Summary
Le présent protocole décrit une technique modifiée et simplifiée avec une procédure de constriction aortique transverse (TAC) mini-invasive utilisant un rétracteur fabriqué par vous-même. Cette procédure peut être effectuée sans ventilateur ni microscope et introduit une surcharge de pression, conduisant éventuellement à une hypertrophie cardiaque ou à une insuffisance cardiaque.
Abstract
La constriction aortique transverse (TAC) est une chirurgie fréquemment utilisée dans la recherche sur l’insuffisance cardiaque et l’hypertrophie cardiaque basée sur la formation d’une surcharge de pression dans des modèles murins. Le principal défi de cette procédure est de visualiser clairement l’arc aortique transversal et de bander précisément le vaisseau cible. Les approches classiques effectuent une thoracotomie partielle pour exposer l’arc aortique transverse. Cependant, il s’agit d’un modèle à poitrine ouverte qui provoque un traumatisme chirurgical assez important et nécessite un ventilateur pendant la chirurgie. Pour éviter les traumatismes inutiles et simplifier la procédure opératoire, l’arc aortique est approché via la proportion proximale du sternum, atteignant et liant le vaisseau cible à l’aide d’un petit rétracteur fabriqué par lui-même qui contient un collet. Cette procédure peut être effectuée sans entrer dans la cavité plèvre et ne nécessite pas de ventilateur ou d’opération microchirurgicale, ce qui laisse aux souris des schémas respiratoires physiologiques, simplifie la procédure et réduit considérablement le temps d’opération. En raison de l’approche moins invasive et du temps d’opération réduit, les souris peuvent subir moins de réactions de stress et récupérer rapidement.
Introduction
L’insuffisance cardiaque est un symptôme clinique complexe qui résulte d’une altération de la structure et de la fonction du remplissage ventriculaire ou de l’éjection de sang1. Le stade de la maladie est principalement défini via la classification fonctionnelle de la New York Heart Association basée sur la gravité des symptômes et l’activité physique2. Pour les patients présentant une fraction d’éjection supérieure à 50%, des anomalies structurelles et / ou fonctionnelles ont augmenté les peptides natriurétiques pour soutenir le diagnostic d’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (ICFE)2. La cardiopathie ischémique est l’une des principales causes parmi les multiples étiologies de l’insuffisance cardiaque. Ainsi, le modèle d’infarctus du myocarde (comme la ligature coronarienne permanente) est souvent utilisé pour étudier la physiopathologie après une hypoperfusion cardiaque ou une lésion d’ischémie-reperfusion 3,4. Outre les lésions myocardiques aiguës, d’autres facteurs de risque tels que l’hypertension, le diabète, l’obésité et des antécédents familiaux de cardiomyopathie contribuent également au développement de l’insuffisance cardiaque. Une fois que les patients ont passé le stade A (à risque d’insuffisance cardiaque) et sont entrés dans le stade B (insuffisance précardiaque), une modification structurelle se produit1. Par exemple, les patients hypertendus passent d’abord par une hypertrophie adaptative du ventricule gauche, puis se développent progressivement en hypertrophie cardiaque inadaptée et transitent vers une insuffisance cardiaque par remodelage pathologique5.
En tant que stade terminal de diverses maladies cardiovasculaires, l’insuffisance cardiaque chronique a été étudiée pendant des décennies6. Plusieurs modèles murins ont été largement utilisés dans la recherche sur l’insuffisance cardiaque, y compris la perfusion de médicaments (angiotensine II), les troubles métaboliques (diabète ou régime riche en calories) et la constriction aortique7. Parmi ces modèles, la perfusion d’angiotensine II s’accompagne de divers effets secondaires pour les organes, tels que le rein7. L’induction de troubles métaboliques nécessite généralement une période de temps assez longue. La constriction aortique ascendante a été considérée comme ayant une pertinence limitée pour la maladie humaine7.
Le TAC est un modèle fiable qui augmente la postcharge et induit une hypertrophie cardiaque ainsi qu’une insuffisance cardiaque8. Le modèle TAC à poitrine ouverte a été décrit pour la première fois par Rockman et al. et a été utilisé dans de nombreux laboratoires à travers le monde9. Cependant, cette procédure TAC classique provoque un traumatisme assez important chez les souris et modifie leur comportement normal, ce qui peut prendre un long temps de récupération et perturber la poursuite du traitement10. D’autres procédures modifiées de TAC thoracique fermé ont réduit certaines étapes invasives, mais ont nécessité des compétences microchirurgicales ou une ventilation mécanique10,11.
