Summary
Dit protocol biedt methoden voor het genereren van 3D-gemanipuleerde hart- en skeletspierweefsels en beschrijft het gebruik ervan in preklinische screeningsmodaliteiten voor geneesmiddelen. De beschreven methoden maken gebruik van een magnetisch detectiesysteem om de gelijktijdige beoordeling van 24 weefsels parallel te vergemakkelijken.
Abstract
Het nauwkeurig modelleren van gezonde en ziekteomstandigheden in vitro is van vitaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën en therapeutica. Voor hart- en skeletspierziekten vormen contractiele kracht en kinetiek belangrijke maatstaven voor het beoordelen van de spierfunctie. Nieuwe en verbeterde methoden voor het genereren van gemanipuleerde spierweefsels (EMT's) uit geïnduceerde pluripotente stamcellen hebben in vitro ziektemodellering betrouwbaarder gemaakt voor contractiele weefsels; Het reproduceerbaar fabriceren van weefsels uit gesuspendeerde celculturen en het meten van hun contractiliteit is echter een uitdaging. Dergelijke technieken worden vaak geplaagd door hoge uitvalpercentages en vereisen complexe instrumentatie en aangepaste data-analyseroutines. Een nieuw platform en apparaat dat 3D EMT's gebruikt in combinatie met een labelvrije, zeer parallelle en automatiseringsvriendelijke contractiliteitstest omzeilt veel van deze obstakels. Het platform maakt eenvoudige en reproduceerbare fabricage van 3D-EMT's mogelijk met behulp van vrijwel elke celbron. Weefselcontractiliteit wordt vervolgens gemeten via een instrument dat tegelijkertijd 24 weefsels meet zonder dat complexe software-analyseroutines nodig zijn. Het instrument kan op betrouwbare wijze micronewtonveranderingen in kracht meten, waardoor dosisafhankelijke samengestelde screening mogelijk is om het effect van een geneesmiddel of therapeutisch middel op de contractiele output te meten. Gemanipuleerde weefsels gemaakt met dit apparaat zijn volledig functioneel, genereren spiertrekkingen en tetanische contracties bij elektrische stimulatie en kunnen longitudinaal in cultuur gedurende weken of maanden worden geanalyseerd. Hier tonen we gegevens van hartspier-EMT's onder acute en chronische dosering met bekende toxische stoffen, waaronder een medicijn (BMS-986094) dat uit klinische onderzoeken werd gehaald na sterfgevallen bij patiënten als gevolg van onverwachte cardiotoxiciteit. Veranderde skeletspierfunctie in gemanipuleerde weefsels als reactie op behandeling met een myosineremmer wordt ook gepresenteerd. Dit platform stelt de onderzoeker in staat om complexe, informatierijke bio-engineered modelsystemen te integreren in hun workflow voor het ontdekken van geneesmiddelen met minimale aanvullende training of vereiste vaardigheden.
Introduction
Geïnduceerde pluripotente stamcelmodellen (iPSC) worden steeds meer belangrijke spelers in de preklinische pijplijn voor therapeutische ontdekking en ontwikkeling, evenals fundamenteel biologisch onderzoek en ziektemodellering 1,2,3,4,5. Contractiele weefsels, zoals hart- en skeletspieren afgeleid van iPSC's, hebben een groot potentieel voor het verbeteren van de voorspellende kracht van menselijke in vitro studies, aangezien directe beoordeling van spiercontractiele kracht en kinetiek kwantitatieve maatstaven zijn om de algehele weefselfunctie te bestuderen 4,6,7,8. Doorgaans zijn metingen van contractiele kracht verkregen hetzij indirect door optische tracking van substraatafbuiging 9,10, hetzij direct door bevestiging van cellen/weefsels aan een krachtopnemer4,11,12. Deze methoden, hoewel nauwkeurig, hebben inherent een lage doorvoer en vereisen meestal zeer bekwame operators om gegevens te verzamelen en te analyseren.
Eerder werk heeft aangetoond dat magnetische velddetectie deze obstakels omzeilt en een alternatieve methode biedt om de gemanipuleerde spierfunctie tegelijkertijd over meerdere weefselconstructies te beoordelen13. Het Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bouwt voort op deze technologie met behulp van een apparaat dat in staat is om de contractiliteit van gemanipuleerde spierweefsels op een zeer parallelle manier te meten die gebruik maakt van de complexiteit van 3D-cellulaire modellen met screening met hogere doorvoer14. Het platform maakt labelvrije, kwantitatieve, real-time monitoring van de contractiele functie in hart- en skeletspierweefsels in of buiten een standaard celkweekincubator mogelijk, waardoor de noodzaak voor optische contractiele beeldvorming en analyse wordt geëlimineerd. Deze technologie vergemakkelijkt directe vergelijking van gezonde en zieke cellijnen en maakt het mogelijk om het effect van een geneesmiddel op contractiele weefsels te meten, waarbij kwantificeerbare, in vitro, veiligheids- en werkzaamheidsgegevens voor nieuwe en bestaande therapeutische verbindingen worden vastgesteld.
Gemanipuleerde 3D-spierweefsels kunnen op een zeer reproduceerbare manier tussen twee palen worden vervaardigd met behulp van de Mantarray-verbruikstoevoegplaat met 24 putten (figuur 1). De ene paal is stijf, terwijl de andere paal flexibel is en een kleine magneet bevat. Wanneer het weefselconstruct samentrekt, verplaatst het de flexibele paal en de ingebedde magneet. De EMT-plaat wordt in het instrument geplaatst en de postverplaatsing wordt gemeten via een reeks magnetische sensoren op een printplaat onder de plaathouder. De gemeten veranderingen in het magnetisch veld worden met behulp van een wiskundig algoritme omgezet in absolute contractiele kracht. Het instrument maakt gebruik van snelle gegevensbemonsteringssnelheden om gedetailleerde informatie te verzamelen over de functionele capaciteit en volwassenheid van het (de) celtype (en) dat wordt getest, inclusief contractiefrequentie, snelheid en vervaltijd. Deze functionele metingen kunnen worden verkregen over alle 24 putten tegelijkertijd met het magnetische detectieplatform of individueel en sequentieel met behulp van traditionele optische methoden.
Deze studie beschrijft een zeer reproduceerbare methode voor het engineeren van 3D-skeletspieren en hartmicrotweefsels in een op fibrine gebaseerde hydrogel. Tijdens een korte reactie van 80 minuten katalyseert trombine de omzetting van fibrinogeen in fibrine, waardoor spiercellen zich kunnen ontwikkelen in gesuspendeerde cultuur15. Stromale cellen helpen de matrix te hermodelleren en weefsels worden contractiel omdat spiercellen een syncytium vormen in de hydrogel. De contractiliteit van deze weefsels werd geanalyseerd met behulp van de magnetische detectiebenadering, zowel voor als na blootstelling aan verbindingen, waarbij deze modaliteit werd gevalideerd voor gebruik in dosis-respons geneesmiddelenstudies. Primaire menselijke myoblasten van een gezonde donorbiopsie werden commercieel verkregen en gekweekt in 2D volgens de protocollen van de leverancier. Cellen werden uitgebreid met behulp van een skeletspiergroeimedium door drie passages om voldoende celaantallen te genereren om 3D-weefsels te fabriceren. Stromale cellen en hiPSC-afgeleide cardiomyocyten werden gedurende 3 dagen gekweekt volgens het protocol van de leverancier om herstel van cryopreservatie mogelijk te maken voordat cellen in weefsels werden gegoten. Er worden representatieve resultaten verstrekt die de soorten datasets illustreren die kunnen worden verzameld met behulp van het magnetische detectieplatform. Veel voorkomende valkuilen in verband met het genereren van gemanipuleerde weefsels met behulp van deze methoden worden ook aangepakt.
Protocol
1. Celkweekprotocol
- Primaire menselijke myoblastcultuur
- Verdun de extracellulaire matrix (ECM) in een verhouding van 1:100 in 8 ml DMEM/F12 medium op ijs.
- Breng 8 ml ECM-oplossing aan op één T175-kolf en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel, maar niet langer dan 24 uur. Zorg ervoor dat de ECM-oplossing de gehele bodem van de kolf bedekt.
- Aliquot 5 ml van het skeletspiergroeimedium tot een conische buis van 15 ml.
- Ontdooi een bevroren injectieflacon met cellen (5,0 x 105 myoblasten) in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 minuten of totdat het ijs net is gesmolten. Spuit de injectieflacon in met 70% ethanol en breng deze over in een bioveiligheidskast (BSC).
- Breng de cellen over in het gealiquoteerde medium met behulp van een P1000. Niet tritureren. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 min.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 1 ml van het groeimedium met behulp van een P1000-pipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Was de erlenmeyer met ECM-coating met 15 ml DPBS. Zuig DPBS aan en voeg vervolgens 30 ml van het groeimedium toe aan de kolf.
- Voeg 4 ml van het groeimedium toe aan de cellen, meng en verdeel de celsuspensie in de T-175-kolf. Zorg ervoor dat het totale volume 35 ml is. Schuif de kolf 5-6 keer voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts, gevolgd door 5-6 keer naar voren en naar achteren om een gelijkmatige verdeling van de cellen op het oppervlak van de kolf te garanderen.
- Plaats de T-175-kolf in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweek de cellen gedurende 3 dagen of totdat ze niet meer dan 70% confluency bereiken en passeer vervolgens de cellen.
- Het passeren van primaire menselijke myoblasten
- Verdun de ECU in een verhouding van 1:100 in 30 ml DMEM/F12 medium op ijs.
- Breng 10 ml van de ECM-oplossing aan op drie T225-kolven en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien, maar niet meer dan 24 uur. Zorg ervoor dat de ECM-oplossing de gehele bodem van de kolf bedekt.
- Was de cellen met 15 ml DPBS. Zuig het dissociatiereagens op en voeg het toe volgens het protocol van de leverancier.
- Zodra de cellen zijn opgeheven, stopt u de reactie volgens het protocol van de leverancier en verzamelt u de cellen in een conische buis. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 min.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 1 ml van het groeimedium met behulp van een P1000-pipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Was de erlenmeyer met ECM-coating met 15 ml DPBS. Zuig DPBS aan en voeg vervolgens 40 ml van het groeimedium toe aan elke T225-kolf.
- Voeg 14 ml van het groeimedium toe aan de celsuspensie, meng en verdeel 5 ml van de celsuspensie over elke T225-kolf. Zorg ervoor dat het totale volume in elke kolf 45 ml bedraagt. Schuif de kolf 5-6 keer voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts, gevolgd door 5-6 keer vooruit en terug om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
- Plaats de kolven in de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Kweek cellen gedurende 2-3 dagen of totdat ze niet meer dan 70% confluency bereiken en dan passage. Splits de cellen op 1:3 of 1:4 bij elke passage en zaai tussen 3 x 103 en 1 x 104 cellen/cm2.
- hiPSC-afgeleide cardiomyocytencultuur
- Verdun de ECU in een verhouding van 1:60 in 12 ml DMEM/F12 medium op ijs.
- Breng 1 ml ECM-oplossing aan op elk putje van twee 6-putplaten en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel, maar niet meer dan 24 uur.
- Ontdooi een bevroren injectieflacon met cardiomyocyten in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 minuten of totdat het ijs net is gesmolten.
- Spuit de injectieflacon in met 70% ethanol en breng deze over in de BSC.
- Gebruik een p1000-pipet om de ontdooide cellen over te brengen in een conische buis van 50 ml.
- Spoel de lege cryovial met 1 ml kamertemperatuur (RT) plating medium om eventuele resterende cellen te herstellen.
- Doseer langzaam de 1 ml spoelmedia druppelsgewijs (één druppel om de 5 s) in de conische buis van cellen in de loop van 90 s. Draai de buis continu rond om de cellen te mengen tijdens de langzame mediatoevoeging.
- Voeg langzaam 8 ml van het platingmedium toe met behulp van een serologische pipet van 10 ml aan de conische buis van 50 ml cellen.
- Nadat alle media zijn afgegeven, pipet u voorzichtig 3 keer op en neer om de cellen grondig te mengen. Tel cellen met behulp van een hemacytometer en trypan blauw.
- Centrifugeer de cellen in de 50 ml conische buis op 300 x g gedurende 3 min.
- Nadat de cellen zijn gepelletiseerd, zuigt u het supernatant op.
- Gebruik een p1000-pipet om 1 ml van het beplatingsmedium over te brengen naar de buis en breek de pellet voorzichtig af door 3-5 keer langzaam op en neer te pipetteren. Resuspensie van de cellen met een extra beplatingsmedium.
- Zaad tussen 2-4 x 10 6 cellen per put van een 6-putplaat in 2 ml van het platingmedium.
- Was de ECM-gecoate 6-well platen met DPBS (2 ml/put).
- Pipetteer 2 ml celsuspensie per putje van een 6-putplaat. Beweeg de platen voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts 5-6 keer gevolgd door 5-6 keer vooruit en terug om een gelijkmatige verdeling van de cellen op de plaatoppervlakken te garanderen.
- Plaats de plaat in de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Herhaal stap 1.3.3-1.3.16 voor alle injectieflacons van de cellen die moeten worden ontdooid.
- Verander de volgende dag na het plateren naar 3-5 ml (afhankelijk van de cellijn en dichtheid) van het onderhoudsmedium en verander het medium om de andere dag. Kweek cellen gedurende 3-4 dagen voordat ze in 3D-weefsels worden gegoten.
- Stromale celkweek
- Breng 30 ml van de ECM-oplossing aan op een T175-kolf en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel, maar niet langer dan 24 uur.
- Aliquot 5 ml van het stromale celmedium in een conische buis van 15 ml.
- Ontdooi een bevroren injectieflacon met stromale cellen in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 minuten of totdat het ijs net is gesmolten.
- Spuit de injectieflacon in met 70% ethanol en breng deze over in de BSC.
- Gebruik een p1000-pipet om langzaam 1 ml stromale celmedium toe te voegen aan de ontdooide cellen in de injectieflacon.
- Breng de celsuspensie over van de injectieflacon naar de resterende dooimedia in de conische buis. Gebruik een serologische pipet van 5 ml om de cellen te mengen. Pipetteer 3 keer op en neer.
- Tel de cellen met behulp van een hemacytometer en trypan blauw. Draai geen cellen af.
- Was de met ECM beklede T175-kolf met 15 ml DPBS.
- Breng de stromale cellen over in de kolf met een dichtheid van 3-4 x 103 cellen/cm2. Schuif de kolf 5-6 keer voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts, gevolgd door 5-6 keer naar voren en naar achteren om een gelijkmatige verdeling van de cellen op het oppervlak van de kolf te garanderen.
- Verander het medium de volgende dag met 45 ml verwarmd stromaal celmedium. Kweek de cellen gedurende 3-4 dagen voordat ze in 3D-weefsels worden gegoten.
2. Materiaalvoorbereiding
- Fibrinogeen
OPMERKING: Zorg er bij het reconstitueren van fibrinogeen voor dat u de hoeveelheid oppervlak waarop het fibrinogeenpoeder wordt gelaagd, maximaliseert. In dit protocol werd de hoeveelheid gebruikt verdunningsmiddel geoptimaliseerd voor de grootte van de gebruikte container, d.w.z. er werd net genoeg verdunningsmiddel gebruikt om de bodem van de schaal te bedekken. Leg bijvoorbeeld 0,5 g fibrinogeen over 10 ml PBS in een schaal van 100 mm in plaats van een centrifugebuis van 50 ml. Het maximaliseren van de hoeveelheid oppervlakte van het verdunningsmiddel vermindert de hoeveelheid tijd die nodig is om het fibrinogeen te reconstitueren en vermindert potentiële klontering van eiwitten.- Reconstitutie
- Breng 10 ml PBS over in een celkweekschaal van 100 mm en warm tot 37 °C in een celkweekincubator.
- Leg 0,5 g fibrinogeenpoeder over het gehele oppervlak van warme PBS en houd bij 37 °C totdat fibrinogeen volledig is opgelost. Dit mag niet meer dan 2 uur duren. Het oplossende poeder kan voorzichtig worden gezwenkt, maar schud het gerecht niet krachtig.
- Steriele filtratie
- Zodra het poeder volledig is opgelost, laat u de oplossing door een filter van 100 μm lopen en verzamelt u deze in een conische buis van 50 ml om eventuele klonten gelled fibrinogeen te verwijderen.
- Giet de gefilterde oplossing in een spuit van 10 ml met een filter van 0,2 μm. Duw de oplossing door het filter en vang deze op in een nieuwe conische buis van 50 ml. Het filter moet mogelijk meer dan eens worden vervangen om alle 10 ml oplossing te steriliseren.
- Aliquot 300 ml steriel fibrinogeen in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaren bij -20 °C. Ontdooi de aliquots op ijs of bij 4 °C indien nodig. Vermijd herhaaldelijk bevriezen/ontdooien.
- Reconstitutie
- Trombine
- Voeg 6 ml PBS en 4 ml diH2O rechtstreeks toe aan één injectieflacon trombine (1 KU) om een trombinestockoplossing van 100 U/ml te maken.
- Filter steriliseren met een 0,2 μm filter, aliquot, en bewaren bij -20 °C in 1,5 ml plastic microcentrifugebuizen als trombine adsorbeert aan glas. Vermijd herhaaldelijk bevriezen/ontdooien.
- Poly(ethyleenimine)oplossing (PEI)
LET OP: PEI is giftig. Gebruik geschikte PBM's zoals aangegeven door de fabrikant.
OPMERKING: PEI wordt geleverd als een 50% w/v-oplossing. Het is zeer stroperig en moeilijk te pipetteren. Maak een 0,1% oplossing van een 10% voorraadoplossing in plaats van rechtstreeks van de 50% w/v-oplossing.- Meet 5 ml 50% w/v PEI-oplossing in een conische buis van 50 ml.
- Voeg 20 ml diH2O toe en meng tot een 10% stockoplossing. Deze sterk geconcentreerde stamoplossing kan niet steriel worden gefilterd.
- Om een 0,1% oplossing voor celkweek te maken, voegt u 5 ml 10% bouillon toe aan 495 ml diH2O. Steriel filter met behulp van een 500 ml filterkolf en bewaar bij RT niet langer dan 1 week.
- Glutaaraldehyde
LET OP: Glutaaraldehyde is giftig. Gebruik geschikte PBM's zoals aangegeven door de fabrikant.- Glutaaraldehyde wordt geleverd als een 25% oplossing. Om een 0,01% oplossing te maken, voegt u 40 μL toe aan 99,6 ml diH2O. Steriel filter en bewaar bij 4 °C gedurende niet langer dan 1 week.
- Na de voorbereiding
- Plaats de verbruiksset voor het gieten van vloeistoffen in een steriele kweekkap. De gietset bevat een deksel, een paalrooster met 24 paar palen (één paar palen per put van een plaat met 24 putten) en een gespecialiseerde 24-putplaatbodem met 24 gietputten. Elke gietput bevat een sleuf in de bodem van de put om de cel / hydrogelcomponenten vast te houden en ze in een buisvormig weefsel te vormen terwijl de hydrogel polymeriseert (figuur 1B).
- Vul de putjes van een 24-putplaat met 1,5 ml/put van een 0,1% PEI-oplossing en plaats palen in de plaat zodat de uiteinden van elk paar palen onder water staan. Laat het 10 minuten zitten. PEI zal een positieve lading op de palen afzetten, zodat eiwitten in de hydrogel zich stevig aan de palen hechten tijdens het werpen van weefsel.
- Vul de putjes van een tweede 24-putplaat met 2 ml/put steriel diH2O en breng de palen over. Laat het 1 minuut staan.
- Vul in een derde plaat met 24 putten de putten met 1,5 ml / put van 0,01% glutaaraldehyde (GA) en breng de palen over. Laat het 30 minuten zitten. GA zal de positieve lading van PEI op de palen fixeren.
- Terwijl de palen in glutaaraldehyde zitten, zuigt u de diH 2 O-putten op, wast u met 2 ml / put steriel diH2 O, aspirateer en vult u deze bij met 2 ml / put steriel diH2O. Een verse, 24-well plaat kan worden gebruikt in plaats van te spoelen.
- Wanneer 30 minuten voorbij is, breng je de palen over naar de 2 ml / put van steriel diH2O. Laat het 1 minuut staan.
- Zuig de diH 2 Oaan en voeg nog eens 2 ml/putje steriel diH2O toe. Laat het 5 min zitten.
- Breng de palen over op een plaat met 24 putten om te drogen (ongeveer 15 min).
- Eenmaal droog, monteer je de gietkit opnieuw. Parafilm de randen om het deksel en de plaat samen af te sluiten en bewaar vervolgens bij 4 °C gedurende maximaal 72 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel. Langere opslagtijden zijn waarschijnlijk mogelijk, maar zijn niet getest.
3. Weefselgietprotocol
- Voorbereiding van gietplaten
- Koel de weefselgietset voor op 4 °C.
- Breng een emmer ijs over in het BSC. Bereid op ijs 50 μL trombineoplossing (3 μL trombinebouillon + 47 μL EMT-medium) per te gieten put.
OPMERKING: Zie stap 3.2.1 voor meer informatie over EMT-medium. - Haal de gekoelde gietset uit de koelkast en plaats deze op een koud blok of ijs in de celkweekkap. Leg de gietplaat plat op ijs en verplaats het paalrooster van de gietplaat naar een nieuwe, steriele plaat met 24 putten.
- Pipetteer 50 μL trombineoplossing in elke voorgekoelde put van de gietplaat.
- Monteer de kit opnieuw en breng deze terug naar de koelkast totdat deze nodig is voor het gieten van weefsel. Giet de weefsels binnen 3 uur na trombine naast de putjes.
- Celvoorbereiding
- Bereid EMT-basismedium, steriel filter voor en laat het op ijs staan.
OPMERKING: Als celspecifiek gietmedium FBS bevat, gebruik dan warmte-geïnactiveerde FBS omdat het kan interageren met fibrinogeen en voortijdige polymerisatie kan veroorzaken.- Bereid cardiaal EMT-medium voor: voeg 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 en 2,5 g aminocapronzuur toe. (Optioneel) Voeg 10 mM ROCK-remmer toe (voeg alleen toe aan het EMT-medium dat wordt gebruikt voor het gieten van weefsels en niet aan het volledige volume van 500 ml).
- Bereid skelet-EMT-medium voor: Voeg 50 ml F10-medium en 0,25 g aminocapronzuur (ACA) toe voor primaire EMT's en 0,1 g ACA voor iPSC-afgeleide EMT's.
- Verwarm het dissociatiereagens van celkweekkwaliteit tot 37 °C. Verwarm een gelijk volume EMT-medium om het dissociatiereagens te verdunnen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het gebruikte protease volledig is geïnactiveerd. Actieve protease zal interfereren met 3D-weefselvorming en post-hechting. - Was de cellen (figuur 1A) met PBS. Gebruik 2 ml/put voor een plaat met 6 putten. Gebruik respectievelijk 6 ml, 15 ml en 15 ml voor een schaal van 100 mm, T175-kolf en T225-kolf.
- Voeg het verwarmde dissociatiereagens van celkweekkwaliteit toe om de cellen op te tillen en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat de cellen zijn opgetild. Gebruik voor hartkweken het 10x dissociatiereagens. Gebruik voor stromale cellen en skeletspiermyoblasten een 1x dissociatiereagens. Gebruik 1 ml/put voor een plaat met 6 putten, 3 ml voor een schaal van 100 mm, 8 ml voor een T175-kolf en 10 ml voor een T225-kolf.
- Controleer de culturen elke 2-3 minuten door op de zijkant van de plaat te tikken.
- Zodra de cellen zijn opgetild, brengt u ze over naar een conische buis van 50 ml en tritueert u ze met een P1000-pipet om een eencellige suspensie te garanderen.
- Was de plaat of kolf met een extra EMT-medium om de resterende cellen te verzamelen en voeg ze toe aan de conische buis. Gebruik 1 ml/put van het EMT-medium voor een plaat met 6 putten, 2 ml voor een schaal van 100 mm, 5 ml voor een T175-kolf en 5 ml voor een T225-kolf.
- Triturate de cellen om een enkele cel suspensie te garanderen.
- Voeg EMT-medium toe om het dissociatieproces te beëindigen en neem vervolgens monsters van de celsuspensies voor celtellingen. Gebruik 1 ml/put voor een plaat met 6 putten, 3 ml voor een schaal van 100 mm, 8 ml voor een T175-kolf en 10 ml voor een T225-kolf.
- Draai de cellen op 200 x g gedurende 4 min. Voer celtellingen uit met behulp van een hemacytometer en trypan blue terwijl suspensies worden gecentrifugeerd.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 5 ml EMT-basismedium om het resterende dissociatiereagens te verwijderen.
- Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 4 min. Zuig het supernatant op en bereid de celsuspensies voor op de juiste dichtheden.
- Verhoog de levensduur en functie van 3D-skeletspier-EMT's met de toevoeging van 10% -20% ECM-eiwitten in het EMT-medium14,16.
- Zaadstamcel-afgeleide cardiomyocyten en hun stromale cellen op respectievelijk 5 x 10 5 cellen en7,5 x 104 cellen per weefselconstruct. Zaai de skeletspiermyoblasten op 7,5 x 105 cellen per weefselconstructie.
- Hartweefsel
- Zuig het supernatant op en resuspensie de stromale cellen met een dichtheid van 2,5 x 106 cellen per ml in EMT-medium en leg ze op ijs. Gebruik 30 μL van deze suspensie per EMT.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de CM's met een dichtheid van 8,3 x 106 cellen per ml in EMT-medium en leg ze op ijs. Gebruik 60 μL van deze suspensie per EMT.
- Skeletspierweefsels
- Zuig het supernatant op en resuspendien de skeletspiercellen met een dichtheid van 8,3 x 106 cellen per ml in EMT-medium en leg ze op ijs. Gebruik 90 μL van deze suspensie per EMT.
- Bereken de volumes van elke celoplossing die nodig zijn om het gewenste aantal weefsels te vormen (bijvoorbeeld 60 μL van de bereide CMs en 30 μL van de bereide stromale cellen of 90 μL van de skeletspiercellen per EMT).
- Pipetteer de berekende volumes cellen in een conische buis van 15 ml.
- Voeg 10 μL fibrinogeen per EMT toe aan de celsuspensie en houd het op ijs.
- Totale reagentia en celvolumes per EMT: Zorg ervoor dat elke EMT 90 μL cellen, 10 μL fibrinogeen en 50 μL trombineoplossing bevat.
- Bereid EMT-basismedium, steriel filter voor en laat het op ijs staan.
- Weefselgieten
- Breng de weefselgietset over op een celkweekkap en verwijder het deksel (postrooster met flexibele en stijve palen moet op de gietplaat blijven; Figuur 1B). Houd de gietplaat met paalrooster plat op ijs.
- Meng het cel/fibrinogeen mengsel en zuig 100 μL op met een P200-pipet.
- Voeg 100 μL van het mengsel toe aan putjes bereid met 50 μL trombineoplossing en tritueer 5 keer om goed te mengen. Duw de pipet niet voorbij de eerste stop en verwijder de punt na trituratie om te voorkomen dat er bubbels ontstaan.
- In dit stadium, en totdat het paalrooster klaar is om van de gietplaat te worden opgetild (stap 3.3.10), kan elke beweging van het rooster de langdurige hechting van het weefsel aan de palen in gevaar brengen. Houd zowel het rooster als de gietputplaat tegelijkertijd vast met de wijsvinger en duim van één hand om beweging van het rooster te voorkomen.
- Herhaal dit met een verse P200-tip voor elk weefsel totdat alle weefsels zijn gegoten. Meng celsuspensie in een conische buis van 15 ml voordat u elk weefsel giet, omdat cellen snel bezinken.
- Breng de gezaaide kit voorzichtig over naar de incubator en zorg ervoor dat u het rooster niet verplaatst. Beweging van rooster na het zaaien kan resulteren in verminderd succes bij het overbrengen van weefsels uit de gietputten. Incubeer bij 37 °C gedurende 80 minuten, ongeacht het celtype. Dit zal de polymerisatie van de hydrogel beginnen en eiwitten aan de palen laten hechten.
- Maak ondertussen een verse plaat met 24 putten met 2 ml / put van het EMT-medium voor hartweefsels. 10 mM ROCK-remmer kan desgewenst aan het EMT-medium worden toegevoegd. Incubeer de plaat bij 37 °C om het medium op te warmen.
- Bereid 2 ml/put groeimedium met 5 g/l aminocapronzuur (0,2 mm steriel gefilterd) voor primaire skeletspierweefsels of 2 g/l ACA voor van iPSC afgeleide EMT's. Incubeer de plaat bij 37 °C om het medium op te warmen.
- Voeg na de incubatie voorzichtig 1 ml van het EMT-medium toe aan de rand van de gietputten en incubeer nog eens 10 minuten bij 37 °C, ongeacht het celtype. Dit zal de hydrogel losmaken van de randen van de gietput en een gemakkelijke overdracht van het weefsel mogelijk maken.
- Til na 10 minuten voorzichtig het paalrooster op en breng de weefsels over van de gietplaat naar een voorbereide 24-putplaat met medium (figuur 1C). Breng de platen met weefsels terug naar de celkweekincubator bij 37 °C.
- Onderhoud
- Breng na 24 uur de gegoten weefsels over naar een verse plaat met 24 ml /put van de EMT-media (zonder de ROCK-remmer als deze was opgenomen) en incubeer bij 37 °C. Voor skeletspiercellen schakelt u het groeimedium over naar het differentiatiemedium om myoblastfusie te bevorderen.
- Breng de hartweefsels over naar verse putten met 2 ml / put van het EMT-medium om de 2-3 dagen.
- Breng de skeletspierweefsels over naar verse putten met 2 ml / putdifferentiatiemedium met 5 g / L aminocapronzuur (0, 2 mm steriel gefilterd) om de 2-3 dagen. Gebruik 2 g/L ACA voor iPSC-afgeleide weefsels.
- Om te helpen bij mediumveranderingen, brengt u het paalrooster over op een verse 24-putplaat in plaats van het medium in dezelfde plaat te veranderen om te voorkomen dat de 3D-weefsels worden beschadigd. Bereid een tweede 24-well plaat met het EMT-medium en breng de weefsels over naar het verse medium. Houd de plaat met het oude medium naast de actieve cultuur om te gebruiken voor de volgende mediumwissel. Breng het paalrooster heen en weer tussen de twee platen gedurende de kweekperiode. U kunt ook een vers bord gebruiken voor elke mediumwissel.
- Meet de EMT-contractie via optische tracking van post-deflectie (figuur 1D) of magnetische detectiehardware13,14. Hartweefsels beginnen spontaan te kloppen na 3-4 dagen in cultuur. Skeletspierweefsels zijn meestal contractiel met elektrische veldstimulatie na 7 dagen in cultuur.
Representative Results
Cellen werden gegoten in gemanipuleerde spierweefsels in de 2-post verbruiksplaat (figuur 1). Succesvolle EMT's zullen uniform lijken en de matrix zal gelijkmatig over de posten worden verdeeld (figuur 2A). De matrix moet zich ook om beide palen wikkelen, waardoor gelijkwaardige ankerpunten voor het weefsel worden geproduceerd. Fouten in het gieten zijn zeldzaam met deze methode en zijn meestal duidelijk bij een visuele inspectie. Mislukte EMT-productie kan variëren van catastrofale storingen, zoals weefselloslating van de palen (figuur 2B) tot meer subtiele structurele gebreken, zoals luchtbellen en losse bevestiging aan de palen (figuur 2C, D). Weefsels met kleine gebreken kunnen nog steeds levensvatbaar zijn, maar de gegevens van deze weefsels moeten zorgvuldig worden onderzocht om ervoor te zorgen dat deze vergelijkbaar zijn met compromisloze EMT's. Luchtbellen in een EMT kunnen bijvoorbeeld worden uitgeknepen als het weefsel in de loop van de tijd compacter wordt, waardoor een volledig functionele constructie ontstaat zonder contractiele tekortkomingen. Deze weefsels moeten echter van geval tot geval worden beoordeeld, omdat de locatie van de luchtbellen het functionele herstel kan beïnvloeden. Luchtbellen die bij de palen worden gegenereerd, kunnen bijvoorbeeld de weefselaanhechting beïnvloeden, wat de langdurige hechting aan de paal kan belemmeren.
Weefsels beginnen binnen de eerste 24 uur te verdichten als cellen de matrix in de hydrogel hermodelleren (figuur 3). Verdichting is een geleidelijk proces en verloopt meestal gedurende de eerste 2-4 weken van de cultuur. Over het algemeen is weefselverdichting consistent tussen technische en biologische replicaties (figuur 4). Het is normaal dat sommige cellijnen de matrix meer verdichten dan andere, omdat weefsels in de loop van de tijd rijpen. Het percentage myogene cellen binnen een construct beïnvloedt de snelheid en de algehele mate van EMT-verdichting. Het totale myogene gehalte voor zowel hart- als skeletspiercellijnen moet hoger zijn dan 80% om variatie tussen gemanipuleerde weefsels te minimaliseren. Dit is vooral belangrijk bij het vergelijken van contractiele krachten en kinetiek over cellijnen heen.
Binnen de eerste paar dagen na het gieten beginnen cardiomyocyten spontaan in cultuur te kloppen, waarbij de flexibele paal ritmisch wordt gebogen bij elke spiercontractie. Skeletspierconstructies trekken samen als reactie op elektrische stimulatie op dag 7 na het starten van differentiatie. Veldstimulatie werd toegepast op skeletspierweefsels via een externe stimulator bevestigd aan een aangepast 24-well elektrodedeksel. Het deksel, vervaardigd met een paar koolstofelektroden voor elke put, zit bovenop de 24-putplaat van weefsels en stimuleert tegelijkertijd elke EMT om spiercontracties op te wekken. Weefsels werden getemporiseerd met behulp van een 10 V-stimulus gedurende 10 ms pulsduur bij 1 Hz tijdens functionele metingen. Contractiele weefsels duiden op skeletmyoblasten die zijn gefuseerd en myotubes vormen, compleet met functionele sarcomeren en contractiele machines. Skelet-EMT's kleuren positief voor myosine zware keten (MyHC) en dystrofine is gelokaliseerd op het myotube-membraan en onthult een klassieke ringvorm in cross-sectionele immunohistochemische analyse (figuur 5). Zodra EMT's functioneel zijn, kan contractiliteit dagelijks worden gemeten in het magnetische detectie-instrument, waarbij de kracht en kinetiek worden gevolgd naarmate de constructen zich ontwikkelen en rijpen in de loop van de tijd. Zowel hart- als skeletspierweefsel blijven weken tot maanden contractiel in 3D-cultuur (figuur 6) en kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan contractiliteitsstudies.
De magnetische detectiebenadering kan worden gebruikt om tegelijkertijd acute en chronische effecten van structurele cardiotoxische stoffen te meten, zoals doxorubicine (figuur 7) en BMS-986094 (figuur 8), evenals andere geneesmiddelen die de spiercontractiliteit beïnvloeden. Optische trackingmethoden voor contractiedetectie kunnen ook worden gebruikt, maar voorzichtigheid is geboden bij het bestuderen van acute medicijneffecten, omdat metingen sequentieel moeten worden uitgevoerd. De verlengde levensduur van cardiale en skeletale EMT's in 3D-cultuur maakt langdurige geneesmiddelenstudies in deze weefsels mogelijk. Dit stelt gebruikers in staat om de effecten van herhaalde toediening te onderzoeken, evenals voortdurende, langdurige blootstelling aan verbindingen die in de loop van de tijd cardiotoxische effecten kunnen vertonen, zoals gebeurt met doxorubicine. Doxorubicine (dox) is een anti-kanker chemotherapie drug17. De hoeveelheid geneesmiddel die aan patiënten wordt toegediend, varieert, afhankelijk van het type kanker, de leeftijd van de patiënt, de lengte en het gewicht van de patiënt, evenals andere factoren. Om deze reden is het belangrijk om het effect van dox te testen in een breed scala van concentraties en leveringsschema's. Hier werden cardiale EMT's in de loop van 27 dagen behandeld met drie afzonderlijke concentraties (0,1 μM, 1 μM en 10 μM) dox (figuur 7). De groepen werden verder gestratificeerd door EMT's bij elke concentratie te behandelen met een bolusbehandeling of continue toediening met een gemiddelde verandering om de 72 uur. Putten die bolusbehandelingen van dox kregen, werden op drie verschillende tijdstippen aan het medicijn blootgesteld, waardoor herstel tussen de dosering mogelijk was. De twee hoogste doses bolus en continue blootstelling toonden een onmiddellijke en langdurige stopzetting van de contractiele krachtgeneratie gedurende het onderzoek. De middelste en laagste concentraties hadden verschillende effecten op de weefsels, afhankelijk van de toedieningsmethode. In de laagste concentratie van het geneesmiddel vertoonde de bolusgroep geen verschil met de controles. De contractiele kracht nam echter af na 2 weken continue blootstelling. De mid-range concentratie van het medicijn had een interessant effect. Terwijl continue dosering de kracht verminderde gedurende de eerste paar dagen van de behandeling en gedurende het hele experiment duurde, vertoonde de bolusgroep een herstel van de contractiele kracht terug naar controleniveaus wanneer het medicijn na 3 dagen werd uitgewassen. De tweede bolus van het geneesmiddel veroorzaakte echter een volledige stopzetting van de kracht, gevolgd door geen herstel (figuur 7), wat aangeeft dat herhaalde dosering in deze concentratie een cardiotoxisch effect kan hebben bij patiënten die met dit geneesmiddel worden behandeld. De brede reikwijdte van deze studie, zowel in tijd als in experimentele omstandigheden, benadrukt het nut van 3D-gemanipuleerde weefsels bij toxiciteitsscreening, omdat ze contractiel blijven en reageren op chemische blootstelling gedurende langere tijd, waardoor langdurige geneesmiddelenstudies binnen een enkele set spierweefsels mogelijk zijn. Dit vergemakkelijkt niet alleen het identificeren van verbindingen die een cardiotoxisch effect kunnen hebben bij chronische blootstelling, maar ook het detecteren van potentiële cardiotoxische timing van toediening.
In vitro toxiciteitstests in gemanipuleerde menselijke spierweefsels zijn een manier om menselijke patiënten veilig te houden in klinische onderzoeken. BMS-986094 is een nucleotidepolymerase (NS5B)-remmer die wordt gebruikt voor de behandeling van hepatitis C. Het geneesmiddel bevond zich in fase II klinische ontwikkeling toen Bristol-Myers Squibb de ontwikkeling staakte vanwege verschillende gevallen van onverwacht hartfalen bij patiënten18,19. Hier werd BMS-986094 toegepast op cardiale EMT's om te testen of 3D-gemanipuleerde spierweefsels een cardiotoxische reactie op het medicijn zouden ontwikkelen (figuur 8). Drie verschillende concentraties van het medicijn werden toegepast en weefsels werden gedurende 13 dagen gecontroleerd. De contractiele kracht daalde met de toevoeging van het geneesmiddel op een dosisafhankelijke manier (figuur 8A). De twitch-frequentie werd ook aanzienlijk beïnvloed toen de slagsnelheid vertraagde en uiteindelijk stopte zoals verwacht met voortdurende blootstelling aan de cardiotoxische verbinding (p < 0,05, figuur 8B). Deze resultaten laten zien hoe 3D-gemanipuleerde menselijke spierweefsels kunnen worden gebruikt om het op de markt brengen van nieuwe geneesmiddelen te vergemakkelijken en verbindingen te markeren die uiteindelijk falen als gevolg van cardiotoxiciteit. Bovendien kan deze technologie mogelijk levens redden door gevaarlijke geneesmiddelen bloot te stellen voordat ze in klinische onderzoeken bij patiënten worden geplaatst.
Het vermogen om het effect van acute en chronisch toegepaste geneesmiddelen op menselijk contractiel weefsel te meten, is een essentiële eerste stap bij het onderzoeken van therapieën op veiligheid en werkzaamheid. Het is echter belangrijk om te weten dat de concentratie van de toegepaste geneesmiddelen fysiologisch relevant en geschikt is voor in vitro testen. Skeletspierweefsels werden gebruikt om een IC50-waarde vast te stellen voor 2,3-butaandionemonoxime (BDM) in een volledige dosis-responscurve. Dit medicijn is een goed gekarakteriseerde ATPase-remmer van skeletspiermyosine-II20. BDM remt spiercontracties door myosine cross-bridge vorming met het actine filament in sarcomerente voorkomen 21. De hier getoonde resultaten onthullen een dosisafhankelijke afname van de absolute kracht wanneer het geneesmiddel wordt toegepast en volledig herstel van de contractiele kracht wanneer het geneesmiddel wordt uitgewassen, wat aangeeft dat het voorbijgaande effect spiercontracties voorkomt en niet alleen cellen in het weefsel doodt (figuur 9A). Bovendien werd een volledige dosis-responscurve gemeten over de zeven onderzochte concentraties, waarbij een IC50 van 3,2 mM in deze menselijke microtweefsels werd vastgesteld (figuur 9B).
Figuur 1: EMT gieten in de 2-post Mantarray verbruiksplaat met 24 putten . (A) Myogene en stromale cellen werden gekweekt op 2D-oppervlakken voorafgaand aan het gieten van weefsel. (B) Cellen worden opgetild van 2D-oppervlakken en gemengd met extracellulaire matrixeiwitten om hydrogels te vormen in de individuele plaatgietputten die in de inzet worden weergegeven. C) 24-putplaat met gemanipuleerde weefsels in elke put. (D) Representatieve weefsels die ontspannen en samengetrokken gemanipuleerde spieren vertonen, waarbij de verplaatsing van de magnetische paal (groene balken) wordt vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Succesvol en mislukt EMT-gieten . (A) Ideaal gemanipuleerd spierweefsel 24 uur na het gieten gelijkmatig verdicht rond de palen met een homogene cel/matrixsamenstelling door het hele weefsel. (B) Mislukte EMT met loslating van de hydrogel van de flexibele paal. (C) EMT met luchtbellen door het weefsel. (D) Ongelijke weefselafzetting rond beide palen. Weefsel is aan één kant losjes verankerd aan de flexibele paal. Schaalstaven zijn 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verdichting in gemanipuleerd spierweefsel in de loop van de tijd. (A) EMT-constructie getoond 1 dag na het gieten. Weefsels worden overgebracht naar differentiatiemedium, beginnend op dag 0 van celfusie en hydrogelverdichting. (B-E) Dezelfde EMT op dag 7 tot en met dag 21 met een iets kortere totale lengte tussen de twee palen in de loop van de tijd en een kleinere breedte wanneer gemeten door het middelste gedeelte van de EMT. Schaalstaven zijn 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: EMT-diameter in de loop van de tijd. Vier platen van weefsels werden gedurende 21 dagen gevolgd, waarbij de EMT-diameter gedurende de hele verdichting werd vergeleken. Elk weefsel werd elke week door het middengedeelte gemeten met behulp van optische microscopie. Tijdstippen tonen een consistente EMT-grootte tussen platen. Maximale verdichting wordt bereikt op dag 21 als matrixremodellering wordt gestabiliseerd. De tabel toont de standaardafwijking (% van het totaal) van verdichting binnen elke plaat van weefsels en de gemiddelde afwijking voor alle platen. Gekleurde balken zijn individuele platen. Foutbalken zijn SD van EMT's binnen platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Immunohistochemie van de gemanipuleerde skeletspierweefsels. EMT's werden gefixeerd op dag 10 van de cultuur en ingebed in paraffine. Dunne doorsneden (7 μm) werden gekleurd met antilichamen tegen myosine zware keten en dystrofine voorafgaand aan beeldvorming. Groen = MyHC, rood = Dystrofine, blauw = DAPI. Objectieve vergroting is 40X; Schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Contractiele kracht in gemanipuleerde spierweefsels in de loop van de tijd. (A) Gemiddelde absolute spierkracht gemeten van cardiale EMT's van dag 7 tot en met dag 63 in cultuur; n = 3 per groep. (B) Gemiddelde absolute spierkracht in skelet-EMT's afgeleid van een primaire cellijn op dag 7 tot en met dag 53 in cultuur; n = 3. Foutbalken zijn SD voor beide grafieken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Acute en chronische behandeling met doxorubicine in het gemanipuleerde spierweefsel. Drie afzonderlijke dosisconcentraties van dox, 0,1 μM, 1 μM en 10 μM, werden in de loop van 27 dagen in bolus toegediend of continu toegediend aan gemanipuleerde spierweefsels. Bolusdoses van het medicijn werden toegevoegd bij mediaveranderingen op dag 0, 12 en 24, opgemerkt door de groene pijlen op de X-as. Het medicijn werd bij elke mediawissel aan de media toegevoegd voor continue dosering, opgemerkt door de zwarte en groene pijlen op de X-as. De procentuele verandering in kracht ten opzichte van de uitgangswaarden (pre-medicamenteuze behandeling) bevindt zich op de Y-as en de tijd in dagen van behandeling ligt op de X-as. Lichtoranje = DMSO continue controle, donkeroranje = DMSO bolusregeling, lichtgroen = 0,1 μM dox continu, donkergroen = 0,1 μM dox bolus, lichtblauw = 1 μM dox continu, donkerblauw = 1 μM Dox bolus, lichtgeel = 10 μM dox continu, donkergeel = 10 μM dox bolus. Foutbalken zijn SD; n = 3 per voorwaarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Chronische behandeling met BMS-986094 in gemanipuleerd spierweefsel. EMT's werden behandeld met 0,4 μM (groen), 2 μM (donkerblauw) en 10 μM (lichtblauw) BMS-986094 gedurende 13 dagen. (A) Contractiele spierkracht (Y-as) neemt af bij alle geneesmiddelconcentraties in de eerste 2 dagen, terwijl de controleweefsels in DMSO in de loop van de tijd sterker worden (X-as). (B) De hartslagsnelheid, of twitchfrequentie, stopt op een dosisafhankelijke manier in combinatie met een stopzetting van de contractiele kracht weergegeven in grafiek A. Controleweefsels in DMSO (grijs) handhaven een regelmatige slagsnelheid gedurende het experiment. Foutbalken zijn SD; n = 3 per voorwaarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Dosis-respons op BDM in gemanipuleerde skeletspierweefsels . (A) De absolute spierkracht neemt op een dosisafhankelijke manier af wanneer primaire cel-afgeleide EMT's worden blootgesteld aan 2,3-butaandionemonoxiem (BDM) op dag 16 in 3D-cultuur. Absolute twitch-kracht keert terug naar bijna basiswaarden wanneer het medicijn wordt uitgewassen. (B) De absolute spierkracht genormaliseerd tot basiswaarden neemt af op een dosisafhankelijke manier bij blootstelling aan BDM, wat een volledige dosis-responscurve en IC50-waarde oplevert; n = 4 per dosis. Foutbalken zijn SD. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Deze studie beschrijft methoden voor het genereren van 3D-gemanipuleerde hart- en skeletspierweefsels in een 24-well verbruiksmateriaal gietset. Door deze methoden te volgen, is het mogelijk om consequent een complete reeks van 24 weefsels te bereiken zonder gietfouten voor daaropvolgende medicijnscreening. Kritische overwegingen voor het bereiken van een dergelijk resultaat zijn ervoor te zorgen dat tijdens het gieten alle stappen op ijs worden uitgevoerd om voortijdige polymerisatie van de hydrogels te voorkomen, verwijdering van celdissociatie-reagens voorafgaand aan weefselgieten, grondige menging van de cel en hydrogelsuspensie voor elk weefsel, vervanging van pipetpunten tussen weefsels en het gebruik van warmte-geïnactiveerde FBS (indien gebruikt). Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het paalrooster niet wordt verplaatst zodra het gieten begint en voorzichtig wordt overgebracht zodra hydrogels zijn gevormd.
Belangrijke wijzigingen omvatten het gebruik van verschillende celtypen om cardiale versus skeletale EMT's te bereiken en de doping van hydrogels met variabele concentraties van keldermembraaneiwitten om cellulaire rijping en weefselstabiliteit te bevorderen. De gunstige effecten van dergelijke doping moeten van geval tot geval worden getest, maar het is aangetoond dat het de functionele uitkomsten en de levensduur van het weefsel onder bepaalde omstandigheden verbetert14,16,22. Het is ook opmerkelijk dat de vermelde celdichtheden een gids zijn en mogelijk moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. Alternatieve hydrogelsamenstellingen kunnen ook worden beschouwd als een middel om de structurele en functionele eigenschappen van de bereikte EMT'ste wijzigen 23,24,25. De inheemse spiermicro-omgeving bevat ook ondersteunende celtypen om vascularisatie, innervatie en matrixafzetting te bevorderen om myocyten in vorm en functie te ondersteunen26,27. Hoewel het hier beschreven systeem momenteel fibroblasten in 3D-hartweefsels bevat, kunnen extra celtypen een meer fysiologisch relevant model creëren om de veiligheid en werkzaamheid van therapeutische verbindingen in vitro te bestuderen. Eerder zijn een reeks ondersteunende celtypen met succes geïntegreerd in 3D-gemanipuleerde weefsels die een opwindende sjabloon vormen voor toekomstig onderzoek met behulp van het magnetische detectiecontractiliteitsplatform28,29,30.
Probleemoplossing voor dit protocol richt zich op de vorming van onbetrouwbare of inconsistente weefsels tijdens het gietproces. Er moet voor worden gezorgd dat bubbelvorming in de hydrogels wordt voorkomen terwijl ze worden gegoten, terwijl de gelijkmatige verdeling van de cellen tijdens het mengen wordt vergemakkelijkt. Optimalisatie-experimenten zullen waarschijnlijk nodig zijn voor elk nieuw celtype om ideale celdichtheden, celverhoudingen en matrixsamenstelling te identificeren.
Een belangrijke beperking voor deze techniek is het aanzienlijke aantal cellen dat nodig is om een volledige plaat van 24 EMT's te vormen. Voor de hier gepresenteerde gegevens werden 15 miljoen cardiomyocyten en 18 miljoen skeletmyoblasten per plaat gebruikt. Bepaalde onderzoekers hebben mogelijk geen toegang tot dergelijke grote pools celmateriaal, wat hun vermogen om dit platform ten volle te gebruiken kan belemmeren. Als eindgebruikers geen toegang hebben tot magnetische detectiehardware, moeten metingen van postafbuigingen optisch worden uitgevoerd, wat de doorvoer aanzienlijk vermindert en de gelijktijdige registratie van spiercontracties over meerdere putten voorkomt. De Mantarray-hardware overwint deze beperkingen echter om het eerste commerciële systeem te bieden dat in staat is tot continue, niet-invasieve analyse van EMT-contractie tegelijkertijd over meerdere constructies.
Magnetische detectie in 24 putten vergemakkelijkt longitudinale studies van EMT-functionele ontwikkeling in realtime en maakt nauwkeurige meting van acute reacties op chemische, milieu- of genetische manipulatie mogelijk. Hoewel magnetische detectie verschillende voordelen heeft, zoals gelijktijdige meting over meerdere weefsels, en geen ingewikkelde gegevensanalyse vereist, maken optische detectiemethoden gelijktijdige meting van fysiologische metrieken mogelijk, zoals calciumflux of spanningskartering. Datasets zoals die in de resultatensectie worden geïllustreerd, tonen echter de breedte van de toepassingen die deze technologie heeft in de ontwikkelingsruimte van geneesmiddelen. Gezien het feit dat weinig testen op de markt de middelen bieden om een directe beoordeling van contractiele output in engineered muscle uit te voeren, hebben deze methoden het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de preklinische ontwikkelingspijplijn.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers en aandeelhouders in Curi Bio Inc., het bedrijf dat de Mantarray-hardware en bijbehorende software commercialiseert.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van de Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 toegekend aan het Health and Environmental Sciences Institute) en door financiering van de National Institutes of Health (HL151094 aan Dr. Geisse). Wij danken Dr. Alec S. T. Smith voor zijn hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary - DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary - MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
- Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
- Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
- Scheraga, H. A.
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
- Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
- Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
- Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
- Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
- Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
- Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
- Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
- Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
- Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
- Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
- Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
