Summary
Questo protocollo fornisce metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D e descrive il loro uso nelle modalità di screening preclinico dei farmaci. I metodi descritti utilizzano un sistema di rilevamento magnetico per facilitare la valutazione simultanea di 24 tessuti in parallelo.
Abstract
La modellazione accurata delle condizioni di salute e di malattia in vitro è vitale per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento e terapie. Per le malattie cardiache e del muscolo scheletrico, la forza contrattile e la cinetica costituiscono metriche chiave per valutare la funzione muscolare. Metodi nuovi e migliorati per generare tessuti muscolari ingegnerizzati (EMT) da cellule staminali pluripotenti indotte hanno reso la modellizzazione della malattia in vitro più affidabile per i tessuti contrattili; Tuttavia, fabbricare in modo riproducibile tessuti da colture cellulari sospese e misurare la loro contrattilità è impegnativo. Tali tecniche sono spesso afflitte da alti tassi di guasto e richiedono strumentazione complessa e routine di analisi dei dati personalizzate. Una nuova piattaforma e un nuovo dispositivo che utilizza EMT 3D in combinazione con un test di contrattilità senza etichetta, altamente parallelo e compatibile con l'automazione aggirano molti di questi ostacoli. La piattaforma consente la fabbricazione semplice e riproducibile di EMT 3D utilizzando praticamente qualsiasi sorgente cellulare. La contrattilità tissutale viene quindi misurata tramite uno strumento che misura simultaneamente 24 tessuti senza la necessità di complesse routine di analisi software. Lo strumento può misurare in modo affidabile i cambiamenti di forza del micronewton, consentendo lo screening dei composti dose-dipendenti per misurare l'effetto di un farmaco o di una terapia sulla produzione contrattile. I tessuti ingegnerizzati realizzati con questo dispositivo sono perfettamente funzionanti, generano contrazioni e contrazioni tetaniche sulla stimolazione elettrica e possono essere analizzati longitudinalmente in coltura per settimane o mesi. Qui, mostriamo i dati degli EMT del muscolo cardiaco sotto dosaggio acuto e cronico con sostanze tossiche note, incluso un farmaco (BMS-986094) che è stato estratto dagli studi clinici dopo decessi dei pazienti a causa di cardiotossicità imprevista. Viene inoltre presentata l'alterata funzione del muscolo scheletrico nei tessuti ingegnerizzati in risposta al trattamento con un inibitore della miosina. Questa piattaforma consente al ricercatore di integrare sistemi modello bioingegnerizzati complessi e ricchi di informazioni nel proprio flusso di lavoro di scoperta di farmaci con una formazione o competenze aggiuntive minime richieste.
Introduction
I modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) stanno diventando sempre più attori chiave nella pipeline preclinica per la scoperta e lo sviluppo terapeutico, nonché nella ricerca biologica di base e nella modellizzazione delle malattie 1,2,3,4,5. I tessuti contrattili, come il muscolo cardiaco e scheletrico derivati da iPSCs hanno un grande potenziale per migliorare il potere predittivo degli studi umani in vitro poiché la valutazione diretta della forza contrattile muscolare e della cinetica sono metriche quantitative per studiare la funzione complessiva del tessuto 4,6,7,8. Tipicamente, le misure della forza contrattile sono state ottenute indirettamente mediante tracciamento ottico della deflessione del substrato 9,10 o direttamente mediante l'attacco di cellule/tessuti ad un trasduttore di forza4,11,12. Questi metodi, sebbene accurati, sono intrinsecamente a basso throughput e in genere richiedono operatori altamente qualificati per raccogliere e analizzare i dati.
Lavori precedenti hanno dimostrato che il rilevamento del campo magnetico aggira questi ostacoli e fornisce un metodo alternativo per valutare la funzione muscolare ingegnerizzata simultaneamente attraverso più costrutti tissutali13. La piattaforma di contrattilità 3D Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) si basa su questa tecnologia utilizzando un dispositivo in grado di misurare la contrattilità dei tessuti muscolari ingegnerizzati in modo altamente parallelo che sfrutta la complessità dei modelli cellulari 3D con screening a più alto rendimento14. La piattaforma consente il monitoraggio senza etichetta, quantitativo e in tempo reale della funzione contrattile nei tessuti muscolari cardiaci e scheletrici all'interno o all'esterno di un incubatore di coltura cellulare standard, eliminando la necessità di imaging e analisi contrattile basati su ottica. Questa tecnologia facilita il confronto diretto di linee cellulari sane e malate e consente di misurare l'effetto di un farmaco sui tessuti contrattili, stabilendo dati quantificabili, in vitro, di sicurezza ed efficacia per composti terapeutici nuovi ed esistenti.
I tessuti muscolari 3D ingegnerizzati possono essere fabbricati tra due pali in modo altamente riproducibile utilizzando la piastra di colata a 24 pozzetti con consumabile Mantarray (Figura 1). Un palo è rigido, mentre l'altro palo è flessibile e contiene un piccolo magnete. Quando il costrutto di tessuto si contrae, sposta il palo flessibile e il magnete incorporato. La piastra EMT è posizionata all'interno dello strumento e lo spostamento del palo viene misurato tramite una serie di sensori magnetici su un circuito stampato sotto il supporto della piastra. I cambiamenti misurati nel campo magnetico vengono convertiti in forza contrattile assoluta utilizzando un algoritmo matematico. Lo strumento impiega rapide frequenze di campionamento dei dati per consentire la raccolta di informazioni dettagliate sulla capacità funzionale e la maturità del tipo o dei tipi di cellule da analizzare, tra cui frequenza di contrazione, velocità e tempo di decadimento. Queste misurazioni funzionali possono essere ottenute su tutti i 24 pozzetti contemporaneamente alla piattaforma di rilevamento magnetico o singolarmente e sequenzialmente utilizzando metodi ottici tradizionali.
Questo studio descrive un metodo altamente riproducibile per l'ingegneria del muscolo scheletrico 3D e dei microtessuti cardiaci in un idrogel a base di fibrina. Durante una breve reazione di 80 minuti, la trombina catalizza la conversione del fibrinogeno in fibrina, fornendo un'impalcatura per lo sviluppo delle cellule muscolari in coltura sospesa15. Le cellule stromali aiutano a rimodellare la matrice e i tessuti diventano contrattili mentre le cellule muscolari formano un sincizio all'interno dell'idrogel. La contrattilità di questi tessuti è stata analizzata utilizzando l'approccio del rilevamento magnetico, sia prima che dopo l'esposizione al composto, convalidando questa modalità per l'uso negli studi farmacologici dose-risposta. I mioblasti umani primari da una biopsia di donatore sano sono stati ottenuti commercialmente e coltivati in 2D secondo i protocolli del fornitore. Le cellule sono state espanse utilizzando un mezzo di crescita muscolare scheletrico attraverso tre passaggi per generare un numero di cellule sufficiente per fabbricare tessuti 3D. Le cellule stromali e i cardiomiociti derivati da hiPSC sono stati coltivati secondo il protocollo del fornitore per 3 giorni per consentire il recupero dalla crioconservazione prima di lanciare le cellule nei tessuti. Vengono forniti risultati rappresentativi che illustrano i tipi di set di dati che possono essere raccolti utilizzando la piattaforma di rilevamento magnetico. Vengono inoltre affrontate le insidie comuni associate alla generazione di tessuti ingegnerizzati utilizzando questi metodi.