Le présent protocole détaille une méthode étape par étape avec une approche mini-invasive de l’arc aortique à l’aide d’un rétracteur fabriqué par l’intermédiaire d’une incision médiane de 3 mm du bord supérieur du sternum. Ce modèle n’a pas besoin de compétences microchirurgicales, de ventilation mécanique ou de coupe à travers les côtes, offrant ainsi un moyen rapide, limité par les traumatismes chirurgicaux, simple et peu coûteux d’effectuer une chirurgie TAC.
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Protocol
Le protocole actuel est approuvé par le comité d’éthique de l’hôpital Tongji, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Chine. Cette procédure est effectuée sur des souris adultes mâles C57 / BL6 (>10 semaines). Tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés par autoclave avant l’opération.
1. Préparation de l’instrument chirurgical
- Préparez une seringue de 5 ml et pincez le bout de l’aiguille avec un porte-aiguille pour l’émousser.
- Préparez une aiguille de 27 G et émoussez-la avec un porte-aiguille. Couper la pointe de l’aiguille avec des ciseaux ophtalmiques est une autre façon d’émousser l’aiguille.
- Pliez la pointe de l’aiguille de 27 G à 90°.
REMARQUE: Cette aiguille sera utilisée comme entretoise pour se lier à l’aorte pour la constriction des vaisseaux. - Utiliser un fil de fer obtenu commercialement (qualité médicale, 0,5 mm de diamètre, voir le tableau des matériaux) et de la ficelle autour de l’aiguille (figure 1A). Former un petit piège ou une boucle à l’extrémité émoussée de l’aiguille (figure 1B).
REMARQUE: Cet instrument réutilisable agit comme un rétracteur spécial fabriqué par vous-même et permet de passer la suture de soie sous l’aorte dans les dernières étapes. - Autoclaver tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie (y compris l’écarteur spécial fabriqué ci-dessus) pour les stériliser.
2. Préparation des animaux
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de solution de pentobarbital sodique (50 mg/kg, voir le tableau des matières) en fonction du poids corporel. Injecter par voie sous-cutanée 100 μL de lidocaïne à 0,5% localement dans la zone chirurgicale.
- Confirmez que la souris est complètement anesthésiée en pinçant l’orteil de la souris avec le bout de la pince.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Enlevez les poils de la gorge et du haut de la poitrine avec une crème dépilatoire ou une tondeuse.
- Désinfectez la zone non poilue avec trois gommages alternés d’iode et d’éthanol à 70% en cercles concentriques se déplaçant vers l’extérieur.
- Placez la souris en décubitus dorsal sur un coussin chauffant recouvert d’un champ stérile avec sa tête pointant vers l’opérateur. Fixez les extrémités avec du ruban adhésif et les incisives avec une suture 4-0 (Figure 2A).
- Insérez une sonde rectale (voir le tableau des matériaux) pour surveiller la température corporelle pendant l’opération. Maintenir la température corporelle à 37 °C pendant toute l’opération.
- Mettez une paire de gants stériles.
REMARQUE: Une fois les gants stériles enfilés, ne touchez pas d’autres zones ou objets non stérilisés. - Percez un trou (1-1,5 cm de diamètre) dans un nouveau champ stérile jetable avec des ciseaux ophtalmiques stérilisés. Placez le champ stérile sur la souris et assurez-vous que le champ opératoire non poilu est visible à travers le trou.
REMARQUE: Cette étape permet à l’opérateur d’éviter de toucher d’autres zones non stérilisées, ce qui aide à maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie.
3. Constriction de l’aorte transversale
- Faire une incision cutanée verticale de 1,5 cm au niveau de l’encoche suprasternale (Figure 2B) avec la lame du scalpel. Élargissez l’incision cutanée jusqu’au niveau de l’angle sternal.
NOTE: L’encoche suprasternale est une encoche située sur le bord supérieur du manubrium sterni. C’est un symbole de surface qui peut être détecté lorsque les poils de souris sont enlevés (Figure 2B). L’angle sternal est l’articulation entre le manubrium sterni et les corps sterni. Lorsque le sternum est exposé, il se présente sous la forme d’une ligne blanche horizontale sur le sternum au même niveau que la costa secunda (Figure 2C). - Séparez soigneusement la peau et le fascia superficiel et exposez la trachée et le sternal proximal. Faites soigneusement une incision longitudinale médiane de 3 à 4 mm jusqu’au sternum, en partant du bord supérieur jusqu’à l’angle sternal (figure 2D).
