 5′ og 3′ homologe arme og lægemiddelresistensgenkassetter til positiv eller negativ selektion, er den konventionelle KI-effektivitet af ESC’er generelt utilstrækkelig på grund af den høje frekvens af tilfældig genomisk integration 8,10, og der er derfor behov for en forbedret metode med præcis ESC-målretningseffektivitet. For nylig rapporterede vi en tunet ESC KI-metode ved hjælp af CRISPR / Cas9-baseret genomredigering for at opnå højere KI-effektivitet end konventionelle målretningsmetoder11. Den metode, vi beskriver her, er baseret på denne procedure, der muliggør lang DNA (> flere til 10 kb) KI til ESC’er med acceptabel effektivitet til rutinemæssige værker uden lægemiddelvalg; Således ville vektorkonstruktionsproceduren være meget lettere og have brug for en kortere periode, eller cellekulturperioden ville også blive betydeligt kortere.
Genmålretning af ESC’er efterfulgt af kimærproduktion er traditionelt blevet brugt til udvikling af genmanipulerede mus. Ikke desto mindre forbliver gen-knock-in-effektiviteten lav, selvom målretningsvektoren indeholder lange (> flere kb i sædvanlige) homologiarme med positive eller negative lægemiddelselektionsgenkassetter. Vores protokol introducerede en tunet ESC KI-metode til langt eksogent DNA ved hjælp af et cirkulært plasmid uden lægemiddeludvælgelseskassetter som en målretningsvektor ledsaget af Cas9-RNP-medieret genomredigering med en acceptabel effektivitet til rutinemæssige værker. Denne protokol kan således bidrage væsentligt til at reducere den tid, det tager at producere genetisk modificerede kimære mus sammenlignet med den konventionelle ESC-målretning.
I denne protokol brugte vi CRISPR/Cas9-RNP til at inducere stedsspecifikke dobbeltstrengsbrud i genomet, og et cirkulært plasmid blev brugt som målretningsvektor i stedet for en lineariseret. Lineariserede plasmider anvendes konventionelt som en målretningsvektor for gen-KI på grund af deres øgede effektivitet af genomisk integration 8,9,10. Imidlertid er mange genomiske integrationer uspecifikke, selvom vektoren indeholder homologe arme9. På den anden side anvendes cirkulære plasmider sjældent som målretningsvektorer på grund af deres vanskelige at integrere funktion i genomet af ESC’er12 eller fibroblaster13. Det ville således være muligt, at anvendelse af et cirkulært plasmid som en målretningsvektor ledsaget af CRISPR / Cas9-medieret genomredigering minimerer uspecifik tilfældig integration, men maksimerer den stedsspecifikke integration i ESC-genomet. Det ville være bemærkelsesværdigt, at induktionseffektiviteten af dobbeltstrengsbruddet ved CRISPR / Cas9 er ret vigtig14, og det ville derfor være vigtigt at bruge gRNA, der inducerer et dobbeltstrengsbrud ved høj effektivitet. Det bør overvejes at re-designe gRNA, når KI-effektiviteten er for lav. I det tilfælde, der er vist i figur 2, viste 40,9% af ESC-klonerne et KI-specifikt bånd. Faktisk udfører vi som instituttets kernelaboratorium rutinemæssigt genmålretning ved hjælp af ESC’er ved hjælp af den her beskrevne metode og har opnået KI-effektiviteter på 10% -50% for 1-2 kb-sekvenser som Cre, CreERT eller fluorescerende journalister, selvom der er nogle variationer afhængigt af genstedet. De længste DNA-sekvenser, vi med succes har KI ved hjælp af denne metode, er ca. 11,2 kb i Rosa26-locus, og effektiviteten var 12,2% (fem KI-kolonier ud af 41 analyserede kolonier).
