Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

اختبار الأدوية قبل السريرية في أنسجة العضلات المهندسة 3D القابلة للتطوير

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64399
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Curi Bio Inc.
* These authors contributed equally

Summary

يوفر هذا البروتوكول طرقا لتوليد أنسجة العضلات القلبية والهيكلية المهندسة 3D ويصف استخدامها في طرق فحص الأدوية قبل السريرية. تستخدم الطرق الموصوفة نظام استشعار مغناطيسي لتسهيل التقييم المتزامن ل 24 نسيجا بالتوازي.

Abstract

يعد النمذجة الدقيقة للظروف الصحية والمرضية في المختبر أمرا حيويا لتطوير استراتيجيات علاجية وعلاجات جديدة. بالنسبة لأمراض القلب والعضلات والهيكل العظمي ، تشكل قوة الانقباض والحركية مقاييس رئيسية لتقييم وظيفة العضلات. جعلت الطرق الجديدة والمحسنة لتوليد أنسجة العضلات المهندسة (EMTs) من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات نمذجة الأمراض في المختبر أكثر موثوقية للأنسجة المقلصة ؛ ومع ذلك ، فإن تصنيع الأنسجة بشكل متكرر من مزارع الخلايا المعلقة وقياس انقباضها يمثل تحديا. غالبا ما تعاني هذه التقنيات من معدلات فشل عالية وتتطلب أجهزة معقدة وإجراءات تحليل بيانات مخصصة. منصة جديدة وجهاز يستخدم 3D EMTs جنبا إلى جنب مع مقايسة انقباض خالية من الملصقات ، متوازية للغاية ، وصديقة للأتمتة تتحايل على العديد من هذه العقبات. تتيح المنصة التصنيع السهل والقابل للتكرار ل 3D EMTs باستخدام أي مصدر خلوي تقريبا. ثم يتم قياس انقباض الأنسجة عبر أداة تقيس في وقت واحد 24 نسيجا دون الحاجة إلى إجراءات تحليل البرامج المعقدة. يمكن للأداة قياس التغيرات الميكرونيوتنية في القوة بشكل موثوق ، مما يسمح بفحص مركب يعتمد على الجرعة لقياس تأثير الدواء أو العلاج على الناتج المقلص. الأنسجة المهندسة المصنوعة من هذا الجهاز تعمل بكامل طاقتها ، وتولد ارتعاش وانقباضات كزازية عند التحفيز الكهربائي ، ويمكن تحليلها طوليا في الثقافة على مدى أسابيع أو أشهر. هنا ، نعرض بيانات من EMTs عضلة القلب تحت الجرعات الحادة والمزمنة مع المواد السامة المعروفة ، بما في ذلك دواء (BMS-986094) الذي تم سحبه من التجارب السريرية بعد وفيات المرضى بسبب سمية القلب غير المتوقعة. كما يتم تقديم وظيفة العضلات الهيكلية المتغيرة في الأنسجة المهندسة استجابة للعلاج بمثبط الميوسين. تمكن هذه المنصة الباحث من دمج أنظمة النماذج المعقدة والغنية بالمعلومات في سير عمل اكتشاف الأدوية مع الحد الأدنى من التدريب الإضافي أو المهارات المطلوبة.

Introduction

أصبحت نماذج الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) بشكل متزايد لاعبين رئيسيين في خط الأنابيب قبل السريري للاكتشاف والتطوير العلاجي ، بالإضافة إلى الأبحاث البيولوجية الأساسية ونمذجة الأمراض1،2،3،4،5. الأنسجة المقلصة ، مثل عضلة القلب والهيكل العظمي المشتقة من iPSCs تحمل إمكانات كبيرة لتحسين القوة التنبؤية للإنسان في الدراسات المختبرية كتقييم مباشر لقوة انقباض العضلات والحركية هي مقاييس كمية لدراسة وظيفة الأنسجة الكلية4،6،7،8. عادة ، تم الحصول على قياسات قوة الانقباض إما بشكل غير مباشر عن طريق التتبع البصري لانحراف الركيزة 9,10 أو مباشرة عن طريق ربط الخلايا / الأنسجة بمحول قوة4,11,12. هذه الطرق ، على الرغم من دقتها ، هي بطبيعتها منخفضة الإنتاجية وعادة ما تتطلب مشغلين ذوي مهارات عالية لجمع البيانات وتحليلها.

أظهرت الأعمال السابقة أن استشعار المجال المغناطيسي يتحايل على هذه العقبات ويوفر طريقة بديلة لتقييم وظيفة العضلات المهندسة في وقت واحد عبر تركيبات الأنسجةالمتعددة 13. تعتمد منصة Mantarray (محلل المغناطيسية لمصفوفة الأنسجة eNgineered) ثلاثية الأبعاد على هذه التقنية باستخدام جهاز قادر على قياس انقباض أنسجة العضلات المهندسة بطريقة متوازية للغاية تستفيد من تعقيد النماذج الخلوية ثلاثية الأبعاد مع فحص عالي الإنتاجية14. تتيح المنصة مراقبة كمية في الوقت الفعلي خالية من الملصقات لوظيفة الانقباض في أنسجة عضلة القلب والهيكل العظمي داخل أو خارج حاضنة زراعة الخلايا القياسية ، مما يلغي الحاجة إلى التصوير والتحليل المقلص القائم على البصريات. تسهل هذه التقنية المقارنة المباشرة لخطوط الخلايا السليمة والمريضة وتمكن من قياس تأثير الدواء على الأنسجة المقلصة ، وإنشاء بيانات قابلة للقياس الكمي ، في المختبر ، والسلامة ، والفعالية للمركبات العلاجية الجديدة والحالية.

يمكن تصنيع أنسجة العضلات ثلاثية الأبعاد المهندسة بين عمودين بطريقة قابلة للتكرار بدرجة عالية باستخدام لوحة Mantarray الاستهلاكية القابلة للاستهلاك و 24 بئرا (الشكل 1). وظيفة واحدة صلبة ، في حين أن العمود الآخر مرن ويحتوي على مغناطيس صغير. عندما ينقبض بناء الأنسجة ، فإنه يحل محل العمود المرن والمغناطيس المضمن. يتم وضع لوحة EMT داخل الجهاز ، ويتم قياس ما بعد الإزاحة عبر مجموعة من أجهزة الاستشعار المغناطيسية على لوحة دائرة أسفل حامل اللوحة. يتم تحويل التغييرات المقاسة في المجال المغناطيسي إلى قوة انقباض مطلقة باستخدام خوارزمية رياضية. تستخدم الأداة معدلات أخذ عينات سريعة من البيانات لتمكين جمع معلومات مفصلة حول القدرة الوظيفية ونضج نوع (أنواع) الخلية التي يتم فحصها ، بما في ذلك تردد الانكماش والسرعة ووقت الاضمحلال. يمكن الحصول على هذه القياسات الوظيفية عبر جميع الآبار ال 24 في وقت واحد مع منصة الاستشعار المغناطيسي أو بشكل فردي ومتسلسل باستخدام الطرق البصرية التقليدية.

