Her presenterer vi en protokoll for utvikling av genmodifiserte musemodeller ved bruk av embryonale stamceller, spesielt for store DNA-knock-in (KI). Denne protokollen er innstilt ved hjelp av CRISPR / Cas9 genomredigering, noe som resulterer i betydelig forbedret KI-effektivitet sammenlignet med den konvensjonelle homologe rekombinasjonsmedierte lineariserte DNA-målrettingsmetoden.
CRISPR/Cas9-systemet har gjort det mulig å utvikle genmodifiserte mus ved direkte genomredigering ved hjelp av befruktede zygoter. Men selv om effektiviteten i å utvikle gen-knockout-mus ved å indusere liten indelmutasjon ville være tilstrekkelig nok, er effektiviteten av embryogenomredigering for å lage DNA-knock-in (KI) i stor størrelse fortsatt lav. Derfor, i motsetning til den direkte KI-metoden i embryoer, har genmålretting ved hjelp av embryonale stamceller (ESCs) etterfulgt av embryoinjeksjon for å utvikle kimærmus fortsatt flere fordeler (f.eks. Høy gjennomstrømningsmålretting in vitro, multi-allel-manipulasjon, og Cre – og flox-genmanipulering kan utføres på kort tid). I tillegg kan stammer med embryoer som er vanskelige å håndtere in vitro, for eksempel BALB / c, også brukes til ESC-målretting. Denne protokollen beskriver den optimaliserte metoden for stor DNA (flere kb) KI i ESCs ved å bruke CRISPR / Cas9-mediert genomredigering etterfulgt av kimærmusproduksjon for å utvikle genmanipulerte musemodeller.
Å produsere genmodifiserte mus og analysere deres fenotype gjør det mulig for oss å forstå spesifikke genfunksjoner i detalj, in vivo. Mange viktige funn har blitt avdekket ved hjelp av genmodifiserte dyremodeller i livsvitenskapsfeltet. Videre, siden rapporten om genomredigeringsteknologi ved hjelp av CRISPR / Cas91, har forskning med genmodifiserte mus raskt spredt seg til mange laboratorier 2,3. Genomredigering av musezygoter av CRISPR/Cas9 har oppnådd akseptabel effektivitet for å utvikle kort DNA-modifikasjon, for eksempel indelmutasjonsorientert gen knockout4, enkeltnukleotidutskifting eller kort peptid-tag-innsetting ved bruk av enkeltstrengede oligonukleotider (ssODNs) som knock-in (KI) donorer5. På den annen side forblir KI av store DNA-fragmenter i zygoter ved genomredigering med lav effektivitet sammenlignet med den korte DNA-modifikasjonen 6,7. I tillegg er det vanskelig å bruke musestammer som BALB / c, som er en viktig belastning for spesifikke forskningsområder som immunologi, for zygotebasert genomredigering fordi deres preimplantasjonsembryoer er utsatt for in vitro-manipulasjon.
En annen måte å utvikle genmodifiserte musemodeller på er å bruke målrettingsteknikken embryonal stamcelle (ESC) etterfulgt av ESC-injeksjon i preimplantasjonsembryoet for å produsere kimærer 8,9,10, som fortsatt rutinemessig brukes som en konvensjonell metode. Selv om oppkjøpsgraden for å oppnå nøyaktige KI-ESC-kloner ikke er veldig høy i konvensjonelle ESC-målrettingsmetoder, gir ESC-målretting noen fordeler sammenlignet med zygote-genomredigering, spesielt for lang DNA-KI. For eksempel er KI-effektiviteten av lange DNA-fragmenter (> flere kb) i zygote-genomet mindre tydelig6,7, og mange zygoter er nødvendig for å utvikle enda en linje med KI-mus, noe som er uønsket i dagens perspektiv på dyreforsøk. I motsetning til zygote genomredigering, trenger lang DNA-målretting til ESC etterfulgt av kimærproduksjon betydelig færre embryoer enn zygote genomredigering. Videre, selv om preimplantasjonsembryoene fra BALB/c er utsatt for in vitro-manipulasjon, kan deres ESC-er opprettholdes og håndteres in vitro 11 som andre kompetente ESC-er med 129- eller F1-bakgrunn, og gjelder derfor for kimærproduksjoner. Men selv om en målrettingsvektor inneholder 5 ‘og 3’ homologe armer og stoffresistensgenkassetter for positiv eller negativ seleksjon, er den konvensjonelle KI-effektiviteten til ESC generelt utilstrekkelig, på grunn av den høye frekvensen av tilfeldig genomisk integrasjon 8,10, Dermed er det nødvendig med en forbedret metode med presis ESC-målrettingseffektivitet. Nylig rapporterte vi en innstilt ESC KI-metode ved hjelp av CRISPR / Cas9-basert genomredigering for å oppnå høyere KI-effektivitet enn konvensjonelle målrettingsmetoder11. Metoden vi beskriver her er basert på denne prosedyren som muliggjør lang DNA (> flere til 10 kb) KI til ESC med akseptabel effektivitet for rutinearbeid uten legemiddelvalg; Dermed ville vektorkonstruksjonsprosedyren være mye enklere og trenge en kortere periode, eller cellekulturperioden ville også bli betydelig kortere.
Genmålretting av ESC etterfulgt av kimærproduksjon har blitt konvensjonelt brukt til å utvikle genmanipulerte mus. Likevel forblir genets knock-in-effektivitet lav selv om målrettingsvektoren inneholder lange (> flere kb i vanlige) homologiarmer med positive eller negative legemiddelseleksjonsgenkassetter. Vår protokoll introduserte en innstilt ESC KI-metode for langt eksogent DNA ved hjelp av et sirkulært plasmid uten legemiddelvalgkassetter som en målrettingsvektor ledsaget av Cas9-RNP-mediert genomredigering med en akseptabel effektivitet for rutinearbeid. Dermed kan denne protokollen bidra til å redusere tiden det tar å produsere genmodifiserte kimære mus betydelig sammenlignet med den konvensjonelle ESC-målrettingen.
I denne protokollen brukte vi CRISPR / Cas9-RNP for å indusere stedsspesifikke dobbeltstrengsbrudd i genomet, og et sirkulært plasmid ble brukt som målrettingsvektor i stedet for en linearisert. Lineariserte plasmider brukes konvensjonelt som en målrettingsvektor for gen KI på grunn av deres økte effektivitet av genomisk integrasjon 8,9,10. Imidlertid er mange genomiske integrasjoner uspesifikke selv om vektoren inneholder homologe armer9. På den annen side brukes sirkulære plasmider sjelden som målrettingsvektorer på grunn av deres vanskelige å integrere funksjon i genomet til ESCs12 eller fibroblaster13. Dermed vil det være mulig at bruk av et sirkulært plasmid som en målrettingsvektor ledsaget av CRISPR / Cas9-mediert genomredigering minimerer ikke-spesifikk tilfeldig integrasjon, men maksimerer den stedsspesifikke integrasjonen i ESC-genomet. Det ville være bemerkelsesverdig at induksjonseffektiviteten til dobbeltstrengsbruddet av CRISPR / Cas9 er ganske viktig14, og det ville derfor være viktig å bruke gRNA som induserer et dobbeltstrengsbrudd ved høy effektivitet. Det bør vurderes å re-designe gRNA når KI-effektiviteten er for lav. I tilfellet vist i figur 2 viste 40.9% av ESC-kloner et KI-spesifikt bånd. Faktisk, som instituttets kjernelaboratorium, utfører vi rutinemessig genmålretting ved hjelp av ESC-er ved metoden beskrevet her og har oppnådd KI-effektivitet på 10% -50% for 1-2 kb-sekvenser som Cre, CreERT eller fluorescerende reportere, selv om det er noen variasjoner avhengig av genlokus. De lengste DNA-sekvensene vi har lykkes med KI ved hjelp av denne metoden er omtrent 11,2 kb inn i Rosa26-lokuset, og effektiviteten var 12,2% (fem KI-kolonier av 41 analyserte kolonier).
Det vil også være verdt å merke seg at denne protokollen bruker åtte-celle eller morula stadium embryoer som mottakere for ESC mikroinjeksjon, men ikke blastocyst stadium embryoer. Selv om vi ikke har utført sammenligningseksperimenter i dette papiret, har flere rapporter vist at injeksjon av ESC i åtte-celle eller morula stadium embryoer forbedrer effektiviteten av ESC-bidrag til kimær avkom betydelig sammenlignet med ESC-injeksjonen i blastocyster15,16,17,18 . Faktisk resulterte ESC-injeksjoner av forskjellige ESC-linjer, inkludert C57BL / 6, B6-129 F1 og BALB / c, ofte i høy pelsfargekimærutvikling hos noen, men ikke alle, avkom (se figur 4). Begrensningen av metoden er at ESC-ene injisert i preimplantasjonsembryoet ikke alltid kunne bidra til kimceller i en kimær19,20. Germline-overføring av ESC-er vil avhenge av kvaliteten på hver ESC-klone19. Derfor vil det være en fordel å utvikle flere ESC-klonelinjer som en sikkerhetskopi for stabil kimær museproduksjon. Avslutningsvis bruker protokollene som presenteres her enkle målrettingsvektorer som bare inkluderer hver homologiarm og gen av interesse for KI uten stoffresistent kassett. Derfor ville vektorkonstruksjonen være mye enklere, og kulturperioden kunne forkortes sammenlignet med den konvensjonelle ESC-målrettingsteknikken. Dette vil bidra til raskt og lettere å produsere ulike typer genmodifiserte mus for fremtidig analyse innen livsvitenskap.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Saki Nishioka i Osaka University, bioteknologisk forskning og utvikling (ideell organisasjon), og Mio Kikuchi og Reiko Sakamoto i Institutt for medisinsk vitenskap, Universitetet i Tokyo, for deres utmerkede tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av: departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) / Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskudd til MI (JP19H05750, JP21H05033) og MO (20H03162); Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Agency (JST) stipend til MI (JPMJCR21N1); Eunice Kennedy Shriver Nasjonalt institutt for barnehelse og menneskelig utvikling til MI (R01HD088412); Bill & Melinda Gates Foundation til MI (Grand Challenges Explorations grant INV-001902); og Grant for Joint Research Project fra Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University til MI og MO.
BALB/c ESC | – | – | ESC developed from BALB/c strain |
Bambanker | Nippon Genetics | CS-02-001 | Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere |
Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081059 | Section 3.2 and elsewhere. |
CHIR99021 | FUJIFILM Wako | 038-23101 | Section 4.3 |
CreERT gene fragment | GeneWiz | Section 1.1. | |
CRISPR-Cas9 crisprRNA | IDT | crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072534 | tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere. |
DMEM | Nacalai | 08458-45 | MEF medium. Section 2.3 and elsewhere |
Duplex buffer | IDT | 1072534 | RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere. |
FastGene Gel/PCR Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Section 1.1 and 1.2. |
GlutaMax | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutatime substrate |
hCG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
In-Fusion HD Cloning Kit | Clontech | 639648 | DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere |
JM8.A3 ESC | EuMMCR | – | ESC developed from C57BL/6N strain |
Knock-out DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium. |
KSOM | Merck | MR-121-D | Section 6.3 and 6.9. |
Leukemia inhibitory factor | FUJIFILM Wako | 125-05603 | Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol. |
Neon Electroporation system | Thermo Fisher | MPK5000 | Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2. |
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade | Takara | U0490B | Section 1.6. |
PD0325901 | FUJIFILM Wako | 162-25291 | Section 4.3 |
PMSG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
Tail lysis buffer | Nacalai | 06169-95 | Section 5.5. |
Trypsin-EDTA | Nacalai | 32777-15 | Section 2.2 and elsewhere |
V6.5 ESC | – | – | ESC developed from B6J-129 F1 strain |
X-ray irradiation device | Hitachi | MBR-1618R-BE | Section 2.6. |