Summary
本协议描述了一种使用自制牵开器进行微创横主动脉收缩（TAC）手术的改进和简化技术。该手术可以在没有呼吸机或显微镜的情况下进行，并引入压力超负荷，最终导致心脏肥大或心力衰竭。
Abstract
横主动脉收缩（TAC）是基于小鼠模型中压力超负荷的形成，在心力衰竭和心脏肥大研究中经常使用的手术。该手术的主要挑战是清晰地看到横主动脉弓并精确地束带目标血管。经典方法进行部分开胸术以暴露横主动脉弓。然而，它是一种开胸模型，会导致相当大的手术创伤，并且在手术过程中需要呼吸机。为了防止不必要的创伤并简化操作程序，通过胸骨的近端比例 接近 主动脉弓，使用包含圈套的小型自制牵开器到达并绑定目标血管。该手术可以在不进入胸膜腔的情况下进行，不需要呼吸机或显微外科手术，这使小鼠具有生理呼吸模式，简化了手术，并显着减少了手术时间。由于侵入性较小，手术时间较短，小鼠可以经历较少的应激反应并迅速恢复。
Introduction
心力衰竭是一种复杂的临床症状，由心室充盈或射血的结构和功能受损引起1。疾病分期主要通过纽约心脏协会根据症状严重程度和身体活动进行功能分类 来 定义2.对于射血分数超过 50% 的患者，结构和/或功能异常应提高利钠肽，以支持射血分数保留 （HFpEF） 诊断心力衰竭2。缺血性心脏病是心力衰竭多种病因的主要原因。因此，心肌梗死模型（如永久性冠状动脉结扎术）常用于研究心脏灌注不足或缺血再灌注损伤后的病理生理学3，4。除急性心肌损伤外，高血压、糖尿病、肥胖症和心肌病家族史等其他危险因素也会导致心力衰竭的发展。患者通过A期（有心力衰竭风险）进入B期（心力衰竭前期）后，会发生结构改变1。例如，高血压患者首先经历适应性左心室肥大，然后通过病理重塑逐渐发展为适应不良的心脏肥大并过渡到心力衰竭5。
作为各种心血管疾病的终末期，慢性心力衰竭已经研究了几十年6。多种小鼠模型已广泛用于心力衰竭研究，包括药物输注（血管紧张素II），代谢紊乱（糖尿病或高热量饮食）和主动脉收缩7。在这些模型中，血管紧张素II灌注伴有各种器官副作用，如肾脏7。诱导代谢紊乱通常需要相当长的时间。升主动脉收缩被认为与人类疾病相关性有限7.
TAC是一种可靠的模型，可增加后负荷并诱发心脏肥大和心力衰竭8。开胸TAC模型最早由Rockman等人描述，并在世界各地的众多实验室中使用9。然而，这种经典的TAC程序对小鼠造成相当大的创伤并改变其正常行为，这可能需要很长的恢复时间并干扰进一步的治疗10。其他改良的闭胸TAC手术确实减少了一些侵入性步骤，但需要显微外科手术技能或机械通气10，11。
本协议详细介绍了一种循序渐进的方法，该方法使用自制的牵开器通过胸骨上边缘的 3 毫米中线切口 对 主动脉弓进行微创方法。该模型不需要显微外科技术、机械通气或切开肋骨，从而提供了一种快速、手术创伤受限、简单、廉价的方式来进行 TAC 手术。
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Protocol
目前的协议由中国武汉华中科技大学同济医学院同济医院伦理委员会批准。该程序在雄性成年C57 / BL6小鼠（>10周龄）上进行。所有手术器械在手术前均通过高压灭菌进行灭菌。
1. 手术器械的准备
- 准备一个 5 mL 注射器，用针架捏掉针尖以使其变钝。
- 准备一根 27 G 的针头，并用持针器将其钝化。用眼科剪刀剪针尖是使针头变钝的另一种方法。
- 将 27 G 针的尖端弯曲 90°。
注意：此针将用作垫片，与主动脉系紧以进行血管收缩。 - 使用商业获得的铁丝（医用级，直径0.5毫米，见 材料表）并在针周围缠绕（图1A）。在针的钝尖形成一个小圈套或环（图1B）。
注意：这种可重复使用的仪器充当特殊的自制牵开器，并允许人们在后面的步骤中将丝线穿过主动脉下方。 - 手术前高压灭菌所有手术工具（包括上面制作的特殊牵开器）以对其进行消毒。
2. 动物制备
- 根据体重，通过腹膜内注射戊巴比妥钠溶液（50mg / kg，参见材料表）麻醉小鼠。皮下注射100μL的0.5%利多卡因局部到手术区域。
- 通过用镊子的尖端捏住鼠标的脚趾来确认鼠标已完全麻醉。
- 在双眼上涂抹眼药膏，以防止麻醉时干燥。
- 用脱毛膏或剪刀去除喉咙和上胸部的毛发。
- 用三个碘和70%乙醇的交替擦洗液对无毛区域进行消毒，向外移动同心圆。
- 将鼠标仰卧放在覆盖有无菌窗帘的加热垫上，其头部指向操作员。用胶带和门牙用4-0缝合线固定四肢（图2A）。
- 插入直肠探头（见 材料表）以在手术过程中监测体温。在整个操作过程中将体温保持在37°C。
- 戴上一副无菌手套。
注意：戴上无菌手套后，请勿触摸其他未消毒的区域或物体。 - 用无菌眼科剪刀在新的一次性无菌窗帘上切一个洞（直径1-1.5厘米）。将无菌窗帘放在鼠标上，并确保通过孔可以看到无毛的操作区域。
注意：此步骤允许操作员避免触摸其他未消毒的区域，这有助于在手术过程中保持无菌条件。
3.横主动脉收缩
- 用手术刀刀片在胸骨上切口的水平（图2B）做一个1.5厘米的垂直皮肤切口。将皮肤切口向下扩大到胸骨角的水平。
注意：胸骨上切迹是位于胸骨手管上边缘的切口。它是一种表面符号，可以在去除鼠标毛发时检测到（图2B）。胸骨角是胸骨和胸骨之间的关节。当胸骨暴露时，它在胸骨上表现为一条水平白线，位于肋骨的同一水平（图2C）。 - 小心地分离皮肤和浅筋膜，露出气管和胸骨近端。小心地从上边缘到胸骨角在胸骨上做一个3-4毫米的纵向中线切口（图2D）。
注意：切口不得超过胸骨角，因为存在引起小鼠急性气胸的风险。 - 用镊子轻轻抬起胸骨，在其下方抬起胸腺和弓主动脉。小心地使用直镊子，并钝化地解剖目标血管及其周围的组织。
- 握住用户右手末端包含钢丝圈套的先前自制卷收器（步骤 1.4）。
- 小心地将自制牵开器的圈套在主动脉下左颈总动脉和右无名动脉的起源之间（图2E）。
- 将自制的卷收器传给左手，为其他乐器腾出右手。
- 右手用显微镊子，将7-0的丝线穿过末端的圈套，拉出牵开器。这将允许将丝线留在动脉周围以进行进一步结扎（图2F）。
注意：要轻柔，不要将主动脉弓从其原始位置拖拽太多。 - 将27 G针平行于主动脉放置，并将缝合线绑在针和主动脉周围（图2G，H）。
注意：假手术应相同，除了没有主动脉结扎。 - 用眼科镊子抓住 27 G 针头，另一个镊子固定绑在 27 G 针头和主动脉上的结。快速但轻轻地从结扎中拉出27 G针（图2H）。
注意：打结不能太紧，否则不容易拔出针头。拔出针头时要小心，以防主动脉破裂。 - 用4-0合成单丝缝合以中断缝合模式缝合皮肤（图2I）。
4. 术后护理
- 将鼠标放在温暖的垫子上（请参阅 材料表）并等待其恢复。通常，鼠标在大约 60 分钟内复活。
注意：在动物恢复对主要胸骨卧的足够意识之前，不得无人看管。 - 皮下注射0.5mL温盐水，监测动物体液稳态。
注意：此步骤可防止动物脱水和低血容量循环状态。 - 每天将红霉素软膏涂抹在伤口表面，持续 3 天。
- 对于术后疼痛治疗，将1mg / L丁丙诺啡局部麻醉剂肠胃外施用到切口部位（见 材料表）。
- 术后，监测小鼠是否有感染和损伤的迹象（营养不良、驼背姿势和皱褶的皮毛）。
注意：接受手术的动物在完全康复之前不会回到其他动物的陪伴下。
5. 超声成像
- 手术后28天通过超声成像系统12，13（24 MHz，见材料表）计算血流速度，确认横主动脉的成功结扎。
- 在20%富氧空气中用4.5%异氟醚麻醉动物，并在20%富氧空气中用0.5%异氟醚维持。
- 将鼠标置于仰卧位，并用胶带将其四肢固定在电极上。
- 使用脱毛膏，去除胸毛并在胸部涂抹超声波偶联剂。
- 尽可能向左倾斜平台。在将探头保持在垂直位置的同时，沿着胸部的右侧胸骨旁线逐渐降低探头，凹口指向动物的下巴。
- 在仪器的B模式下，调整X轴和Y轴，直到主动脉弓和收缩部位清晰可见。
- 单击脉 搏波多普勒 按钮切换到脉搏波模式。
- 调整收缩部位远端的虚线光标样品体积盒，并找到速度最高的狭窄射流。
- 再次单击 脉搏波多普勒 按钮以获取主动脉血流波形并测量峰值速度。根据波形的峰值计算血流速度（图3A，B）。
- 将成像仪设置为 B 模式。将平台放在水平位置。将探头旋转至胸骨旁左线 30°。
- 调整 X 轴和 Y 轴以获得短轴视图。按 M 模式显示指示线，然后单击 Cine Store 保存图像，以便以后测量心脏壁厚度、腔室尺寸和射血分数。
注：射血分数的计算公式：100% * （（LV Vol;d - LV Vol;s） / LV Vol;d）。计算心输出量的公式：每搏输出量*心率（在绘制的第一帧）/ 1000。射血分数和心输出量等大多数指标都可以 通过 超声成像系统的软件自动测量。左心室体积：左心室舒张容积。左心室体积：左心室收缩容积。
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Representative Results
TAC手术成功后，使用超声成像系统检测压力过载。手术四周后，小鼠心脏功能下降。在本研究中，通过4周后接受TAC手术的小鼠的射血分数（EF），分数缩短（FS），左心室质量（LV质量）和左心室内径（LVID） 验证 了TAC手术的有效性。与假小鼠相比，4周后TAC小鼠的EF显着降低（47%±10%对78%±4%， p <0.0001）（图4A）。TAC小鼠的左心室质量显着升高（158.1±50.5对91.8±21.7mg， p = 0.0226）（图4B）。TAC小鼠的FS显着降低（23±5对46%±3%， p <0.0001）（图4C）。TAC小鼠的LVID显着升高（2.88±0.39对1.81±0.52mm， p = 0.0044）（图4D）。数据代表TAC组和Sham组各六只小鼠。由于小侵入性手术，存活率相当高，主要取决于出血，对于熟练的表演者来说，出血可以降低到5%以下。当完全掌握时，4周后C57BL / 6J小鼠的一般存活率超过95%。进行非配对 t检验以比较假手术组和TAC组。所有数据均以平均± SEM（误差线）表示。
图 1：自制的圈套包含牵开器，用于在主动脉弓周围通过丝线缝合 。 （A） 牵开器的整体视图。（二）牵收器的详细情况。箭头表示丝绸通过的圈套。 请点击此处查看此图的大图。
图2：TAC手术的图像 。 （A）仰卧位小鼠用胶带和缝合线固定。（B）无菌窗帘仅显示手术区域。（C）1.5厘米垂直皮肤切口。红色箭头表示胸骨天使。（D）对胸骨进行的纵向中线切口。（E）显示自制牵开器通过主动脉下方的圈套的图像。（F） 显示 7-0 丝线穿过圈套环的图像。（G） 平行于主动脉放置的 27 G 针。（H）用27G针结扎主动脉。白色箭头表示结扎结。（I）用4-0丝线缝合皮肤。 请点击此处查看此图的大图。
图3：4周后假和TAC小鼠超声成像系统的代表性图像 。 （A）假主动脉弓的脉冲波多普勒成像。 （B）TAC后主动脉弓的脉冲波多普勒成像。（C） 假鼠标计算 EF、左心室质量、壁厚和 LVID 的 M 模式图像。（D） TAC 鼠标计算 EF、左心室质量、壁厚和 LVID 的 M 模式图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：通过超声成像系统测量的心脏功能。 （A）两组小鼠的射血分数（EF）。（B）小鼠的左心室质量（LV质量）分为两组。（C）两组小鼠的分数缩短（FS）。（D）两组小鼠的左心室内径（LVID）。*p < 0.05，**p < 0.005，****p < 0.0005。数据代表每组六只小鼠。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
持续压力超负荷的诱导可逐渐引起心脏肥大和心力衰竭。该模型已在世界各地的众多实验室中使用14，15，16。该方案提供了一种改进的TAC方法，不需要显微外科手术技能或机械通气。
该方案中最重要的一步是在主动脉弓下通过丝线。当圈套钩住主动脉弓时，所有动作都必须轻柔，以减少对动脉的不必要牵引。此外，主动脉周围的缝合线不能太紧，以防在拉出垫片时遇到困难。手术后，充足的食物和水对小鼠快速恢复也很重要。
以前的手稿为TAC提供了其他方法。Eichhorn等人发表了一种封闭的胸部方法，该方法连接横主动脉10。整个过程使肋骨保持完整，从而造成非常小的创伤。Zaw等人提供了一种无需进入胸膜腔17的TAC方法。Tavakoli等人提出了一种不需要插管和通气的微创横动脉收缩11。上述所有技术都需要显微外科技术。此外，Lao等人提供了一种生产具有可吸收缝合线的TAC模型的方法18。本研究中的方案提供了一种快速（在10分钟内）进行TAC手术的替代方法，不需要在显微镜下操作。最小化手术创伤有利于小鼠并减少实验过程中的混杂因素。与开胸模型不同，该模型是微创的，不会影响鼠标的正常呼吸动态。完全掌握后，该技术的存活率超过95%。此外，它不需要机械通气和显微手术技能;自制的可重复使用的牵开器将完成所有工作，避免通气引起的全身炎症效应19。所有这些共同大大简化了操作程序。
这种技术有一些局限性。后负荷的急性增加并不完全反映动脉高血压的逐渐进展。多因素心力衰竭小鼠模型与临床心力衰竭患者之间病理生理学的差异引起了研究人员的关注20。在小鼠中呈现的病理生理学不能完全应用于人类。
总之，该协议提供了一种进行TAC的替代程序，可以在诱导小鼠心力衰竭或心脏肥大时促进研究人员。
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Disclosures
提交人声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由中国国家自然科学基金（NSFC 81822002）资助。我们感谢参加这项工作的所有成员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 nonabsorbable suture | Jinhuan | HM403 | Used for suturing the skin |
| 5 mL syringe | Haifuda Technology Co., Ltd. | BD-309628 | Used for making snare containing retractor |
| 7-0 nonabsorbable suture | Jinhuan | HM701 | Used for aorta ligation |
| Animal temperature monitor | Kaerwen | FT3400 | Used for monitoring body temperature |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | Used for post-surgical pain treatment |
| Depilatory cream | Veet | N/A | Used for remove body hair from the surgical area |
| Heating Pad | Xiaochuangxin | N/A | Used for maintaining body temperature |
| Ibuprofen | MCE | HY-78131 | Used for post-surgical pain treatment |
| Iron wire (0.5 mm) | Qing Yuan | Iron wire #26 | Used for making snare containing retractor |
| Microscopic tweezers | RWD | F12006-10 | Used for penetrating and separating the tissue to open operation space |
| Needle holder | RWD | F12005-10 | Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it |
| Ophthalmic forceps | RWD | F14012-10 | Used for holding skin and other tissues |
| Ophthalmic scissors | RWD | S11001-08 | Used for making sking incision of mouse |
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | Used for mouse anesthesia |
| Sterile operating mat | Hale & hearty | 211002 | Used for placing animal during surgery |
| Ultra-sound imaging system | Fujifilm visualsonics | vevo1100 | Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100 |
References
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