تصف هذه الدراسة طريقة قابلة للتكرار بدرجة عالية لهندسة العضلات الهيكلية 3D والأنسجة الدقيقة القلبية في هيدروجيل قائم على الفيبرين. خلال تفاعل قصير مدته 80 دقيقة ، يحفز الثرومبين تحويل الفيبرينوجين إلى الفيبرين ، مما يوفر سقالة لخلايا العضلات لتتطور في الثقافة المعلقة15. تساعد الخلايا اللحمية في إعادة تشكيل المصفوفة وتصبح الأنسجة قابلة للانقباض حيث تشكل الخلايا العضلية خلية مخلوية داخل الهيدروجيل. تم تحليل انقباض هذه الأنسجة باستخدام نهج الاستشعار المغناطيسي ، قبل وبعد التعرض للمركب ، للتحقق من صحة هذه الطريقة لاستخدامها في دراسات الأدوية استجابة الجرعة. تم الحصول على الخلايا العضلية البشرية الأولية من خزعة من متبرع سليم تجاريا واستزراعها في 2D وفقا لبروتوكولات البائع. تم توسيع الخلايا باستخدام وسط نمو العضلات الهيكلية من خلال ثلاثة ممرات لتوليد أعداد كافية من الخلايا لتصنيع أنسجة 3D. تم استزراع الخلايا اللحمية والخلايا العضلية القلبية المشتقة من hiPSC وفقا لبروتوكول البائع لمدة 3 أيام للسماح بالتعافي من الحفظ بالتبريد قبل صب الخلايا في الأنسجة. وتقدم نتائج تمثيلية توضح أنواع مجموعات البيانات التي يمكن جمعها باستخدام منصة الاستشعار المغناطيسي. كما يتم تناول المزالق الشائعة المرتبطة بتوليد الأنسجة المهندسة باستخدام هذه الطرق.

Protocol

1. بروتوكول زراعة الخلايا

  1. ثقافة الأرومة العضلية البشرية الأولية
    1. تمييع المصفوفة خارج الخلية (ECM) بنسبة 1: 100 في 8 مل من وسط DMEM / F12 على الجليد.
    2. ضع 8 مل من محلول ECM على دورق T175 واحد واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل بذر الخلية ، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة. تأكد من أن محلول ECM يغطي قاع القارورة بالكامل.
    3. القسمة 5 مل من وسط نمو العضلات الهيكلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. قم بإذابة قارورة مجمدة من الخلايا (5.0 × 105 أرومات عضلية) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة أو حتى يذوب الجليد. رش القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول وانقلها إلى خزانة السلامة الحيوية (BSC).
    5. انقل الخلايا إلى الوسط المقتبس باستخدام P1000. لا تسحن. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 3 دقائق.
    6. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط النمو باستخدام ماصة P1000 لتحقيق تعليق خلية واحدة.
    7. اغسل القارورة المطلية ب ECM ب 15 مل من DPBS. نضح DPBS ، ثم أضف 30 مل من وسط النمو إلى القارورة.
    8. أضف 4 مل من وسط النمو إلى الخلايا ، وامزج ووزع تعليق الخلية في دورق T-175. تأكد من أن الحجم الكلي هو 35 مل. حرك القارورة برفق على طول سطح العمل إلى اليسار واليمين 5-6 مرات متبوعة بالأمام والخلف 5-6 مرات لضمان التوزيع المتساوي للخلايا على سطح القارورة.
    9. ضع قارورة T-175 في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استزرع الخلايا لمدة 3 أيام أو حتى لا تصل إلى أكثر من 70٪ التقاء ، ثم تمر الخلايا.
  2. تمرير الخلايا العضلية البشرية الأولية
    1. قم بتخفيف ECM بنسبة 1: 100 في 30 مل من وسط DMEM / F12 على الجليد.
    2. ضع 10 مل من محلول ECM على ثلاث قوارير T225 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل بذر الخلية ، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة. تأكد من أن حل ECM يغطي قاع القارورة بالكامل.
    3. اغسل الخلايا ب 15 مل من DPBS. نضح وإضافة كاشف التفكك وفقا لبروتوكول البائع.
    4. بمجرد رفع الخلايا ، أوقف التفاعل وفقا لبروتوكول البائع واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 3 دقائق.
    5. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط النمو باستخدام ماصة P1000 لتحقيق تعليق خلية واحدة.
    6. اغسل القارورة المطلية ب ECM ب 15 مل من DPBS. نضح DPBS ، ثم أضف 40 مل من وسط النمو إلى كل قارورة T225.
    7. أضف 14 مل من وسط النمو إلى تعليق الخلية ، واخلط ووزع 5 مل من معلق الخلية على كل دورق T225. تأكد من أن الحجم الكلي في كل قارورة هو 45 مل. حرك القارورة برفق على طول سطح العمل إلى اليسار واليمين 5-6 مرات متبوعة بالأمام والخلف 5-6 مرات لضمان التوزيع المتساوي.
    8. ضع القوارير في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    9. خلايا الثقافة لمدة 2-3 أيام أو حتى لا تصل إلى أكثر من 70 ٪ التقاء ، ثم المرور. قسم الخلايا عند 1: 3 أو 1: 4 في كل ممر والبذور بين 3 × 103 و 1 × 104 خلايا / سم2.
  3. ثقافة خلايا عضلة القلب المشتقة من hiPSC
    1. قم بتخفيف ECM بنسبة 1:60 في 12 مل من وسط DMEM / F12 على الجليد.
    2. ضع 1 مل من محلول ECM على كل بئر من لوحين من 6 آبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل بذر الخلية ، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة.
    3. قم بإذابة قارورة مجمدة من خلايا عضلة القلب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة أو حتى يذوب الجليد.
    4. رش القارورة بنسبة 70 ٪ من الإيثانول ونقلها إلى BSC.
    5. استخدم ماصة p1000 لنقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    6. اشطف المبرد الفارغ ب 1 مل من وسط طلاء درجة حرارة الغرفة (RT) لاستعادة أي خلايا متبقية.
    7. قم بتوزيع 1 مل من وسائط الشطف بالتنقيط ببطء (قطرة واحدة كل 5 ثوان) في الأنبوب المخروطي للخلايا على مدار 90 ثانية. قم بتدوير الأنبوب باستمرار لخلط الخلايا أثناء إضافة الوسائط البطيئة.
    8. أضف ببطء 8 مل من وسط الطلاء باستخدام ماصة مصلية 10 مل إلى أنبوب الخلايا المخروطي 50 مل.
    9. بعد الاستغناء عن جميع الوسائط ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل 3 مرات لخلط الخلايا جيدا. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم والمثقب الأزرق.
    10. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل في 300 × غرام لمدة 3 دقائق.
    11. بعد تكوير الخلايا ، نضح المادة الطافية.
    12. استخدم ماصة p1000 لنقل 1 مل من وسط الطلاء إلى الأنبوب وتفتيت الحبيبات برفق عن طريق السحب ببطء لأعلى ولأسفل 3-5 مرات. أعد تعليق الخلايا بوسط طلاء إضافي.
    13. البذور بين 2-4 × 106 خلايا لكل بئر من 6 صفيحة بئر في 2 مل من وسط الطلاء.
    14. اغسل الألواح ذات 6 آبار المطلية ب ECM باستخدام DPBS (2 مل / بئر).
    15. ماصة 2 مل من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 6 آبار. حرك الألواح برفق على طول سطح العمل إلى اليسار واليمين 5-6 مرات متبوعة بالأمام والخلف 5-6 مرات لضمان التوزيع المتساوي للخلايا على أسطح الألواح.
    16. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    17. كرر الخطوات 1.3.3-1.3.16 لإذابة جميع قوارير الخلايا.
    18. قم بالتغيير إلى 3-5 مل (حسب خط الخلية والكثافة) من وسط الصيانة في اليوم التالي بعد الطلاء ، ثم قم بتغيير الوسط كل يومين. خلايا الثقافة لمدة 3-4 أيام قبل الصب في الأنسجة ثلاثية الأبعاد.
  4. ثقافة الخلايا اللحمية
    1. ضع 30 مل من محلول ECM على دورق T175 واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل بذر الخلية ، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة.
    2. القسمة 5 مل من وسط الخلية اللحمية في أنبوب مخروطي 15 mL.
    3. قم بإذابة قارورة مجمدة من الخلايا اللحمية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة أو حتى يذوب الجليد للتو.
    4. رش القارورة بنسبة 70 ٪ من الإيثانول ونقلها إلى BSC.
    5. استخدم ماصة p1000 لإضافة 1 مل ببطء من وسط الخلية اللحمية إلى الخلايا المذابة في القارورة.
    6. انقل تعليق الخلية من القارورة إلى وسائط الذوبان المتبقية في الأنبوب المخروطي. استخدم ماصة مصلية سعة 5 مل لخلط الخلايا. ماصة صعودا وهبوطا 3 مرات.
    7. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم والتريبان الأزرق. لا تدور الخلايا.
    8. اغسل قارورة T175 المطلية ب ECM ب 15 مل من DPBS.
    9. انقل الخلايا اللحمية إلى القارورة بكثافة 3-4 × 103 خلايا / سم2. حرك القارورة برفق على طول سطح العمل إلى اليسار واليمين 5-6 مرات متبوعة بالأمام والخلف 5-6 مرات لضمان التوزيع المتساوي للخلايا على سطح القارورة.
    10. قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي باستخدام 45 مل من وسط الخلايا اللحمية الدافئة. استزرع الخلايا لمدة 3-4 أيام قبل صبها في الأنسجة ثلاثية الأبعاد.

2. إعداد المواد

  1. الفيبرينوجين
    ملاحظة: عند إعادة تكوين الفيبرينوجين ، احرص على زيادة مساحة السطح التي يتم وضع مسحوق الفيبرينوجين عليها إلى أقصى حد. في هذا البروتوكول ، تم تحسين كمية المادة المخففة المستخدمة إلى حجم الحاوية المستخدمة ، أي تم استخدام مادة مخففة كافية لتغطية قاع الطبق. على سبيل المثال ، طبقة 0.5 غرام من الفيبرينوجين أكثر من 10 مل من PBS في طبق 100 مم بدلا من أنبوب طرد مركزي 50 مل. سيؤدي تعظيم مساحة سطح المادة المخففة إلى تقليل مقدار الوقت اللازم لإعادة تكوين الفيبرينوجين وتقليل التكتل المحتمل للبروتين.
    1. اعاده تشكيل
      1. انقل 10 مل من PBS إلى طبق زراعة الخلايا 100 مم ودفئه إلى 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا.
      2. ضع 0.5 جم من مسحوق الفيبرينوجين على كامل سطح برنامج تلفزيوني دافئ واحفظه عند 37 درجة مئوية حتى يذوب الفيبرينوجين تماما. يجب ألا يستغرق هذا أكثر من 2 ساعة. قد يتم تدوير المسحوق المذاب بلطف ، لكن لا تهز الطبق بقوة.
    2. الترشيح المعقم
      1. بمجرد أن يذوب المسحوق تماما ، قم بتشغيل المحلول من خلال مرشح 100 ميكرومتر واجمعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لإزالة أي كتل من الفيبرينوجين المتبلور.
      2. صب المحلول المصفى في حقنة سعة 10 مل مغطاة بفلتر 0.2 ميكرومتر. ادفع المحلول عبر الفلتر واجمعه في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. قد يلزم تغيير المرشح أكثر من مرة لتعقيم كل 10 مل من المحلول.
      3. القسمة 300 مل من الفيبرينوجين المعقم في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. قم بإذابة القسمة على الثلج أو عند 4 درجات مئوية حسب الحاجة. تجنب التجميد / الذوبان المتكرر.
  2. الثرومبين
    1. أضف 6 مل من PBS و 4 مل من diH2O مباشرة في قنينة واحدة من الثرومبين (1 KU) لصنع محلول مخزون ثرومبين 100 وحدة / مل.
    2. تعقيم المرشح بفلتر 0.2 ميكرومتر ، والقسمة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية في أنابيب طرد مركزي بلاستيكية دقيقة سعة 1.5 مل حيث يمتص الثرومبين بالزجاج. تجنب التجميد / الذوبان المتكرر.
  3. محلول بولي (إيثيلينيمين) (PEI)
    تحذير: جزيرة الأمير إدوارد سامة. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يتم توفير جزيرة الأمير إدوارد كحل 50٪ وزن / حجم. إنه شديد اللزوجة ويصعب ماصة. اصنع حلا بنسبة 0.1٪ من حل مخزون بنسبة 10٪ بدلا من حل 50٪ w / v مباشرة.
    1. قم بقياس 5 مل من محلول PEI بنسبة 50٪ وزن / وزن في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    2. أضف 20 مل من diH2O واخلطها للحصول على محلول مخزون بنسبة 10٪. لا يمكن تصفية محلول المخزون عالي التركيز هذا بشكل معقم.
    3. لعمل محلول 0.1٪ لزراعة الخلايا ، أضف 5 مل من مخزون 10٪ إلى 495 مل diH2O. مرشح معقم باستخدام قارورة مرشح 500 مل وتخزينها في RT لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد.
  4. الجلوتارالدهيد
    تنبيه: الجلوتارالدهيد سام. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة.
    1. يتم توفير الجلوتارالدهيد كمحلول 25٪. لعمل محلول 0.01٪ ، أضف 40 ميكرولتر إلى 99.6 مل من diH2O. مرشح معقم واحفظه في 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد.
  5. بعد التحضير
    1. ضع مجموعة صب الأنسجة المستهلكة داخل غطاء مزرعة معقم. تحتوي مجموعة الصب على غطاء ، وشبكة عمود تحمل 24 زوجا من الأعمدة (زوج واحد من الأعمدة لكل بئر من صفيحة 24 بئرا) ، وقاع صفيحة 24 بئرا متخصصا يحتوي على 24 بئر صب. يحتوي كل بئر صب على خندق في قاع البئر لعقد مكونات الخلية / الهيدروجيل وتشكيلها في نسيج على شكل أنبوب أثناء بلمرة الهيدروجيل (الشكل 1 ب).
    2. املأ آبار صفيحة 24 بئرا ب 1.5 مل / بئر من محلول PEI بنسبة 0.1٪ وضع أعمدة في لوحة بحيث يتم غمر أطراف كل زوج من الأعمدة. اتركه لمدة 10 دقائق. سوف تودع جزيرة الأمير إدوارد شحنة موجبة على الأعمدة بحيث تلتصق البروتينات الموجودة في الهيدروجيل بقوة بالأعمدة أثناء صب الأنسجة.
    3. املأ آبار صفيحة ثانية من 24 بئرا ب 2 مل / بئر من diH2O المعقم وانقل الأعمدة. اتركه لمدة 1 دقيقة.
    4. في صفيحة ثالثة مكونة من 24 بئرا ، املأ الآبار ب 1.5 مل / بئر من 0.01٪ جلوتارالدهيد (GA) وانقل الوظائف. اتركه لمدة 30 دقيقة. سيقوم GA بإصلاح الشحنة الموجبة من جزيرة الأمير إدوارد إلى المنشورات.
    5. بينما تجلس الأعمدة في الجلوتارالدهيد ، قم بنضح آبار diH 2 O ، واغسلها ب 2 مل / بئر من diH 2 O المعقم ، ونضح، وأعد تعبئتها ب 2 مل / بئر من diH2O المعقم. يمكن استخدام طبق جديد من 24 بئرا بدلا من الشطف.
    6. عندما تنتهي 30 دقيقة ، انقل الأعمدة إلى 2 مل / بئر من diH2O المعقم. اتركه لمدة 1 دقيقة.
    7. نضح diH 2 O وأضف 2 مل / بئر أخرى من diH2O المعقم. اتركه لمدة 5 دقائق.
    8. انقل الأعمدة إلى طبق من 24 بئرا حتى يجف (حوالي 15 دقيقة).
    9. بمجرد أن يجف ، أعد تجميع مجموعة الصب. قم بتقطيع الحواف لإغلاق الغطاء واللوحة معا ، ثم قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة قبل بذر الخلايا. من المحتمل أن تكون أوقات التخزين الأطول ممكنة ولكن لم يتم اختبارها.

