Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

CRISPR/Cas9-mediert svært effektiv genmålretting i embryonale stamceller for utvikling av genmanipulerte musemodeller

Published: August 24, 2022 doi: 10.3791/64385
Automatic Translation
*1, *2, 1,2
1Laboratory of Reproductive Systems Biology, Center for Experimental Medicine and Systems Biology, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, 2Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for utvikling av genmodifiserte musemodeller ved bruk av embryonale stamceller, spesielt for store DNA-knock-in (KI). Denne protokollen er innstilt ved hjelp av CRISPR / Cas9 genomredigering, noe som resulterer i betydelig forbedret KI-effektivitet sammenlignet med den konvensjonelle homologe rekombinasjonsmedierte lineariserte DNA-målrettingsmetoden.

Abstract

CRISPR/Cas9-systemet har gjort det mulig å utvikle genmodifiserte mus ved direkte genomredigering ved hjelp av befruktede zygoter. Men selv om effektiviteten i å utvikle gen-knockout-mus ved å indusere liten indelmutasjon ville være tilstrekkelig nok, er effektiviteten av embryogenomredigering for å lage DNA-knock-in (KI) i stor størrelse fortsatt lav. Derfor, i motsetning til den direkte KI-metoden i embryoer, har genmålretting ved hjelp av embryonale stamceller (ESCs) etterfulgt av embryoinjeksjon for å utvikle kimærmus fortsatt flere fordeler (f.eks. Høy gjennomstrømningsmålretting in vitro, multi-allel-manipulasjon, og Cre - og flox-genmanipulering kan utføres på kort tid). I tillegg kan stammer med embryoer som er vanskelige å håndtere in vitro, for eksempel BALB / c, også brukes til ESC-målretting. Denne protokollen beskriver den optimaliserte metoden for stor DNA (flere kb) KI i ESCs ved å bruke CRISPR / Cas9-mediert genomredigering etterfulgt av kimærmusproduksjon for å utvikle genmanipulerte musemodeller.

Introduction

Å produsere genmodifiserte mus og analysere deres fenotype gjør det mulig for oss å forstå spesifikke genfunksjoner i detalj, in vivo. Mange viktige funn har blitt avdekket ved hjelp av genmodifiserte dyremodeller i livsvitenskapsfeltet. Videre, siden rapporten om genomredigeringsteknologi ved hjelp av CRISPR / Cas91, har forskning med genmodifiserte mus raskt spredt seg til mange laboratorier 2,3. Genomredigering av musezygoter av CRISPR/Cas9 har oppnådd akseptabel effektivitet for å utvikle kort DNA-modifikasjon, for eksempel indelmutasjonsorientert gen knockout4, enkeltnukleotidutskifting eller kort peptid-tag-innsetting ved bruk av enkeltstrengede oligonukleotider (ssODNs) som knock-in (KI) donorer5. På den annen side forblir KI av store DNA-fragmenter i zygoter ved genomredigering med lav effektivitet sammenlignet med den korte DNA-modifikasjonen 6,7. I tillegg er det vanskelig å bruke musestammer som BALB / c, som er en viktig belastning for spesifikke forskningsområder som immunologi, for zygotebasert genomredigering fordi deres preimplantasjonsembryoer er utsatt for in vitro-manipulasjon.

En annen måte å utvikle genmodifiserte musemodeller på er å bruke målrettingsteknikken embryonal stamcelle (ESC) etterfulgt av ESC-injeksjon i preimplantasjonsembryoet for å produsere kimærer 8,9,10, som fortsatt rutinemessig brukes som en konvensjonell metode. Selv om oppkjøpsgraden for å oppnå nøyaktige KI-ESC-kloner ikke er veldig høy i konvensjonelle ESC-målrettingsmetoder, gir ESC-målretting noen fordeler sammenlignet med zygote-genomredigering, spesielt for lang DNA-KI. For eksempel er KI-effektiviteten av lange DNA-fragmenter (> flere kb) i zygote-genomet mindre tydelig6,7, og mange zygoter er nødvendig for å utvikle enda en linje med KI-mus, noe som er uønsket i dagens perspektiv på dyreforsøk. I motsetning til zygote genomredigering, trenger lang DNA-målretting til ESC etterfulgt av kimærproduksjon betydelig færre embryoer enn zygote genomredigering. Videre, selv om preimplantasjonsembryoene fra BALB/c er utsatt for in vitro-manipulasjon, kan deres ESC-er opprettholdes og håndteres in vitro 11 som andre kompetente ESC-er med 129- eller F1-bakgrunn, og gjelder derfor for kimærproduksjoner. Men selv om en målrettingsvektor inneholder 5 'og 3' homologe armer og stoffresistensgenkassetter for positiv eller negativ seleksjon, er den konvensjonelle KI-effektiviteten til ESC generelt utilstrekkelig, på grunn av den høye frekvensen av tilfeldig genomisk integrasjon 8,10, Dermed er det nødvendig med en forbedret metode med presis ESC-målrettingseffektivitet. Nylig rapporterte vi en innstilt ESC KI-metode ved hjelp av CRISPR / Cas9-basert genomredigering for å oppnå høyere KI-effektivitet enn konvensjonelle målrettingsmetoder11. Metoden vi beskriver her er basert på denne prosedyren som muliggjør lang DNA (> flere til 10 kb) KI til ESC med akseptabel effektivitet for rutinearbeid uten legemiddelvalg; Dermed ville vektorkonstruksjonsprosedyren være mye enklere og trenge en kortere periode, eller cellekulturperioden ville også bli betydelig kortere.

