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Developmental Biology

CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन-मैनिपुलेटेड माउस मॉडल विकसित करने के लिए भ्रूण स्टेम सेल में अत्यधिक कुशल जीन लक्ष्यीकरण

Published: August 24, 2022 doi: 10.3791/64385
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, खासकर बड़े डीएनए नॉक-इन (केआई) के लिए। इस प्रोटोकॉल को CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके ट्यून किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक समरूप पुनर्संयोजन-मध्यस्थता रैखिक डीएनए लक्ष्यीकरण विधि की तुलना में केआई दक्षता में काफी सुधार हुआ है।

Abstract

CRISPR / Cas9 प्रणाली ने निषेचित युग्मकों का उपयोग करके प्रत्यक्ष जीनोम संपादन द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को विकसित करना संभव बना दिया है। हालांकि, हालांकि छोटे इंडेल म्यूटेशन को प्रेरित करके जीन-नॉकआउट चूहों को विकसित करने में दक्षता पर्याप्त होगी, बड़े आकार के डीएनए नॉक-इन (केआई) बनाने के लिए भ्रूण जीनोम संपादन की दक्षता अभी भी कम है। इसलिए, भ्रूण में प्रत्यक्ष केआई विधि के विपरीत, चिमेरा चूहों को विकसित करने के लिए भ्रूण इंजेक्शन के बाद भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) का उपयोग करके जीन लक्ष्यीकरण में अभी भी कई फायदे हैं (उदाहरण के लिए, विट्रो में उच्च थ्रूपुट लक्ष्यीकरण, मल्टी-एलील हेरफेर, और सीआरई और फ्लॉक्स जीन हेरफेर कम अवधि में किया जा सकता है)। इसके अलावा, इन विट्रो में मुश्किल से संभालने वाले भ्रूण वाले उपभेदों, जैसे बीएएलबी / सी, का उपयोग ईएससी लक्ष्यीकरण के लिए भी किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल जीन-मैनिपुलेटेड माउस मॉडल विकसित करने के लिए चिमेरा चूहों के उत्पादन के बाद सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता जीनोम संपादन को लागू करके ईएससी में बड़े आकार के डीएनए (कई केबी) केआई के लिए अनुकूलित विधि का वर्णन करता है।

Introduction

आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उत्पादन करना और उनके फेनोटाइप का विश्लेषण करना हमें विवो में विशिष्ट जीन कार्यों को विस्तार से समझने में सक्षम बनाता है। जीवन विज्ञान क्षेत्र में जीन-संशोधित पशु मॉडल का उपयोग करके कई महत्वपूर्ण निष्कर्षों को उजागर किया गया है। इसके अलावा, CRISPR / Cas91 का उपयोग करके जीनोम संपादन तकनीक की रिपोर्ट के बाद से, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करके अनुसंधान जल्दी से कई प्रयोगशालाओंमें फैल गया है। CRISPR/Cas9 द्वारा माउस युग्मकों के जीनोम संपादन ने लघु डीएनए संशोधन विकसित करने के लिए स्वीकार्य दक्षता हासिल की है, जैसे कि इंडेल म्यूटेशन-ओरिएंटेड जीन नॉकआउट4, सिंगल न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन, या सिंगल-स्ट्रैंडेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एसएसओडीएन) का उपयोग करके शॉर्ट पेप्टाइड-टैग सम्मिलन नॉक-इन (केआई) दाताओंके रूप में। दूसरी ओर, जीनोम संपादन द्वारा युग्मनज में बड़े डीएनए टुकड़ों का केआई छोटे आकार के डीएनए संशोधन 6,7 की तुलना में कम दक्षता पर रहता है। इसके अलावा, माउस उपभेदों जैसे बीएएलबी / सी का उपयोग करना मुश्किल है, जो युग्मनज-आधारित जीनोम संपादन के लिए इम्यूनोलॉजी जैसे विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों के लिए एक महत्वपूर्ण तनाव है क्योंकि उनके प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण इन विट्रो हेरफेर के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।

आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल विकसित करने का एक और तरीका भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) लक्ष्यीकरण तकनीक का उपयोग करना है, जिसके बाद प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण में ईएससी इंजेक्शन द्वारा चिमेरा 8,9,10 का उत्पादन किया जाता है, जो अभी भी नियमित रूप से पारंपरिक विधि के रूप में उपयोग किया जाता है। यद्यपि पारंपरिक ईएससी लक्ष्यीकरण विधियों में सटीक केआई-ईएससी क्लोन प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण दर बहुत अधिक नहीं है, ईएससी लक्ष्यीकरण युग्मनज जीनोम संपादन की तुलना में कुछ फायदे प्रदान करता है, खासकर लंबे डीएनए केआई के लिए। उदाहरण के लिए, युग्मनज जीनोम में लंबे डीएनए टुकड़ों (कई केबी >) की केआई दक्षताकम स्पष्ट है 6,7, और केआई माउस की एक पंक्ति को विकसित करने के लिए कई युग्मकों की आवश्यकता होती है, जो पशु प्रयोगों के वर्तमान परिप्रेक्ष्य में अवांछनीय है। युग्मनज जीनोम संपादन के विपरीत, चिमेरा उत्पादन के बाद ईएससी को लंबे डीएनए लक्ष्यीकरण के लिए युग्मनज जीनोम संपादन की तुलना में काफी कम भ्रूण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, भले ही बीएएलबी / सी से प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण इन विट्रो हेरफेर के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, उनके ईएससी को विट्रो 11 में अन्य सक्षम 129 या एफ 1 पृष्ठभूमि ईएससी के रूप में बनाए रखा और संभाला जा सकता है, इसलिए, चिमेरा प्रोडक्शंस के लिए लागू होता है। हालांकि, भले ही एक लक्ष्यीकरण वेक्टर में सकारात्मक या नकारात्मक चयन के लिए 5 ' और 3 ' समरूप हथियार और दवा प्रतिरोध जीन कैसेट होते हैं, ईएससी की पारंपरिक केआई दक्षता आम तौर पर अपर्याप्त होती है, क्योंकि यादृच्छिक जीनोमिक एकीकरण 8,10 की उच्च आवृत्ति होती है, इस प्रकार, सटीक ईएससी लक्ष्यीकरण दक्षता के साथ एक बेहतर विधि की आवश्यकता होती है। हाल ही में, हमने पारंपरिक लक्ष्यीकरणविधियों की तुलना में उच्च केआई दक्षता प्राप्त करने के लिए CRISPR / Cas9-आधारित जीनोम संपादन का उपयोग करके एक ट्यून-अप ईएससी केआई विधि की सूचना दी। यहां हम जिस विधि का वर्णन करते हैं वह इस प्रक्रिया पर आधारित है जो दवा चयन के बिना नियमित कार्यों के लिए स्वीकार्य दक्षता के साथ ईएससी के लिए लंबे डीएनए (कई से 10 केबी >) केआई को सक्षम बनाता है; इस प्रकार, वेक्टर निर्माण प्रक्रिया बहुत आसान होगी और इसके लिए कम अवधि की आवश्यकता होगी, या सेल संस्कृति अवधि भी काफी कम हो जाएगी।

Protocol

सभी माउस प्रयोगों को टोक्यो विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या पीए 17-63) और ओसाका विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या बाइकन-एपी-एच 30-01) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और उनके दिशानिर्देशों के साथ-साथ आगमन दिशानिर्देशों (https://arriveguidelines.org) के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. वेक्टर निर्माण को लक्षित करना

  1. एक केआई कैसेट को बढ़ाएं (सीआरईआरटी, पीसीआर के लिए टेम्पलेट डीएनए मूल रूप से एक वाणिज्यिक जीन संश्लेषण कंपनी से है) और पीसीआर द्वारा 5'- या 3'-होमोलॉजी हथियारों का अनुमानित 1 केबी टुकड़ा। डीएनए क्लोनिंग (चरण 1.3) के लिए, प्रत्येक पीसीआर प्राइमर के 5 'अंत में 15-मेर ओवरलैप अनुक्रम जोड़ें। एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर डीएनए टुकड़ों को शुद्ध करें, इसके बाद डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके डीएनए टुकड़े का निष्कर्षण करें।
  2. एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम (ओं) का उपयोग करके बैकबोन प्लास्मिड (जैसे, पीयूसी 19 या पीबीएस) को रैखिक करें जो क्लोनिंग के लिए मल्टी-क्लोनिंग साइट में कहीं विशिष्ट रूप से पचता है। फिर, डीएनए शोधन किट का उपयोग करके पचे हुए प्लास्मिड को शुद्ध करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए क्लोनिंग किट का उपयोग करके प्रत्येक पीसीआर टुकड़े (जैसे, 5'-होमोलॉजी आर्म, 3'-होमोलॉजी आर्म) और केआई अनुक्रम को एक साथ पचे हुए प्लास्मिड में क्लोन करें।
  4. निर्मित प्लास्मिड (चरण 1.3) का उपयोग करके सक्षम कोशिकाओं को पानी के स्नान में 1 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके बदलें, फिर उन्हें एलबी प्लेट पर बीज दें जिसमें एम्पीसिलीन या कनामाइसिन जैसे एंटीबायोटिक दवाओं की उचित एकाग्रता होती है। प्रतिरोधी क्लोन चयन के लिए उन्हें रात भर कल्चर करें।
  5. 200 μL पिपेट युक्तियों का उपयोग करके कई (चार से आठ) अलग-अलग कॉलोनियों को उठाएं और युक्तियों को 3 एमएल तरल एलबी में स्थानांतरित करें जिसमें उपयुक्त एंटीबायोटिक्स (100 μg / mL एम्पीसिलिन या 20 μL / mL kanamycin) होते हैं और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलने के साथ कल्चर करते हैं।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एंडोटॉक्सिन-मुक्त ग्रेड वाणिज्यिक प्लास्मिड शुद्धिकरण किट का उपयोग करके अगले दिन प्लास्मिड को शुद्ध करें। सेंगर अनुक्रमण द्वारा प्लास्मिड में क्लोन अनुक्रम की पुष्टि करें। न्यूक्लियस मुक्त पानी का उपयोग करके प्लास्मिड एकाग्रता को 1 μg DNA / μL पर समायोजित करें। जीन लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में प्लास्मिड का उपयोग करें।

2. ईएससी के लिए फीडर कोशिकाओं के रूप में माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) की तैयारी

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा 8-10 सप्ताह की गर्भवती आईसीआर मादा चूहों (14.5 दिन पोस्टकोइटम) का त्याग। नसबंदी के लिए 70% (वी / वी) इथेनॉल का उपयोग करके पेट को अच्छी तरह से पोंछें, कक्षीय कैंची और बल का उपयोग करके पेट को काटें, और भ्रूण युक्त गर्भाशय को ठीक करें।
  2. गर्भाशय को 100 मिमी डिश में रखें जिसमें 10 एमएल फॉस्फेट बोवाइन सीरम (पीबीएस) होता है जिसमें 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है। कक्षीय कैंची और फोर्सप्स का उपयोग करके भ्रूण से प्लेसेंटा और एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक ऊतकों को हटा दें। कक्षीय कैंची का उपयोग करके भ्रूण को कीमा करें और पीबीएस समाधान जिसमें कीमा भ्रूण कोशिकाएं होती हैं, को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. सेंट्रीफ्यूज 280 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। 0.25% (w/v) ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान का 10 एमएल जोड़ें, पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं, और फिर ट्रिप्सिन पाचन के लिए पानी के स्नान का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 20 एमएल एमईएफ माध्यम (डीएमईएम जिसमें 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है) जोड़ें, कोमल व्युत्क्रम द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 280 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, 10 एमएल एमईएफ माध्यम जोड़ें, और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. कई नए 100 मिमी व्यंजनों में सेल निलंबन को बीज दें (एक 100 मिमी डिश के लिए 10 एमएल एमईएफ माध्यम के साथ भ्रूण की संख्या के समान व्यंजन तैयार करें)। असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए माध्यम 4 से 5 घंटे के पोस्ट-सीडिंग को बदलें और संलग्न एमईएफ को बढ़ने दें। कोशिकाओं को पारित करें जब वे ट्रिप्सिन का उपयोग करके ~ 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं।
  6. एक एक्स-रे विकिरण उपकरण में, सीडिंग के लगभग 12-15 दिनों के बाद, एमईएफ माध्यम में प्रसार एमईएफ युक्त संस्कृति व्यंजन रखें। निर्माता के निर्देश के अनुसार सेल चक्र को रोकने के लिए एमईएफ को 50 जीवाई एक्स-रे (कुल) के साथ उजागर करें।
  7. ट्रिप्सिनेटेड एमईएफ को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक 100 मिमी डिश के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़कर विकिरणित एमईएफ को इंजेक्ट करें, फिर ट्रिप्सिन पाचन को रोकने के लिए 4 एमएल एमईएफ माध्यम जोड़ें और एक नए 50 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन एकत्र करें।
  8. एमईएफ को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 280 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक ताजा एमईएफ माध्यम से धोएं, ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, और उन्हें सेल-फ्रीजिंग माध्यम में1.6 x 10 6 कोशिकाओं / ट्यूब पर फ्रीज करें। उपयोग होने तक स्टोर करें; कोशिकाओं को कई वर्षों तक तरल नाइट्रोजन में स्थिर रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।

3. कैस 9-आरएनपी-डीएनए मिश्रण तैयारी

  1. पाइपिंग द्वारा कमजोर पड़ने वाले बफर (प्रत्येक आरएनए एकाग्रता 200 μM पर) में ट्रैकरआरएनए और क्रिस्पआरएनए को भंग करें। ट्रैकआरएनए समाधान, क्रिस्पआरएनए समाधान और तनुकरण बफर (2: 2: 5 पर मात्रा अनुपात) को कोमल टैपिंग द्वारा मिलाएं और प्रत्येक आरएनए को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइक्लर का उपयोग करके नष्ट करें और इसके बाद तापमान 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने तक 1 डिग्री सेल्सियस /
    नोट: जीआरएनए अनुक्रम CRISPOR, http://crispor.tefor.net का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया था।
  2. कैस 9-आरएनपी कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5: 3: 2 के वॉल्यूम अनुपात में मिश्रित एनाल्ड आरएनए, 10 μg / μL Cas9 न्यूक्लियस, और इलेक्ट्रोपोरेशन बफर को इनक्यूबेट करें। नियमित कार्य में, एक लोकस जीनोम संपादन के लिए 1.25 μL एनाल्ड आरएनए, Cas9 न्यूक्लियस के 0.75 μL और इलेक्ट्रोपोरेशन बफर के 0.5 μL को मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  3. निम्नलिखित सामग्रियों को 1.5 एमएल ट्यूब में मिलाएं: इलेक्ट्रोपोरेशन बफर का 10 μL, Cas9-RNP कॉम्प्लेक्स का 1 μL (चरण 3.2), और परिपत्र लक्ष्यीकरण वेक्टर का 1 μL (1 μg/ Cas9-RNP-DNA मिश्रण की कुल मात्रा 12 μL है। Cas9-RNP-DNA मिश्रण को विद्युतीकरण तक बर्फ पर रखें।
    नोट: केआई के बाद जीआरएनए के पुन: दरार को रोकने के लिए, जीआरएनए को ऐसी स्थिति में डिजाइन करें जहां जीआरएनए मान्यता अनुक्रम को केआई दाता के एकीकरण से विभाजित किया जाता है। यदि जीआरएनए को ऐसे स्थान पर डिज़ाइन नहीं किया जा सकता है, तो कई न्यूक्लियोटाइड मूक उत्परिवर्तन, जिसके द्वारा अमीनो एसिड अनुक्रम नहीं बदलता है, केआई दाता के प्लास्मिड में शामिल होते हैं।

4. ईएससी का जीन लक्ष्यीकरण

  1. जिलेटिन-लेपित सेल कल्चर व्यंजन तैयार करने के लिए, 60 मिमी डिश के लिए 2 एमएल पर 0.1% (डब्ल्यू / वी) जिलेटिन घोल जोड़ें, 24-वेल प्लेट के लिए 500 μL, 96-वेल प्लेट के लिए 100 μL, और आर्द्र इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। जिलेटिन समाधान निकालें, पीबीएस की समान मात्रा के साथ दो बार धोएं, और उपयोग होने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान का उपयोग करके माइटोटिक रूप से निष्क्रिय जमे हुए एमईएफ स्टॉक (चरण 2.2) को पिघलाएं, और एमईएफ को जिलेटिन-लेपित 60 मिमी डिश (एमईएफ की एक जमी हुई स्टॉक ट्यूब जिसमें दो60 मिमी व्यंजनों के लिए 1.6 x 10 6 कोशिकाएं होती हैं, चरण 2.2) पर ईएससी सीडिंग से 1 दिन पहले रखें।
  3. 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान का उपयोग करके एक जमे हुए ईएससी स्टॉक ट्यूब (2 x 105 ईएससी / ट्यूब पर संग्रहीत; सेल गिनती सेल काउंटर का उपयोग करके की गई थी) को पिघलाएं, और पूर्व-बीज वाले एमईएफ (चरण 4.1) वाले 60 मिमी डिश पर 1 x 105 ईएससी रखें।
  4. 4 एमएल ईएससी कल्चर माध्यम (ईएससीएम, डीएमईएम-आधारित संशोधित माध्यम के साथ 15% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन सब्सट्रेट, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक, और t2i (0.2 μM PD0325901 और 3 μM CHIR9901) में संस्कृति जो ईएससी11% तक पहुंचने तक 5% CO2 के साथ 57 ° C तक बनाए रखती है।
    नोट: हम ईएससी की तीन अलग-अलग लाइनों का उपयोग करते हैं: जेएम 8। बी 6 एन से ए 3, बी 6-129 एफ 1 से वी 6.5, और इन-हाउस विकसित बीएएलबी / सी ईएससी। इस पांडुलिपि में एक ही केआई प्रोटोकॉल का उपयोग सभी ईएससी लाइनों के लिए किया जाता है।
  5. संवर्धन ईएससी को 4 एमएल पीबीएस के साथ धोएं, फिर पाचन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 800 μL के साथ इलाज करें। ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए 1 एमएल ईएससीएम जोड़ें और पाइपिंग द्वारा ईएससी को एकल कोशिकाओं से अलग करें।
  6. 280 x g पर 5 मिनट के लिए ईएससी युक्त समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, ईएससीएम के ताजा 1 एमएल में ईएससी को फिर से निलंबित करें, और ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। 1 x 105 ईएससी को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें 500 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  7. ईएससी गोली को कैस 9-आरएनपी-डीएनए मिश्रण (चरण 3.3) के 12 μL में पुन: निलंबित करें और बुदबुदाने से बचने के लिए कोमल पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए पुन: निलंबित ईएससी की सेवा करें। इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम कैस 9-आरएनपी-डीएनए ट्रांसडक्शन (चित्रा 1) के लिए 1,400 वी और 30 एमएस पर एक एकल पल्स का उपयोग करता है।
  8. 60 मिमी डिश में इलेक्ट्रोपोरेटेड ईएससी को कल्चर करें जिसमें माइटोटिक रूप से निष्क्रिय एमईएफ (धारा 4.2) के साथ 4 एमएल ईएससीएम होता है। हर दिन माध्यम बदलें।
  9. इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 से 5 दिनों के बाद ईएससी को 4 एमएल पीबीएस के साथ धो लें, फिर पाचन के लिए आर्द्र इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 800 μL और कल्चर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करें। ट्रिप्सिन पाचन को रोकने के लिए 2 एमएल ईएससीएम जोड़ें और 5 मिनट के लिए 280 x ग्राम पर सेल मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. सुपरनैटेंट को छोड़ दें, ईएससी को ताजा ईएससीएम के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें, और ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें। ईएससी को 1 x 103 ईएससी प्रति 60 मिमी डिश पर पारित करें जिसमें ईएससीएम और फीडर एमईएफ शामिल हैं। कॉलोनी के जोर पकड़ने तक हर दिन माध्यम बदलें।
    नोट: पिक-अप से पहले ईएससी को एक बार पारित करने का कारण यह था कि ईएससी डिवीजन के बाद जीनोम संपादन जारी रह सकता है, इसलिए पहली कॉलोनी हमेशा कई मामलों में क्लोन नहीं होती है। इसलिए, कॉलोनी पिक-अप से पहले ईएससी का पहला मार्ग एकल क्लोन लेने के लिए एक आवश्यक कदम है।

5. लक्षित ईएससी की पीसीआर जीनोटाइपिंग

  1. पहले मार्ग (चरण 4.9) के 5 से 7 दिन बाद ईएससी कल्चर डिश से एस्पिरेटेड ईएससीएम और पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (30x से 40x आवर्धन) के तहत 20 μL पिपेट का उपयोग करके 5 μL PBS के साथ एकल ESC कॉलोनियों को चुनें। अलग-अलग कॉलोनियों को गोल-तल 96-वेल प्लेट के एक कुएं में रखें जिसमें 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान का 15 μL हो।
  2. 96-वेल प्लेट को बर्फ पर रखें जब तक कि 48 अलग-अलग कॉलोनियों को उठाया न जाए। 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें, फिर ट्रिप्सिन पाचन को रोकने के लिए 80 μL ESCM जोड़ें और पाइपिंग द्वारा ईएससी कॉलोनियों को एकल कोशिकाओं में अलग करें।
    नोट: चूंकि इस विधि की केआई दक्षता आमतौर पर 10% -50% होती है, इसलिए हम नियमित रूप से 48 क्लोन उठाते हैं और पहले उनमें से 24 का उपयोग करके जीनोटाइपिंग करते हैं। यदि इस बिंदु पर कई केआई क्लोन प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं, तो हम शेष 24 क्लोनों का उपयोग करके केआई के लिए स्क्रीन करते हैं।
  3. पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए 40 μL ESC निलंबन (चरण 5) को जिलेटिन-लेपित फीडर-मुक्त 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें प्रति कुएं 50 μL ESCM हो। जमे हुए ईएससी स्टॉक बनाने के लिए, शेष 60 μL ESC निलंबन को जिलेटिन-लेपित 24-वेल प्लेट में एक कुएं में स्थानांतरित करें, जिसमें 500 μL ESCM और फीडर MEF शामिल हैं।
  4. स्टॉक व्यक्तिगत ईएससी क्लोन 24-वेल प्लेट (चरण 5.3) में संवर्धित होते हैं जब तक कि वे 60% से 80% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाते। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा व्यक्तिगत ईएससी क्लोन को पुनर्प्राप्त करें, एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और 5 मिनट के लिए 280 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, कोशिकाओं को 500 μL सेल फ्रीजिंग माध्यम में पुन: निलंबित करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस गहरे फ्रीजर का उपयोग करके फ्रीज करें।
  5. पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए, 96-वेल फीडर-फ्री प्लेट (चरण 5.3) में ईएससी क्लोन को कल्चर करें जब तक कि ईएससी 90% से अधिक कॉन्फ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाता। आकांक्षा द्वारा प्रत्येक कुएं से ईएससीएम निकालें और पीबीएस के 100 μL से दो बार धोएं।
  6. पीबीएस को एस्पिरेट करें और प्रोटीन के युक्त लाइसिस बफर के 100 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और ईएससी लाइसेट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। गर्मी कक्ष का उपयोग करके कम से कम 1 घंटे के लिए ईएससी लाइसेट को 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। इथेनॉल वर्षा के बाद पारंपरिक फिनोल-क्लोरोफॉर्म डीएनए शुद्धिकरण विधि का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए को निकालें और शुद्ध करें।
  7. डीनेस-मुक्त पानी के 20 μL में अवक्षेपित डीएनए को भंग करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए की शुद्धता और एकाग्रता निर्धारित करें। लक्ष्य क्षेत्र को बढ़ाने के लिए लोकस-विशिष्ट प्राइमर सेट का उपयोग करके जीनोमिक पीसीआर करें। फिर, अनुक्रम की जांच करें और वांछित केआई अनुक्रमों के साथ ईएससी क्लोन चुनें।

6. आठ-सेल चरण भ्रूण की तैयारी और ईएससी का माइक्रोइंजेक्शन

  1. वयस्क आईसीआर महिलाओं में गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोफिन (पीएमएसजी) के 5 आईयू इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। 48 घंटे के बाद, मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोफिन (एचसीजी) के 5 आईयू को उन्हीं महिलाओं में इंजेक्ट करें, फिर हार्मोन-उपचारित महिलाओं को आईसीआर पुरुषों के साथ संभोग करें। अगले दिन योनि में मैथुन प्लग की जांच करें (भ्रूण दिन 0.5, ईडी 0.5)।
    नोट: कोट रंग अनुपात द्वारा चिमेरिज्म का मूल्यांकन करने के लिए, आईसीआर स्ट्रेन से ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग ईएससी के प्राप्तकर्ता के रूप में करें जिसमें काले या अगौती कोट रंग पृष्ठभूमि है, या सी 57बीएल /6 स्ट्रेन से ब्लास्टोसिस्ट को ईएससी के प्राप्तकर्ता के रूप में उपयोग करें जिसमें अल्बिनो पृष्ठभूमि है।
  2. ईडी 1.5 पर डिंबवाहिनी एकत्र करें और इसे एचईपीईएस बफर्ड माध्यम (एफएचएम) बूंदों में रखें। इनफंडिबुलम में डाली गई फ्लशिंग सुई का उपयोग करके एफएचएम के साथ डिंबवाहिनी को फ्लश करके दो-सेल या चार-सेल चरण भ्रूण को पुनर्प्राप्त करें।
  3. एकत्र किए गए भ्रूण को मुंह के पिपेट का उपयोग करके कई ताजा एफएचएम बूंदों में ले जाकर धोएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर खनिज तेल से ढके 35 मिमी सेल कल्चर डिश पर 50 डिग्री सेल्सियस में भ्रूण गिरता है, 1 दिन के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर जब तक आठ-सेल या मोरुला चरण (ईडी 2.5) तक नहीं पहुंच जाता है।
  4. यदि अगले संग्रह के दिन भ्रूण का उपयोग नहीं किया जाता है, तो उन्हें कार्ड प्रोटोकॉल (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) के अनुसार विट्रीफिकेशन द्वारा फ्रीज करें, और उपयोग तक तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।
  5. एक पुलर और माइक्रोफोर्ज का उपयोग करके भ्रूण (80-100 μm बाहरी व्यास) और ईएससी इंजेक्शन (लगभग 13 μm व्यास) को पकड़ने के लिए ग्लास पिपेट तैयार करें।
  6. एक होल्डिंग पिपेट को एकीकृत करें जिसमें एफएचएम एक माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े केशिका धारक में होता है और माइक्रोमैनिपुलेटर के बाईं ओर स्थापित होता है। एक इंजेक्शन पिपेट को दूसरे माइक्रोइंजेक्टर से कनेक्ट करें और इसे दाईं ओर सेट करें। माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में सीधे दो पिपेट संरेखित करें।
  7. एफएचएम माध्यम में 12% (डब्ल्यू / वी) पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी) की 5 μL बूंदें और FHM की 5 μL बूंदों को 60 मिमी डिश के एक ही ढक्कन पर साथ-साथ वितरित करें और बूंदों को खनिज तेल के साथ कवर करें। 5 μL FHM ड्रॉप में भ्रूण को स्थानांतरित करें और भ्रूण वाले FHM ड्रॉप में ESC निलंबन के 1-5 μL जोड़ें।
    नोट: ड्रॉप तैयारी से पहले 60 मिमी कल्चर डिश पर 4 एमएल ईएसएम में 30 मिनट के लिए ईएससी और एमईएफ निलंबन छोड़ दें। चूंकि एमईएफ ईएससी की तुलना में तेजी से नीचे से चिपके रहते हैं, इसलिए यह 30 मिनट का इनक्यूबेशन सतह पर तैरने वाले में असंबद्ध ईएस कोशिकाओं की एकाग्रता की अनुमति देता है।
  8. पीवीपी के साथ इंजेक्शन पिपेट के अंदर धोएं, फिर भ्रूण और ईएससी युक्त बूंद पर जाएं।
  9. तीन अलग-अलग ईसीएस डबल्स उठाएं जिन्होंने इंजेक्शन पिपेट में अपने सेल डिवीजन (छह कोशिकाओं) को समाप्त कर दिया है। एक आठ-कोशिका या मोरुला चरण भ्रूण को पकड़ें, जिसने आकांक्षा द्वारा होल्डिंग पिपेट के साथ संघनन पूरा कर लिया है। पीजोइलेक्ट्रिक पल्स (तीव्रता: 3; गति: 3) के साथ ज़ोना पेलुसीडा में एक छेद बनाएं। ज़ोना पेलुसीडा के अंदर छह-कोशिका वाले ईएससी को निष्कासित करें और पिपेट को भ्रूण से बाहर खींचें।
  10. ईएससी-इंजेक्शन वाले भ्रूण को कई केएसओएम बूंदों के साथ एक मुंह पिपेट का उपयोग करके धीरे से धोएं और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर खनिज तेल से ढके एक नए 50 μL KSOM ड्रॉप में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट चरण में विकसित न हो जाए।
  11. स्यूडोप्रेग्नेंट मादा चूहों (2.5 दिन पोस्टकोइटम, 20 ब्लास्टोसिस्ट प्रति सिर) के प्रत्येक गर्भाशय सींग में 10 ईएससी-इंजेक्शन ब्लास्टोसिस्ट स्थानांतरित करें।
  12. सरोगेट मां के जन्म देने के बाद, उच्चतम चिमेरिज्म अनुपात (कोट रंग द्वारा पुष्टि की गई 70% या उससे अधिक) के साथ कम से कम दो पुरुष चिमेरा का चयन करें, और फिर उन्हें एफ 1 विषम केआई प्राप्त करने के लिए उपयुक्त तनाव वाली महिलाओं के साथ संभोग करें।
  13. अनुसंधान के लिए उपयुक्त वांछनीय जीनोटाइप (ओं) या आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले चूहों को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त भागीदारों के साथ व्यक्तिगत केआई चूहों को प्रजनन करें।

Representative Results

हमने अपनी पिछली पांडुलिपि11 के अनुसार जीन-मैनिपुलेटेड माउस उत्पादन विकसित करने के लिए ईएससी में विशिष्ट जीन (ओं) को लक्षित किया है। ईएससी जीनोटाइपिंग (धारा 4 में वर्णित) नियमित रूप से पीसीआर द्वारा प्राइमरों का उपयोग करके की जाती है। प्राइमरों को होमोलॉजी आर्म्स के बाहर जीनोमिक अनुक्रमों और केआई डीएनए टुकड़े (चित्रा 2 ए) में विशिष्ट अनुक्रमों पर डिज़ाइन किया गया है। उस स्थिति में, कोई जंगली-प्रकार का एलील प्रवर्धित नहीं होता है, जबकि एक विशिष्ट आकार के पीसीआर एम्प्लिकॉन का पता केवल तभी लगाया जाता है जब लक्षित बहिर्जात डीएनए लक्ष्य स्थान पर केआई होता है। प्रतिनिधि जीनोटाइपिंग पीसीआर परिणाम चित्रा 2 बी में दिखाए गए हैं। 22 क्लोनों में से नौ (40.9%) ने इस मामले में केआई-विशिष्ट बैंड दिखाया। चित्रा 2 में दिखाए गए परिणाम सहित तीन प्रतिनिधि लक्ष्यीकरण परिणाम तालिका 1 में दिखाए गए हैं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यहां दिखाई गई विधि किसी भी दवा चयन के बिना जीन केआई के लिए कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।

ईएससी को एक इंजेक्शन पिपेट में उठाया जाता है, फिर ज़ोना पेलुसीडा में एक छेद पीजोइलेक्ट्रिक प्लस का उपयोग करके बनाया जाता है, और ईएससी को भ्रूण कोशिकाओं के बीच जारी किया जाता है (चित्रा 3)। तकनीकी रूप से, आठ-सेल या मोरुला चरण भ्रूण में ईएससी इंजेक्शन लगाने का यह प्रोटोकॉल आमतौर पर कई माउस सुविधाओं में उपयोग किए जाने वाले ब्लास्टोसिस्ट में ईएससी इंजेक्शन के प्रोटोकॉल के समान है। प्रतिनिधि चिमेरिक चूहों को चित्रा 4 में दिखाया गया है। चिमेरिज्म के कोट रंग मूल्यांकन के लिए, आईसीआर स्ट्रेन (अल्बिनो, सफेद बाल) से भ्रूण का उपयोग बी 6 या बी 6-129 एफ 1 ईएससी के प्राप्तकर्ता के रूप में किया गया था, और बी 6 भ्रूण का उपयोग बीएएलबी / सी ईएससी के प्राप्तकर्ता के रूप में किया गया था (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: CRISPR / Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) -मध्यस्थ परिपत्र प्लास्मिड एकीकरण का एक योजनाबद्ध एक ईएससी जीनोम के विशिष्ट स्थान में। इलेक्ट्रोपोरेशन कैस 9-आरएनपी के साथ ईएससी में एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में एक परिपत्र प्लास्मिड का परिचय देता है। संक्षेप: जीओआई = रुचि का जीन, एचए = होमोलॉजी आर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
() केआई-विशिष्ट पीसीआर प्राइमरों को होमोलॉजी आर्म्स (फॉरवर्ड) के बाहर जीनोमिक अनुक्रमों पर और केआई डीएनए टुकड़े (रिवर्स) में विशिष्ट अनुक्रमों में डिज़ाइन किया गया है। (बी) प्रतिनिधि जीनोटाइपिंग पीसीआर परिणाम। एक जंगली प्रकार के जीनोम का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। संक्षेप: जीओआई = रुचि का जीन, एचए = होमोलॉजी आर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: आठ-कोशिका चरण भ्रूण इंजेक्शन की प्रतिनिधि छवियां। (A) माइक्रोइंजेक्शन के लिए, ईएससी के तीन डबल्स (छह कोशिकाएं, तीर) उठाए जाते हैं। (बी) ज़ोना पेलुसीडा में एक छेद एक पीजोइलेक्ट्रिक पल्स के साथ बनाया जाता है, और ईएससी को प्रत्येक ब्लास्टोमेरे के बीच में निष्कासित कर दिया जाता है। दिखाया गया स्केल पट्टी 50 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: चिमेरा चूहों की प्रतिनिधि छवियां। (A, B) ESC C57BL/6N (JM8) से प्राप्त होता है। ए 3, अगौती बाल; ए) या बी 6-129 एफ 1 (अगौती बाल; बी) को आईसीआर (अल्बिनो, सफेद बाल) भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है, इसके बाद भ्रूण को मां सरोगेट्स में स्थानांतरित किया जाता है। () बीएएलबी/सी (अल्बिनो, सफेद बाल) से प्राप्त ईएससी को सी57बीएल/6जे (काले बाल) भ्रूणों में इंजेक्ट किया जाता है, इसके बाद भ्रूण को मातृ सरोगेट्स को हस्तांतरित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोजेक्ट ID कोरोमोसोम 5'HA लंबाई (bp) 3'HA लंबाई (bp) आकार डालें (बीपी) विश्लेषित क्लोनों की संख्या केआई क्लोन की संख्या दक्षता (%) टिप्पणियां
R26-CC* Chr6 965 1006 5321 23 2 8.7% -
R4-03* Chr8 1000 997 3070 22 6 27.3% -
P4-01* Chr15 1000 1000 2569 22 9 40.9% चित्र 2 में दिखाया गया है

तालिका 1: ईएससी में तीन स्वतंत्र जीनोमिक लोकी में केआई क्षमता। *इन परियोजनाओं को अब तक प्रकाशित नहीं किया गया है। भविष्य में स्वतंत्र पांडुलिपियों में इन जीनों के नाम का खुलासा किया जाएगा।

Discussion

चिमेरा उत्पादन के बाद ईएससी के जीन लक्ष्यीकरण का उपयोग पारंपरिक रूप से जीन-मैनिपुलेटेड चूहों को विकसित करने के लिए किया गया है। फिर भी, जीन नॉक-इन दक्षता कम रहती है, भले ही लक्ष्यीकरण वेक्टर में सकारात्मक या नकारात्मक दवा चयन जीन कैसेट्स के साथ लंबे (सामान्य रूप से कई केबी >) होमोलॉजी हथियार होते हैं। हमारे प्रोटोकॉल ने नियमित कार्यों के लिए स्वीकार्य दक्षता पर कैस 9-आरएनपी-मध्यस्थता जीनोम संपादन के साथ एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में किसी भी दवा चयन कैसेट के बिना एक परिपत्र प्लास्मिड का उपयोग करके लंबे बहिर्जात डीएनए की एक ट्यून-अप ईएससी केआई विधि पेश की। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल पारंपरिक ईएससी लक्ष्यीकरण की तुलना में आनुवंशिक रूप से संशोधित चिमेरिक चूहों के उत्पादन में लगने वाले समय की मात्रा को काफी हद तक कम करने में मदद कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने जीनोम में साइट-विशिष्ट डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित करने के लिए CRISPR / Cas9-RNP का उपयोग किया, और एक गोलाकार प्लास्मिड का उपयोग रैखिक के बजाय लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में किया गया था। रैखिक प्लास्मिड को पारंपरिक रूप से जीन केआई के लिए एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि जीनोमिक एकीकरण 8,9,10 की उनकी बढ़ी हुई दक्षता के कारण। हालांकि, कई जीनोमिक एकीकरण निरर्थक हैं, भले ही वेक्टर में समरूप हथियार9 हों। दूसरी ओर, गोलाकार प्लास्मिड को शायद ही कभी लक्षित वैक्टर के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि ईएससी12 या फाइब्रोब्लास्ट13 के जीनोम में उनकी हार्ड-टू-एकीकृत विशेषता होती है। इस प्रकार, यह संभव होगा कि CRISPR / Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के साथ एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में एक परिपत्र प्लास्मिड को लागू करने से निरर्थक यादृच्छिक एकीकरण कम हो जाता है लेकिन ईएससी जीनोम में साइट-विशिष्ट एकीकरण को अधिकतम किया जाता है। यह उल्लेखनीय होगा कि CRISPR/Cas9 द्वारा डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की प्रेरण दक्षता काफीमहत्वपूर्ण है, इस प्रकार जीआरएनए का उपयोग करना आवश्यक होगा जो उच्च दक्षता पर डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित करता है। जब केआई दक्षता बहुत कम होती है तो जीआरएनए को फिर से डिजाइन करने पर विचार किया जाना चाहिए। चित्रा 2 में दिखाए गए मामले में, ईएससी क्लोन के 40.9% ने केआई-विशिष्ट बैंड दिखाया। वास्तव में, संस्थान की मुख्य प्रयोगशाला के रूप में, हम नियमित रूप से यहां वर्णित विधि द्वारा ईएससी का उपयोग करके जीन लक्ष्यीकरण करते हैं और 1-2 केबी अनुक्रमों जैसे सीआरई, सीआरईआरटी, या फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों के लिए 10% -50% की केआई क्षमता हासिल की है, हालांकि जीन लोकस के आधार पर कुछ भिन्नताएं हैं। इस विधि का उपयोग करके हमारे पास सफलतापूर्वक केआई के सबसे लंबे डीएनए अनुक्रम रोसा 26 लोकस में लगभग 11.2 केबी हैं, और दक्षता 12.2% (41 विश्लेषण की गई कॉलोनियों में से पांच केआई कॉलोनियां) थी।

यह भी ध्यान दिया जाएगा कि यह प्रोटोकॉल ईएससी माइक्रोइंजेक्शन के प्राप्तकर्ता के रूप में आठ-सेल या मोरुला चरण भ्रूण का उपयोग करता है, लेकिन ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूण नहीं। यद्यपि हमने इस पेपर में प्रयोगों की तुलना नहीं की है, कई रिपोर्टों से पता चला है कि आठ-सेल या मोरुला चरण भ्रूण में ईएससी का इंजेक्शन ब्लास्टोसिस्ट 15,16,17,18 में ईएससी इंजेक्शन की तुलना में चिमेरिक संतानों में ईएससी योगदान की दक्षता में काफी सुधार करता है . दरअसल, सी 57बीएल /6, बी 6-129 एफ 1, और बीएएलबी / सी सहित विभिन्न ईएससी लाइनों के ईएससी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप आमतौर पर कुछ, लेकिन सभी, संतानों में उच्च कोट रंग चिमेरा विकास होता है (चित्रा 4 देखें)। विधि की सीमा यह है कि प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण में इंजेक्ट किए गए ईएससी हमेशा चिमेरा19,20 में रोगाणु कोशिकाओं में योगदान नहीं कर सकते हैं। ईएससी का जर्मलाइन ट्रांसमिशन प्रत्येक ईएससी क्लोन 19 की गुणवत्ता पर निर्भरकरेगा। इसलिए, स्थिर चिमेरिक माउस उत्पादन के लिए बैकअप के रूप में कई ईएससी क्लोन लाइनों को विकसित करना फायदेमंद होगा। अंत में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सरल लक्ष्यीकरण वैक्टर का उपयोग करते हैं जिसमें किसी भी दवा प्रतिरोधी कैसेट के बिना केआई के लिए केवल प्रत्येक होमोलॉजी आर्म और जीन ऑफ इंटरेस्ट शामिल है। इसलिए, वेक्टर निर्माण बहुत आसान होगा, और पारंपरिक ईएससी लक्ष्यीकरण तकनीक की तुलना में संस्कृति अवधि को छोटा किया जा सकता है। यह जीवन विज्ञान में भविष्य के विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को जल्दी और सुविधाजनक रूप से उत्पादन करने में मदद करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

हम ओसाका विश्वविद्यालय, जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान और विकास (गैर-लाभकारी संगठन) में साकी निशिओका और चिकित्सा विज्ञान संस्थान, टोक्यो विश्वविद्यालय में मियो किकुची और रीको साकामोतो को उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम द्वारा समर्थित किया गया था: शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (एमईएक्सटी)/जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) काकेन्ही एमआई (जेपी 19 एच 05750, जेपी 21 एच 05033), और एमओ (20 एच 03162) को अनुदान; कोर रिसर्च फॉर इवोल्यूशनल साइंस एंड टेक्नोलॉजी (क्रेस्ट), जापान साइंस एंड टेक्नोलॉजी एजेंसी (जेएसटी) एमआई को अनुदान (जेपीएमजेसीआर 21 एन 1); यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट टू एमआई (आर01एचडी088412); बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन को एमआई (ग्रैंड चैलेंजेस एक्सप्लोरेशन अनुदान आईएनवी -001902); और माइक्रोबियल रोगों के लिए अनुसंधान संस्थान, ओसाका विश्वविद्यालय के एमआई और एमओ के संयुक्त अनुसंधान परियोजना के लिए अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c ESC - - ESC developed from BALB/c strain
Bambanker Nippon Genetics CS-02-001 Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere
Cas9 Nuclease V3 IDT 1081059 Section 3.2 and elsewhere.
CHIR99021 FUJIFILM Wako 038-23101 Section 4.3
CreERT gene fragment GeneWiz Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA IDT crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.
CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072534 tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.
DMEM Nacalai 08458-45 MEF medium. Section 2.3 and elsewhere
Duplex buffer IDT 1072534 RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.
FastGene Gel/PCR Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Section 1.1 and 1.2.
GlutaMax Thermo Fisher 35-050-061 L-glutatime substrate
hCG ASKA Animal Health Section 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit Clontech 639648 DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere
JM8.A3 ESC EuMMCR - ESC developed from C57BL/6N strain
Knock-out DMEM Thermo Fisher 10829018 Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.
KSOM Merck MR-121-D Section 6.3 and 6.9.
Leukemia inhibitory factor FUJIFILM Wako 125-05603 Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.
Neon Electroporation system Thermo Fisher MPK5000 Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade Takara U0490B Section 1.6.
PD0325901 FUJIFILM Wako 162-25291 Section 4.3
PMSG ASKA Animal Health Section 6.1.
Tail lysis buffer Nacalai 06169-95 Section 5.5.
Trypsin-EDTA Nacalai 32777-15 Section 2.2 and elsewhere
V6.5 ESC - - ESC developed from B6J-129 F1 strain
X-ray irradiation device Hitachi MBR-1618R-BE Section 2.6.

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 186
CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन-मैनिपुलेटेड माउस मॉडल विकसित करने के लिए भ्रूण स्टेम सेल में अत्यधिक कुशल जीन लक्ष्यीकरण
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Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M.More

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models. J. Vis. Exp. (186), e64385, doi:10.3791/64385 (2022).

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