3. بروتوكول صب الأنسجة

  1. إعداد لوحة الصب
    1. قم بتبريد مجموعة صب الأنسجة مسبقا على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. نقل دلو من الثلج إلى BSC. على الجليد ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين (3 ميكرولتر من مخزون الثرومبين + 47 ميكرولتر من وسط EMT) لكل بئر ليتم صبها.
      ملاحظة: راجع الخطوة 3.2.1 للحصول على تفاصيل حول وسيط EMT.
    3. أخرج مجموعة الصب المبردة من الثلاجة وضعها على كتلة باردة أو ثلج داخل غطاء زراعة الخلية. ضع صفيحة الصب بشكل مسطح على الجليد وانقل شبكة العمود من لوحة الصب إلى لوحة جديدة معقمة من 24 بئرا.
    4. ماصة 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين في كل بئر مبرد مسبقا من لوحة الصب.
    5. أعد تجميع المجموعة وأعدها إلى الثلاجة لحين الحاجة إليها لصب الأنسجة. صب الأنسجة في غضون 3 ساعات من الثرومبين بالإضافة إلى الآبار.
  2. إعداد الخلية
    1. تحضير وسط قاعدة EMT ، مرشح معقم ، واتركه على الجليد.
      ملاحظة: إذا كان وسيط الصب الخاص بالخلية يحتوي على FBS ، فاستخدم FBS المعطل بالحرارة لأنه قد يتفاعل مع الفيبرينوجين ويسبب البلمرة المبكرة.
      1. تحضير وسط EMT للقلب: أضف 500 مل من وسط RPMI ، و 10 مل من B27 ، و 2.5 جم من حمض أمينوكابرويك. (اختياري) أضف مثبط 10 mM ROCK (أضف فقط إلى وسط EMT المستخدم في صب الأنسجة وليس حجم 500 مل بالكامل).
      2. تحضير وسط EMT الهيكلي: أضف 50 مل من وسط F10 و 0.25 جم من حمض أمينوكابرويك (ACA) ل EMTs الأولية و 0.1 جم من ACA ل EMTs المشتقة من iPSC.
    2. قم بتسخين كاشف تفكك درجة زراعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين حجم متساو من وسط EMT لتخفيف كاشف التفكك.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يكون البروتياز المستخدم غير نشط تماما. سوف تتداخل البروتياز النشط مع تكوين الأنسجة 3D وبعد الالتزام.
    3. اغسل الخلايا (الشكل 1 أ) باستخدام برنامج تلفزيوني. استخدم 2 مل / بئر للوحة 6 آبار. استخدم 6 مل و 15 مل و 15 مل لطبق 100 مم ودورق T175 ودورق T225 على التوالي.
    4. أضف كاشف تفكك درجة زراعة الخلايا الدافئة لرفع الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى ترفع الخلايا. بالنسبة لمزارع القلب ، استخدم كاشف التفكك 10x. بالنسبة للخلايا اللحمية والخلايا العضلية الهيكلية ، استخدم كاشف تفكك 1x. استخدم 1 مل / بئر لطبق 6 آبار ، و 3 مل لطبق 100 مم ، و 8 مل لدورق T175 ، و 10 مل لدورق T225.
    5. تحقق من الثقافات كل 2-3 دقائق عن طريق النقر على جانب اللوحة.
    6. بمجرد رفع الخلايا ، قم بنقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وسحنها باستخدام ماصة P1000 لضمان تعليق خلية واحدة.
    7. اغسل اللوحة أو القارورة بوسيط EMT إضافي لجمع الخلايا المتبقية وإضافتها إلى الأنبوب المخروطي. استخدم 1 مل / بئر من وسط EMT للوحة 6 آبار ، و 2 مل لطبق 100 مم ، و 5 مل لقارورة T175 ، و 5 مل لقارورة T225.
    8. سحن الخلايا لضمان تعليق خلية واحدة.
    9. أضف وسيط EMT لإنهاء عملية التفكك ، ثم خذ عينات من معلقات الخلايا لتعداد الخلايا. استخدم 1 مل / بئر لطبق 6 آبار ، و 3 مل لطبق 100 مم ، و 8 مل لدورق T175 ، و 10 مل لدورق T225.
    10. أدر الخلايا على حرارة 200 × جم لمدة 4 دقائق. قم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام مقياس الدم وأزرق التريبان أثناء الطرد المركزي للمعلقات.
    11. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من وسط قاعدة EMT لإزالة كاشف التفكك المتبقي.
    12. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 4 دقائق. نضح الطافد وإعداد تعليق الخلية في الكثافات المناسبة.
    13. زيادة طول العمر ووظيفة EMTs العضلات والهيكل العظمي 3D مع إضافة 10٪ -20٪ بروتينات ECM في وسط EMT14,16.
    14. الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البذور وخلاياها اللحمية في 5 × 10 5 خلايا و7.5 × 104 خلايا لكل بناء نسيج ، على التوالي. زرع الخلايا العضلية الهيكلية في 7.5 × 105 خلايا لكل بناء الأنسجة.
    15. أنسجة القلب
      1. نضح الطافد وإعادة تعليق الخلايا اللحمية بكثافة 2.5 × 106 خلايا لكل مل في وسط EMT ووضعها على الجليد. استخدم 30 ميكرولتر من هذا التعليق لكل EMT.
      2. نضح الطافع وإعادة تعليق CMs بكثافة 8.3 × 106 خلايا لكل مل في وسط EMT ووضعها على الجليد. استخدم 60 ميكرولتر من هذا التعليق لكل EMT.
    16. الأنسجة العضلية الهيكلية
      1. نضح الطافع وإعادة تعليق خلايا العضلات الهيكلية بكثافة 8.3 × 106 خلايا لكل مل في وسط EMT ووضعها على الجليد. استخدم 90 ميكرولتر من هذا التعليق لكل EMT.
    17. احسب أحجام كل محلول خلوي مطلوب لتكوين العدد المطلوب من الأنسجة (على سبيل المثال ، 60 ميكرولتر من CMs المحضرة و 30 ميكرولتر من الخلايا اللحمية المحضرة أو 90 ميكرولتر من خلايا العضلات الهيكلية لكل EMT).
    18. ماصة الأحجام المحسوبة للخلايا في أنبوب مخروطي 15 mL.
    19. أضف 10 ميكرولتر من الفيبرينوجين لكل EMT إلى تعليق الخلية واحتفظ بها على الجليد.
    20. إجمالي الكواشف وأحجام الخلايا لكل EMT: تأكد من أن كل EMT يحتوي على 90 ميكرولتر من الخلايا و 10 ميكرولتر من الفيبرينوجين و 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين.
  3. صب الأنسجة
    1. انقل مجموعة صب الأنسجة إلى غطاء زراعة الخلايا وقم بإزالة الغطاء (يجب أن تظل الشبكة اللاحقة التي تحتوي على أعمدة مرنة وصلبة على لوحة الصب ؛ الشكل 1 ب). حافظ على لوحة الصب مع وضع شبكة ما بعد مسطحة على الجليد.
    2. امزج خليط الخلية / الفيبرينوجين وارسم 100 ميكرولتر باستخدام ماصة P200.
    3. أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى الآبار المحضرة ب 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين وسحن 5 مرات للخلط جيدا. لا تدفع الماصة إلى ما بعد المحطة الأولى وقم بإزالة الطرف بعد التثليج لتجنب تكوين أي فقاعات.
    4. في هذه المرحلة ، وحتى تصبح الشبكة البريدية جاهزة للرفع من لوحة الصب (الخطوة 3.3.10) ، قد تؤدي أي حركة للشبكة إلى الإضرار بالارتباط طويل الأمد للأنسجة بالوظائف. امسك كلا من الشبكة ولوحة البئر المصبوبة في وقت واحد باستخدام إصبع المؤشر والإبهام بيد واحدة لتجنب أي حركة للشبكة.
    5. كرر مع طرف P200 جديد لكل منديل حتى يتم صب جميع المناديل. امزج معلق الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل قبل صب كل نسيج حيث تستقر الخلايا بسرعة.
    6. انقل بعناية المجموعة المصنفة إلى الحاضنة ، مع التأكد من عدم تحريك الشبكة. قد تؤدي حركة الشبكة بعد البذر إلى انخفاض النجاح في نقل الأنسجة من آبار الصب. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة ، بغض النظر عن نوع الخلية. سيبدأ هذا في بلمرة الهيدروجيل ويسمح للبروتينات بالالتصاق بالوظائف.
    7. في هذه الأثناء ، قم بإعداد صفيحة جديدة من 24 بئرا مع 2 مل / بئر من وسط EMT لأنسجة القلب. يمكن إضافة مثبط 10 mM ROCK إلى وسط EMT إذا رغبت في ذلك. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لتدفئة الوسط.
    8. تحضير 2 مل / بئر من وسط النمو الذي يحتوي على 5 جم / لتر حمض أمينوكابرويك (0.2 مم معقم مرشح) لأنسجة العضلات الهيكلية الأولية أو 2 جم / لتر ACA ل EMTs المشتقة من iPSC. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لتدفئة الوسط.
    9. بعد الحضانة ، أضف برفق 1 مل من وسط EMT إلى حافة آبار الصب واحتضانها لمدة 10 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية ، بغض النظر عن نوع الخلية. سيؤدي ذلك إلى إزاحة الهيدروجيل من حواف بئر الصب والسماح بنقل الأنسجة بسهولة.
    10. بعد 10 دقائق ، ارفع شبكة العمود بعناية وانقل الأنسجة من لوحة الصب إلى صفيحة 24 بئرا معدة بوسط (الشكل 1C). أعد الألواح بالمناديل إلى حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  4. صيانة
    1. بعد 24 ساعة ، انقل الأنسجة الزهرية إلى صفيحة جديدة من 24 بئرا مع 2 مل / بئر من وسائط EMT (بدون مثبط ROCK إذا تم تضمينه) واحتضانها عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لخلايا العضلات الهيكلية ، قم بتبديل وسط النمو إلى وسط التمايز لتعزيز اندماج الخلايا العضلية.
    2. نقل أنسجة القلب إلى آبار جديدة مع 2 مل / بئر من وسط EMT كل 2-3 أيام.
    3. نقل الأنسجة العضلية الهيكلية إلى آبار جديدة باستخدام 2 مل / وسط تمايز جيد يحتوي على 5 جم / لتر حمض أمينوكابرويك (0.2 مم معقم مصفى) كل 2-3 أيام. استخدم 2 جم / لتر ACA للأنسجة المشتقة من iPSC.
    4. للمساعدة في التغييرات المتوسطة ، انقل الشبكة البريدية إلى لوحة جديدة مكونة من 24 بئرا بدلا من تغيير الوسط في نفس اللوحة لتجنب إتلاف أنسجة 3D. قم بإعداد صفيحة ثانية من 24 بئرا باستخدام وسيط EMT ونقل الأنسجة إلى الوسط الطازج. احتفظ بالطبق مع الوسيط القديم جنبا إلى جنب مع الثقافة النشطة لاستخدامها في التغيير الوسيط التالي. انقل شبكة البريد ذهابا وإيابا بين اللوحين طوال فترة الاستزراع. بدلا من ذلك ، استخدم طبقا جديدا لكل تغيير متوسط.
    5. قم بقياس انكماش EMT إما عن طريق التتبع البصري للانحراف اللاحق (الشكل 1D) أو أجهزة الاستشعار المغناطيسي13,14. تبدأ أنسجة القلب في النبض تلقائيا بعد 3-4 أيام في الثقافة. عادة ما تكون أنسجة العضلات الهيكلية مقلصة مع تحفيز المجال الكهربائي بعد 7 أيام في الثقافة.

Representative Results

تم صب الخلايا في أنسجة عضلية مهندسة في اللوحة الاستهلاكية 2-post (الشكل 1). ستظهر EMTs الناجحة موحدة ، وسيتم توزيع المصفوفة بالتساوي بين الوظائف (الشكل 2 أ). يجب أن تلتف المصفوفة أيضا حول كلا العمودين ، مما ينتج نقاط ربط مكافئة للأنسجة. الفشل في الصب نادر الحدوث بهذه الطريقة وعادة ما يكون واضحا مع الفحص البصري. يمكن أن يتراوح إنتاج EMT غير الناجح من الإخفاقات الكارثية ، مثل انفصال الأنسجة عن الوظائف (الشكل 2 ب) إلى عيوب هيكلية أكثر دقة ، مثل فقاعات الهواء والتعلق الفضفاض بالوظائف (الشكل 2C ، D). قد تظل الأنسجة ذات العيوب الطفيفة قابلة للحياة ، ولكن يجب فحص البيانات من هذه الأنسجة بعناية للتأكد من أنها قابلة للمقارنة مع EMTs غير المنقوصة . على سبيل المثال ، قد يتم ضغط فقاعات الهواء داخل EMT مع ضغط الأنسجة بمرور الوقت ، مما يجعل بنية تعمل بكامل طاقتها دون أوجه قصور في الانقباض. يجب تقييم هذه الأنسجة على أساس كل حالة على حدة ، لأن موقع فقاعات الهواء قد يؤثر على الانتعاش الوظيفي. على سبيل المثال ، قد تؤثر فقاعات الهواء المتولدة في الوظائف على ارتباط الأنسجة ، مما قد يعيق الالتصاق طويل الأمد بالعمود.

تبدأ الأنسجة في الانضغاط خلال ال 24 ساعة الأولى حيث تعيد الخلايا تشكيل المصفوفة داخل الهيدروجيل (الشكل 3). الضغط هو عملية تدريجية وعادة ما يستمر خلال الأسابيع 2-4 الأولى من الثقافة. بشكل عام ، يكون ضغط الأنسجة متسقا بين النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية (الشكل 4). من الطبيعي أن تضغط بعض خطوط الخلايا المصفوفة أكثر من غيرها مع نضوج الأنسجة بمرور الوقت. تؤثر النسبة المئوية للخلايا العضلية داخل البنية على المعدل والدرجة الكلية لضغط EMT. يجب أن يكون إجمالي المحتوى العضلي لكل من خطوط خلايا العضلات القلبية والهيكلية أعلى من 80٪ لتقليل التباين بين الأنسجة المهندسة. هذا مهم بشكل خاص عند مقارنة القوى المقلصة والحركية عبر خطوط الخلايا.

في غضون الأيام القليلة الأولى بعد الصب ، تبدأ خلايا عضلة القلب في النبض تلقائيا في الثقافة ، مما يؤدي إلى ثني العمود المرن بشكل إيقاعي مع كل تقلص عضلي. تنقبض العضلات الهيكلية استجابة للتحفيز الكهربائي بحلول اليوم 7 بعد بدء التمايز. تم تطبيق التحفيز الميداني على أنسجة العضلات الهيكلية عبر محفز خارجي متصل بغطاء قطب كهربائي مخصص مكون من 24 بئرا. الغطاء ، المصنوع بزوج من أقطاب الكربون لكل بئر ، يجلس فوق صفيحة الأنسجة المكونة من 24 بئرا ، ويحفز في نفس الوقت كل EMT للحث على تقلصات العضلات. تم تخطيط الأنسجة باستخدام محفز 10 فولت لفترات نبضة 10 مللي ثانية عند 1 هرتز أثناء القياسات الوظيفية. تشير الأنسجة المقلصة إلى الأرومات العضلية الهيكلية التي اندمجت ، وشكلت أنابيب عضلية كاملة مع القطع العضلية الوظيفية والآلات المقلصة. بقع EMTs الهيكلية إيجابية لسلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) ويتم توطين الديستروفين في غشاء الأنبوب العضلي مما يكشف عن شكل حلقة كلاسيكي في التحليل الكيميائي المناعي المستعرض (الشكل 5). بمجرد أن تعمل EMTs ، يمكن قياس الانقباض يوميا في أداة الاستشعار المغناطيسي ، وتتبع القوة والحركية مع تطور التركيبات ونضجها بمرور الوقت. تظل كل من أنسجة العضلات القلبية والهيكلية قابلة للانقباض لأسابيع إلى أشهر في ثقافة 3D (الشكل 6) ، ويمكن استخدامها لمجموعة واسعة من دراسات الانقباض.

يمكن استخدام نهج الكشف المغناطيسي لقياس الآثار الحادة والمزمنة للمواد السامة للقلب الهيكلية في وقت واحد ، مثل دوكسوروبيسين (الشكل 7) و BMS-986094 (الشكل 8) ، وكذلك الأدوية الأخرى التي تؤثر على انقباض العضلات. يمكن أيضا استخدام طرق التتبع البصري للكشف عن الانكماش ، ولكن يجب توخي الحذر عند دراسة تأثيرات الأدوية الحادة حيث يجب أخذ القياسات بالتتابع. طول العمر الممتد من EMTs القلب والهيكل العظمي في ثقافة 3D تمكن من دراسات المخدرات على المدى الطويل في هذه الأنسجة. يسمح هذا للمستخدمين باستكشاف آثار تكرار الجرعات ، بالإضافة إلى التعرض المستمر طويل الأمد للمركبات التي قد تظهر تأثيرات سمية للقلب بمرور الوقت كما يحدث مع دوكسوروبيسين. دوكسوروبيسين (دوكس) هو دواء علاج كيميائي مضاد للسرطان17. تختلف كمية الدواء التي يتم إعطاؤها للمرضى ، اعتمادا على نوع السرطان وعمر المريض وطول المريض ووزنه ، بالإضافة إلى عوامل أخرى. لهذا السبب ، من المهم اختبار تأثير dox عبر مجموعة واسعة من التركيزات وجداول التسليم. هنا ، تم علاج EMTs القلب على مدار 27 يوما بثلاثة تركيزات منفصلة (0.1 ميكرومتر ، 1 ميكرومتر ، و 10 ميكرومتر) من dox (الشكل 7). تم تقسيم المجموعات إلى طبقات أخرى عن طريق معالجة EMTs في كل تركيز إما بمعالجة البلعة أو الإدارة المستمرة مع تغيير متوسط كل 72 ساعة. تعرضت الآبار التي أعطيت علاجات بلعة دوكس للدواء في ثلاث نقاط زمنية منفصلة ، مما سمح بالتعافي بين الجرعات. أظهرت أعلى جرعتين من البلعة والتعرض المستمر توقفا فوريا ومطولا لتوليد القوة الانقباضية طوال فترة الدراسة. كان للتركيزات المتوسطة والدنيا تأثيرات متفاوتة على الأنسجة ، اعتمادا على طريقة الإعطاء. في أقل تركيز للدواء ، لم تظهر مجموعة البلعة أي اختلاف عن الضوابط. ومع ذلك ، تضاءلت قوة انقباض بعد 2 أسابيع من التعرض المستمر. كان للتركيز متوسط المدى للدواء تأثير مثير للاهتمام. في حين أن الجرعات المستمرة قللت من القوة خلال اليومين الأولين من العلاج واستمرت طوال التجربة ، أظهرت مجموعة البلعة استعادة قوة الانقباض مرة أخرى إلى مستويات التحكم عندما تم غسل الدواء بعد 3 أيام. ومع ذلك ، تسببت البلعة الثانية من الدواء في توقف كامل للقوة ، يليه عدم الشفاء (الشكل 7) ، مما يشير إلى أن الجرعات المتكررة عند هذا التركيز قد يكون لها تأثير سمي للقلب في المرضى الذين عولجوا بهذا الدواء. يسلط النطاق الواسع لهذه الدراسة ، في كل من الوقت والظروف التجريبية ، الضوء على فائدة الأنسجة المهندسة 3D في فحص السمية ، لأنها تظل مقلصة وتستجيب للتعرض الكيميائي على مدى فترات طويلة من الزمن ، مما يسمح بإجراء دراسات دوائية طويلة الأجل ضمن مجموعة واحدة من الأنسجة العضلية. هذا لا يسهل فقط تحديد المركبات التي قد يكون لها تأثير سمي للقلب مع التعرض المزمن ولكن أيضا الكشف عن توقيت السمية القلبية المحتملة للإعطاء.

يعد اختبار السمية في المختبر في أنسجة العضلات البشرية المهندسة إحدى الطرق للمساعدة في الحفاظ على سلامة المرضى من البشر في التجارب السريرية. BMS-986094 هو مثبط بوليميراز النوكليوتيدات (NS5B) يستخدم لعلاج التهاب الكبد C. كان الدواء في المرحلة الثانية من التطوير السريري عندما توقف بريستول مايرز سكويب عن التطوير بسبب العديد من حالات قصور القلب غير المتوقع في المرضى18,19. هنا ، تم تطبيق BMS-986094 على EMTs القلبية لاختبار ما إذا كانت أنسجة العضلات المهندسة 3D ستطور تفاعلا سميا للقلب للدواء (الشكل 8). تم تطبيق ثلاثة تركيزات مختلفة من الدواء ، وتم رصد الأنسجة على مدى 13 يوما. انخفضت قوة الانقباض مع إضافة الدواء بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 8 أ). تأثر تردد النشل أيضا بشكل كبير حيث تباطأ معدل النبض وتوقف في النهاية كما هو متوقع مع استمرار التعرض للمركب السمي للقلب (p < 0.05 ، الشكل 8B). توضح هذه النتائج كيف يمكن استخدام أنسجة العضلات البشرية المهندسة 3D لتسهيل جلب أدوية جديدة إلى السوق والإبلاغ عن المركبات التي تفشل في النهاية بسبب السمية القلبية. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه التكنولوجيا أن تنقذ الأرواح من خلال تعريض الأدوية الخطرة قبل وضعها على المرضى في التجارب السريرية.

تعد القدرة على قياس تأثير الأدوية الحادة والمزمنة على الأنسجة الانقباضية البشرية خطوة أولى حيوية عند التحقيق في العلاجات من أجل السلامة والفعالية. ومع ذلك ، من المهم معرفة أن تركيز الأدوية المطبقة مناسب من الناحية الفسيولوجية ومناسب للاختبار في المختبر . تم استخدام أنسجة العضلات الهيكلية لإنشاء قيمة IC50 لأحادي البيوتانديون 2،3 (BDM) في منحنى الاستجابة الكاملة للجرعة. هذا الدواء هو مثبط ATPase ذو المواصفات الجيدة للميوسين العضلي الهيكلي II20. يمنع BDM تقلصات العضلات عن طريق منع تكوين جسر الميوسين المتقاطع مع خيوط الأكتين في القطع العضلية21. تكشف النتائج الموضحة هنا عن انخفاض يعتمد على الجرعة في القوة المطلقة عند تطبيق الدواء والتعافي الكامل للقوة المقلصة عند غسل الدواء ، مما يشير إلى أن التأثير العابر يمنع تقلصات العضلات وليس مجرد قتل الخلايا داخل الأنسجة (الشكل 9 أ). علاوة على ذلك ، تم قياس منحنى الاستجابة الكاملة للجرعة عبر التركيزات السبعة التي تم فحصها ، مما أدى إلى إنشاء IC50 من 3.2 mM في هذه الأنسجة الدقيقة البشرية (الشكل 9B).

Figure 1
الشكل 1: صب EMT في لوحة Mantarray الاستهلاكية 24 بئرا القابلة للاستهلاك. (أ) تمت زراعة الخلايا العضلية واللحمية على أسطح ثنائية الأبعاد قبل صب الأنسجة. (ب) ترفع الخلايا من أسطح 2D وتخلط مع بروتينات مصفوفة خارج الخلية لتكوين هلاميات مائية في آبار صب الألواح الفردية الموضحة في الجزء الداخلي. (ج) صفيحة من 24 بئرا تحتوي على مناديل هندسية في كل بئر. (د) الأنسجة التمثيلية التي تظهر ارتخاء وتقلص العضلات المهندسة، ومقارنة إزاحة العمود المغناطيسي (الأشرطة الخضراء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صب EMT الناجح وغير الناجح . (أ) الأنسجة العضلية المثالية المهندسة لمدة 24 ساعة بعد الصب مضغوطة بشكل موحد حول الأعمدة مع تكوين خلية / مصفوفة متجانسة في جميع أنحاء الأنسجة. (ب) فشل EMT يظهر انفصال الهيدروجيل عن العمود المرن. (ج) EMT يحتوي على فقاعات هواء في جميع أنحاء الأنسجة. د: ترسب الأنسجة غير المتكافئ حول كلا العمودين. يتم تثبيت الأنسجة بشكل فضفاض على العمود المرن على جانب واحد. قضبان المقياس 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: الضغط في الأنسجة العضلية المهندسة بمرور الوقت. (أ) يظهر بناء EMT 1 يوم بعد الصب. يتم نقل الأنسجة إلى وسط تمايز ، بدءا من اليوم 0 من اندماج الخلايا وضغط الهيدروجيل. (ب - ه) نفس EMT في اليوم 7 حتى اليوم 21 يظهر طولا إجماليا أقصر قليلا بين الوظيفتين بمرور الوقت وعرضا أصغر عند قياسه من خلال القسم الأوسط من EMT. قضبان المقياس 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: قطر EMT بمرور الوقت. تم تتبع أربع لوحات من الأنسجة على مدار 21 يوما ، مقارنة قطر EMT طوال فترة الضغط. تم قياس كل نسيج من خلال القسم الأوسط كل أسبوع باستخدام الفحص المجهري الضوئي. تظهر النقاط الزمنية حجم EMT متسقا بين اللوحات. يتم الوصول إلى أقصى ضغط في اليوم 21 حيث يتم تثبيت إعادة تشكيل المصفوفة. يوضح الجدول الانحراف المعياري (٪ من الإجمالي) للضغط داخل كل لوحة من الأنسجة ومتوسط الانحراف لجميع الألواح. القضبان الملونة هي لوحات فردية. أشرطة الخطأ هي SD من EMTs داخل اللوحات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الكيمياء الهيستولوجية المناعية للأنسجة العضلية الهيكلية المهندسة. تم إصلاح EMTs في اليوم 10 من الثقافة وجزءا لا يتجزأ من البارافين. تم تلطيخ المقاطع العرضية الرقيقة (7 ميكرومتر) بالأجسام المضادة ضد سلسلة الميوسين الثقيلة والديستروفين قبل التصوير. الأخضر = MyHC ، الأحمر = الديستروفين ، الأزرق = DAPI. التكبير الموضوعي هو 40X ؛ شريط المقياس هو 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: قوة انقباض الأنسجة العضلية المهندسة بمرور الوقت. (أ) متوسط قوة الارتعاش المطلقة المقاسة من EMTs القلبية من اليوم 7 حتى اليوم 63 في الثقافة ؛ ن = 3 لكل مجموعة. (ب) متوسط قوة الارتعاش المطلقة في EMTs الهيكلية المشتقة من خط الخلية الأولية في اليوم 7 حتى اليوم 53 في الثقافة ؛ ن = 3. أشرطة الخطأ هي SD لكلا الرسمين البيانيين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: علاج دوكسوروبيسين الحاد والمزمن في الأنسجة العضلية المهندسة. تم إعطاء ثلاثة تركيزات جرعة منفصلة من dox ، 0.1 μM و 1 μM و 10 μM ، إما في بلعة أو تدار بشكل مستمر لأنسجة العضلات المهندسة على مدار 27 يوما. تمت إضافة جرعات البلعة من الدواء عند تغييرات الوسائط في الأيام 0 و 12 و 24 ، والتي لاحظتها الأسهم الخضراء على المحور X. تمت إضافة الدواء إلى وسائل الإعلام في كل تغيير في الوسائط للجرعات المستمرة ، والتي لاحظتها الأسهم السوداء والخضراء على المحور X. النسبة المئوية للتغير في القوة من قيم خط الأساس (العلاج قبل الدواء) على المحور Y ، والوقت في أيام العلاج على المحور X. برتقالي فاتح = تحكم مستمر DMSO ، برتقالي داكن = تحكم بلعة DMSO ، أخضر فاتح = 0.1 ميكرومتر دوكس مستمر ، أخضر داكن = 0.1 ميكرومتر دوكس بلعة ، أزرق فاتح = 1 ميكرومتر دوكس مستمر ، أزرق داكن = 1 ميكرومتر دوكس بلعة ، أصفر فاتح = 10 ميكرومتر دوكس مستمر ، أصفر داكن = 10 ميكرومتر دوكس بلعة. أشرطة الخطأ هي SD ؛ ن = 3 لكل شرط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: العلاج المزمن باستخدام BMS-986094 في الأنسجة العضلية المهندسة. تمت معالجة EMTs ب 0.4 ميكرومتر (أخضر) ، 2 ميكرومتر (أزرق غامق) ، و 10 ميكرومتر (أزرق فاتح) BMS-986094 على مدار 13 يوما. (أ) تنخفض قوة الارتعاش المقلص (المحور Y) في جميع تركيزات الدواء في أول 2 أيام ، في حين أن أنسجة التحكم في DMSO تستمر في الحصول على أقوى بمرور الوقت (المحور X). (ب) يتوقف معدل ضربات القلب، أو تردد الارتعاش، بطريقة تعتمد على الجرعة جنبا إلى جنب مع توقف قوة الانقباض الموضحة في التمثيل البياني (أ). تحافظ أنسجة التحكم في DMSO (الرمادي) على معدل ضربات منتظم طوال التجربة. أشرطة الخطأ هي SD ؛ ن = 3 لكل شرط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: استجابة الجرعة ل BDM في الأنسجة العضلية الهيكلية المهندسة. (أ) تنخفض قوة الارتعاش المطلقة بطريقة تعتمد على الجرعة عندما تتعرض EMTs المشتقة من الخلايا الأولية لأحادي البيوتانديون 2،3 (BDM) في اليوم 16 في الثقافة ثلاثية الأبعاد. تعود قوة الارتعاش المطلقة إلى القيم الأساسية القريبة عند غسل الدواء. (ب) تنخفض قوة الارتعاش المطلقة التي يتم تطبيعها إلى قيم خط الأساس بطريقة تعتمد على الجرعة عند تعرضها ل BDM مما يؤدي إلى منحنى استجابة كامل للجرعة وقيمة IC50 ؛ ن = 4 لكل جرعة. أشرطة الخطأ هي SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تصف هذه الدراسة طرق توليد أنسجة العضلات القلبية والهيكلية المهندسة 3D داخل مجموعة صب قابلة للاستهلاك 24 بئرا. باتباع هذه الطرق ، من الممكن تحقيق مجموعة كاملة من 24 نسيجا باستمرار دون أي فشل في الصب لفحص الأدوية اللاحق. تتمثل الاعتبارات الحاسمة لتحقيق مثل هذه النتيجة في التأكد من أنه أثناء الصب يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد لمنع البلمرة المبكرة للهلاميات المائية ، وإزالة كاشف تفكك الخلايا قبل صب الأنسجة ، والخلط الشامل للخلية وتعليق الهيدروجيل لكل نسيج ، واستبدال أطراف الماصة بين الأنسجة ، واستخدام FBS المعطل بالحرارة (إذا تم استخدامه على الإطلاق). أيضا ، من المهم التأكد من عدم تحريك الشبكة البريدية بمجرد بدء الصب ونقلها برفق بمجرد تكوين الهلاميات المائية.