Det skal også bemærkes, at denne protokol anvender ottecellede eller morulastadiet embryoner som modtagere af ESC-mikroinjektion, men ikke blastocyst-stadiets embryoner. Selvom vi ikke har udført sammenligningseksperimenter i dette papir, har flere rapporter vist, at injektion af ESC’er i ottecellede eller morula-stadiumembryoner forbedrer effektiviteten af ESC-bidrag til kimære afkom signifikant sammenlignet med ESC-injektionen i blastocyster15,16,17,18 . Faktisk resulterede ESC-injektioner af forskellige ESC-linjer, herunder C57BL/6, B6-129 F1 og BALB/c, almindeligvis i udvikling af kimærer med høj pelsfarve hos nogle, men ikke alle, afkom (se figur 4). Begrænsningen ved metoden er, at de ESC’er, der injiceres i præimplantationsembryoet, ikke altid kunne bidrage til kimceller i en kimær 19,20. Overførsel af kønsceller vil afhænge af kvaliteten af hver ESC-klon19. Derfor vil det være en fordel at udvikle flere ESC-klonlinjer som backup til stabil kimæmisk museproduktion. Afslutningsvis bruger de protokoller, der præsenteres her, enkle målretningsvektorer, som kun inkluderer hver homologiarm og gen af interesse for KI uden nogen lægemiddelresistent kassette. Derfor ville vektorkonstruktionen være meget lettere, og kulturperioden kunne forkortes sammenlignet med den konventionelle ESC-målretningsteknik. Dette ville hjælpe med hurtigt og lettere at producere forskellige typer genetisk modificerede mus til fremtidig analyse inden for biovidenskab.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Saki Nishioka i Osaka University, Biotechnology Research and Development (nonprofit organisation) og Mio Kikuchi og Reiko Sakamoto i Institute of Medical Science, University of Tokyo, for deres fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af: Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT)/Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskud til MI (JP19H05750, JP21H05033) og MO (20H03162); Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Agency (JST) bevilling til MI (JPMJCR21N1); Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development til MI (R01HD088412); Bill & Melinda Gates Foundation til MI (Grand Challenges Explorations-bevilling INV-001902); og bevillingen til fælles forskningsprojekt fra Forskningsinstituttet for Mikrobielle Sygdomme, Osaka University til MI og MO.
BALB/c ESC | – | – | ESC developed from BALB/c strain |
Bambanker | Nippon Genetics | CS-02-001 | Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere |
Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081059 | Section 3.2 and elsewhere. |
CHIR99021 | FUJIFILM Wako | 038-23101 | Section 4.3 |
CreERT gene fragment | GeneWiz | Section 1.1. | |
CRISPR-Cas9 crisprRNA | IDT | crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072534 | tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere. |
DMEM | Nacalai | 08458-45 | MEF medium. Section 2.3 and elsewhere |
Duplex buffer | IDT | 1072534 | RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere. |
FastGene Gel/PCR Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Section 1.1 and 1.2. |
GlutaMax | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutatime substrate |
hCG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
In-Fusion HD Cloning Kit | Clontech | 639648 | DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere |
JM8.A3 ESC | EuMMCR | – | ESC developed from C57BL/6N strain |
Knock-out DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium. |
KSOM | Merck | MR-121-D | Section 6.3 and 6.9. |
Leukemia inhibitory factor | FUJIFILM Wako | 125-05603 | Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol. |
Neon Electroporation system | Thermo Fisher | MPK5000 | Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2. |
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade | Takara | U0490B | Section 1.6. |
PD0325901 | FUJIFILM Wako | 162-25291 | Section 4.3 |
PMSG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
Tail lysis buffer | Nacalai | 06169-95 | Section 5.5. |
Trypsin-EDTA | Nacalai | 32777-15 | Section 2.2 and elsewhere |
V6.5 ESC | – | – | ESC developed from B6J-129 F1 strain |
X-ray irradiation device | Hitachi | MBR-1618R-BE | Section 2.6. |