Protocol
1. Protocollo di coltura cellulare
- Coltura primaria di mioblasti umani
- Diluire la matrice extracellulare (ECM) in un rapporto di 1:100 in 8 mL di terreno DMEM/F12 su ghiaccio.
- Applicare 8 mL di soluzione ECM su un matraccio T175 e incubare a 37 °C per almeno 1 ora prima della semina cellulare, ma non più di 24 ore. Assicurarsi che la soluzione ECM copra l'intero fondo del pallone.
- Aliquote 5 mL del terreno di crescita del muscolo scheletrico ad un tubo conico da 15 ml.
- Scongelare una fiala congelata di cellule (5,0 x 105 mioblasti) a bagnomaria a 37 °C per 2 minuti o fino a quando il ghiaccio non si è appena sciolto. Spruzzare il flaconcino con etanolo al 70% e trasferirlo in un armadio di biosicurezza (BSC).
- Trasferire le celle nel mezzo aliquotato utilizzando un P1000. Non trituricare. Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL del terreno di crescita utilizzando una pipetta P1000 per ottenere una sospensione a singola cellula.
- Lavare il matraccio rivestito di ECM con 15 mL di DPBS. Aspirare DPBS, quindi aggiungere 30 ml del terreno di coltura al pallone.
- Aggiungere 4 mL del mezzo di crescita alle cellule, mescolare e distribuire la sospensione cellulare nel pallone T-175. Assicurarsi che il volume totale sia di 35 ml. Far scorrere delicatamente il matraccio lungo il piano di lavoro verso sinistra e destra 5-6 volte seguito da avanti e indietro 5-6 volte per garantire una distribuzione uniforme delle celle sulla superficie del pallone.
- Introdurre il matraccio T-175 in un incubatore di coltura cellulare a 37 °C e al 5% di CO2. Coltiva le cellule per 3 giorni o fino a quando non raggiungono più del 70% di confluenza, quindi passano le cellule.
- Passaggio di mioblasti umani primari
- Diluire l'ECM in un rapporto di 1:100 in 30 mL di terreno DMEM/F12 su ghiaccio.
- Applicare 10 mL della soluzione ECM a tre matraccio T225 e incubare a 37 °C per almeno 1 ora prima della semina cellulare, ma non più di 24 ore. Assicurarsi che la soluzione ECM copra l'intero fondo del pallone.
- Lavare le celle con 15 ml di DPBS. Aspirare e aggiungere il reagente di dissociazione secondo il protocollo del fornitore.
- Una volta sollevate le cellule, interrompere la reazione secondo il protocollo del fornitore e raccogliere le cellule in un tubo conico. Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL del terreno di crescita utilizzando una pipetta P1000 per ottenere una sospensione a singola cellula.
- Lavare il matraccio rivestito di ECM con 15 mL di DPBS. Aspirare DPBS, quindi aggiungere 40 ml del terreno di coltura a ciascun matraccio T225.
- Aggiungere 14 mL del terreno di crescita alla sospensione cellulare, mescolare e distribuire 5 mL della sospensione cellulare a ciascun matraccio T225. Assicurarsi che il volume totale in ciascun matraccio sia di 45 ml. Far scorrere delicatamente il matraccio lungo il piano di lavoro verso sinistra e destra 5-6 volte seguito da avanti e indietro 5-6 volte per garantire una distribuzione uniforme.
- Introdurre i palloni nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C e al 5% di CO2.
- Cellule di coltura per 2-3 giorni o fino a quando non raggiungono più del 70% di confluenza, e quindi passaggio. Dividere le cellule a 1:3 o 1:4 ad ogni passaggio e seminare tra 3 x 103 e 1 x 104 celle/cm2.
- coltura cardiomiocitaria derivata da hiPSC
- Diluire l'ECM in un rapporto di 1:60 in 12 mL di terreno DMEM/F12 su ghiaccio.
- Applicare 1 mL della soluzione ECM su ciascun pozzetto di due piastre da 6 pozzetti e incubare a 37 °C per almeno 1 ora prima della semina cellulare, ma non più di 24 ore.
- Scongelare una fiala congelata di cardiomiociti a bagnomaria a 37 °C per 2 minuti o fino a quando il ghiaccio non si è appena sciolto.
- Spruzzare il flaconcino con etanolo al 70% e trasferirlo alla BSC.
- Utilizzare una pipetta p1000 per trasferire le celle scongelate in un tubo conico da 50 ml.
- Risciacquare il crioviale vuoto con 1 ml di terreno di placcatura a temperatura ambiente (RT) per recuperare eventuali cellule rimanenti.
- Erogare lentamente 1 mL di mezzo di risciacquo a goccia (una goccia ogni 5 s) nel tubo conico delle cellule nel corso di 90 s. Ruotare continuamente il tubo per mescolare le celle durante l'aggiunta lenta del supporto.
- Aggiungere lentamente 8 mL del mezzo di placcatura utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL alla provetta conica da 50 mL delle cellule.
- Dopo aver erogato tutti i supporti, pipettare delicatamente su e giù 3 volte per mescolare accuratamente le cellule. Contare le cellule usando un ematocitometro e tripano blu.
- Centrifugare le celle nel tubo conico da 50 mL a 300 x g per 3 minuti.
- Dopo che le cellule sono state pellettizzate, aspirare il surnatante.
- Utilizzare una pipetta p1000 per trasferire 1 mL del mezzo di placcatura al tubo e rompere delicatamente il pellet mediante pipettaggio lento su e giù 3-5 volte. Risospendere le celle con un mezzo di placcatura aggiuntivo.
- Seminare tra 2-4 x 10 6 cellule per pozzetto di una piastra a6 pozzetti in 2 ml del mezzo di placcatura.
- Lavare le piastre a 6 pozzetti rivestite con ECM con DPBS (2 ml/pozzetto).
- Pipettare 2 ml di sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Spostare delicatamente le piastre lungo il piano di lavoro verso sinistra e destra 5-6 volte seguite da avanti e indietro 5-6 volte per garantire una distribuzione uniforme delle celle sulle superfici delle piastre.
- Introdurre la piastra nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C e al 5% di CO2.