NOTE: La coupe ne doit pas dépasser l’angle sternal, car il existe un risque de provoquer un pneumothorax aigu chez la souris. - Soulevez doucement le sternum avec une pince et le thymus et l’arcus aortae en dessous. Utilisez soigneusement des pinces droites et disséquez carrément le vaisseau cible et les tissus qui l’entourent.
- Tenez l’enrouleur précédemment fabriqué par vous-même (étape 1.4) qui contenait un piège métallique à l’extrémité de la main droite de l’utilisateur.
- Passez soigneusement le piège de l’écarteur autofabriqué sous l’aorte entre l’artère carotide commune gauche et l’origine de l’artère innominée droite (Figure 2E).
- Passez l’écarteur auto-fabriqué à la main gauche pour épargner la main droite pour d’autres instruments.
- Avec une pince microscopique dans la main droite, passez une suture de soie 7-0 à travers la boucle de la caisse claire à la fin et sortez l’écarteur. Cela permettra de quitter la suture de soie autour de l’artère pour une ligature ultérieure (Figure 2F).
REMARQUE: Soyez doux et ne faites pas trop glisser l’arc aortique de sa position initiale. - Placez une aiguille de 27 G parallèle à l’aorte et attachez la suture autour de l’aiguille et de l’aorte (Figure 2G,H).
REMARQUE: La procédure fictive devrait être la même, sauf qu’il n’y a pas de ligature de l’aorte. - Tenez l’aiguille de 27 G avec une pince ophtalmique et une autre pince tenant le nœud attaché à l’aiguille de 27 G et à l’aorte. Retirez rapidement mais doucement l’aiguille de 27 G de la ligature (Figure 2H).
REMARQUE: Le nœud ne doit pas être trop serré, sinon il ne sera pas facile de retirer l’aiguille. Soyez prudent lorsque vous retirez l’aiguille en cas de rupture de l’aorte. - Suturer la peau avec une suture monofilament synthétique 4-0 dans un motif de suture interrompu (Figure 2I).
4. Soins postopératoires
- Placez la souris sur un coussin chaud (voir Tableau des matériaux) et attendez qu’elle revive. Généralement, la souris revit en environ 60 minutes.
REMARQUE : L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment conscience de la position couchée sternelle principale. - Injecter par voie sous-cutanée 0,5 mL de solution saline chaude et surveiller l’homéostasie liquidienne des animaux.
NOTE: Cette étape empêche les animaux de se déshydrater et de pratiquer une circulation hypovolémique. - Appliquez une pommade à l’érythromycine sur la surface de la plaie tous les jours pendant 3 jours.
- Pour le traitement de la douleur postopératoire, administrer 1 mg/L d’anesthésique local buprénorphine par voie parentérale au site d’incision (voir le tableau des matériaux).
- Après l’opération, surveillez la souris pour détecter tout signe d’infection et d’affaiblissement (malnutrition, posture voûtée et fourrure ébouriffée).
REMARQUE : Les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale ne sont pas retournés en compagnie d’autres animaux tant qu’ils ne sont pas complètement rétablis.
5. Imagerie échographique
- Confirmer la réussite de la ligature de l’aorte transversale en calculant la vitesse du flux sanguin à l’aide d’un système d’imagerie par ultrasons12,13 (24 MHz, voir le tableau des matériaux) 28 jours après la chirurgie.
- Anesthésier l’animal avec 4,5 % d’isoflurane dans de l’air enrichi en oxygène à 20 % et maintenir avec 0,5 % d’isoflurane dans de l’air enrichi en oxygène à 20 %.
- Placez la souris en décubitus dorsal et fixez ses extrémités à l’électrode avec du ruban adhésif.
- À l’aide d’une crème dépilatoire, retirez les poils de la poitrine et appliquez un agent de couplage à ultrasons sur la poitrine.
- Inclinez la plate-forme vers la gauche aussi loin que possible. Tout en gardant la sonde en position verticale, abaissez-la progressivement le long de la ligne parasternale droite sur la poitrine avec l’encoche pointant vers le menton de l’animal.
- Sous le mode B de l’instrument, ajustez les axes X et Y jusqu’à ce que l’arc aortique et le site de constriction soient clairement visibles.
- Cliquez sur le bouton Doppler à ondes de pouls pour passer en mode onde de pouls.
- Ajustez la boîte de volume de l’échantillon du curseur en pointillés distal au site resserré et trouvez le jet sténose avec la vitesse la plus élevée.
- Cliquez à nouveau sur le bouton Doppler à ondes de pouls pour obtenir la forme d’onde du flux aortique et mesurer la vitesse maximale. Calculer la vitesse du flux sanguin en fonction du pic des modèles d’ondes (Figure 3A, B).
- Réglez l’imageur sur le mode B. Placez la plate-forme en position horizontale. Faites pivoter la sonde de 30° vers la ligne parasternale gauche.
- Ajustez les axes X et Y pour obtenir une vue d’axe courte. Appuyez sur le mode M pour afficher la ligne de l’indicateur et cliquez sur Cine Store pour enregistrer l’image pour une mesure ultérieure de l’épaisseur de la paroi cardiaque, de la dimension de la chambre et de la fraction d’éjection.
NOTE: La formule de calcul de la fraction d’éjection: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). La formule de calcul du débit cardiaque: Volume de l’AVC * Fréquence cardiaque (à la première image dessinée) / 1000. La plupart des indices tels que la fraction d’éjection et le débit cardiaque peuvent être mesurés automatiquement via le logiciel du système d’imagerie par ultrasons. LV Vol;d: volume diastolique du ventricule gauche. Vol;s BT : volume systolique du ventricule gauche.
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Representative Results
Après une chirurgie TAC réussie, une surcharge de pression a été détectée à l’aide d’un système d’imagerie par ultrasons. Quatre semaines après la chirurgie, les souris développent une diminution de la fonction cardiaque. Dans la présente étude, l’efficacité de la chirurgie TAC a été validée par fraction d’éjection (FE), raccourcissement fractionné (FS), masse ventriculaire gauche (masse VG) et diamètre interne ventriculaire gauche (LVID) de souris ayant subi une chirurgie TAC après 4 semaines. La FE a été significativement réduite chez les souris TAC après 4 semaines par rapport aux souris simulées (47 % ± 10 % contre 78 % ± 4 %, p < 0,0001) (Figure 4A). La masse du VG était significativement élevée chez les souris TAC (158,1 ± 50,5 vs 91,8 ± 21,7 mg, p = 0,0226) (figure 4B). La FS a été significativement réduite chez les souris TAC (23 ± 5 vs 46 % ± 3 %, p < 0,0001) (figure 4C). La LVID était significativement élevée chez les souris TAC (2,88 ± 0,39 vs 1,81 ± 0,52 mm, p = 0,0044) (Figure 4D). Les données représentent six souris chacune pour les groupes TAC et Sham. En raison des petites procédures invasives, le taux de survie est plutôt élevé et dépend principalement des saignements, qui peuvent être réduits à moins de 5% pour un artiste qualifié. Lorsqu’il est complètement maîtrisé, le taux de survie général présenté chez les souris C57BL / 6J après 4 semaines est supérieur à 95%. Un test t non apparié a été effectué pour comparer les groupes simulé et TAC. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB (barres d’erreur).
Figure 1 : Colet autofabriqué contenant un rétracteur pour faire passer la suture de soie autour de l’arc aortique. (A) Vue d’ensemble de l’enrouleur. (B) Détail du rétracteur. La flèche indique le piège à travers lequel la soie doit passer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de la chirurgie TAC. (A) Souris en position couchée sur le dos fixée avec du ruban adhésif et une suture. (B) Champ stérile ne montrant que la zone chirurgicale. (C) Incision cutanée verticale de 1,5 cm. La flèche rouge indique un ange sternal. (D) Incision longitudinale médiane pratiquée sur le sternum. (E) Image montrant le piège de l’écarteur autofabriqué passant sous l’aorte. (F) Image montrant la suture de soie 7-0 passant à travers la boucle de caisse claire. (G) Une aiguille de 27 G qui a été placée parallèlement à l’aorte. (H) Ligature de l’aorte avec l’aiguille de 27 G. La flèche blanche indique un nœud de ligature. (I) Peau suturée avec suture de soie 4-0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Image représentative du système d’imagerie par ultrasons de souris fictives et TAC après 4 semaines. (A) Imagerie Doppler à ondes pulsées de l’arc aortique simulé. (B) Imagerie Doppler à ondes pulsées de l’arc aortique après TAC. (C) Image en mode M de la souris simulée calculant EF, masse BT, épaisseur de paroi et LVID. (D) Image en mode M de souris TAC calculant EF, masse BT, épaisseur de paroi et LVID. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Fonction cardiaque mesurée par système d’imagerie par ultrasons. (A) Fraction d’éjection (FE) des souris en deux groupes. (B) La masse ventriculaire gauche (masse VG) des souris était en deux groupes. (C) Raccourcissement fractionné (FS) des souris en deux groupes. (D) Le diamètre interne du ventriculaire gauche (LVID) des souris en deux groupes. *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Les données représentent six souris par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’induction d’une surcharge de pression soutenue peut progressivement provoquer une hypertrophie cardiaque et une insuffisance cardiaque. Ce modèle a été utilisé dans de nombreux laboratoires à travers le monde14,15,16. Le protocole a fourni une méthode TAC améliorée qui ne nécessite pas de compétences microchirurgicales ou de ventilation mécanique.
L’étape la plus importante de ce protocole est de passer la suture de soie sous l’arc aortique. Lorsque le collet a accroché l’arc aortique, tous les mouvements doivent être doux pour réduire la traction inutile à l’artère. Aussi, la suture autour de l’aorte ne doit pas être trop serrée en cas de difficulté lors du retrait de l’entretoise. Après l’opération, une nourriture et de l’eau abondantes sont également importantes pour que la souris se rétablisse rapidement.
Les manuscrits précédents ont fourni d’autres méthodes pour l’ATC. Eichhorn et al. ont publié une méthode de poitrine fermée qui ligature l’aorte transversale10. L’ensemble de la procédure permet aux côtes de rester intactes, causant ainsi un très petit traumatisme. Zaw et coll. ont fourni une méthode TAC sans pénétrer dans la cavité pleurale17. Tavakoli et coll. ont présenté une constriction aortique transversale mini-invasive qui n’a pas besoin d’intubation etde ventilation 11. Toutes les techniques ci-dessus nécessitent des compétences microchirurgicales. En outre, Lao et al. ont fourni une méthode pour produire des modèles TAC avec des sutures résorbables18. Le protocole de cette étude offre un moyen alternatif d’effectuer rapidement (dans les 10 minutes) une chirurgie TAC qui n’a pas besoin d’opérer au microscope. La minimisation des traumatismes chirurgicaux profite aux souris et réduit les facteurs de confusion pendant l’expérience. Contrairement au modèle à poitrine ouverte, ce modèle est peu invasif et n’affecte pas la dynamique respiratoire normale de la souris. Lorsqu’elle est entièrement maîtrisée, le taux de survie de cette technique est supérieur à 95%. En outre, il n’a pas besoin de ventilation mécanique et de compétences en chirurgie microscopique; Un rétracteur réutilisable fabriqué par ses soins fera toute l’affaire, en évitant les effets inflammatoires systémiques induits par la ventilation19. Tous ces éléments simplifient considérablement la procédure d’exploitation.
Il y a quelques limites à cette technique. L’augmentation aiguë de la postcharge ne reflète pas entièrement la progression progressive de l’hypertension artérielle. Les écarts de physiopathologie entre les modèles murins multifactoriels d’insuffisance cardiaque et les patients atteints d’insuffisance cardiaque clinique ont suscité des inquiétudes chez les chercheurs20. La physiopathologie présentée chez la souris ne peut pas être complètement appliquée aux humains.
En conclusion, ce protocole fournit une procédure alternative pour effectuer le TAC, ce qui peut faciliter les investigateurs lors de l’induction d’une insuffisance cardiaque ou d’une hypertrophie cardiaque chez la souris.
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Disclosures
Les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail est financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC 81822002). Nous remercions tous les membres qui ont pris part à ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 nonabsorbable suture | Jinhuan | HM403 | Used for suturing the skin |
| 5 mL syringe | Haifuda Technology Co., Ltd. | BD-309628 | Used for making snare containing retractor |
| 7-0 nonabsorbable suture | Jinhuan | HM701 | Used for aorta ligation |
| Animal temperature monitor | Kaerwen | FT3400 | Used for monitoring body temperature |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | Used for post-surgical pain treatment |
| Depilatory cream | Veet | N/A | Used for remove body hair from the surgical area |
| Heating Pad | Xiaochuangxin | N/A | Used for maintaining body temperature |
| Ibuprofen | MCE | HY-78131 | Used for post-surgical pain treatment |
| Iron wire (0.5 mm) | Qing Yuan | Iron wire #26 | Used for making snare containing retractor |
| Microscopic tweezers | RWD | F12006-10 | Used for penetrating and separating the tissue to open operation space |
| Needle holder | RWD | F12005-10 | Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it |
| Ophthalmic forceps | RWD | F14012-10 | Used for holding skin and other tissues |
| Ophthalmic scissors | RWD | S11001-08 | Used for making sking incision of mouse |
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | Used for mouse anesthesia |
| Sterile operating mat | Hale & hearty | 211002 | Used for placing animal during surgery |
| Ultra-sound imaging system | Fujifilm visualsonics | vevo1100 | Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100 |
References
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