Protocol

Alle museeksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Tokyo (godkjenningsnummer PA17-63) og Osaka University (godkjenningsnummer Biken-AP-H30-01) og utført i henhold til deres retningslinjer samt ARRIVE-retningslinjene (https://arriveguidelines.org).

1. Målretting av vektorkonstruksjon

  1. Forsterk en KI-kassett (CreERT her, mal-DNA for PCR er opprinnelig fra et kommersielt gensyntesefirma) og et omtrentlig 1 kb fragment av 5'- eller 3'-homologiarmer ved PCR. For DNA-kloning (trinn 1.3), legg til 15-mer overlappingssekvenser på 5'-enden av hver PCR-primer. Rens PCR DNA-fragmentene ved agarosegelelektroforese, etterfulgt av ekstraksjon av DNA-fragmentet ved hjelp av et DNA-rensingssett.
  2. Linearisere ryggradsplasmidet (f.eks. pUC19 eller pBS) ved hjelp av et passende restriksjonsenzym (er) som unikt fordøyes et sted i multikloningsstedet for kloning. Rens deretter det fordøyede plasmidet ved hjelp av et DNA-rensingssett.
  3. Klon hvert PCR-fragment (f.eks. 5'-homologiarm, 3'-homologiarm) og KI-sekvens samtidig inn i det fordøyede plasmidet ved hjelp av et DNA-kloningssett i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Transformer de kompetente cellene ved hjelp av det konstruerte plasmidet (trinn 1.3) ved oppvarming ved 42 ° C i 1 minutt i et vannbad, og frø dem deretter på en LB-plate som inneholder riktig konsentrasjon av antibiotika som ampicillin eller kanamycin. Kultur dem over natten for motstandsdyktige klonevalg.
  5. Plukk opp flere (fire til åtte) individuelle kolonier ved hjelp av 200 μL pipettespisser og overfør spissene til 3 ml flytende LB som inneholder passende antibiotika (100 μg / ml ampicillin eller 20 μL / ml kanamycin) og kultur over natten ved 37 ° C med risting.
  6. Rens plasmidet dagen etter ved hjelp av et endotoksinfritt kommersielt plasmidrensingssett i henhold til produsentens instruksjoner. Bekreft den klonede sekvensen i plasmidet ved Sanger-sekvensering. Juster plasmidkonsentrasjonen ved 1 μg DNA / μL ved hjelp av nukleasefritt vann. Bruk plasmidet som genmålrettingsvektor.