تشمل التعديلات الرئيسية استخدام أنواع مختلفة من الخلايا لتحقيق EMTs القلبية مقابل الهيكل العظمي وتعاطي المنشطات من الهلاميات المائية بتركيزات متغيرة من بروتينات الغشاء القاعدي لتعزيز النضج الخلوي واستقرار الأنسجة. يجب اختبار الآثار المفيدة لمثل هذه المنشطات على أساس كل حالة على حدة ، ولكن ثبت أنها تحسن النتائج الوظيفية وطول عمر الأنسجة في ظل ظروف معينة14،16،22. من الجدير بالذكر أيضا أن كثافات الخلايا المدرجة هي دليل وقد تحتاج إلى تحسين لخطوط الخلايا المختلفة. يمكن أيضا اعتبار تركيبات الهيدروجيل البديلة وسيلة لتعديل الخصائص الهيكلية والوظيفية ل EMTsالمحققة 23،24،25. تحتوي البيئة المكروية للعضلات الأصلية أيضا على أنواع خلايا داعمة لتعزيز الأوعية الدموية والتعصيب وترسب المصفوفة لدعم الخلايا العضلية في الشكل والوظيفة26,27. في حين أن النظام الموصوف هنا يدمج حاليا الخلايا الليفية في أنسجة القلب 3D ، فإن أنواع الخلايا الإضافية قد تخلق نموذجا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة سلامة وفعالية المركبات العلاجية في المختبر. في السابق ، تم دمج مجموعة من أنواع الخلايا الداعمة بنجاح في الأنسجة المهندسة ثلاثية الأبعاد مما يوفر نموذجا مثيرا للدراسة المستقبلية باستخدام منصة انقباض الاستشعار المغناطيسي28،29،30.

يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا البروتوكول على تكوين أنسجة غير موثوقة أو غير متسقة أثناء عملية الصب. يجب توخي الحذر لتجنب تكوين الفقاعات في الهلاميات المائية أثناء صبها مع الاستمرار في تسهيل التوزيع المتساوي للخلايا أثناء الخلط. من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى تجارب التحسين لكل نوع جديد من الخلايا لتحديد كثافة الخلايا المثالية ونسب الخلايا وتكوين المصفوفة.

أحد القيود الرئيسية لهذه التقنية هو العدد الكبير من الخلايا المطلوبة لإنشاء لوحة كاملة من 24 EMTs. بالنسبة للبيانات المقدمة هنا ، تم استخدام 15 مليون خلية عضلية قلبية و 18 مليون خلية عضلية هيكلية لكل لوحة. قد لا يتمكن بعض الباحثين من الوصول إلى مثل هذه المجموعات الكبيرة من المواد الخلوية ، مما قد يمنع قدرتهم على استخدام هذه المنصة إلى أقصى حد. إذا لم يكن لدى المستخدمين النهائيين إمكانية الوصول إلى أجهزة الاستشعار المغناطيسي ، فيجب إجراء قياسات الانحرافات اللاحقة بصريا ، مما يقلل بشكل كبير من الإنتاجية ويمنع التسجيل المتزامن لتقلصات العضلات عبر آبار متعددة. ومع ذلك ، فإن أجهزة Mantarray تتغلب على هذه القيود لتقديم أول نظام تجاري قادر على التحليل المستمر وغير الجراحي لانكماش EMT في وقت واحد عبر تركيبات متعددة.

يسهل الاستشعار المغناطيسي عبر 24 بئرا الدراسات الطولية للتطور الوظيفي EMT في الوقت الفعلي ويسمح بقياس دقيق للاستجابات الحادة للتلاعب الكيميائي أو البيئي أو الجيني. في حين أن الاستشعار المغناطيسي له العديد من المزايا مثل القياس المتزامن عبر أنسجة متعددة ، ولا يتطلب تحليلا معقدا للبيانات ، فإن طرق الكشف البصري تتيح القياس المتزامن للمقاييس الفسيولوجية مثل تدفق الكالسيوم أو رسم خرائط الجهد. ومع ذلك ، فإن مجموعات البيانات مثل تلك الموضحة في قسم النتائج توضح اتساع نطاق تطبيقات هذه التكنولوجيا في مجال تطوير الأدوية. بالنظر إلى أن عددا قليلا من المقايسات في السوق توفر الوسائل لإجراء تقييم مباشر للناتج المقلص في العضلات المهندسة ، فإن هذه الأساليب لديها القدرة على إحداث ثورة في خط أنابيب التطوير قبل السريري.

Disclosures

جميع المؤلفين هم موظفون وأصحاب أسهم في شركة Curi Bio Inc. ، الشركة التي تقوم بتسويق أجهزة Mantarray والبرامج المرتبطة بها.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من إدارة الغذاء والدواء (U01 FD006676-01 الممنوحة لمعهد العلوم الصحية والبيئية) وبتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (HL151094 إلى الدكتور جيس). نشكر الدكتور أليك س. ت. سميث على مساعدته في إعداد هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainer  CELLTREAT 229485
100 mm cell culture dish ThermoFisher 150466
50 mL Steriflip filter MilliporeSigma  SCGP00525
500 mL filter flask MilliporeSigma  S2GVU05RE
6-aminocaproic acid Sigma A2504
B27 Gibco 17504044
Cardiosight Maintenance Medium NEXEL CM-002A
Cardiosight Plating Medium NEXEL CM-020A
C-Pace EM stimulator  IonOptix  EM
Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit Primary - DIFF
Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit Curi Bio Primary - MAINT
DAPI Invitrogen D1306
DMEM, high glucose, GlutaMAX Gibco 10566-016
Dnase Sigma 11284932001
DPBS Gibco 14190-250
Dystrophin antibody  Abcam ab154168
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific 10082147 Must be heat-inactivated
Fibrinogen (Bovine) Sigma E8630
Glutaraldehyde Sigma 354400
Ham's F10 Gibco 11550043
Hemacytometer  Sigma  Z359629
HS-27A Fibroblasts ATCC CRL-2496
Human Skeletal Muscle Myoblasts  Lonza  CC-2580
Luer Lock 0.2 µm syringe filter Corning 431219
Luer Lock 10 mL syringe BH Supplies BH10LL
Mantarray Instrument Curi Bio MANTA-24-B1 System
Mantarray Plate Kits Curi Bio MA-24-SKM-5 Pack of 5 kits
Mantarray stimulation lid  Curi Bio EM
Matrigel (ECM) Corning 356231
Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes NEXEL C-002
Optical Microscope Nikon Ti2E MEA54000
Pan Myosin Heavy Chain antibody  DSHB MF-20
Poly(ethyleneimine) Sigma P3143
ROCK inhibitor StemCell Technologies Y-27632
RPMI Gibco 11875-093
Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) Lonza CC-3245
Standard 24-well plates Greiner M8812  Other manufacturer's plates will not fit
Standard 6-well plates ThermoFisher 140675
Stromal medium (DMEM + 20% FBS)
T175 Filter Flask ThermoFisher 159910
T225 Filter Flask ThermoFisher 159934
Thrombin Sigma T4648
Trypan Blue solution, 0.4% ThermoFisher 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Scientific A1217702
TrypLE Select Enzyme (1x) Thermo Scientific 12563011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
  2. Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
  3. Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
  4. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  5. Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
  6. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  7. Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
  8. Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
  9. Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
  10. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  11. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
  12. Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  13. Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
  14. Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
  15. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  16. Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
  17. Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
  18. Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
  19. Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
  20. Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
  21. Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
  22. Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
  23. Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
  24. Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
  25. Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
  26. Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
  27. Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
  28. Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
  29. Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
  30. Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 194،
اختبار الأدوية قبل السريرية في أنسجة العضلات المهندسة 3D القابلة للتطوير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berry, B. J., Luttrell, S. M.,… More

Berry, B. J., Luttrell, S. M., Moerk, C. T., Macadangdang, J., Perez, J., Gray, K., Ghazizadeh, H., Kharoufeh, S., Nelsen, B., Geisse, N. A. Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues. J. Vis. Exp. (194), e64399, doi:10.3791/64399 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter