Summary
本プロトコルは、自作リトラクターを用いた低侵襲横断大動脈狭窄(TAC)手順を伴う修正され単純化された技術を記述する。この手順は人工呼吸器や顕微鏡なしで行うことができ、圧力過負荷を引き起こし、最終的には心肥大または心不全につながります。
Abstract
横行大動脈狭窄(TAC)は、マウスモデルにおける圧力過負荷の形成に基づく心不全および心肥大に関する研究で頻繁に使用される手術です。この手順の主な課題は、横方向の大動脈弓を明確に視覚化し、標的血管を正確にバンド化することです。古典的なアプローチは、横方向大動脈弓を露出させるために部分開胸術を行います。しかし、それはかなり大きな外科的外傷を引き起こし、手術中に人工呼吸器を必要とするオープンチェストモデルです。不必要な外傷を防ぎ、手術手順を簡素化するために、大動脈弓は胸骨の近位比率 を介して 接近し、スネアを含む小さな自作リトラクターを使用して標的血管に到達して結合します。この手順は、胸膜腔に入ることなく実施することができ、人工呼吸器または顕微手術を必要とせず、マウスに生理学的呼吸パターンを残し、手順を簡素化し、手術時間を大幅に短縮する。侵襲性の低いアプローチと操作時間の短縮により、マウスはストレス反応が少なく、急速に回復することができます。
Introduction
心不全は、心室充填または排出血液の構造および機能の障害に起因する複雑な臨床症状です1。病期は、主に症状の重症度と身体活動に基づくニューヨーク心臓協会の機能分類によって定義されます2。駆出率が50%を超える患者では、構造的および/または機能的異常がナトリウム利尿ペプチドを上昇させ、駆出率(HFpEF)2を維持した心不全の診断を支持しました。虚血性心疾患は、心不全の複数の病因の中で主要な原因です。したがって、心筋梗塞モデル(永久冠動脈結紮など)は、心臓低灌流または虚血再灌流損傷後の病態生理学を研究するためにしばしば使用されます3,4。急性心筋損傷に加えて、高血圧、糖尿病、肥満、心筋症の家族歴などの他の危険因子も心不全の発症に寄与します。患者がステージA(心不全のリスクがある)を通過し、ステージB(心不全前)に入ると、構造変化が起こります1。たとえば、高血圧患者は最初に適応性左心室肥大を経験し、その後徐々に不適応心肥大に発展し、病理学的リモデリングによって心不全に移行します5。
さまざまな心血管疾患の末期段階として、慢性心不全は何十年にもわたって研究されてきました6。薬物注入(アンジオテンシンII)、代謝障害(糖尿病または高カロリー食)、大動脈狭窄など、複数のマウスモデルが心不全の研究に広く使用されています7。これらのモデルの中で、アンジオテンシンII灌流は腎臓7などの様々な臓器副作用を伴う。代謝障害の誘発は通常、かなり長い期間を必要とします。上行大動脈狭窄は、ヒト疾患との関連性が限定的であると考えられてきた7。
TACは、後負荷を増加させ、心肥大と心不全を誘発する信頼性の高いモデルです8。オープンチェストTACモデルは、Rockmanらによって最初に記述され、世界中の多数の研究所で使用されました9。しかしながら、この古典的なTAC手順は、マウスにかなり大きな外傷を引き起こし、それらの正常な行動を変化させ、それは長い回復時間を要し、さらなる治療を妨害する可能性がある10。他の修正された閉鎖胸部TAC手順は、いくつかの侵襲的ステップを減らしましたが、顕微手術のスキルまたは機械的換気を必要としました10,11。
本プロトコルは、胸骨の上端の3mmの正中線切開 を介して 自作の開創器を使用して大動脈弓への低侵襲アプローチを伴う段階的な方法を詳述している。このモデルは、顕微手術のスキル、機械的換気、または肋骨の切断を必要としないため、TAC手術を行うための迅速で外科的外傷が制限され、複雑で安価な方法を提供します。
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Protocol
現在のプロトコルは、中国武漢の華中科技大学同済医科大学同済病院の倫理委員会によって承認されています。この手順は、雄の成人C57 / BL6マウス(>10週齢)で行われます。すべての手術器具は、手術前にオートクレーブ滅菌によって滅菌されました。
1.手術器具の準備
- 5 mLシリンジを用意し、針ホルダーで針の先端をつまんで鈍らせます。
- 27 Gの針を用意し、針ホルダーで鈍らせます。眼科用ハサミで針の先端を切ることは、針を鈍らせる別の方法です。
- 27G針の先端を90°曲げます。
注:この針は、血管狭窄のために大動脈と結びつけるためのスペーサーとして使用されます。 - 市販の鉄線(医療グレード、直径0.5 mm、 材料表を参照)を使用し、針の周りにひもを付けます(図1A)。針の鈍い先端に小さなスネアまたはループを形成します(図1B)。
注:この再利用可能な器具は、特別な自作のリトラクターとして機能し、後のステップで大動脈の下に絹縫合糸を通過させることができます。 - 手術前にすべての手術器具(上記で作成した特別な開創器を含む)をオートクレーブして滅菌します。
2.動物の準備
- 体重に応じて、ペントバルビタールナトリウム溶液(50 mg / kg、材料表を参照)の腹腔内注射を介してマウスを麻酔します。.100μLの0.5%リドカインを手術領域に局所的に皮下注射する。
- 鉗子の先端でマウスのつま先をつまんで、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。
- 麻酔下での乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を両眼に塗布します。
- 脱毛クリームまたはバリカンで喉と胸の上部から髪を取り除きます。
- 外側に移動する同心円状のヨウ素と70%エタノールの3つの交互のスクラブで、髪のない領域を消毒します。
- マウスを滅菌ドレープで覆われた加熱パッドの上に仰臥位で置き、頭をオペレーターに向けます。四肢を粘着テープで固定し、4-0縫合糸で切歯を固定します(図2A)。
- 直腸プローブを挿入します( 材料の表を参照)手術中の体温を監視します。手術中は体温を37°Cに維持してください。
- 滅菌手袋を着用してください。
注意: 滅菌手袋を着用したら、他の滅菌されていない領域や物体に触れないでください。 - 滅菌した眼科用ハサミで新しい使い捨て滅菌ドレープに穴(直径1〜1.5 cm)を切ります。滅菌ドレープをマウスの上に置き、穴から髪の毛のない操作フィールドが見えることを確認します。
注:このステップにより、オペレーターは他の滅菌されていない領域に触れることを回避できるため、手術中に無菌状態を維持するのに役立ちます。
3.横行大動脈の狭窄
- メスの刃で胸骨上ノッチ(図2B)のレベルで1.5cmの垂直皮膚切開を行います。皮膚切開部を胸骨角のレベルまで拡大します。
注:胸骨上ノッチは、マヌブリウムスターニの上端にあるノッチです。これは、マウスの毛が除去されたときに検出できる表面記号です(図2B)。胸骨角は、マヌブリウムスターニとコーパススターニの間の関節です。胸骨が露出すると、肋骨と同じレベルの胸骨に水平の白い線として表示されます(図2C)。 - 皮膚と表在性筋膜を慎重に分離し、気管と近位胸骨を露出させます。上端から胸骨角まで、胸骨に3〜4 mmの縦正中線切開を慎重に行います(図2D)。
注:マウスに急性気胸を引き起こす危険性があるため、切り傷は胸骨角を超えてはなりません。 - 鉗子とその下の胸腺と弧大動脈で胸骨をそっと持ち上げます。まっすぐな鉗子を慎重に使用し、標的血管とその周囲の組織を鈍く解剖します。
- ユーザーの右手の端にワイヤースネアが含まれていた以前に自作のリトラクター(ステップ1.4)を持ちます。
- 自作開創器のスネアを大動脈の下に、左総頸動脈と右頚動脈の起点の間に慎重に通します(図2E)。
- 自作のリトラクターを左手に渡して、右手を他の楽器用に予備にします。
- 右手に顕微鏡ピンセットを持って、7-0シルク縫合糸を最後にスネアのループに通し、リトラクターを引き出します。これにより、さらなる結紮のために動脈の周りに絹縫合糸を残すことができます(図2F)。
注意: 穏やかに、大動脈弓を元の位置から引きずりすぎないでください。 - 27 Gの針を大動脈と平行に置き、縫合糸を針と大動脈の周りに結びます(図2G、H)。
注:大動脈結紮がないことを除いて、偽の手順は同じである必要があります。 - 眼科用鉗子と、27Gの針と大動脈に結び付けられた結び目を保持する別の鉗子で27Gの針をつかみます。結紮から27Gの針をすばやく、しかし穏やかに引き抜きます(図2H)。
注意: 結び目はきつすぎてはいけません、さもなければ針を引き出すのは簡単ではありません。大動脈が破裂した場合に針を抜くときは注意してください。 - 中断された縫合パターンで4−0合成モノフィラメント縫合糸で皮膚を縫合する(図2I)。
4.術後ケア
- マウスを暖かいパッド( 材料の表を参照)に置き、マウスが復活するのを待ちます。通常、マウスは約60分で復活します。
注:動物は、主胸骨横臥に十分な意識を取り戻すまで放置してはなりません。 - 0.5 mLの温かい生理食塩水を皮下注射し、動物の体液恒常性を監視します。
注:このステップは、動物が脱水症や血液量減少性循環状態になるのを防ぎます。 - エリスロマイシン軟膏を毎日3日間創傷表面に塗布する。
- 術後の痛みの治療のために、1 mg / Lのブプレノルフィン局所麻酔薬を切開部位に非経口的に投与します( 材料の表を参照)。.
- 術後、感染と障害の兆候(栄養失調、猫背の姿勢、波立たせられた毛皮)がないかマウスを監視します。
注:手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻されません。
5.超音波イメージング
- 手術後28日目に超音波画像システム12,13(24MHz、材料表を参照)を介して血流速度を計算して、横行大動脈の結紮が成功したことを確認します。
- 動物を20%酸素富化空気中の4.5%イソフルランで麻酔し、20%酸素富化空気中の0.5%イソフルランで維持する。
- マウスを仰臥位に置き、その四肢を粘着テープで電極に固定します。
- 脱毛クリームを使用して、胸毛を取り除き、胸部に超音波カップリング剤を塗布します。
- プラットフォームをできるだけ左に傾けます。プローブを垂直位置に保ちながら、ノッチが動物のあごを指すように、胸部の右傍胸骨線に沿ってプローブを徐々に下げます。
- 機器のBモードで、大動脈弓と狭窄部位がはっきりと見えるまでX軸とY軸を調整します。
- パルス波 ドップラーボタンをクリックして、パルス波 モードに切り替えます。
- 破線のカーソルサンプルボリュームボックスを狭窄部位の遠位に調整し、最高速度の狭窄ジェットを見つけます。
- パルス波ドップラーボタンをもう一度クリックして、大動脈流の波形を取得し、ピーク速度を測定します。波のパターンのピークに応じて血流速度を計算します(図3A、B)。
- イメージャーをBモードに設定します。プラットフォームを水平位置に置きます。プローブを左傍胸骨線に30°回転させます。
- X 軸と Y 軸を調整して、短軸ビューを取得します。Mモードを押してインジケーターラインを表示し、Cine Storeをクリックして、心臓壁の厚さ、チャンバーの寸法、および駆出率を後で測定するために画像を保存します。
注意: 駆出率の計算式:100%*((LVボリューム;d - LVボリューム)/ LVボリューム;d)。心拍出量を計算するための式:ストローク量*心拍数(最初に描かれたフレームで)/ 1000。駆出率や心拍出量などのほとんどの指標は、超音波イメージングシステムのソフトウェア を介して 自動的に測定できます。LV Vol;d:左心室の拡張期容積。LV巻:左心室の収縮期容積。
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Representative Results
TAC手術が成功した後、超音波画像システムを使用して圧力過負荷が検出されました。手術の4週間後、マウスは心機能の低下を発症します。本研究では、TAC手術の有効性を、4週間後にTAC手術を受けたマウスの駆出率(EF)、分数短縮(FS)、左心室腫瘤(LV量)、左心室内径(LVID) を介して 検証しました。EFは、偽マウスと比較して4週間後のTACマウスにおいて有意に減少した(47%±10%対78%±4%、 p <0.0001)(図4A)。LV質量はTACマウスにおいて有意に上昇した(158.1 ± 50.5 vs 91.8 ± 21.7 mg、 p = 0.0226)(図4B)。FSはTACマウスにおいて有意に減少した(23±5対46%±3%、 p <0.0001)(図4C)。LVIDはTACマウスにおいて有意に上昇した(2.88 ± 0.39 vs 1.81 ± 0.52 mm、 p = 0.0044)(図4D)。データは、TAC群およびSham群についてそれぞれ6匹のマウスを表す。侵襲的処置が小さいため、生存率はかなり高く、主に出血に依存しており、熟練したパフォーマーにとっては5%未満に減らすことができます。完全に習得した場合、4週間後のC57BL / 6Jマウスで提示される一般的な生存率は95%を超えています。偽グループとTACグループを比較するために、対応のない t検定を実行しました。すべてのデータは、SEM(エラーバー)±平均値として表示されます。
図1:大動脈弓の周りに絹縫合糸を通過させるための自作のスネアを含む リトラクター。 (A)リトラクターの全体図。(B)リトラクターの詳細。矢印は、シルクが通過するためのスネアを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TAC手術の画像 。 (A)仰臥位マウスをテープと縫合糸で固定する。(B)手術部位のみを示す滅菌ドレープ。(C)1.5cmの垂直皮膚切開。赤い矢印は胸骨の天使を示しています。(D)胸骨に行われた縦正中切開。(E)大動脈の下を通過する自作開創器のスネアを示す画像。(f)スネアループを通過する7-0シルク縫合糸を示す画像。(g)大動脈と平行に配置された27G針。(H)27G針による大動脈の結紮。白い矢印は結紮結び目を示す。(i)4-0絹縫合糸で皮膚を縫合する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:4週間後の偽マウス及びTACマウスの超音波画像化システムからの代表像 。 (A)偽大動脈弓のパルス波ドップラーイメージング。 (B)TAC後の大動脈弓のパルス波ドップラーイメージング。(C)EF、LV質量、肉厚、およびLVIDを計算する偽マウスのMモード画像。(D) EF、LV質量、肉厚、LVIDを計算するTACマウスのMモード画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:超音波画像システムを介して測定された心機能。 (a)2群のマウスの駆出率(EF)。(B)マウスの左心室質量(LV質量)は2群とした。(C)2群のマウスの分別短縮(FS)。(D)2群のマウスの左心室内径(LVID)。*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005.データは、1群あたり6匹のマウスを表す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
持続的な圧力過負荷の誘発は、徐々に心肥大と心不全を引き起こす可能性があります。このモデルは、世界中の多くの研究所で使用されています14,15,16。このプロトコルは、顕微手術のスキルや機械的換気を必要としない改良されたTAC法を提供しました。
このプロトコルの最も重要なステップは、大動脈弓の下に絹縫合糸を通すことです。スネアが大動脈弓に引っ掛かったとき、動脈への不必要な牽引を減らすために、すべての動きは穏やかでなければなりません。また、大動脈の周りの縫合糸は、スペーサーを引き出すのが難しい場合に備えてきつすぎてはいけません。手術後、マウスが急速に回復するためには、豊富な食物と水も重要です。
以前の原稿は、TACに他の方法を提供してきました。Eichhornらは、横大動脈10を結紮する閉鎖胸部法を発表した。手順全体により、肋骨は無傷のままであるため、非常に小さな外傷を引き起こします。Zawらは、胸膜腔17に入ることなくTAC法を提供した。Tavakoliらは、挿管と換気を必要としない低侵襲の横行大動脈狭窄を示しました11。上記の技術はすべて顕微手術のスキルを必要とします。さらに、Laoらは、吸収性縫合糸18を有するTACモデルを作製する方法を提供した。この研究のプロトコルは、顕微鏡下で操作する必要のないTAC手術を迅速に(10分以内に)実施するための代替方法を提供します。外科的外傷を最小限に抑えることは、マウスに利益をもたらし、実験中の交絡因子を減らす。オープンチェストモデルとは異なり、このモデルは低侵襲であり、マウスの通常の呼吸動態に影響を与えません。完全に習得すると、このテクニックの生存率は95%を超えます。また、機械的換気や顕微鏡手術のスキルは必要ありません。自作の再利用可能なリトラクターがすべてのトリックを行い、換気によって引き起こされる全身性の炎症効果を回避します19。これらすべてを組み合わせることで、操作手順が大幅に簡素化されます。
この手法にはいくつかの制限があります。後負荷の急激な増加は、動脈性高血圧の漸進的な進行を完全には反映していない。多因子心不全マウスモデルと臨床的心不全患者との間の病態生理学の不一致は、研究者の間で懸念を引き起こしています20。マウスで提示された病態生理学は、人間に完全に適用することはできません。
結論として、このプロトコルはTACを実施するための代替手順を提供し、マウスに心不全または心肥大を誘発する際に研究者を容易にすることができる。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言した。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC 81822002)によって資金提供されています。この作業に参加したすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 nonabsorbable suture | Jinhuan | HM403 | Used for suturing the skin |
| 5 mL syringe | Haifuda Technology Co., Ltd. | BD-309628 | Used for making snare containing retractor |
| 7-0 nonabsorbable suture | Jinhuan | HM701 | Used for aorta ligation |
| Animal temperature monitor | Kaerwen | FT3400 | Used for monitoring body temperature |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | Used for post-surgical pain treatment |
| Depilatory cream | Veet | N/A | Used for remove body hair from the surgical area |
| Heating Pad | Xiaochuangxin | N/A | Used for maintaining body temperature |
| Ibuprofen | MCE | HY-78131 | Used for post-surgical pain treatment |
| Iron wire (0.5 mm) | Qing Yuan | Iron wire #26 | Used for making snare containing retractor |
| Microscopic tweezers | RWD | F12006-10 | Used for penetrating and separating the tissue to open operation space |
| Needle holder | RWD | F12005-10 | Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it |
| Ophthalmic forceps | RWD | F14012-10 | Used for holding skin and other tissues |
| Ophthalmic scissors | RWD | S11001-08 | Used for making sking incision of mouse |
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | Used for mouse anesthesia |
| Sterile operating mat | Hale & hearty | 211002 | Used for placing animal during surgery |
| Ultra-sound imaging system | Fujifilm visualsonics | vevo1100 | Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100 |
References
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