- Ripetere i passaggi 1.3.3-1.3.16 per tutti i flaconcini delle cellule da scongelare.
- Passare a 3-5 ml (a seconda della linea cellulare e della densità) del terreno di mantenimento il giorno successivo alla placcatura, quindi cambiare il terreno a giorni alterni. Cellule di coltura per 3-4 giorni prima di fondere nei tessuti 3D.
- Coltura cellulare stromale
- Applicare 30 mL della soluzione ECM su un matraccio T175 e incubare a 37 °C per almeno 1 ora prima della semina cellulare, ma non più di 24 ore.
- Aliquote 5 mL del mezzo cellulare stromale in un tubo conico da 15 ml.
- Scongelare una fiala congelata di cellule stromali a bagnomaria a 37 °C per 2 minuti o fino a quando il ghiaccio si è appena sciolto.
- Spruzzare il flaconcino con etanolo al 70% e trasferirlo alla BSC.
- Utilizzare una pipetta p1000 per aggiungere lentamente 1 mL del mezzo cellulare stromale alle cellule scongelate nel flaconcino.
- Trasferire la sospensione cellulare dal flaconcino al mezzo di disgelo rimanente nel tubo conico. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 ml per miscelare le cellule. Pipetta su e giù 3 volte.
- Contare le cellule usando un ematocitometro e tripano blu. Non ruotare le celle.
- Lavare il matraccio T175 rivestito di ECM con 15 mL di DPBS.
- Trasferire le cellule stromali nel matraccio ad una densità di 3-4 x 103 cellule/cm2. Far scorrere delicatamente il matraccio lungo il piano di lavoro verso sinistra e destra 5-6 volte seguito da avanti e indietro 5-6 volte per garantire una distribuzione uniforme delle celle sulla superficie del pallone.
- Cambiare il terreno il giorno successivo con 45 ml di mezzo cellulare stromale riscaldato. Coltiva le cellule per 3-4 giorni prima di fondere nei tessuti 3D.
2. Preparazione del materiale
- Fibrinogeno
NOTA: Quando si ricostituisce il fibrinogeno, fare attenzione a massimizzare la quantità di superficie su cui viene stratificata la polvere di fibrinogeno. In questo protocollo, la quantità di diluente utilizzata è stata ottimizzata in base alle dimensioni del contenitore utilizzato, ovvero è stato utilizzato un diluente sufficiente a coprire il fondo del piatto. Ad esempio, strato 0,5 g di fibrinogeno su 10 ml di PBS in un piatto da 100 mm piuttosto che in una provetta da centrifuga da 50 ml. Massimizzare la quantità di superficie del diluente ridurrà la quantità di tempo necessaria per ricostituire il fibrinogeno e ridurre il potenziale aggregazione di proteine.- Ricostituzione
- Trasferire 10 mL di PBS in una capsula di coltura cellulare da 100 mm e riscaldarli a 37 °C in un incubatore di colture cellulari.
- Versare 0,5 g di fibrinogeno in polvere su tutta la superficie del PBS caldo e mantenere a 37 °C fino a completa dissoluzione del fibrinogeno. Questo non dovrebbe richiedere più di 2 ore. La polvere di dissoluzione può essere fatta roteare delicatamente, ma non scuotere vigorosamente il piatto.
- Filtrazione sterile
- Una volta che la polvere si è completamente sciolta, far passare la soluzione attraverso un filtro da 100 μm e raccoglierla in un tubo conico da 50 ml per rimuovere eventuali grumi di fibrinogeno gelificato.
- Versare la soluzione filtrata in una siringa da 10 ml ricoperta da un filtro da 0,2 μm. Spingere la soluzione attraverso il filtro e raccoglierla in un nuovo tubo conico da 50 ml. Potrebbe essere necessario cambiare il filtro più di una volta per sterilizzare tutti i 10 ml di soluzione.
- Aliquot 300 mL di fibrinogeno sterile in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -20 °C. Scongelare le aliquote sul ghiaccio o a 4 °C secondo necessità. Evitare ripetuti congelamenti/disgeli.
- Ricostituzione
- Trombina
- Aggiungere 6 mL di PBS e 4 mL di diH2O direttamente in un flaconcino di trombina (1 KU) per ottenere una soluzione madre di trombina da 100 U/ml.
- Filtrare con un filtro da 0,2 μm, aliquota e conservare a -20 °C in provette di microcentrifuga di plastica da 1,5 ml come adsorbimento della trombina al vetro. Evitare ripetuti congelamenti/disgeli.
- Soluzione di poli(etilenimmina) (PEI)
ATTENZIONE: PEI è tossico. Utilizzare DPI appropriati come indicato dal fabbricante.
NOTA: PEI viene fornito come soluzione al 50% p/v. È altamente viscoso e difficile da pipettare. Fare una soluzione allo 0,1% da una soluzione madre al 10% piuttosto che direttamente dalla soluzione al 50% p/v.- Misurare 5 mL di soluzione PEI al 50% p/v in un tubo conico da 50 ml.
- Aggiungere 20 ml di diH2O e mescolare fino a ottenere una soluzione madre al 10%. Questa soluzione madre altamente concentrata non può essere filtrata sterile.
- Per ottenere una soluzione allo 0,1% per la coltura cellulare, aggiungere 5 ml di 10% di brodo a 495 mL diH2O. Filtro sterile utilizzando un matraccio filtrante da 500 mL e conservare a RT per non più di 1 settimana.
- Glutaraldeide
ATTENZIONE: La glutaraldeide è tossica. Utilizzare DPI appropriati come indicato dal fabbricante.- La glutaraldeide viene fornita come soluzione al 25%. Per ottenere una soluzione allo 0,01%, aggiungere 40 μL a 99,6 mL di diH2O. Filtro sterile e conservare a 4 °C per non più di 1 settimana.
- Post preparazione
- Posizionare il kit di fusione del tessuto di consumo all'interno di una cappa di coltura sterile. Il kit di colata contiene un coperchio, un reticolo di pali contenente 24 coppie di pali (una coppia di pali per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) e un fondo specializzato a 24 pozzetti contenente 24 pozzetti di colata. Ogni pozzetto di colata contiene una trincea sul fondo del pozzetto per contenere i componenti della cellula / idrogel e modellarli in un tessuto a forma di tubo mentre l'idrogel polimerizza (Figura 1B).
- Riempire i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con 1,5 ml / pozzetto di una soluzione PEI allo 0,1% e posizionare i pali nella piastra in modo che le punte di ciascuna coppia di pali siano sommerse. Lasciare riposare per 10 minuti. PEI depositerà una carica positiva sui pali in modo che le proteine nell'idrogel si attacchino saldamente ai pali durante la colata dei tessuti.
- Riempire i pozzetti di una seconda piastra a 24 pozzetti con 2 ml/pozzetto di diH2O sterile e trasferire i pali. Lasciare riposare per 1 minuto.
- In una terza piastra da 24 pozzetti, riempire i pozzetti con 1,5 ml / pozzetto di glutaraldeide (GA) allo 0,01% e trasferire i pali. Lascia riposare per 30 minuti. GA fisserà la carica positiva dal PEI ai pali.
- Mentre i pali si trovano nella glutaraldeide, aspirare i pozzetti diH 2 O, lavare con 2 ml / pozzetto di diH 2 O sterile, aspirare e riempire con2ml / pozzetto di diH2O sterile. Una piastra fresca da 24 pozzetti può essere utilizzata al posto del risciacquo.
- Allo scadere di 30 minuti, trasferire i pali nei 2 ml/pozzetto didiH 2O sterile. Lasciare riposare per 1 minuto.
- Aspirare il diH 2 O e aggiungere altri2mL/pozzetto di diH2O sterile. Lasciare riposare per 5 minuti.
- Trasferire i pali su una piastra a 24 pozzetti per asciugare (circa 15 minuti).
- Una volta asciutto, rimontare il kit di fusione. Parafilmare i bordi per sigillare il coperchio e la piastra insieme, quindi conservare a 4 °C per un massimo di 72 ore prima della semina cellulare. Tempi di conservazione più lunghi sono probabilmente possibili, ma non sono stati testati.
3. Protocollo di fusione dei tessuti
- Preparazione della piastra di colata
- Pre-raffreddare il kit di colata dei tessuti a 4 °C.
- Trasferire un secchio di ghiaccio nella BSC. Su ghiaccio, preparare 50 μL di soluzione di trombina (3 μL di brodo di trombina + 47 μL di mezzo EMT) per pozzetto da colare.
NOTA: vedere il passaggio 3.2.1 per i dettagli sul supporto EMT. - Rimuovere il kit di colata refrigerato dal frigorifero e posizionarlo su un blocco freddo o ghiaccio all'interno della cappa di coltura cellulare. Posare la piastra di colata piatta sul ghiaccio e spostare il reticolo del palo dalla piastra di colata a una nuova piastra sterile a 24 pozzetti.
- Pipettare 50 μL di soluzione di trombina in ciascun pozzetto prerefrigerato della piastra di colata.
- Rimontare il kit e rimetterlo in frigorifero fino al momento necessario per la fusione dei tessuti. Gettare i tessuti entro 3 ore dalla trombina oltre ai pozzetti.
- Preparazione cellulare
- Preparare il mezzo base EMT, il filtro sterile e lasciare in ghiaccio.
NOTA: Se il mezzo di fusione specifico della cellula contiene FBS, utilizzare FBS inattivato dal calore in quanto potrebbe interagire con il fibrinogeno e causare la polimerizzazione prematura.- Preparare il mezzo EMT cardiaco: aggiungere 500 ml di terreno RPMI, 10 ml di B27 e 2,5 g di acido aminocaproico. (Facoltativo) Aggiungere 10 mM di inibitore ROCK (aggiungere solo al mezzo EMT utilizzato per la colata dei tessuti e non all'intero volume di 500 ml).
- Preparare il terreno EMT scheletrico: aggiungere 50 ml di terreno F10 e 0,25 g di acido aminocaproico (ACA) per EMT primarie e 0,1 g di ACA per EMT derivati da iPSC.
- Riscaldare il reagente di dissociazione per coltura cellulare a 37 °C. Riscaldare un volume uguale di mezzo EMT per diluire il reagente di dissociazione.
NOTA: È fondamentale che la proteasi utilizzata sia completamente inattivata. La proteasi attiva interferirà con la formazione del tessuto 3D e la post-aderenza. - Lavare le celle (Figura 1A) con PBS. Utilizzare 2 ml/pozzetto per una piastra a 6 pozzetti. Utilizzare 6 ml, 15 ml e 15 ml per un piatto da 100 mm, un matraccio T175 e un matraccio T225, rispettivamente.
- Aggiungere il reagente di dissociazione di grado di coltura cellulare riscaldato per sollevare le cellule e incubare a 37 °C per 5 minuti o fino a quando le cellule non si sono sollevate. Per le colture cardiache, utilizzare il reagente di dissociazione 10x. Per le cellule stromali e i mioblasti muscolari scheletrici, utilizzare un reagente di dissociazione 1x. Utilizzare 1 mL/pozzetto per una piastra a 6 pozzetti, 3 ml per un piatto da 100 mm, 8 mL per un matraccio T175 e 10 mL per un matraccio T225.
- Controlla le colture ogni 2-3 minuti toccando il lato del piatto.
- Una volta che le cellule si sono sollevate, trasferirle in un tubo conico da 50 mL e triturarle con una pipetta P1000 per garantire una sospensione a cella singola.
- Lavare la piastra o il matraccio con un mezzo EMT aggiuntivo per raccogliere le celle rimanenti e aggiungerle al tubo conico. Utilizzare 1 mL/pozzetto del mezzo EMT per una piastra a 6 pozzetti, 2 mL per un piatto da 100 mm, 5 mL per un matraccio T175 e 5 mL per un matraccio T225.
- Triturare le cellule per garantire una sospensione a singola cellula.
- Aggiungere il mezzo EMT per terminare il processo di dissociazione, quindi prelevare campioni delle sospensioni cellulari per la conta cellulare. Utilizzare 1 mL/pozzetto per una piastra a 6 pozzetti, 3 ml per un piatto da 100 mm, 8 mL per un matraccio T175 e 10 mL per un matraccio T225.
- Ruotare le celle a 200 x g per 4 minuti. Eseguire la conta cellulare utilizzando un ematocitometro e tripano blu mentre le sospensioni vengono centrifugate.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di terreno base EMT per rimuovere il reagente di dissociazione residuo.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 4 minuti. Aspirare il surnatante e preparare le sospensioni cellulari alle densità appropriate.
- Aumentare la longevità e la funzione delle EMT muscolari scheletriche 3D con l'aggiunta di proteine ECM del 10%-20% nel mezzo EMT14,16.
- Cardiomiociti derivati da cellule staminali seme e loro cellule stromali rispettivamente a 5 x 10 5 cellule e7,5 x 104 cellule per costrutto tissutale. Seminare i mioblasti del muscolo scheletrico a 7,5 x 105 cellule per costrutto tissutale.
- Tessuti cardiaci
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule stromali ad una densità di 2,5 x 106 cellule per ml in mezzo EMT e metterle su ghiaccio. Utilizzare 30 μL di questa sospensione per EMT.
- Aspirare il surnatante e risospendere i CM ad una densità di 8,3 x 106 cellule per mL in mezzo EMT e metterli su ghiaccio. Utilizzare 60 μL di questa sospensione per EMT.