2. Fremstilling av musens embryonale fibroblast (MEF) som materceller for ESC

  1. Ofre 8-10 uker gamle gravide ICR kvinnelige mus (14,5 dager postcoitum) ved cervikal dislokasjon. Tørk magen godt ved å bruke 70% (v / v) etanol for sterilisering, kutt magen ved hjelp av orbital saks og tang, og gjenopprette fosterholdig livmor.
  2. Legg livmoren i en 100 mm tallerken som inneholder 10 ml fosfatbovint serum (PBS) inneholdende 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Fjern morkakene og ekstraembryonale vev fra fostrene ved hjelp av orbital saks og tang. Hakk fostrene ved hjelp av orbital saks og overfør PBS-løsningen som inneholder hakkede føtale celler til et 50 ml konisk rør.
  3. Sentrifuge ved 280 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten ved aspirasjon. Tilsett 10 ml 0,25% (w / v) trypsin-EDTA-løsning, bland godt ved pipettering, og inkluder deretter i 10 minutter ved 37 ° C ved hjelp av et vannbad for trypsinfordøyelse.
  4. Tilsett 20 ml MEF-medium (DMEM inneholdende 10 % (v/v) føtalt bovint serum, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin) for å stoppe den enzymatiske reaksjonen, bland godt ved mild inversjon og sentrifuge ved 280 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved aspirasjon, tilsett 10 ml MEF-medium og bland godt ved pipettering.
  5. Frø cellesuspensjonen i flere nye 100 mm retter (tilbered samme antall retter som antall fostre med 10 ml MEF-medium for en 100 mm tallerken). Endre mediet 4 til 5 timer etter såing for å fjerne ufestede celler og la den vedlagte MEF vokse. Passasje cellene når de når ~ 80% sammenløp ved hjelp av trypsin.
  6. Plasser kulturskålene som inneholder den prolifererende MEF i MEF-medium, ca. 12-15 dager etter såing, i en røntgenbestrålingsenhet. Utsett MEF med et røntgenbilde på 50 Gy (totalt) for å stoppe cellesyklusen i henhold til produsentens instruksjoner.
  7. Trypsiniser den bestrålte MEF ved å tilsette 2 ml 0,25% trypsin-EDTA for en 100 mm tallerken i 5 minutter ved 37 ° C, tilsett deretter 4 ml MEF-medium for å stoppe trypsinfordøyelsen og samle cellesuspensjonen i et nytt 50 ml rør.
  8. Vask MEF med et friskt MEF-medium ved sentrifugering ved 280 x g i 5 minutter ved 4 ° C, tell antall celler ved hjelp av en celleteller med trypanblå farging, og frys dem ved 1,6 x 106 celler / rør i et cellefrysemedium. Oppbevares til bruk; Celler kan lagres stabilt i flytende nitrogen i flere år.

3. Cas9-RNP-DNA blanding forberedelse

  1. Løs opp tracrRNA og crisprRNA i fortynningsbuffer (hver RNA-konsentrasjon ved 200 μM) ved pipettering. Bland tracrRNA-løsningen, crisprRNA-løsningen og fortynningsbufferen (volumforhold ved 2:2:5) ved forsiktig tapping og anneal hvert RNA ved hjelp av en termisk syklus ved 95 °C i 10 minutter etterfulgt av 1 °C/min stepdown-sykluser til temperaturen når 4 °C.
    MERK: gRNA-sekvensen ble designet ved hjelp av CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
  2. Inkuber de glødede RNA-ene, 10 μg / μL Cas9-nukleasen og elektroporeringsbufferen blandet i et volumforhold på 5: 3: 2 ved 37 ° C i 20 minutter for å danne Cas9-RNP-komplekset. I rutinemessig arbeid, bland og inkuberer 1,25 μL glødet RNA, 0,75 μL Cas9 nukleasen og 0,5 μL av elektroporeringsbufferen for en lokus genomredigering.
  3. Bland følgende materialer i et 1,5 ml rør: 10 μL elektroporeringsbuffer, 1 μL Cas9-RNP-kompleks (trinn 3,2) og 1 μL sirkulær målrettingsvektor (1 μg / μL, trinn 1,6). Den totale mengden Cas9-RNP-DNA-blanding er 12 μL. Hold Cas9-RNP-DNA-blandingen på is til elektroporering.
    MERK: For å forhindre re-spaltning av gRNA etter KI, design gRNA i en posisjon der gRNA-gjenkjenningssekvensen splittes ved integrering av KI-donoren. Hvis gRNA ikke kan utformes på et slikt sted, er flere nukleotidstille mutasjoner, hvorved aminosyresekvensen ikke endres, inkludert i plasmidet til KI-donoren.

4. Genmålretting av ESC

  1. For å tilberede de gelatinbelagte cellekulturrettene, tilsett 0,1% (w / v) gelatinløsning ved 2 ml for en 60 mm tallerken, 500 μL for en 24-brønns tallerken, 100 μL for en 96-brønns tallerken og inkuber i 2 timer i en fuktig inkubator. Fjern gelatinoppløsningen, vask to ganger med samme mengde PBS, og oppbevar ved romtemperatur til bruk.
  2. Tin mitotisk inaktivert frossen MEF-bestand (trinn 2.2) ved hjelp av et vannbad på 37 °C i 1 min, og legg MEF på en gelatinbelagt 60 mm tallerken (ett frosset rørrør med MEF som inneholder 1,6 x 106 celler for to 60 mm retter, trinn 2,2) 1 dag før ESC-såing.
  3. Tine et frosset ESC-lagerrør (lagret ved 2 x 10 5 ESCer / rør; celletelling ble utført ved hjelp av en celleteller) ved hjelp av et 37 ° C vannbad i 1 min, og legg 1 x 105 ESC på en 60 mm tallerken som inneholder forhåndsfrøet MEF (trinn 4.1).
  4. Kultur i 4 ml ESC-kulturmedium (ESCM, DMEM-basert modifisert medium med 15% (v / v) føtalt bovint serum, 2 mM L-glutaminsubstrat, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,1 mM 2-merkaptoetanol, leukemihemmende faktor og t2i (0,2 μM PD0325901 og 3 μM CHIR99021) som opprettholder pluripotens av ESC11) ved 37 ° C med 5% CO2 til ESC når 50% til 70% sammenløp.
    MERK: Vi bruker tre forskjellige linjer med ESC: JM8. A3 fra B6N, V6.5 fra B6-129 F1, og egenutviklet BALB/c ESC. De samme KI-protokollene i dette manuskriptet brukes for alle ESC-linjer.
  5. Vask den dyrkende ESC med 4 ml PBS, og behandle deretter med 800 μL 0,25% trypsin-EDTA-løsning i 5 minutter ved 37 ° C for fordøyelsen. Tilsett 1 ml ESCM for å inaktivere trypsinet og dissosiere ESC-ene til enkeltceller ved pipettering.
  6. Sentrifuge den ESC-holdige oppløsningen i 5 minutter ved 280 x g, kast supernatanten, resuspender ESC i fersk 1 ml ESCM og tell antall celler ved hjelp av en celleteller med trypanblå farging. Overfør 1 x 10 5 ESC-er til et nytt1,5 ml rør og vask dem tre ganger med PBS ved sentrifugering ved 500 x g, 4 °C.
  7. Resuspender ESC-pelleten i 12 μL Cas9-RNP-DNA-blanding (trinn 3.3) og bland godt ved skånsom pipettering for å unngå bobler. Server den resuspenderte ESC for elektroporering. Elektroporeringssystemet bruker en enkelt puls ved 1,400 V og 30 ms for Cas9-RNP-DNA-transduksjon (figur 1).
  8. Dyrk de elektroporerte ESC-ene i en 60 mm parabol som inneholder 4 ml ESCM med mitotisk inaktivert MEF (pkt. 4.2). Bytt medium hver dag.
  9. Vask ESC-ene med 4 ml PBS 3 til 5 dager etter elektroporeringen, og behandle deretter med 800 μL 0,25% trypsin-EDTA og kultur ved 37 ° C i 5 minutter i en fuktig inkubator for fordøyelsen. Tilsett 2 ml ESCM for å stoppe trypsinfordøyelsen og sentrifuger celleblandingen ved 280 x g i 5 minutter.
  10. Kast supernatanten, resuspender ESC-ene i 1 ml fersk ESCM, og tell cellekonsentrasjonen ved hjelp av en celleteller med trypanblå farging. Passasje ESC-ene med 1 x 103 ESC per 60 mm fat som inneholder ESCM og mater MEF. Bytt medium hver dag til kolonien tar seg opp.
    MERK: Grunnen til at ESC er bestått en gang før henting var at genomredigering kan fortsette å skje etter ESC-divisjon, så den første kolonien er ikke alltid klonen i mange tilfeller. Derfor er den første passasjen av ESC før koloniopptaket et viktig skritt for å plukke opp enkeltkloner.

5. PCR-genotyping av målrettede ESC-er

  1. Aspirer ESCM fra ESC-kulturskålen 5 til 7 dager etter første passasje (trinn 4.9) og tilsett 4 ml PBS. Plukk opp enkle ESC-kolonier med 5 μL PBS ved hjelp av en 20 μL pipette under et stereomikroskop (30x til 40x forstørrelse). Plasser de enkelte koloniene i en brønn med en rundbunnet 96-brønnplate som inneholder 15 μL 0,25% trypsin-EDTA-løsning.
  2. Hold 96-brønnsplaten på is til 48 individuelle kolonier er plukket opp. Inkuber 96-brønnsplaten i 5 minutter i en 37 ° C fuktig 5% CO2 inkubator, tilsett deretter 80 μL ESCM for å stoppe trypsinfordøyelsen og dissosiere ESC-kolonier i enkeltceller ved pipettering.
    MERK: Siden KI-effektiviteten til denne metoden vanligvis er 10% -50%, plukker vi rutinemessig opp 48 kloner og utfører først genotyping ved hjelp av 24 av dem. Hvis flere KI-kloner ikke kan oppnås på dette tidspunktet, screener vi videre for KI ved å bruke de resterende 24 klonene.
  3. Overfør 40 μL ESC-suspensjon (trinn 5) til en gelatinbelagt materfri 96-brønnsplate som inneholder 50 μL ESCM per brønn for PCR-genotyping. Overfør de resterende 60 μL ESC-suspensjonen til en brønn i en gelatinbelagt 24-brønnsplate, som inneholder 500 μL ESCM og mater MEF, for å lage den frosne ESC-bestanden.
  4. Lager individuelle ESC-kloner dyrket i 24-brønnsplaten (trinn 5.3) til de vil nå 60% til 80% sammenløp. Gjenopprett individuelle ESC-kloner ved trypsinisering som nevnt ovenfor, samle celler i et nytt 1,5 ml rør og sentrifuge ved 280 x g i 5 minutter. Kast supernatanten, resuspender cellene i 500 μL cellefrysemedium, og frys dem ned med en -80 °C dypfryser.
  5. For PCR-genotyping er kultur ESC-kloner i den 96-brønns materfrie platen (trinn 5.3) til ESC når mer enn 90% sammenløp. Fjern ESCM fra hver brønn ved aspirasjon og vask to ganger med 100 μL PBS.
  6. Aspirer PBS og tilsett 100 μL lysisbuffer som inneholder proteinase K, bland godt og overfør ESC-lysatet til et nytt 1,5 ml rør. Varm opp ESC-lysatet ved 65 °C i minst 1 time ved hjelp av et varmekammer. Trekk ut og rens det genomiske DNA ved hjelp av en konvensjonell fenol-kloroform DNA-rensingsmetode etterfulgt av etanolutfelling.
  7. Oppløs det utfelte DNA i 20 μL DNase-fritt vann og bestem renheten og konsentrasjonen av DNA ved hjelp av et spektrofotometer. Utfør genomisk PCR ved hjelp av lokusspesifikke primersett for å forsterke målområdet. Kontroller deretter sekvensen og velg ESC-klonene med de ønskede KI-sekvensene.

6. Fremstilling av åtte-celle stadium embryo og mikroinjeksjon av ESC

  1. Injiser 5 IE gravid hoppe serumgonadotropin (PMSG) intraperitonealt i voksne ICR-kvinner. Etter 48 timer, injiser 5 IE humant choriongonadotropin (hCG) i de samme hunnene, og kompis deretter de hormonbehandlede hunnene med ICR-hannene. Kontroller kopulatorpluggen i skjeden dagen etter (embryonale dag 0,5, ED0,5).
    MERK: For å evaluere kimærisme etter pelsfargeforhold, bruk blastocyst fra ICR-stammen som mottaker for en ESC som har svart eller agouti-pelsfargebakgrunn, eller blastocyst fra C57BL / 6-stammen som mottaker for en ESC som har albinobakgrunn.
  2. Samle ovidukten ved ED1.5 og legg den i HEPES bufrede medium (FHM) dråper. Gjenopprett tocellede eller firecellede embryoer ved å skylle ovidukten med FHM ved hjelp av en spylenål satt inn i infundibulumet.
  3. Vask de innsamlede embryoene ved å flytte dem inn i flere friske FHM-dråper ved hjelp av en munnpipette. Kultur embryoene i 50 μL KSOM faller på en 35 mm cellekulturskål dekket med mineralolje ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 1 dag til åttecelle- eller morulastadiet (ED2.5) er nådd.
  4. Hvis embryoene ikke brukes neste innsamlingsdag, frys dem ved vitrifisering i henhold til CARD-protokollen (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html), og oppbevar dem i flytende nitrogen til bruk.
  5. Forbered glasspipetter for å holde embryoene (80-100 μm ytre diameter) og ESC-injeksjon (ca. 13 μm diameter) ved hjelp av en avtrekker og mikroforge.
  6. Integrer en holdepipette som inneholder FHM i en kapillærholder koblet til en mikroinjektor og sett opp på venstre side av mikromanipulatoren. Koble en injeksjonspipette til en annen mikroinjektor og sett den opp på høyre side. Juster de to pipettene rett i mikroskopets synsfelt.
  7. Dispenser 5 μL dråper 12% (w / v) polyvinylpyrrolidon (PVP) i FHM medium og 5 μL dråper FHM på samme lokk på en 60 mm tallerken side om side og dekk dråpene med mineralolje. Overfør embryoer i 5 μL FHM-dråpen og tilsett 1-5 μL av ESC-suspensjonen til FHM-dråpen som inneholder embryoer.
    MERK: La ESC- og MEF-suspensjonen stå i 30 minutter i 4 ml ESM på 60 mm kulturfat før dråpetilberedningen. Siden MEFs holder seg til bunnen raskere enn ESCs, tillater denne 30-minutters inkubasjonen konsentrasjonen av ufestede ES-celler i supernatanten.
  8. Vask inne i injeksjonspipetten med PVP, og flytt deretter til dråpen som inneholder embryoene og ESC-ene.
  9. Plukk opp tre individuelle ECS-dubletter som nettopp er ferdige med celledelingen (seks celler) i injeksjonspipetten. Hold et åtte-celle eller morula stadium embryo, som har fullført komprimering, med holdepipetten ved aspirasjon. Lag et hull i zona pellucida med en piezoelektrisk puls (intensitet: 3; hastighet: 3). Fjern den sekscellede ESC inne i zona pellucida og trekk pipetten ut av embryoene.
  10. Vask de ESC-injiserte embryoene med flere KSOM-dråper forsiktig med en munnpipette og inkuber dem i en ny 50 μL KSOM-dråpe dekket med mineralolje ved 37 ° C, 5% CO2 til embryoene utvikler seg til blastocyststadiet.
  11. Overfør de 10 ESC-injiserte blastocystene til hvert livmorhorn hos pseudopregnant hunnmus (2,5 dager etter coitum, 20 blastocyster per hode).
  12. Etter at surrogatmoren har født, velg minst to mannlige kimærer med høyest kimærforhold (70% eller høyere som bekreftet av frakkfarge), og parer dem deretter med passende stammehunner for å oppnå F1 heterozygot KI.
  13. Avle individuelle KI-mus med passende partnere for å skaffe mus med ønskelig genotype (er) eller genetisk bakgrunn egnet for forskning.

