यहां हम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, खासकर बड़े डीएनए नॉक-इन (केआई) के लिए। इस प्रोटोकॉल को CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके ट्यून किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक समरूप पुनर्संयोजन-मध्यस्थता रैखिक डीएनए लक्ष्यीकरण विधि की तुलना में केआई दक्षता में काफी सुधार हुआ है।
CRISPR / Cas9 प्रणाली ने निषेचित युग्मकों का उपयोग करके प्रत्यक्ष जीनोम संपादन द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को विकसित करना संभव बना दिया है। हालांकि, हालांकि छोटे इंडेल म्यूटेशन को प्रेरित करके जीन-नॉकआउट चूहों को विकसित करने में दक्षता पर्याप्त होगी, बड़े आकार के डीएनए नॉक-इन (केआई) बनाने के लिए भ्रूण जीनोम संपादन की दक्षता अभी भी कम है। इसलिए, भ्रूण में प्रत्यक्ष केआई विधि के विपरीत, चिमेरा चूहों को विकसित करने के लिए भ्रूण इंजेक्शन के बाद भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) का उपयोग करके जीन लक्ष्यीकरण में अभी भी कई फायदे हैं (उदाहरण के लिए, विट्रो में उच्च थ्रूपुट लक्ष्यीकरण, मल्टी-एलील हेरफेर, और सीआरई और फ्लॉक्स जीन हेरफेर कम अवधि में किया जा सकता है)। इसके अलावा, इन विट्रो में मुश्किल से संभालने वाले भ्रूण वाले उपभेदों, जैसे बीएएलबी / सी, का उपयोग ईएससी लक्ष्यीकरण के लिए भी किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल जीन-मैनिपुलेटेड माउस मॉडल विकसित करने के लिए चिमेरा चूहों के उत्पादन के बाद सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता जीनोम संपादन को लागू करके ईएससी में बड़े आकार के डीएनए (कई केबी) केआई के लिए अनुकूलित विधि का वर्णन करता है।
आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उत्पादन करना और उनके फेनोटाइप का विश्लेषण करना हमें विवो में विशिष्ट जीन कार्यों को विस्तार से समझने में सक्षम बनाता है। जीवन विज्ञान क्षेत्र में जीन-संशोधित पशु मॉडल का उपयोग करके कई महत्वपूर्ण निष्कर्षों को उजागर किया गया है। इसके अलावा, CRISPR / Cas91 का उपयोग करके जीनोम संपादन तकनीक की रिपोर्ट के बाद से, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करके अनुसंधान जल्दी से कई प्रयोगशालाओंमें फैल गया है। CRISPR/Cas9 द्वारा माउस युग्मकों के जीनोम संपादन ने लघु डीएनए संशोधन विकसित करने के लिए स्वीकार्य दक्षता हासिल की है, जैसे कि इंडेल म्यूटेशन-ओरिएंटेड जीन नॉकआउट4, सिंगल न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन, या सिंगल-स्ट्रैंडेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एसएसओडीएन) का उपयोग करके शॉर्ट पेप्टाइड-टैग सम्मिलन नॉक-इन (केआई) दाताओंके रूप में। दूसरी ओर, जीनोम संपादन द्वारा युग्मनज में बड़े डीएनए टुकड़ों का केआई छोटे आकार के डीएनए संशोधन 6,7 की तुलना में कम दक्षता पर रहता है। इसके अलावा, माउस उपभेदों जैसे बीएएलबी / सी का उपयोग करना मुश्किल है, जो युग्मनज-आधारित जीनोम संपादन के लिए इम्यूनोलॉजी जैसे विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों के लिए एक महत्वपूर्ण तनाव है क्योंकि उनके प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण इन विट्रो हेरफेर के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।
आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल विकसित करने का एक और तरीका भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) लक्ष्यीकरण तकनीक का उपयोग करना है, जिसके बाद प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण में ईएससी इंजेक्शन द्वारा चिमेरा 8,9,10 का उत्पादन किया जाता है, जो अभी भी नियमित रूप से पारंपरिक विधि के रूप में उपयोग किया जाता है। यद्यपि पारंपरिक ईएससी लक्ष्यीकरण विधियों में सटीक केआई-ईएससी क्लोन प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण दर बहुत अधिक नहीं है, ईएससी लक्ष्यीकरण युग्मनज जीनोम संपादन की तुलना में कुछ फायदे प्रदान करता है, खासकर लंबे डीएनए केआई के लिए। उदाहरण के लिए, युग्मनज जीनोम में लंबे डीएनए टुकड़ों (कई केबी >) की केआई दक्षताकम स्पष्ट है 6,7, और केआई माउस की एक पंक्ति को विकसित करने के लिए कई युग्मकों की आवश्यकता होती है, जो पशु प्रयोगों के वर्तमान परिप्रेक्ष्य में अवांछनीय है। युग्मनज जीनोम संपादन के विपरीत, चिमेरा उत्पादन के बाद ईएससी को लंबे डीएनए लक्ष्यीकरण के लिए युग्मनज जीनोम संपादन की तुलना में काफी कम भ्रूण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, भले ही बीएएलबी / सी से प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण इन विट्रो हेरफेर के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, उनके ईएससी को विट्रो 11 में अन्य सक्षम 129 या एफ 1 पृष्ठभूमि ईएससी के रूप में बनाए रखा और संभाला जा सकता है, इसलिए, चिमेरा प्रोडक्शंस के लिए लागू होता है। हालांकि, भले ही एक लक्ष्यीकरण वेक्टर में सकारात्मक या नकारात्मक चयन के लिए 5 ‘ और 3 ‘ समरूप हथियार और दवा प्रतिरोध जीन कैसेट होते हैं, ईएससी की पारंपरिक केआई दक्षता आम तौर पर अपर्याप्त होती है, क्योंकि यादृच्छिक जीनोमिक एकीकरण 8,10 की उच्च आवृत्ति होती है, इस प्रकार, सटीक ईएससी लक्ष्यीकरण दक्षता के साथ एक बेहतर विधि की आवश्यकता होती है। हाल ही में, हमने पारंपरिक लक्ष्यीकरणविधियों की तुलना में उच्च केआई दक्षता प्राप्त करने के लिए CRISPR / Cas9-आधारित जीनोम संपादन का उपयोग करके एक ट्यून-अप ईएससी केआई विधि की सूचना दी। यहां हम जिस विधि का वर्णन करते हैं वह इस प्रक्रिया पर आधारित है जो दवा चयन के बिना नियमित कार्यों के लिए स्वीकार्य दक्षता के साथ ईएससी के लिए लंबे डीएनए (कई से 10 केबी >) केआई को सक्षम बनाता है; इस प्रकार, वेक्टर निर्माण प्रक्रिया बहुत आसान होगी और इसके लिए कम अवधि की आवश्यकता होगी, या सेल संस्कृति अवधि भी काफी कम हो जाएगी।
चिमेरा उत्पादन के बाद ईएससी के जीन लक्ष्यीकरण का उपयोग पारंपरिक रूप से जीन-मैनिपुलेटेड चूहों को विकसित करने के लिए किया गया है। फिर भी, जीन नॉक-इन दक्षता कम रहती है, भले ही लक्ष्यीकरण वेक्टर में सकारात्मक या नकारात्मक दवा चयन जीन कैसेट्स के साथ लंबे (सामान्य रूप से कई केबी >) होमोलॉजी हथियार होते हैं। हमारे प्रोटोकॉल ने नियमित कार्यों के लिए स्वीकार्य दक्षता पर कैस 9-आरएनपी-मध्यस्थता जीनोम संपादन के साथ एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में किसी भी दवा चयन कैसेट के बिना एक परिपत्र प्लास्मिड का उपयोग करके लंबे बहिर्जात डीएनए की एक ट्यून-अप ईएससी केआई विधि पेश की। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल पारंपरिक ईएससी लक्ष्यीकरण की तुलना में आनुवंशिक रूप से संशोधित चिमेरिक चूहों के उत्पादन में लगने वाले समय की मात्रा को काफी हद तक कम करने में मदद कर सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हमने जीनोम में साइट-विशिष्ट डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित करने के लिए CRISPR / Cas9-RNP का उपयोग किया, और एक गोलाकार प्लास्मिड का उपयोग रैखिक के बजाय लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में किया गया था। रैखिक प्लास्मिड को पारंपरिक रूप से जीन केआई के लिए एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि जीनोमिक एकीकरण 8,9,10 की उनकी बढ़ी हुई दक्षता के कारण। हालांकि, कई जीनोमिक एकीकरण निरर्थक हैं, भले ही वेक्टर में समरूप हथियार9 हों। दूसरी ओर, गोलाकार प्लास्मिड को शायद ही कभी लक्षित वैक्टर के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि ईएससी12 या फाइब्रोब्लास्ट13 के जीनोम में उनकी हार्ड-टू-एकीकृत विशेषता होती है। इस प्रकार, यह संभव होगा कि CRISPR / Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के साथ एक लक्ष्यीकरण वेक्टर के रूप में एक परिपत्र प्लास्मिड को लागू करने से निरर्थक यादृच्छिक एकीकरण कम हो जाता है लेकिन ईएससी जीनोम में साइट-विशिष्ट एकीकरण को अधिकतम किया जाता है। यह उल्लेखनीय होगा कि CRISPR/Cas9 द्वारा डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की प्रेरण दक्षता काफीमहत्वपूर्ण है, इस प्रकार जीआरएनए का उपयोग करना आवश्यक होगा जो उच्च दक्षता पर डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित करता है। जब केआई दक्षता बहुत कम होती है तो जीआरएनए को फिर से डिजाइन करने पर विचार किया जाना चाहिए। चित्रा 2 में दिखाए गए मामले में, ईएससी क्लोन के 40.9% ने केआई-विशिष्ट बैंड दिखाया। वास्तव में, संस्थान की मुख्य प्रयोगशाला के रूप में, हम नियमित रूप से यहां वर्णित विधि द्वारा ईएससी का उपयोग करके जीन लक्ष्यीकरण करते हैं और 1-2 केबी अनुक्रमों जैसे सीआरई, सीआरईआरटी, या फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों के लिए 10% -50% की केआई क्षमता हासिल की है, हालांकि जीन लोकस के आधार पर कुछ भिन्नताएं हैं। इस विधि का उपयोग करके हमारे पास सफलतापूर्वक केआई के सबसे लंबे डीएनए अनुक्रम रोसा 26 लोकस में लगभग 11.2 केबी हैं, और दक्षता 12.2% (41 विश्लेषण की गई कॉलोनियों में से पांच केआई कॉलोनियां) थी।
यह भी ध्यान दिया जाएगा कि यह प्रोटोकॉल ईएससी माइक्रोइंजेक्शन के प्राप्तकर्ता के रूप में आठ-सेल या मोरुला चरण भ्रूण का उपयोग करता है, लेकिन ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूण नहीं। यद्यपि हमने इस पेपर में प्रयोगों की तुलना नहीं की है, कई रिपोर्टों से पता चला है कि आठ-सेल या मोरुला चरण भ्रूण में ईएससी का इंजेक्शन ब्लास्टोसिस्ट 15,16,17,18 में ईएससी इंजेक्शन की तुलना में चिमेरिक संतानों में ईएससी योगदान की दक्षता में काफी सुधार करता है . दरअसल, सी 57बीएल /6, बी 6-129 एफ 1, और बीएएलबी / सी सहित विभिन्न ईएससी लाइनों के ईएससी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप आमतौर पर कुछ, लेकिन सभी, संतानों में उच्च कोट रंग चिमेरा विकास होता है (चित्रा 4 देखें)। विधि की सीमा यह है कि प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण में इंजेक्ट किए गए ईएससी हमेशा चिमेरा19,20 में रोगाणु कोशिकाओं में योगदान नहीं कर सकते हैं। ईएससी का जर्मलाइन ट्रांसमिशन प्रत्येक ईएससी क्लोन 19 की गुणवत्ता पर निर्भरकरेगा। इसलिए, स्थिर चिमेरिक माउस उत्पादन के लिए बैकअप के रूप में कई ईएससी क्लोन लाइनों को विकसित करना फायदेमंद होगा। अंत में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सरल लक्ष्यीकरण वैक्टर का उपयोग करते हैं जिसमें किसी भी दवा प्रतिरोधी कैसेट के बिना केआई के लिए केवल प्रत्येक होमोलॉजी आर्म और जीन ऑफ इंटरेस्ट शामिल है। इसलिए, वेक्टर निर्माण बहुत आसान होगा, और पारंपरिक ईएससी लक्ष्यीकरण तकनीक की तुलना में संस्कृति अवधि को छोटा किया जा सकता है। यह जीवन विज्ञान में भविष्य के विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को जल्दी और सुविधाजनक रूप से उत्पादन करने में मदद करेगा।
The authors have nothing to disclose.
हम ओसाका विश्वविद्यालय, जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान और विकास (गैर-लाभकारी संगठन) में साकी निशिओका और चिकित्सा विज्ञान संस्थान, टोक्यो विश्वविद्यालय में मियो किकुची और रीको साकामोतो को उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम द्वारा समर्थित किया गया था: शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (एमईएक्सटी)/जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) काकेन्ही एमआई (जेपी 19 एच 05750, जेपी 21 एच 05033), और एमओ (20 एच 03162) को अनुदान; कोर रिसर्च फॉर इवोल्यूशनल साइंस एंड टेक्नोलॉजी (क्रेस्ट), जापान साइंस एंड टेक्नोलॉजी एजेंसी (जेएसटी) एमआई को अनुदान (जेपीएमजेसीआर 21 एन 1); यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट टू एमआई (आर01एचडी088412); बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन को एमआई (ग्रैंड चैलेंजेस एक्सप्लोरेशन अनुदान आईएनवी -001902); और माइक्रोबियल रोगों के लिए अनुसंधान संस्थान, ओसाका विश्वविद्यालय के एमआई और एमओ के संयुक्त अनुसंधान परियोजना के लिए अनुदान।
BALB/c ESC | – | – | ESC developed from BALB/c strain |
Bambanker | Nippon Genetics | CS-02-001 | Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere |
Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081059 | Section 3.2 and elsewhere. |
CHIR99021 | FUJIFILM Wako | 038-23101 | Section 4.3 |
CreERT gene fragment | GeneWiz | Section 1.1. | |
CRISPR-Cas9 crisprRNA | IDT | crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072534 | tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere. |
DMEM | Nacalai | 08458-45 | MEF medium. Section 2.3 and elsewhere |
Duplex buffer | IDT | 1072534 | RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere. |
FastGene Gel/PCR Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Section 1.1 and 1.2. |
GlutaMax | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutatime substrate |
hCG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
In-Fusion HD Cloning Kit | Clontech | 639648 | DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere |
JM8.A3 ESC | EuMMCR | – | ESC developed from C57BL/6N strain |
Knock-out DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium. |
KSOM | Merck | MR-121-D | Section 6.3 and 6.9. |
Leukemia inhibitory factor | FUJIFILM Wako | 125-05603 | Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol. |
Neon Electroporation system | Thermo Fisher | MPK5000 | Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2. |
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade | Takara | U0490B | Section 1.6. |
PD0325901 | FUJIFILM Wako | 162-25291 | Section 4.3 |
PMSG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
Tail lysis buffer | Nacalai | 06169-95 | Section 5.5. |
Trypsin-EDTA | Nacalai | 32777-15 | Section 2.2 and elsewhere |
V6.5 ESC | – | – | ESC developed from B6J-129 F1 strain |
X-ray irradiation device | Hitachi | MBR-1618R-BE | Section 2.6. |