- Tessuti muscolari scheletrici
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule muscolari scheletriche ad una densità di 8,3 x 106 cellule per mL in mezzo EMT e metterle su ghiaccio. Utilizzare 90 μL di questa sospensione per EMT.
- Calcolare i volumi di ciascuna soluzione cellulare necessari per costituire il numero desiderato di tessuti (ad esempio, 60 μL delle CM preparate e 30 μL delle cellule stromali preparate o 90 μL delle cellule muscolari scheletriche per EMT).
- Pipettare i volumi calcolati delle celle in un tubo conico da 15 ml.
- Aggiungere 10 μL di fibrinogeno per EMT alla sospensione cellulare e tenerlo in ghiaccio.
- Reagenti totali e volumi cellulari per EMT: assicurarsi che ogni EMT abbia 90 μL di cellule, 10 μL di fibrinogeno e 50 μL di soluzione di trombina.
- Preparare il mezzo base EMT, il filtro sterile e lasciare in ghiaccio.
- Colata di tessuti
- Trasferire il kit di fusione del tessuto in una cappa di coltura cellulare e rimuovere il coperchio (il reticolo del palo contenente montanti flessibili e rigidi deve rimanere sulla piastra di fusione; Figura 1B). Mantenere la piastra di fusione con il reticolo post steso piatto sul ghiaccio.
- Mescolare la miscela cellula/fibrinogeno e aspirare 100 μL con una pipetta P200.
- Aggiungere 100 μL della miscela ai pozzetti preparati con 50 μL di soluzione di trombina e triturare 5 volte per mescolare bene. Non spingere la pipetta oltre il primo stop e rimuovere la punta dopo la triturazione per evitare di creare bolle.
- In questa fase, e fino a quando il reticolo del palo non è pronto per essere sollevato dalla piastra di colata (fase 3.3.10), qualsiasi movimento del reticolo può compromettere l'attacco a lungo termine del tessuto ai pali. Tenere contemporaneamente il reticolo e la piastra del pozzo di lancio usando il dito puntatore e il pollice di una mano per evitare qualsiasi movimento del reticolo.
- Ripetere con una punta P200 fresca per ogni tessuto fino a quando tutti i tessuti sono colati. Mescolare la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL prima di colare ogni tessuto mentre le cellule si depositano rapidamente.
- Trasferire con attenzione il kit seminato sull'incubatore, assicurandosi di non spostare il reticolo. Il movimento del reticolo dopo la semina può comportare una diminuzione del successo nel trasferimento dei tessuti fuori dai pozzetti di colata. Incubare a 37 °C per 80 minuti, indipendentemente dal tipo di cellula. Questo inizierà la polimerizzazione dell'idrogel e consentirà alle proteine di attaccarsi ai pali.
- Nel frattempo, preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con 2 ml / pozzetto del mezzo EMT per i tessuti cardiaci. Se lo si desidera, può essere aggiunto un inibitore di 10 mM ROCK al mezzo EMT. Incubare la piastra a 37 °C per riscaldare il mezzo.
- Preparare 2 ml/pozzetto di terreno di coltura contenente 5 g/L di acido aminocaproico (0,2 mm sterile filtrato) per i tessuti muscolari scheletrici primari o 2 g/L di ACA per EMT derivate da iPSC. Incubare la piastra a 37 °C per riscaldare il mezzo.
- Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 1 mL del mezzo EMT sul bordo dei pozzetti di colata e incubare per altri 10 minuti a 37 °C, indipendentemente dal tipo di cellula. Questo rimuoverà l'idrogel dai bordi del pozzetto di colata e consentirà un facile trasferimento del tessuto.
- Dopo 10 minuti, sollevare con attenzione il reticolo post e trasferire i tessuti dalla piastra di colata a una piastra a 24 pozzetti preparata con mezzo (Figura 1C). Riportare le piastre con i tessuti nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C.
- Manutenzione
- Dopo 24 ore, trasferire i tessuti colati in una piastra fresca da 24 pozzetti con 2 ml/pozzetto del mezzo EMT (senza l'inibitore ROCK se incluso) e incubare a 37 °C. Per le cellule muscolari scheletriche, passare dal mezzo di crescita al mezzo di differenziazione per promuovere la fusione dei mioblasti.
- Trasferire i tessuti cardiaci in pozzetti freschi con 2 ml/pozzetto del mezzo EMT ogni 2-3 giorni.
- Trasferire i tessuti muscolari scheletrici in pozzetti freschi con 2 ml/pozzetto di terreno di differenziazione contenente 5 g/L di acido aminocaproico (0,2 mm sterile filtrato) ogni 2-3 giorni. Utilizzare 2 g/L di ACA per i tessuti derivati da iPSC.
- Per aiutare nei cambiamenti medi, trasferire il reticolo post su una nuova piastra a 24 pozzetti piuttosto che cambiare il mezzo nella stessa piastra per evitare di danneggiare i tessuti 3D. Preparare una seconda piastra a 24 pozzetti con il mezzo EMT e trasferire i tessuti sul terreno fresco. Conservare il piatto con il vecchio mezzo accanto alla coltura attiva da utilizzare per il prossimo cambiamento del mezzo. Trasferire il reticolo post avanti e indietro tra le due piastre durante il periodo di coltura. In alternativa, utilizzare un piatto fresco per ogni cambio di mezzo.
- Misurare la contrazione EMT tramite tracciamento ottico della post deflessione (Figura 1D) o hardware di rilevamento magnetico13,14. I tessuti cardiaci iniziano a battere spontaneamente dopo 3-4 giorni in coltura. I tessuti muscolari scheletrici sono tipicamente contrattili con stimolazione del campo elettrico dopo 7 giorni in coltura.
Representative Results
Le cellule sono state gettate in tessuti muscolari ingegnerizzati nella piastra consumabile a 2 montanti (Figura 1). Gli EMT di successo appariranno uniformi e la matrice sarà distribuita uniformemente tra i pali (Figura 2A). La matrice dovrebbe anche avvolgere entrambi i pali, producendo punti di ancoraggio equivalenti per il tessuto. I fallimenti nella fusione sono rari con questo metodo e di solito sono evidenti con un'ispezione visiva. La produzione di EMT infruttuosa può variare da guasti catastrofici, come il distacco di tessuto dai pali (Figura 2B) a difetti strutturali più sottili, come bolle d'aria e attaccamento allentato ai pali (Figura 2C, D). I tessuti con difetti minori possono ancora essere vitali, ma i dati di questi tessuti dovrebbero essere esaminati attentamente per assicurarsi che siano paragonabili agli EMT non compromessi. Ad esempio, le bolle d'aria all'interno di un EMT possono essere spremute mentre il tessuto si compatta nel tempo, rendendo un costrutto completamente funzionale senza carenze contrattili. Questi tessuti devono essere valutati caso per caso, tuttavia, poiché la posizione delle bolle d'aria può influenzare il recupero funzionale. Le bolle d'aria generate sui pali, ad esempio, possono influenzare l'attaccamento dei tessuti, che potrebbe impedire l'aderenza a lungo termine al palo.
I tessuti iniziano a compattarsi entro le prime 24 ore quando le cellule rimodellano la matrice all'interno dell'idrogel (Figura 3). La compattazione è un processo graduale e di solito procede nelle prime 2-4 settimane di coltura. Nel complesso, la compattazione tissutale è coerente tra repliche tecniche e biologiche (Figura 4). È normale che alcune linee cellulari compattano la matrice più di altre man mano che i tessuti maturano nel tempo. La percentuale di cellule miogeniche all'interno di un costrutto influenza il tasso e il grado complessivo di compattazione EMT. Il contenuto miogenico totale per le linee cellulari muscolari cardiache e scheletriche dovrebbe essere superiore all'80% per ridurre al minimo la variazione tra i tessuti ingegnerizzati. Ciò è particolarmente importante quando si confrontano le forze contrattili e la cinetica tra le linee cellulari.
Entro i primi giorni dopo il casting, i cardiomiociti iniziano a battere spontaneamente in coltura, piegando ritmicamente il palo flessibile ad ogni contrazione muscolare. I costrutti muscolari scheletrici si contraggono in risposta alla stimolazione elettrica entro il giorno 7 dopo l'inizio della differenziazione. La stimolazione del campo è stata applicata ai tessuti muscolari scheletrici tramite uno stimolatore esterno collegato a un coperchio personalizzato dell'elettrodo a 24 pozzetti. Il coperchio, fabbricato con una coppia di elettrodi di carbonio per ogni pozzetto, si trova sopra la piastra di tessuti a 24 pozzetti, stimolando simultaneamente ogni EMT per indurre contrazioni muscolari. I tessuti sono stati stimolati utilizzando uno stimolo a 10 V per durate di impulso di 10 ms a 1 Hz durante le misurazioni funzionali. I tessuti contrattili indicano mioblasti scheletrici che si sono fusi, formando miotubi completi di sarcomeri funzionali e macchinari contrattili. La colorazione EMT scheletrica positiva per la catena pesante della miosina (MyHC) e la distrofina è localizzata sulla membrana del miotubo rivelando una classica forma ad anello nell'analisi immunoistochimica in sezione trasversale (Figura 5). Una volta che gli EMT sono funzionali, la contrattilità può essere misurata quotidianamente nello strumento di rilevamento magnetico, tracciando la forza e la cinetica mentre i costrutti si sviluppano e maturano nel tempo. Sia i tessuti muscolari cardiaci che quelli scheletrici rimangono contrattili per settimane o mesi in coltura 3D (Figura 6) e possono essere utilizzati per una vasta gamma di studi di contrattilità.
L'approccio di rilevamento magnetico può essere utilizzato per misurare simultaneamente gli effetti acuti e cronici di cardiotossici strutturali, come la doxorubicina (Figura 7) e BMS-986094 (Figura 8), nonché altri farmaci che influenzano la contrattilità muscolare. Possono essere utilizzati anche metodi di tracciamento ottico per il rilevamento della contrazione, ma è necessario prestare attenzione quando si studiano gli effetti acuti dei farmaci poiché le misurazioni devono essere prese in sequenza. La longevità prolungata degli EMT cardiaci e scheletrici nella coltura 3D consente studi farmacologici a lungo termine in questi tessuti. Ciò consente agli utenti di esplorare gli effetti del dosaggio ripetuto, nonché l'esposizione continua a lungo termine a composti che possono mostrare effetti cardiotossici nel tempo come accade con la doxorubicina. La doxorubicina (dox) è un farmaco chemioterapico anti-cancro17. La quantità di farmaco somministrato ai pazienti varia a seconda del tipo di cancro, dell'età del paziente, dell'altezza e del peso del paziente, nonché di altri fattori. Per questo motivo, è importante testare l'effetto del dox in una vasta gamma di concentrazioni e programmi di consegna. Qui, gli EMT cardiaci sono stati trattati nel corso di 27 giorni con tre concentrazioni separate (0,1 μM, 1 μM e 10 μM) di dox (Figura 7). I gruppi sono stati ulteriormente stratificati trattando EMT ad ogni concentrazione con un trattamento in bolo o una somministrazione continua con un cambiamento medio ogni 72 ore. I pozzi trattati in bolo di dox sono stati esposti al farmaco in tre punti temporali separati, consentendo il recupero tra un dosaggio e l'altro. Le due dosi più alte di bolo e l'esposizione continua hanno mostrato una cessazione immediata e prolungata della generazione di forza contrattile durante lo studio. Le concentrazioni medie e più basse hanno avuto effetti variabili sui tessuti, a seconda del metodo di somministrazione. Nella concentrazione più bassa del farmaco, il gruppo bolo non ha mostrato alcuna differenza rispetto ai controlli. Tuttavia, la forza contrattile è diminuita dopo 2 settimane di esposizione continua. La concentrazione di fascia media del farmaco ha avuto un effetto interessante. Mentre il dosaggio continuo ha ridotto la forza nei primi due giorni di trattamento ed è durato per tutto l'esperimento, il gruppo in bolo ha mostrato un recupero della forza contrattile ai livelli di controllo quando il farmaco è stato lavato dopo 3 giorni. Tuttavia, il secondo bolo del farmaco ha causato una completa cessazione della forza, seguita da nessun recupero (Figura 7), indicando che il dosaggio ripetuto a questa concentrazione può avere un effetto cardiotossico nei pazienti trattati con questo farmaco. L'ampia portata di questo studio, sia nel tempo che in condizioni sperimentali, evidenzia l'utilità dei tessuti ingegnerizzati 3D nello screening della tossicità, poiché rimangono contrattili e reattivi all'esposizione chimica per lunghi periodi di tempo, consentendo studi farmacologici a lungo termine all'interno di un singolo set di tessuti muscolari. Ciò facilita non solo l'identificazione dei composti che possono avere un effetto cardiotossico con l'esposizione cronica, ma anche la rilevazione di potenziali tempi cardiotossici di somministrazione.
I test di tossicità in vitro nei tessuti muscolari umani ingegnerizzati sono un modo per aiutare a mantenere i pazienti umani al sicuro negli studi clinici. BMS-986094 è un inibitore della nucleotide polimerasi (NS5B) usato per trattare l'epatite C. Il farmaco era in fase di sviluppo clinico II quando Bristol-Myers Squibb ha interrotto lo sviluppo a causa di diversi casi di insufficienza cardiaca inaspettata nei pazienti18,19. Qui, BMS-986094 è stato applicato agli EMT cardiaci per verificare se i tessuti muscolari ingegnerizzati in 3D svilupperebbero una reazione cardiotossica al farmaco (Figura 8). Sono state applicate tre diverse concentrazioni del farmaco e i tessuti sono stati monitorati per 13 giorni. La forza contrattile è diminuita con l'aggiunta del farmaco in modo dose-dipendente (Figura 8A). Anche la frequenza delle contrazioni è stata significativamente influenzata poiché la frequenza di battito è rallentata e alla fine si è fermata come previsto con l'esposizione continua al composto cardiotossico (p < 0,05, Figura 8B). Questi risultati dimostrano come i tessuti muscolari umani ingegnerizzati in 3D possono essere utilizzati per facilitare l'immissione sul mercato di nuovi farmaci e segnalare composti che alla fine falliscono a causa della cardiotossicità. Inoltre, questa tecnologia potrebbe potenzialmente salvare vite esponendo farmaci pericolosi prima che vengano immessi nei pazienti negli studi clinici.
La capacità di misurare l'effetto di farmaci acuti e cronicamente applicati sul tessuto contrattile umano è un primo passo fondamentale quando si studiano le terapie per la sicurezza e l'efficacia. È importante sapere, tuttavia, che la concentrazione di farmaci applicati è fisiologicamente rilevante e appropriata per i test in vitro . I tessuti muscolari scheletrici sono stati utilizzati per stabilire un valore IC50 per il 2,3-butanedione monoxima (BDM) in una curva dose-risposta completa. Questo farmaco è un inibitore ATPasi ben caratterizzato del muscolo scheletrico miosina-II20. Il BDM inibisce le contrazioni muscolari impedendo la formazione di ponti incrociati della miosina con il filamento di actina nei sarcomeri21. I risultati mostrati qui rivelano una diminuzione dose-dipendente della forza assoluta quando il farmaco viene applicato e un completo recupero della forza contrattile quando il farmaco viene lavato, indicando che l'effetto transitorio sta prevenendo le contrazioni muscolari e non semplicemente uccidendo le cellule all'interno del tessuto (Figura 9A). Inoltre, è stata misurata una curva dose-risposta completa tra le sette concentrazioni esaminate, stabilendo un IC50 di 3,2 mM in questi microtessuti umani (Figura 9B).
Figura 1: Colata EMT nella piastra a 24 pozzetti consumabile Mantarray a 2 montanti . (A) Le cellule miogeniche e stromali sono state coltivate su superfici 2D prima della fusione dei tessuti. (B) Le cellule vengono sollevate da superfici 2D e mescolate insieme con proteine della matrice extracellulare per formare idrogel nei singoli pozzetti di colata a piastre mostrati nel riquadro. (C) Piastra a 24 pozzetti contenente tessuti ingegnerizzati in ogni pozzetto. (D) Tessuti rappresentativi che mostrano muscoli ingegnerizzati rilassati e contratti, confrontando lo spostamento del palo magnetico (barre verdi). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Fusione EMT riuscita e non riuscita . (A) Tessuto muscolare ingegnerizzato ideale 24 ore dopo il casting uniformemente compattato attorno ai montanti con composizione omogenea di cellule/matrice in tutto il tessuto. (B) EMT fallito che mostra il distacco dell'idrogel dal palo flessibile. (C) EMT contenente bolle d'aria in tutto il tessuto. (D) Deposizione di tessuto diseguale attorno ad entrambi i pali. Il tessuto è liberamente ancorato al palo flessibile su un lato. Le barre della scala sono 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Compattazione nel tessuto muscolare ingegnerizzato nel tempo. (A) Costrutto EMT mostrato 1 giorno dopo la fusione. I tessuti vengono trasferiti nel mezzo di differenziazione, a partire dal giorno 0 della fusione cellulare e della compattazione dell'idrogel. (B-E) Lo stesso EMT dal giorno 7 al giorno 21 mostra una lunghezza complessiva leggermente più corta tra i due pali nel tempo e una larghezza inferiore se misurata attraverso la sezione centrale dell'EMT. Le barre della scala sono 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Diametro EMT nel tempo. Quattro piastre di tessuti sono state monitorate per 21 giorni, confrontando il diametro EMT durante la compattazione. Ogni tessuto è stato misurato attraverso la sezione centrale ogni settimana utilizzando la microscopia ottica. I punti temporali mostrano dimensioni EMT coerenti tra le piastre. La compattazione massima viene raggiunta al giorno 21 quando il rimodellamento della matrice viene stabilizzato. La tabella mostra la deviazione standard (% del totale) della compattazione all'interno di ciascuna piastra di tessuti e la deviazione media per tutte le piastre. Le barre colorate sono piatti singoli. Le barre di errore sono SD di EMT all'interno delle piastre. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Immunoistochimica dei tessuti muscolari scheletrici ingegnerizzati. Gli EMT sono stati fissati il giorno 10 della cultura e incorporati nella paraffina. Sezioni trasversali sottili (7 μm) sono state colorate con anticorpi contro la catena pesante della miosina e la distrofina prima dell'imaging. Verde = MyHC, rosso = Distrofina, blu = DAPI. L'ingrandimento dell'obiettivo è 40X; La barra di scala è 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Forza contrattile nei tessuti muscolari ingegnerizzati nel tempo. (A) Forza di contrazione assoluta media misurata dagli EMT cardiaci dal giorno 7 al giorno 63 in coltura; n = 3 per gruppo. (B) Forza di contrazione assoluta media negli EMT scheletrici derivati da una linea cellulare primaria dal giorno 7 al giorno 53 in coltura; n = 3. Le barre di errore sono SD per entrambi i grafici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Trattamento acuto e cronico con doxorubicina nel tessuto muscolare ingegnerizzato. Tre concentrazioni di dose separate di dox, 0,1 μM, 1 μM e 10 μM, sono state somministrate in bolo o somministrate continuamente ai tessuti muscolari ingegnerizzati nel corso di 27 giorni. Le dosi in bolo del farmaco sono state aggiunte ai cambiamenti dei media nei giorni 0, 12 e 24, notate dalle frecce verdi sull'asse X. Il farmaco è stato aggiunto ai media ad ogni cambio di supporto per il dosaggio continuo, notato dalle frecce nere e verdi sull'asse X. La variazione percentuale di forza rispetto ai valori basali (pre-trattamento farmacologico) è sull'asse Y e il tempo in giorni di trattamento è sull'asse X. Arancione chiaro = controllo continuo DMSO, arancione scuro = controllo del bolo DMSO, verde chiaro = 0,1 μM dox continuo, verde scuro = 0,1 μM dox bolo, azzurro = 1 μM dox continuo, blu scuro = 1 μM Dox bolo, giallo chiaro = 10 μM dox continuo, giallo scuro = 10 μM dox bolo. Le barre di errore sono SD; n = 3 per condizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Trattamento cronico con BMS-986094 nel tessuto muscolare ingegnerizzato. Gli EMT sono stati trattati con BMS-986094 da 0,4 μM (verde), 2 μM (blu scuro) e 10 μM (blu chiaro) per 13 giorni. (A) La forza di contrazione contrattile (asse Y) diminuisce a tutte le concentrazioni di farmaco nei primi 2 giorni, mentre i tessuti di controllo nel DMSO continuano a diventare più forti nel tempo (asse X). (B) La frequenza del battito cardiaco, o frequenza di contrazione, cessa in modo simile alla dose-dipendente in tandem con una cessazione della forza contrattile mostrata nel grafico A. I tessuti di controllo in DMSO (grigio) mantengono una frequenza di battito regolare per tutta la durata dell'esperimento. Le barre di errore sono SD; n = 3 per condizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Dose-risposta al BDM nei tessuti muscolari scheletrici ingegnerizzati . (A) La forza assoluta di contrazione diminuisce in modo dose-dipendente quando le EMT derivate da cellule primarie sono esposte a 2,3-butanedione monoxima (BDM) il giorno 16 in coltura 3D. La forza assoluta di contrazione ritorna ai valori vicini al basale quando il farmaco viene lavato. (B) La forza assoluta di contrazione normalizzata ai valori basali diminuisce in modo dose-dipendente quando esposta al BDM producendo una curva dose-risposta completa e un valore IC50 ; n = 4 per dose. Le barre di errore sono SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Questo studio descrive i metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D all'interno di un kit di fusione consumabile da 24 pozzetti. Seguendo questi metodi, è possibile ottenere costantemente una gamma completa di 24 tessuti senza errori di fusione per il successivo screening farmacologico. Le considerazioni critiche per ottenere un tale risultato sono garantire che durante la colata tutte le fasi vengano eseguite su ghiaccio per prevenire la polimerizzazione prematura degli idrogel, la rimozione del reagente di dissociazione cellulare prima della fusione tissutale, la miscelazione accurata della cellula e della sospensione di idrogel per ciascun tessuto, la sostituzione delle punte delle pipette tra i tessuti e l'uso di FBS inattivato dal calore (se utilizzato). Inoltre, è importante assicurarsi che il reticolo del palo non venga spostato una volta iniziata la colata e venga trasferito delicatamente una volta che si sono formati gli idrogel.
Le principali modifiche includono l'uso di diversi tipi di cellule per ottenere EMT cardiaci rispetto a quelli scheletrici e il drogaggio di idrogel con concentrazioni variabili di proteine di membrana basale per promuovere la maturazione cellulare e la stabilità dei tessuti. Gli effetti benefici di tale drogaggio devono essere testati caso per caso, ma è stato dimostrato che migliorano i risultati funzionali e la longevità dei tessuti in determinate circostanze14,16,22. È anche interessante notare che le densità cellulari elencate sono una guida e potrebbero dover essere ottimizzate per diverse linee cellulari. Composizioni alternative di idrogel potrebbero anche essere considerate come un mezzo per modificare le proprietà strutturali e funzionali degli EMT raggiunti23,24,25. Il microambiente muscolare nativo contiene anche tipi cellulari di supporto per promuovere la vascolarizzazione, l'innervazione e la deposizione della matrice per supportare i miociti nella forma e nella funzione26,27. Mentre il sistema qui descritto attualmente incorpora fibroblasti nei tessuti cardiaci 3D, ulteriori tipi di cellule possono creare un modello più fisiologico rilevante per studiare la sicurezza e l'efficacia dei composti terapeutici in vitro. In precedenza, una serie di tipi di cellule di supporto sono stati integrati con successo in tessuti ingegnerizzati in 3D presentando un modello entusiasmante per studi futuri utilizzando la piattaforma di contrattilità di rilevamento magnetico28,29,30.
La risoluzione dei problemi per questo protocollo si concentra sulla formazione di tessuti inaffidabili o incoerenti durante il processo di fusione. Bisogna fare attenzione per evitare la formazione di bolle negli idrogel mentre vengono lanciati, facilitando comunque la distribuzione uniforme delle cellule durante la miscelazione. Saranno probabilmente necessari esperimenti di ottimizzazione per ogni nuovo tipo di cellula per identificare le densità cellulari ideali, i rapporti cellulari e la composizione della matrice.
Una delle principali limitazioni per questa tecnica è il numero significativo di cellule necessarie per stabilire una piastra completa di 24 EMT. Per i dati qui presentati, sono stati utilizzati 15 milioni di cardiomiociti e 18 milioni di mioblasti scheletrici per piastra. Alcuni ricercatori potrebbero non avere accesso a tali grandi pool di materiale cellulare, il che potrebbe inibire la loro capacità di utilizzare questa piattaforma nella sua massima estensione. Se gli utenti finali non hanno accesso all'hardware di rilevamento magnetico, le misurazioni delle deflessioni devono essere eseguite otticamente, il che riduce significativamente la produttività e impedisce la registrazione simultanea delle contrazioni muscolari attraverso più pozzetti. Tuttavia, l'hardware Mantarray supera queste limitazioni per offrire il primo sistema commerciale in grado di eseguire un'analisi continua e non invasiva della contrazione EMT simultaneamente su più costrutti.
Il rilevamento magnetico attraverso 24 pozzetti facilita gli studi longitudinali dello sviluppo funzionale EMT in tempo reale e consente una misurazione accurata delle risposte acute alla manipolazione chimica, ambientale o genetica. Mentre il rilevamento magnetico presenta diversi vantaggi come la misurazione simultanea su più tessuti e non richiede complicate analisi dei dati, i metodi di rilevamento ottico consentono la misurazione simultanea di metriche fisiologiche come il flusso di calcio o la mappatura della tensione. Tuttavia, set di dati come quelli illustrati nella sezione dei risultati dimostrano l'ampiezza delle applicazioni che questa tecnologia ha nello spazio di sviluppo di farmaci. Dato che pochi test sul mercato offrono i mezzi per eseguire una valutazione diretta della produzione contrattile nel muscolo ingegnerizzato, questi metodi hanno il potenziale per rivoluzionare la pipeline di sviluppo preclinico.
Disclosures
Tutti gli autori sono dipendenti e azionisti di Curi Bio Inc., la società che commercializza l'hardware Mantarray e il software associato.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal finanziamento della Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 assegnato all'Istituto di scienze della salute e dell'ambiente) e dal finanziamento del National Institutes of Health (HL151094 al Dr. Geisse). Ringraziamo il Dr. Alec S. T. Smith per la sua assistenza nella preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary - DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary - MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
- Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
- Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
- Scheraga, H. A.
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
- Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
- Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
- Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
- Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
- Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
- Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
- Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
- Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
- Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
- Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
- Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