Representative Results

Vi har målrettet spesifikke gen (er) i ESC etterfulgt av kimærproduksjon for å utvikle genmanipulert museproduksjon i henhold til vårt forrige manuskript11. ESC-genotyping (beskrevet i avsnitt 4) utføres rutinemessig ved bruk av PCR ved bruk av primere. Primerne er designet på genomiske sekvenser utenfor homologiarmene og de spesifikke sekvensene i KI DNA-fragmentet (figur 2A). I så fall forsterkes ingen villtypeallel, mens en PCR-amplikon av en bestemt størrelse bare oppdages når det målrettede eksogene DNA er KI ved målstedet. Representative genotyping av PCR-resultater er vist i figur 2B. Ni av 22 kloner (40,9%) viste et KI-spesifikt bånd i dette tilfellet. Tre representative målrettingsresultater, inkludert resultatet vist i figur 2, er vist i tabell 1. Disse resultatene indikerer at metoden vist her er effektiv og reproduserbar for gen KI uten medikamentvalg.

ESC plukkes opp i en injeksjonspipet, deretter lages et hull i zona pellucida ved hjelp av et piezoelektrisk pluss, og ESC frigjøres mellom embryonale celler (figur 3). Teknisk sett er denne protokollen for å injisere en ESC i et åtte-cellers eller morula-stadium embryo lik protokollen for ESC-injeksjon i en blastocyst som vanligvis brukes i mange museanlegg. Representative kimære mus er vist i figur 4. For pelsfargeevaluering av kimærisme ble embryoet fra ICR-stammen (albino, hvitt hår) brukt som mottaker av B6 eller B6-129 F1 ESC, og B6-embryoer ble brukt som mottaker av BALB / c ESCs (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Et skjema for CRISPR/Cas9 ribonukleoprotein (RNP)-mediert sirkulær plasmidintegrasjon i det spesifikke lokuset til et ESC-genom. Elektroporering introduserer et sirkulært plasmid som en målrettingsvektor i ESC-er med Cas9-RNP. Forkortelser: GOI = gen av interesse, HA = homologiarm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Genomiske PCR-analyser for KI-screening av målrettede ESC-kloner. (A) KI-spesifikke PCR-primere er designet på genomiske sekvenser utenfor homologiarmene (fremover) og i de spesifikke sekvensene i KI DNA-fragmentet (revers). (B) Representative genotyping PCR-resultater. Et villtypegenom ble brukt som en negativ kontroll. Forkortelser: GOI = gen av interesse, HA = homologiarm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder av embryoinjeksjon i åttecellestadiet . (A) For mikroinjeksjon plukkes tre dubletter av ESC (seks celler, pilspisser) opp. (B) Et hull i zona pellucida er laget med en piezoelektrisk puls, og ESC-er blir utvist mellom hver blastomer. Skalalinjen som vises er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representative bilder av kimærmus . (A,B) ESC avledet fra C57BL/6N (JM8. A3, Agouti hår; A) eller B6-129 F1 (Agouti hår; B) injiseres i ICR (albino, hvitt hår) embryoer, etterfulgt av overføring av embryoene til mor surrogater. (C) ESC avledet fra BALB / c (albino, hvitt hår) injiseres i C57BL / 6J (svart hår) embryoer, etterfulgt av overføring av embryoene til mor surrogater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Prosjekt-ID Choromosome 5'HA lengde (bp) 3'HA lengde (bp) Sett inn størrelse (bp) Antall analyserte kloner Antall KI kloner Virkningsgrad (%) Merknader
R26-CC* Chr6 965 1006 5321 23 2 8.7% -
R4-03* Chr8 1000 997 3070 22 6 27.3% -
P4-01* Chr15 1000 1000 2569 22 9 40.9% Vist i figur 2

Tabell 1: KI-effektivitet i tre uavhengige genomiske loci i ESC. *Disse prosjektene er ikke publisert så langt. Navnet på disse genene vil bli avslørt i uavhengige manuskripter i fremtiden.

Discussion

Genmålretting av ESC etterfulgt av kimærproduksjon har blitt konvensjonelt brukt til å utvikle genmanipulerte mus. Likevel forblir genets knock-in-effektivitet lav selv om målrettingsvektoren inneholder lange (> flere kb i vanlige) homologiarmer med positive eller negative legemiddelseleksjonsgenkassetter. Vår protokoll introduserte en innstilt ESC KI-metode for langt eksogent DNA ved hjelp av et sirkulært plasmid uten legemiddelvalgkassetter som en målrettingsvektor ledsaget av Cas9-RNP-mediert genomredigering med en akseptabel effektivitet for rutinearbeid. Dermed kan denne protokollen bidra til å redusere tiden det tar å produsere genmodifiserte kimære mus betydelig sammenlignet med den konvensjonelle ESC-målrettingen.

I denne protokollen brukte vi CRISPR / Cas9-RNP for å indusere stedsspesifikke dobbeltstrengsbrudd i genomet, og et sirkulært plasmid ble brukt som målrettingsvektor i stedet for en linearisert. Lineariserte plasmider brukes konvensjonelt som en målrettingsvektor for gen KI på grunn av deres økte effektivitet av genomisk integrasjon 8,9,10. Imidlertid er mange genomiske integrasjoner uspesifikke selv om vektoren inneholder homologe armer9. På den annen side brukes sirkulære plasmider sjelden som målrettingsvektorer på grunn av deres vanskelige å integrere funksjon i genomet til ESCs12 eller fibroblaster13. Dermed vil det være mulig at bruk av et sirkulært plasmid som en målrettingsvektor ledsaget av CRISPR / Cas9-mediert genomredigering minimerer ikke-spesifikk tilfeldig integrasjon, men maksimerer den stedsspesifikke integrasjonen i ESC-genomet. Det ville være bemerkelsesverdig at induksjonseffektiviteten til dobbeltstrengsbruddet av CRISPR / Cas9 er ganske viktig14, og det ville derfor være viktig å bruke gRNA som induserer et dobbeltstrengsbrudd ved høy effektivitet. Det bør vurderes å re-designe gRNA når KI-effektiviteten er for lav. I tilfellet vist i figur 2 viste 40.9% av ESC-kloner et KI-spesifikt bånd. Faktisk, som instituttets kjernelaboratorium, utfører vi rutinemessig genmålretting ved hjelp av ESC-er ved metoden beskrevet her og har oppnådd KI-effektivitet på 10% -50% for 1-2 kb-sekvenser som Cre, CreERT eller fluorescerende reportere, selv om det er noen variasjoner avhengig av genlokus. De lengste DNA-sekvensene vi har lykkes med KI ved hjelp av denne metoden er omtrent 11,2 kb inn i Rosa26-lokuset, og effektiviteten var 12,2% (fem KI-kolonier av 41 analyserte kolonier).

Det vil også være verdt å merke seg at denne protokollen bruker åtte-celle eller morula stadium embryoer som mottakere for ESC mikroinjeksjon, men ikke blastocyst stadium embryoer. Selv om vi ikke har utført sammenligningseksperimenter i dette papiret, har flere rapporter vist at injeksjon av ESC i åtte-celle eller morula stadium embryoer forbedrer effektiviteten av ESC-bidrag til kimær avkom betydelig sammenlignet med ESC-injeksjonen i blastocyster15,16,17,18 . Faktisk resulterte ESC-injeksjoner av forskjellige ESC-linjer, inkludert C57BL / 6, B6-129 F1 og BALB / c, ofte i høy pelsfargekimærutvikling hos noen, men ikke alle, avkom (se figur 4). Begrensningen av metoden er at ESC-ene injisert i preimplantasjonsembryoet ikke alltid kunne bidra til kimceller i en kimær19,20. Germline-overføring av ESC-er vil avhenge av kvaliteten på hver ESC-klone19. Derfor vil det være en fordel å utvikle flere ESC-klonelinjer som en sikkerhetskopi for stabil kimær museproduksjon. Avslutningsvis bruker protokollene som presenteres her enkle målrettingsvektorer som bare inkluderer hver homologiarm og gen av interesse for KI uten stoffresistent kassett. Derfor ville vektorkonstruksjonen være mye enklere, og kulturperioden kunne forkortes sammenlignet med den konvensjonelle ESC-målrettingsteknikken. Dette vil bidra til raskt og lettere å produsere ulike typer genmodifiserte mus for fremtidig analyse innen livsvitenskap.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Saki Nishioka i Osaka University, bioteknologisk forskning og utvikling (ideell organisasjon), og Mio Kikuchi og Reiko Sakamoto i Institutt for medisinsk vitenskap, Universitetet i Tokyo, for deres utmerkede tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av: departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) / Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskudd til MI (JP19H05750, JP21H05033) og MO (20H03162); Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Agency (JST) stipend til MI (JPMJCR21N1); Eunice Kennedy Shriver Nasjonalt institutt for barnehelse og menneskelig utvikling til MI (R01HD088412); Bill & Melinda Gates Foundation til MI (Grand Challenges Explorations grant INV-001902); og Grant for Joint Research Project fra Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University til MI og MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c ESC - - ESC developed from BALB/c strain
Bambanker Nippon Genetics CS-02-001 Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere
Cas9 Nuclease V3 IDT 1081059 Section 3.2 and elsewhere.
CHIR99021 FUJIFILM Wako 038-23101 Section 4.3
CreERT gene fragment GeneWiz Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA IDT crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.
CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072534 tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.
DMEM Nacalai 08458-45 MEF medium. Section 2.3 and elsewhere
Duplex buffer IDT 1072534 RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.
FastGene Gel/PCR Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Section 1.1 and 1.2.
GlutaMax Thermo Fisher 35-050-061 L-glutatime substrate
hCG ASKA Animal Health Section 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit Clontech 639648 DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere
JM8.A3 ESC EuMMCR - ESC developed from C57BL/6N strain
Knock-out DMEM Thermo Fisher 10829018 Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.
KSOM Merck MR-121-D Section 6.3 and 6.9.
Leukemia inhibitory factor FUJIFILM Wako 125-05603 Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.
Neon Electroporation system Thermo Fisher MPK5000 Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade Takara U0490B Section 1.6.
PD0325901 FUJIFILM Wako 162-25291 Section 4.3
PMSG ASKA Animal Health Section 6.1.
Tail lysis buffer Nacalai 06169-95 Section 5.5.
Trypsin-EDTA Nacalai 32777-15 Section 2.2 and elsewhere
V6.5 ESC - - ESC developed from B6J-129 F1 strain
X-ray irradiation device Hitachi MBR-1618R-BE Section 2.6.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  3. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  4. Oji, A., et al. CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. Scientific Reports. 6, 31666 (2016).
  5. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  6. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  7. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  8. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).
  9. Johnson, R. S., et al. Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination. Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).
  10. Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells. Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).
  11. Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing. Genome Editing in Animals - Methods and Protocols 2nd edition. Hatada, I. , (2022).
  12. Yagi, M., et al. Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).
  13. Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).
  14. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322 (5903), 949-953 (2008).
  15. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  16. Hu, M., et al. Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos. Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).
  17. Guo, J., et al. Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos. Stem Cells International. 2014, 409021 (2014).
  18. Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies. Nature Communications. 13 (1), 2351 (2022).
  19. Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats. Nature Communications. 12 (1), 1328 (2021).
  20. Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3. Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 186
CRISPR/Cas9-mediert svært effektiv genmålretting i embryonale stamceller for utvikling av genmanipulerte musemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M.… More

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models. J. Vis. Exp. (186), e64385, doi:10.3791/64385 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter