Summary
Denne protokollen gir metoder for å generere 3D-konstruerte hjerte- og skjelettmuskulaturvev og beskriver deres bruk i prekliniske legemiddelscreeningsmodaliteter. De beskrevne metodene benytter et magnetisk sensorsystem for å lette samtidig vurdering av 24 vev parallelt.
Abstract
Nøyaktig modellering av friske og sykdomstilstander in vitro er avgjørende for utviklingen av nye behandlingsstrategier og terapier. For hjerte- og skjelettmuskelsykdommer utgjør kontraktil kraft og kinetikk nøkkeltall for vurdering av muskelfunksjon. Nye og forbedrede metoder for å generere konstruerte muskelvev (EMT) fra induserte pluripotente stamceller har gjort in vitro sykdomsmodellering mer pålitelig for kontraktilt vev; Imidlertid er reproduserbar fremstilling av vev fra suspenderte cellekulturer og måling av kontraktiliteten utfordrende. Slike teknikker er ofte plaget med høye feilrater og krever kompleks instrumentering og tilpassede dataanalyserutiner. En ny plattform og enhet som bruker 3D-EMT-er sammen med en etikettfri, svært parallell og automatiseringsvennlig kontraktilitetsanalyse omgår mange av disse hindringene. Plattformen muliggjør enkel og reproduserbar fabrikasjon av 3D-EMT-er ved bruk av praktisk talt alle cellekilder. Vevskontraktilitet måles deretter via et instrument som samtidig måler 24 vev uten behov for komplekse programvareanalyserutiner. Instrumentet kan på en pålitelig måte måle mikronewtonendringer i kraft, noe som muliggjør doseavhengig sammensatt screening for å måle effekten av et legemiddel eller terapeutisk på kontraktil utgang. Konstruerte vev laget med denne enheten er fullt funksjonelle, genererer rykninger og tetaniske sammentrekninger ved elektrisk stimulering, og kan analyseres i lengderetningen i kultur over uker eller måneder. Her viser vi data fra hjertemuskel-EMT under akutt og kronisk dosering med kjente toksiske stoffer, inkludert et legemiddel (BMS-986094) som ble trukket fra kliniske studier etter pasientdødsfall på grunn av uventet kardiotoksisitet. Endret skjelettmuskulaturfunksjon i konstruert vev som respons på behandling med en myosinhemmer presenteres også. Denne plattformen gjør det mulig for forskeren å integrere komplekse, informasjonsrike bioengineered modellsystemer i deres arbeidsflyt for narkotikaforskning med minimal tilleggsopplæring eller ferdigheter som kreves.
Introduction
Induserte pluripotente stamcellemodeller (iPSC) blir i økende grad sentrale aktører i den prekliniske rørledningen for terapeutisk oppdagelse og utvikling, samt grunnleggende biologisk forskning og sykdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktilt vev, som hjerte- og skjelettmuskulatur avledet fra iPSCs, har stort potensial for å forbedre den prediktive kraften til humane in vitro-studier, da direkte vurdering av muskelkontraktil kraft og kinetikk er kvantitative beregninger for å studere total vevsfunksjon 4,6,7,8. Vanligvis har målinger av kontraktil kraft blitt oppnådd enten indirekte ved optisk sporing av substratavbøyning 9,10 eller direkte ved festing av celler / vev til en krafttransduser4,11,12. Disse metodene, selv om de er nøyaktige, har iboende lav gjennomstrømning og krever vanligvis dyktige operatører for å samle inn og analysere data.
Tidligere arbeid har vist at magnetfeltføling omgår disse hindringene og gir en alternativ metode for å vurdere konstruert muskelfunksjon samtidig over flere vevskonstruksjoner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denne teknologien ved hjelp av en enhet som er i stand til å måle kontraktiliteten til konstruerte muskelvev på en svært parallell måte som utnytter kompleksiteten til 3D-cellulære modeller med høyere gjennomstrømningsscreening14. Plattformen muliggjør etikettfri, kvantitativ, sanntidsovervåking av kontraktil funksjon i hjerte- og skjelettmuskulaturvev i eller utenfor en standard cellekulturinkubator, og eliminerer behovet for optisk-basert kontraktil avbildning og analyse. Denne teknologien muliggjør direkte sammenligning av friske og syke cellelinjer og muliggjør måling av et legemiddels effekt på kontraktilt vev, etablering av kvantifiserbare, in vitro, sikkerhets- og effektdata for nye og eksisterende terapeutiske forbindelser.
Konstruert 3D-muskelvev kan fremstilles mellom to stolper på en svært reproduserbar måte ved hjelp av Mantarray forbruksvare, 24-brønns støpeplate (figur 1). Det ene innlegget er stivt, mens det andre innlegget er fleksibelt og inneholder en liten magnet. Når vevskonstruksjonen trekker seg sammen, fortrenger den den fleksible stolpen og den innebygde magneten. EMT-platen er plassert i instrumentet, og etter forskyvning måles via en rekke magnetiske sensorer på et kretskort under plateholderen. De målte endringene i magnetfeltet omdannes til absolutt kontraktil kraft ved hjelp av en matematisk algoritme. Instrumentet benytter raske datasamplingshastigheter for å muliggjøre innsamling av detaljert informasjon om funksjonell kapasitet og modenhet av celletypen (e) som analyseres, inkludert sammentrekningsfrekvens, hastighet og forfallstid. Disse funksjonelle målingene kan oppnås på tvers av alle 24 brønner samtidig med magnetisk sensorplattform eller individuelt og sekvensielt ved hjelp av tradisjonelle optiske metoder.
Denne studien beskriver en svært reproduserbar metode for engineering 3D skjelettmuskulatur og hjerte mikrovev i en fibrinbasert hydrogel. Under en kort, 80-minutters reaksjon katalyserer trombin omdannelsen av fibrinogen til fibrin, og gir et stillas for muskelceller å utvikle seg i suspendert kultur15. Stromale celler hjelper til med å omforme matrisen og vev blir kontraktile ettersom muskelceller danner et syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten til disse vevene ble analysert ved hjelp av magnetisk sensing-tilnærming, både før og etter sammensatt eksponering, og validerte denne modaliteten for bruk i dose-respons-legemiddelstudier. Primære humane myoblaster fra en frisk donorbiopsi ble oppnådd kommersielt og dyrket i 2D i henhold til leverandørens protokoller. Celler ble utvidet ved hjelp av et skjelettmuskulaturvekstmedium gjennom tre passasjer for å generere tilstrekkelige cellenumre til å fremstille 3D-vev. Stromale celler og hiPSC-avledede kardiomyocytter ble dyrket i henhold til leverandørens protokoll i 3 dager for å tillate utvinning fra kryopreservering før støping av celler i vev. Representative resultater er gitt som illustrerer hvilke typer datasett som kan samles inn ved hjelp av magnetisk sensorplattform. Vanlige fallgruver forbundet med generering av konstruerte vev ved hjelp av disse metodene blir også adressert.
Protocol
1. Protokoll for cellekultur
- Primær human myoblastkultur
- Fortynn den ekstracellulære matriksen (ECM) i forholdet 1:100 i 8 ml DMEM/F12-medium på is.
- Påfør 8 ml ECM-oppløsning på en T175-kolbe og inkuber ved 37 °C i minst 1 time før cellesåing, men ikke mer enn 24 timer. Forsikre deg om at ECM-løsningen dekker hele kolbebunnen.
- Aliquot 5 ml av skjelettmuskelvekstmediet til et 15 ml konisk rør.
- Tine et frossent hetteglass med celler (5,0 x 105 myoblaster) i et vannbad ved 37 °C i 2 minutter eller til isen nettopp har smeltet. Spray hetteglasset med 70% etanol og overfør det til et biosikkerhetsskap (BSC).
- Overfør cellene til aliquoted medium ved hjelp av en P1000. Ikke triturer. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 3 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1 ml av vekstmediet ved hjelp av en P1000-pipette for å oppnå en enkeltcellesuspensjon.
- Vask den ECM-belagte kolben med 15 ml DPBS. Aspirer DPBS, og tilsett deretter 30 ml av vekstmediet til kolben.
- Tilsett 4 ml av vekstmediet til cellene, bland og fordel cellesuspensjonen i T-175-kolben. Forsikre deg om at totalvolumet er 35 ml. Skyv kolben forsiktig langs arbeidsflaten til venstre og høyre 5-6 ganger etterfulgt av frem og tilbake 5-6 ganger for å sikre jevn fordeling av celler på kolbeoverflaten.
- Plasser T-175-kolben i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Kultur cellene i 3 dager eller til de ikke når mer enn 70% sammenløp, og deretter passere cellene.
- Passerende primære humane myoblaster
- Fortynn ECM i forholdet 1:100 i 30 ml DMEM/F12-medium på is.
- Påfør 10 ml ECM-oppløsningen på tre T225-kolber og inkuber ved 37 °C i minst 1 time før cellesåing, men ikke mer enn 24 timer. Sørg for at ECM-løsningen dekker hele kolbebunnen.
- Vask cellene med 15 ml DPBS. Aspirer og tilsett dissosiasjonsreagenset i henhold til leverandørens protokoll.
- Når cellene er løftet, stopp reaksjonen i henhold til leverandørens protokoll og samle cellene i et konisk rør. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 3 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1 ml av vekstmediet ved hjelp av en P1000-pipette for å oppnå en enkeltcellesuspensjon.
- Vask den ECM-belagte kolben med 15 ml DPBS. Aspirer DPBS, og tilsett deretter 40 ml av vekstmediet til hver T225-kolbe.
- Tilsett 14 ml av vekstmediet til cellesuspensjonen, bland og fordel 5 ml av cellesuspensjonen til hver T225-kolbe. Forsikre deg om at det totale volumet i hver kolbe er 45 ml. Skyv kolben forsiktig langs arbeidsflaten til venstre og høyre 5-6 ganger etterfulgt av frem og tilbake 5-6 ganger for å sikre jevn fordeling.
- Plasser kolbene i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
- Kulturceller i 2-3 dager eller til de ikke når mer enn 70% sammenløp, og deretter passasje. Del cellene ved 1:3 eller 1:4 ved hver passasje og frø mellom 3 x 103 og 1 x 104 celler/cm2.
- hiPSC-avledet kardiomyocytdyrkning
- Fortynn ECM i forholdet 1:60 i 12 ml DMEM/F12-medium på is.
- Påfør 1 ml ECM-oppløsning på hver brønn med to 6-brønnsplater og inkuber ved 37 °C i minst 1 time før cellesåing, men ikke mer enn 24 timer.
- Tine et frossent hetteglass med kardiomyocytter i et vannbad ved 37 °C i 2 minutter eller til isen nettopp har smeltet.
- Spray hetteglasset med 70% etanol og overfør det til BSC.
- Bruk en p1000-pipette til å overføre de tinte cellene til et 50 ml konisk rør.
- Skyll den tomme kryovialen med 1 ml romtemperatur (RT) platingmedium for å gjenopprette eventuelle gjenværende celler.
- Dispenser sakte 1 ml skyllemedier dråpevis (en dråpe hver 5. s) inn i det koniske røret av celler i løpet av 90 s. Virvle røret kontinuerlig for å blande cellene under tilsetningen av langsomme medier.
- Tilsett sakte 8 ml av pletteringsmediet ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette til den 50 ml koniske cellerøret.
- Etter at alle mediene er dispensert, pipetter du forsiktig opp og ned 3 ganger for å blande cellene grundig. Telle celler ved hjelp av et hemacytometer og trypan blå.
- Sentrifuger cellene i det koniske røret på 50 ml ved 300 x g i 3 minutter.
- Etter at cellene har blitt pelletert, aspirerer supernatanten.
- Bruk en p1000-pipette til å overføre 1 ml av pletteringsmediet til røret og bryt forsiktig opp pelleten ved å pipettere sakte opp og ned 3-5 ganger. Resuspender cellene med et ekstra pletteringsmedium.
- Frø mellom 2-4 x 10 6 celler per brønn av en6 brønnplate i 2 ml av pletteringsmediet.
- Vask ECM-belagte 6-brønnsplater med DPBS (2 ml/brønn).
- Pipette 2 ml cellesuspensjon per brønn på en 6 brønnplate. Beveg platene forsiktig langs arbeidsflaten til venstre og høyre 5-6 ganger etterfulgt av frem og tilbake 5-6 ganger for å sikre jevn fordeling av celler på plateflatene.
- Plasser platen i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
- Gjenta trinn 1.3.3-1.3.16 for alle hetteglass med cellene som skal tines.
- Bytt til 3-5 ml (avhengig av cellelinje og tetthet) vedlikeholdsmedium neste dag etter plating, og bytt deretter medium annenhver dag. Dyrkningsceller i 3-4 dager før de kastes inn i 3D-vev.
- Stromal cellekultur
- Påfør 30 ml ECM-oppløsning på en T175-kolbe og inkuber ved 37 °C i minst 1 time før cellesåing, men ikke mer enn 24 timer.
- Aliquot 5 ml av stromalcellemediet til et 15 ml konisk rør.
- Tine et frossent hetteglass med stromale celler i et vannbad ved 37 °C i 2 minutter eller til isen nettopp har smeltet.
- Spray hetteglasset med 70% etanol og overfør det til BSC.
- Bruk en p1000-pipette til langsomt å tilsette 1 ml av stromalcellemediet til de tinte cellene i hetteglasset.
- Overfør cellesuspensjonen fra hetteglasset til det gjenværende tinemediet i det koniske røret. Bruk en 5 ml serologisk pipette til å blande cellene. Pipette opp og ned 3 ganger.
- Telle cellene ved hjelp av et hemacytometer og trypan blå. Ikke spinn ned celler.
- Vask den ECM-belagte T175-kolben med 15 ml DPBS.
- Overfør stromale celler til kolben med en tetthet på 3-4 x 103 celler/cm2. Skyv kolben forsiktig langs arbeidsflaten til venstre og høyre 5-6 ganger etterfulgt av frem og tilbake 5-6 ganger for å sikre jevn fordeling av celler på kolbeoverflaten.
- Bytt medier neste dag med 45 ml oppvarmet stromalcellemedium. Dyrk cellene i 3-4 dager før du kaster inn i 3D-vev.
2. Materiell forberedelse
- Fibrinogen
MERK: Når du rekonstituerer fibrinogen, må du passe på å maksimere mengden overflate som fibrinogenpulveret legges lagvis på. I denne protokollen ble mengden fortynningsmiddel som ble brukt optimalisert til størrelsen på beholderen som ble brukt, det vil si at akkurat nok fortynningsmiddel ble brukt til å dekke bunnen av fatet. For eksempel, lag 0,5 g fibrinogen over 10 ml PBS i en 100 mm tallerken i stedet for et 50 ml sentrifugerør. Maksimering av mengden overflateareal av fortynningsvæsken vil redusere tiden som trengs for å rekonstituere fibrinogenet og redusere potensiell klumping av protein.- Rekonstituering
- Overfør 10 ml PBS til en 100 mm cellekulturskål og varm til 37 °C i en cellekulturinkubator.
- Legg 0,5 g fibrinogenpulver over hele overflaten av varm PBS og hold ved 37 °C til fibrinogenet er fullstendig oppløst. Dette bør ikke ta mer enn 2 timer. Det oppløsende pulveret kan roteres forsiktig, men ikke rist fatet kraftig.
- Steril filtrering
- Når pulveret er fullstendig oppløst, kjør oppløsningen gjennom et 100 μm filter og samle det inn i et 50 ml konisk rør for å fjerne eventuelle klumper av gelert fibrinogen.
- Hell den filtrerte oppløsningen i en 10 ml sprøyte med et 0,2 μm filter. Skyv oppløsningen gjennom filteret og samle den opp i et nytt 50 ml konisk rør. Det kan være nødvendig å skifte filteret mer enn én gang for å sterilisere alle 10 ml oppløsningen.
- Aliquot 300 ml sterilfibrinogen i 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 °C. Tine alikotene på is eller ved 4 °C etter behov. Unngå gjentatt frysing/tining.
- Rekonstituering
- Trombin
- Tilsett 6 ml PBS og 4 ml diH2O direkte i ett hetteglass med trombin (1 KU) for å lage en 100 E/ml trombinoppløsning.
- Filtrer steriliser med et 0,2 μm filter, alikot, og oppbevar ved -20 ° C i 1,5 ml plastmikrosentrifugerør som trombin adsorberer til glass. Unngå gjentatt frysing/tining.
- Poly (etylenimin) løsning (PEI)
FORSIKTIG: PEI er giftig. Bruk egnet PPE som angitt av produsenten.
MERK: PEI leveres som en 50 % w/v-løsning. Det er svært tyktflytende og vanskelig å pipette. Lag en 0,1 % løsning fra en 10 % lagerløsning i stedet for direkte fra 50 % w/v-løsningen.- Mål 5 ml 50 % w/v PEI-oppløsning i et 50 ml konisk rør.
- Tilsett 20 ml diH2O og bland for å gi en 10 % stamløsning. Denne høykonsentrerte stamløsningen kan ikke filtreres sterilt.
- For å lage en 0,1% løsning for cellekultur, tilsett 5 ml 10% lager til 495 ml diH2O. Sterilt filter ved hjelp av en 500 ml filterkolbe og oppbevar ved RT i ikke lenger enn 1 uke.
- Glutaraldehyd
FORSIKTIG: Glutaraldehyd er giftig. Bruk egnet PPE som angitt av produsenten.- Glutaraldehyd leveres som en 25% løsning. For å lage en 0,01% løsning, tilsett 40 μL til 99,6 ml diH2O. Sterilt filter og oppbevar ved 4 °C i ikke lenger enn 1 uke.
- Post forberedelse
- Plasser forbruksvarer vevstøpesett inne i en steril kultur hette. Støpesettet inneholder et lokk, et stolpegitter som inneholder 24 par stolper (ett par stolper per brønn på en 24-brønnsplate), og en spesialisert 24-brønns platebunn som inneholder 24 støpebrønner. Hver støpebrønn inneholder en grøft i bunnen av brønnen for å holde cellen / hydrogelkomponentene og støpe dem til et rørformet vev når hydrogelen polymeriserer (figur 1B).
- Fyll brønnene på en 24-brønns plate med 1,5 ml / brønn av en 0,1% PEI-løsning og plasser stolper i plate slik at spissene på hvert par stolper er nedsenket. La den sitte i 10 min. PEI vil sette inn en positiv ladning på stolpene slik at proteiner i hydrogelen fester seg godt til stolpene under vevstøping.
- Fyll brønnene på en annen 24-brønns plate med 2 ml / brønn av steril diH2O og overfør stolpene. La den sitte i 1 min.
- I en tredje 24-brønns plate, fyll brønnene med 1,5 ml / brønn på 0,01% glutaraldehyd (GA) og overfør stolpene. La den sitte i 30 min. GA vil fikse den positive ladningen fra PEI til innleggene.
- Mens stolpene sitter i glutaraldehyd, aspirer diH 2 O-brønnene, vask med 2 ml/brønn steril diH 2 O, aspirer og fyll påmed 2 ml/brønn steril diH2O. En fersk, 24-brønns plate kan brukes i stedet for å skylle.
- Når 30 min er oppe, overfør stolpene til 2 ml/brønn med steril diH2O. La den sitte i 1 min.
- Aspirer diH 2 Oog tilsett ytterligere 2 ml/brønn med steril diH2O. La den sitte i 5 min.
- Overfør stolpene til en 24-brønns plate for å tørke (ca. 15 min).
- Når det er tørt, monter du støpesettet igjen. Parafilm kantene for å forsegle lokket og platen sammen, og oppbevar deretter ved 4 °C i opptil 72 timer før cellesåing. Lengre lagringstid er sannsynligvis mulig, men har ikke blitt testet.
3. Vevstøping protokoll
- Forberedelse av støpeplate
- Forkjøl vevstøpesettet ved 4 °C.
- Overfør en bøtte med is til BSC. På is, lag 50 μL trombinoppløsning (3 μL trombinbestand + 47 μL EMT-medium) per brønn som skal støpes.
MERK: Se trinn 3.2.1 for detaljer om EMT-medium. - Fjern det avkjølte støpesettet fra kjøleskapet og legg det på en kald blokk eller is inne i cellekulturhetten. Legg støpeplaten flatt på is og flytt stolpegitteret fra støpeplaten til en ny, steril 24-brønnsplate.
- Pipette 50 μL trombinoppløsning i hver forkjølt brønn på støpeplaten.
- Sett sammen settet igjen og sett det tilbake i kjøleskapet til det trengs for støping av vev. Kast vevet innen 3 timer etter trombin i tillegg til brønnene.
- Cell forberedelse
- Forbered EMT-basemedium, sterilt filter og la det ligge på is.
MERK: Hvis cellespesifikt støpemedium inneholder FBS, bruk varmeinaktivert FBS, da det kan interagere med fibrinogen og forårsake for tidlig polymerisering.- Forbered hjerte-EMT-medium: Tilsett 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 og 2,5 g aminokapronsyre. (Valgfritt) Tilsett 10 mM ROCK-hemmer (tilsett kun EMT-mediet som brukes til støping av vev og ikke hele 500 ml volumet).
- Forbered skjelett-EMT-medium: Tilsett 50 ml F10-medium og 0,25 g aminokapronsyre (ACA) for primære EMT og 0,1 g ACA for iPSC-avledede EMT-er.
- Varm cellekulturgradens dissosiasjonsreagens til 37 °C. Varm et like stort volum EMT-medium for å fortynne dissosiasjonsreagenset.
MERK: Det er viktig at proteasen som brukes er fullstendig inaktivert. Aktiv protease vil forstyrre 3D-vevsdannelse og etterlevelse. - Vask cellene (figur 1A) med PBS. Bruk 2 ml / brønn for en 6-brønns plate. Bruk 6 ml, 15 ml og 15 ml til henholdsvis 100 mm tallerken, T175-kolbe og T225-kolbe.
- Tilsett det oppvarmede dissosiasjonsreagenset for cellekultur for å løfte cellene og inkubere ved 37 °C i 5 minutter eller til cellene har løftet seg. For hjertekulturer, bruk 10x dissosiasjonsreagenset. For stromale celler og skjelettmuskulatur myoblaster, bruk et 1x dissosiasjonsreagens. Bruk 1 ml / brønn for en 6-brønnsplate, 3 ml for en 100 mm tallerken, 8 ml for en T175-kolbe og 10 ml for en T225-kolbe.
- Sjekk kulturene hver 2-3 min ved å banke på siden av platen.
- Når cellene har løftet, overfør dem til et 50 ml konisk rør og triturere med en P1000-pipette for å sikre en encellesuspensjon.
- Vask platen eller kolben med et ekstra EMT-medium for å samle de gjenværende cellene og legge dem til det koniske røret. Bruk 1 ml / brønn av EMT-mediet for en 6-brønnsplate, 2 ml for en 100 mm tallerken, 5 ml for en T175-kolbe og 5 ml for en T225-kolbe.
- Triturere cellene for å sikre en enkelt celle suspensjon.
- Legg til EMT-medium for å avslutte dissosiasjonsprosessen, og ta deretter prøver av cellesuspensjonene for celletelling. Bruk 1 ml / brønn for en 6-brønnsplate, 3 ml for en 100 mm tallerken, 8 ml for en T175-kolbe og 10 ml for en T225-kolbe.
- Spinn cellene ved 200 x g i 4 minutter. Utfør celletellinger ved hjelp av et hemacytometer og trypanblå mens suspensjonene sentrifugeres.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 5 ml EMT-basemedium for å fjerne det gjenværende dissosiasjonsreagenset.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 4 minutter. Aspirer supernatanten og klargjør cellesuspensjonene ved passende tettheter.
- Øk levetiden og funksjonen til 3D-skjelettmuskulatur-EMT med tillegg av 10% -20% ECM-proteiner i EMT-mediet14,16.
- Frøstamcelleavledede kardiomyocytter og deres stromale celler ved henholdsvis 5 x 10 5 celler og7,5 x 104 celler per vevskonstruksjon. Frø skjelettmuskulaturen myoblaster ved 7,5 x 105 celler per vev konstruere.
- Hjerte vev
- Aspirer supernatanten og resuspender stromale celler med en tetthet på 2,5 x 106 celler per ml i EMT-medium og legg dem på is. Bruk 30 μL av denne suspensjonen per EMT.
- Aspirer supernatanten og resuspender CMene med en tetthet på 8,3 x 106 celler per ml i EMT-medium og legg dem på is. Bruk 60 μL av denne suspensjonen per EMT.
- Skjelettmuskulatur vev
- Aspirer supernatanten og resuspender skjelettmuskelcellene med en tetthet på 8,3 x 106 celler per ml i EMT-medium og legg dem på is. Bruk 90 μL av denne suspensjonen per EMT.
- Beregn volumene av hver celleoppløsning som kreves for å utgjøre ønsket antall vev (f.eks. 60 μL av de fremstilte CM og 30 μL av de preparerte stromale celler eller 90 μL av skjelettmuskelcellene per EMT).
- Pipett de beregnede volumene av celler inn i et 15 ml konisk rør.
- Tilsett 10 μL fibrinogen per EMT til cellesuspensjonen og hold den på is.
- Totale reagenser og cellevolum per EMT: Sørg for at hver EMT har 90 μL celler, 10 μL fibrinogen og 50 μL trombinoppløsning.
- Forbered EMT-basemedium, sterilt filter og la det ligge på is.
- Vev støping
- Overfør vevstøpesettet til en cellekulturhette og fjern lokket (stolpegitter som inneholder fleksible og stive stolper skal forbli på støpeplaten; Figur 1B). Hold støpeplaten med stolpegitter liggende flatt på is.
- Bland cellen/fibrinogenblandingen og trekk opp 100 μL med en P200-pipette.
- Tilsett 100 μl av blandingen til brønner fremstilt med 50 μL trombinoppløsning og triturer 5 ganger for å blande godt. Ikke skyv pipetten forbi første stopp og fjern spissen etter triturering for å unngå å skape bobler.
- På dette stadiet, og til stolpegitteret er klart til å løftes fra støpeplaten (trinn 3.3.10), kan enhver bevegelse av gitteret kompromittere den langsiktige festingen av vevet til stolpene. Hold både gitteret og støpebrønnplaten samtidig ved hjelp av pekerfingeren og tommelen på den ene hånden for å unngå bevegelse av gitteret.
- Gjenta med en fersk P200-spiss for hvert vev til alle vevene er støpt. Bland cellesuspensjon i et 15 ml konisk rør før du støper hvert vev ettersom cellene raskt legger seg.
- Overfør forsiktig frøsettet til inkubatoren, og pass på at du ikke flytter gitteret. Bevegelse av gitter etter såing kan føre til redusert suksess ved overføring av vev ut av støpebrønnene. Inkuber ved 37 °C i 80 minutter, uavhengig av celletype. Dette vil starte polymerisasjonen av hydrogelen og tillate proteiner å feste seg til stolpene.
- I mellomtiden forbereder du en fersk 24-brønnsplate med 2 ml / brønn av EMT-mediet for hjertevev. 10 mM ROCK-hemmer kan tilsettes EMT-mediet om ønskelig. Inkuber platen ved 37 °C for å varme opp mediet.
- Klargjør 2 ml/brønn vekstmedium som inneholder 5 g/l aminokapronsyre (0,2 mm sterilt filtrert) for primært skjelettmuskelvev eller 2 g/l ACA for iPSC-deriverte EMTer. Inkuber platen ved 37 °C for å varme opp mediet.
- Etter inkubering, tilsett forsiktig 1 ml av EMT-mediet til kanten av støpebrønnene og inkuber i ytterligere 10 minutter ved 37 °C, uavhengig av celletype. Dette vil løsne hydrogelen fra kantene av støpebrønnen og tillate enkel overføring av vevet.
- Etter 10 min, løft forsiktig stolpegitteret og overfør vevet fra støpeplaten til en forberedt 24-brønnsplate med medium (figur 1C). Sett platene med vev tilbake til cellekulturinkubatoren ved 37 °C.
- Vedlikehold
- Etter 24 timer overføres det støpte vevet til en fersk 24-brønns plate med 2 ml/brønn av EMT-mediet (uten ROCK-hemmeren hvis den er inkludert) og inkuberer ved 37 °C. For skjelettmuskelceller, bytt vekstmediet til differensieringsmediet for å fremme myoblastfusjon.
- Overfør hjertevevet til ferske brønner med 2 ml/brønn av EMT-mediet hver 2-3 dag.
- Overfør skjelettmuskelvevet til ferske brønner med 2 ml/brønndifferensieringsmedium inneholdende 5 g/l aminokapronsyre (0,2 mm sterilfiltrert) hver 2-3 dag. Bruk 2 g / l ACA for iPSC-avledet vev.
- For å hjelpe til med middels endringer, overfør stolpegitteret til en fersk 24-brønnsplate i stedet for å endre mediet i samme plate for å unngå å skade 3D-vevet. Forbered en andre 24-brønnsplate med EMT-mediet og overfør vevet til det friske mediet. Hold tallerkenen med det gamle mediet sammen med den aktive kulturen som skal brukes til neste mediumendring. Overfør postgitteret frem og tilbake mellom de to platene gjennom kulturperioden. Alternativt kan du bruke en ny tallerken for hver middels endring.
- Mål EMT-kontraksjonen enten via optisk sporing av postavbøyning (figur 1D) eller magnetisk sensormaskinvare13,14. Hjertevev begynner å slå spontant etter 3-4 dager i kultur. Skjelettmuskulaturvev er vanligvis kontraktilt med elektrisk feltstimulering etter 7 dager i kultur.
Representative Results
Celler ble støpt inn i konstruert muskelvev i 2-post forbruksplaten (figur 1). Vellykkede EMT-er vil virke ensartede, og matrisen vil være jevnt fordelt mellom innleggene (figur 2A). Matrisen skal også vikle seg rundt begge stolpene, og produsere ekvivalente ankerpunkter for vevet. Feil i støping er sjeldne med denne metoden og er vanligvis åpenbare med en visuell inspeksjon. Mislykket EMT-produksjon kan variere fra katastrofale feil, for eksempel vevsavløsning fra stolpene (figur 2B) til mer subtile strukturelle feil, for eksempel luftbobler og løs festing til stolpene (figur 2C, D). Vev med mindre feil kan fortsatt være levedyktige, men dataene fra disse vevene bør undersøkes nøye for å sikre at det er sammenlignbart med kompromissløse EMT. For eksempel kan luftbobler i en EMT presses ut når vevet komprimeres over tid, noe som gir en fullt funksjonell konstruksjon uten kontraktile mangler. Disse vevene må imidlertid vurderes i hvert enkelt tilfelle, da plasseringen av luftboblene kan påvirke funksjonell restitusjon. Luftbobler generert på innleggene, for eksempel, kan påvirke vevsfeste, noe som kan hindre langvarig overholdelse av innlegget.
Vev begynner å komprimere i løpet av de første 24 timene når celler ombygger matrisen i hydrogelen (figur 3). Komprimering er en gradvis prosess og fortsetter vanligvis i løpet av de første 2-4 ukene av kulturen. Samlet sett er vevskomprimering konsistent mellom tekniske og biologiske replikater (figur 4). Det er normalt for noen cellelinjer å komprimere matrisen mer enn andre ettersom vev modnes over tid. Prosentandelen av myogene celler i en konstruksjon påvirker hastigheten og den totale graden av EMT-komprimering. Totalt myogent innhold for både hjerte- og skjelettmuskelcellelinjer bør være over 80% for å minimere variasjon mellom konstruerte vev. Dette er spesielt viktig når man sammenligner kontraktile krefter og kinetikk på tvers av cellelinjer.
I løpet av de første dagene etter støping begynner kardiomyocytter å spontant slå i kultur, rytmisk bøye det fleksible innlegget med hver muskelkontraksjon. Skjelettmuskelkonstruksjoner trekker seg sammen som respons på elektrisk stimulering innen dag 7 etter start av differensiering. Feltstimulering ble påført skjelettmuskulaturvev via en ekstern stimulator festet til et tilpasset 24-brønns elektrodelokk. Lokket, produsert med et par karbonelektroder for hver brønn, sitter på toppen av den 24-brønns platen av vev, samtidig som hver EMT stimulerer til å indusere muskelkontraksjoner. Vev ble tempoet ved hjelp av en 10 V stimulus for 10 ms pulsvarighet ved 1 Hz under funksjonelle målinger. Kontraktile vev indikerer skjelettmyoblaster som har smeltet, danner myorør komplett med funksjonelle sarkomerer og kontraktilt maskineri. Skjelett-EMT er flekkpositivt for myosin heavy chain (MyHC) og dystrofin er lokalisert til myotubemembranen, og viser en klassisk ringform i tverrsnitts immunhistokjemisk analyse (figur 5). Når EMT er funksjonelt, kan kontraktilitet måles daglig i magnetisk sensorinstrument, sporingskraft og kinetikk etter hvert som konstruksjonene utvikles og modnes over tid. Både hjerte- og skjelettmuskelvev forblir kontraktilt i uker til måneder i 3D-kultur (figur 6), og de kan brukes til et bredt spekter av kontraktilitetsstudier.
Den magnetiske deteksjonsmetoden kan brukes til samtidig å måle akutte og kroniske effekter av strukturelle kardiotoksiske stoffer, som doksorubicin (figur 7) og BMS-986094 (figur 8), samt andre legemidler som påvirker muskelkontraktiliteten. Optiske sporingsmetoder for kontraksjonsdeteksjon kan også brukes, men man må være forsiktig når man studerer akutte legemiddeleffekter, da målinger må tas sekvensielt. Den forlengede levetiden til hjerte- og skjelett-EMT i 3D-kultur muliggjør langsiktige legemiddelstudier i disse vevene. Dette tillater brukere å utforske effekten av gjentatt dosering, samt vedvarende, langsiktig eksponering for forbindelser som kan vise kardiotoksiske effekter over tid som forekommer med doksorubicin. Doksorubicin (dox) er et anti-kreft kjemoterapi stoff17. Mengden medikament administrert til pasienter varierer, avhengig av type kreft, pasientens alder, pasientens høyde og vekt, samt andre faktorer. Av denne grunn er det viktig å teste effekten av dox over et bredt spekter av konsentrasjoner og leveringsplaner. Her ble hjerte-EMT behandlet i løpet av 27 dager med tre separate konsentrasjoner (0,1 μM, 1 μM og 10 μM) dox (figur 7). Gruppene ble stratifisert videre ved å behandle EMT ved hver konsentrasjon med enten bolusbehandling eller kontinuerlig administrering med middels endring hver 72. time. Wells som fikk bolusbehandlinger av dox ble eksponert for stoffet ved tre separate tidspunkter, noe som muliggjorde gjenoppretting mellom dosering. De to høyeste dosene med bolus og kontinuerlig eksponering viste en umiddelbar og langvarig opphør av kontraktil kraftgenerering gjennom hele studien. Den midtre og laveste konsentrasjonen hadde varierende effekter på vevet, avhengig av administrasjonsmetode. I den laveste konsentrasjonen av legemidlet viste bolusgruppen ingen forskjell fra kontrollene. Kontraktilkraften ble imidlertid redusert etter 2 uker med kontinuerlig eksponering. Den midtre konsentrasjonen av stoffet hadde en interessant effekt. Mens kontinuerlig dosering reduserte kraften i løpet av de første par dagene av behandlingen og varte gjennom hele forsøket, viste bolusgruppen en gjenoppretting av kontraktil kraft tilbake til kontrollnivåer når legemidlet ble vasket ut etter 3 dager. Den andre bolusen av legemidlet forårsaket imidlertid full opphør av kraft, etterfulgt av ingen utvinning (figur 7), noe som indikerer at gjentatt dosering ved denne konsentrasjonen kan ha en kardiotoksisk effekt hos pasienter behandlet med dette legemidlet. Det brede omfanget av denne studien, både i tid og eksperimentelle forhold, fremhever bruken av 3D-konstruerte vev i toksisitetsscreening, da de forblir kontraktile og reagerer på kjemisk eksponering over lengre perioder, noe som muliggjør langsiktige legemiddelstudier innenfor et enkelt sett med muskelvev. Dette gjør det ikke bare mulig å identifisere forbindelser som kan ha en kardiotoksisk effekt ved kronisk eksponering, men også å oppdage potensiell kardiotoksisk administreringstid.
In vitro toksisitetstesting i konstruert humant muskelvev er en måte å bidra til å holde menneskelige pasienter trygge i kliniske studier. BMS-986094 er en nukleotidpolymerase (NS5B) hemmer som brukes til å behandle hepatitt C. Legemidlet var i fase II klinisk utvikling da Bristol-Myers Squibb avsluttet utviklingen på grunn av flere tilfeller av uventet hjertesvikt hos pasienter18,19. Her ble BMS-986094 brukt på hjerte-EMT for å teste om 3D-konstruert muskelvev ville utvikle en kardiotoksisk reaksjon på stoffet (figur 8). Tre forskjellige konsentrasjoner av stoffet ble påført, og vev ble overvåket over 13 dager. Kontraktil kraft falt med tillegg av legemidlet på en doseavhengig måte (figur 8A). Twitch-frekvensen ble også signifikant påvirket da slagfrekvensen avtok og til slutt stoppet som forventet med fortsatt eksponering for kardiotoksisk forbindelse (p < 0,05, figur 8B). Disse resultatene demonstrerer hvordan 3D-konstruerte menneskelige muskelvev kan brukes til å lette å bringe nye stoffer til markedet og flagge forbindelser som til slutt mislykkes på grunn av kardiotoksisitet. Videre kan denne teknologien potensielt redde liv ved å eksponere farlige stoffer før de blir satt inn i pasienter i kliniske studier.
Evnen til å måle effekten av akutte og kronisk påførte legemidler på humant kontraktilt vev er et viktig første skritt når man undersøker terapi for sikkerhet og effekt. Det er imidlertid viktig å vite at konsentrasjonen av legemidler som anvendes er fysiologisk relevant og hensiktsmessig for in vitro-testing . Skjelettmuskelvev ble brukt til å etablere en IC50-verdi for 2,3-butandionmonoksim (BDM) i en full dose-responskurve. Dette stoffet er en godt karakterisert ATPase-hemmer av skjelettmuskulatur myosin-II20. BDM hemmer muskelkontraksjoner ved å forhindre myosin-kryssbrodannelse med aktinfilamentet i sarkomerer21. Resultatene vist her viser en doseavhengig reduksjon i absolutt kraft når legemidlet påføres og fullstendig gjenoppretting av kontraktil kraft når stoffet vaskes ut, noe som indikerer at den forbigående effekten forhindrer muskelkontraksjoner og ikke bare dreper celler i vevet (figur 9A). Videre ble en full dose-responskurve målt over de syv konsentrasjonene som ble undersøkt, og etablerte en IC50 på 3,2 mM i disse humane mikrovevene (figur 9B).
Figur 1: EMT-støping i 2-post Mantarray forbruksplate 24-brønn . (A) Myogene og stromale celler ble dyrket på 2D-overflater før vevstøping. (B) Celler løftes fra 2D-overflater og blandes sammen med ekstracellulære matriksproteiner for å danne hydrogeler i de enkelte platestøpebrønnene vist i innfelt. (C) 24-brønns plate som inneholder konstruert vev i hver brønn. (D) Representativt vev som viser avslappet og kontrahert konstruert muskel, sammenligner forskyvning av magnetstolpen (grønne søyler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vellykket og mislykket EMT-støping . (A) Ideelt konstruert muskelvev 24 timer etter støping jevnt komprimert rundt stolpene med homogen celle / matrikssammensetning gjennom hele vevet. (B) Mislykket EMT som viser løsrivelse av hydrogelen fra den fleksible stolpen. (C) EMT som inneholder luftbobler i hele vevet. (D) Ulik vevsavsetning rundt begge innleggene. Vevet er løst forankret til den fleksible stolpen på den ene siden. Skalastenger er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Komprimering i konstruert muskelvev over tid. (A) EMT-konstruksjon vist 1 dag etter støping. Vev overføres til differensieringsmedium, som begynner dag 0 av cellefusjon og hydrogelkomprimering. (VG Nett) Den samme EMT på dag 7 til dag 21 viser en litt kortere total lengde mellom de to stolpene over tid og mindre bredde målt gjennom den midtre delen av EMT. Skalastenger er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: EMT-diameter over tid. Fire plater med vev ble sporet over 21 dager, og sammenlignet EMT-diameter gjennom komprimering. Hvert vev ble målt gjennom midtseksjonen hver uke ved hjelp av optisk mikroskopi. Tidspunkter viser konsistent EMT-størrelse mellom platene. Maksimal komprimering nås på dag 21 når matriseombyggingen stabiliseres. Tabellen viser standardavviket (% av totalen) av komprimering innenfor hver plate av vev og gjennomsnittlig avvik for alle platene. Fargede barer er individuelle plater. Feilfelt er SD for EMT-er i plater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Immunhistokjemi i konstruert skjelettmuskulatur. EMT ble fiksert på dag 10 av kulturen og innebygd i parafin. Tynne tverrsnitt (7 μm) ble farget med antistoffer mot myosin, tungkjede og dystrofin før bildediagnostikk. Grønn = MyHC, rød = Dystrofin, blå = DAPI. Objektiv forstørrelse er 40X; Skala bar er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kontraktil kraft i konstruert muskelvev over tid. (A) Gjennomsnittlig absolutt rykningskraft målt fra hjerte-EMT fra dag 7 til dag 63 i kultur; n = 3 per gruppe. (B) Gjennomsnittlig absolutt rykningskraft i skjelett-EMT avledet fra en primær cellelinje på dag 7 til dag 53 i kultur; n = 3. Feilfelt er SD for begge grafene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7 Akutt og kronisk doksorubicinbehandling i konstruert muskelvev. Tre separate dosekonsentrasjoner av dox, 0,1 μM, 1 μM og 10 μM, ble levert enten i bolus eller administrert kontinuerlig til konstruert muskelvev i løpet av 27 dager. Bolusdoser av legemidlet ble tilsatt ved medieendringer på dag 0, 12 og 24, notert av de grønne pilene på X-aksen. Stoffet ble lagt til media ved hver medieendring for kontinuerlig dosering, notert av de svarte og grønne pilene på X-aksen. Den prosentvise endringen i kraft fra utgangsverdier (pre-medikamentell behandling) er på Y-aksen, og tiden i behandlingsdager er på X-aksen. Lys oransje = DMSO kontinuerlig kontroll, mørk oransje = DMSO boluskontroll, lysegrønn = 0,1 μM dox kontinuerlig, mørkegrønn = 0,1 μM dox bolus, lyseblå = 1 μM dox kontinuerlig, mørk blå = 1 μM Dox bolus, lys gul = 10 μM dox kontinuerlig, mørk gul = 10 μM dox bolus. Feilfelt er SD; n = 3 per betingelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Kronisk behandling med BMS-986094 i konstruert muskelvev. EMT ble behandlet med 0,4 μM (grønn), 2 μM (mørk blå) og 10 μM (lyseblå) BMS-986094 over 13 dager. (A) Kontraktil rykningskraft (Y-aksen) reduseres ved alle legemiddelkonsentrasjoner de første 2 dagene, mens kontrollvevet i DMSO fortsetter å bli sterkere over tid (X-aksen). (B) Hjerterytmen, eller rykningsfrekvensen, opphører på en doseavhengig måte i takt med opphør av kontraktil kraft vist i graf A. Kontrollvev i DMSO (grå) opprettholder en regelmessig slagfrekvens gjennom hele eksperimentet. Feilfelt er SD; n = 3 per betingelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Dose-respons på BDM i konstruert skjelettmuskulatur. (A) Absolutt rykningskraft reduseres på en doseavhengig måte når primære celleavledede EMT blir utsatt for 2,3-butandionmonoksim (BDM) på dag 16 i 3D-kultur. Absolutt rykningskraft går tilbake til nær baseline-verdier når stoffet vaskes ut. (B) Absolutt rykningskraft normalisert til baselineverdier reduseres på en doseavhengig måte når den eksponeres for BDM, noe som gir en full dose-responskurve og IC50-verdi; n = 4 per dose. Feilfelt er SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne studien beskriver metoder for å generere 3D-konstruert hjerte- og skjelettmuskulaturvev i et 24-brønns forbrukssett. Ved å følge disse metodene er det mulig å konsekvent oppnå et komplett utvalg av 24 vev uten støpefeil for påfølgende legemiddelscreening. Kritiske hensyn for å oppnå et slikt resultat er å sikre at under støping utføres alle trinnene på is for å forhindre for tidlig polymerisering av hydrogelene, fjerning av celledissosiasjonsreagens før vevstøping, grundig blanding av cellen og hydrogelsuspensjonen for hvert vev, utskifting av pipettespisser mellom vev og bruk av varmeinaktivert FBS (hvis det brukes i det hele tatt). Det er også viktig å sikre at stolpegitteret ikke flyttes når støpingen starter og overføres forsiktig når hydrogeler har dannet seg.
Store modifikasjoner inkluderer bruk av forskjellige celletyper for å oppnå hjerte versus skjelett-EMT og doping av hydrogeler med variable konsentrasjoner av kjellermembranproteiner for å fremme cellulær modning og vevsstabilitet. De gunstige effektene av slik doping må testes i hvert enkelt tilfelle, men har vist seg å forbedre funksjonelle utfall og vevets levetid under visse omstendigheter14,16,22. Det er også bemerkelsesverdig at celletetthetene som er oppført, er en veiledning og kanskje må optimaliseres for forskjellige cellelinjer. Alternative hydrogelsammensetninger kan også betraktes som et middel til å modifisere de strukturelle og funksjonelle egenskapene til de oppnådde EMTene23,24,25. Det opprinnelige muskelmikromiljøet inneholder også støttende celletyper for å fremme vaskularisering, innervering og matriksavsetning for å støtte myocytter i form og funksjon26,27. Mens systemet beskrevet her for tiden inkorporerer fibroblaster i 3D-hjertevev, kan flere celletyper skape en mer fysiologisk relevant modell for å studere sikkerheten og effekten av terapeutiske forbindelser in vitro. Tidligere har en rekke støttende celletyper blitt integrert i 3D-konstruerte vev som presenterer en spennende mal for fremtidig studie ved hjelp av magnetisk sensing kontraktilitetsplattform28,29,30.
Feilsøking for denne protokollen fokuserer på dannelsen av upålitelige eller inkonsekvente vev under støpeprosessen. Det må utvises forsiktighet for å unngå bobledannelse i hydrogelene ettersom de støpes, samtidig som det letter jevn fordeling av cellene under blanding. Optimaliseringseksperimenter vil trolig være nødvendig for hver ny celletype for å identifisere ideelle celletettheter, celleforhold og matrisesammensetning.
En stor begrensning for denne teknikken er det betydelige antallet celler som kreves for å etablere en full plate med 24 EMT. For dataene som presenteres her, ble det brukt 15 millioner kardiomyocytter og 18 millioner skjelettmyoblaster per plate. Enkelte forskere har kanskje ikke tilgang til så store bassenger av cellulært materiale, noe som kan hemme deres evne til å bruke denne plattformen i sin fulle utstrekning. Hvis sluttbrukere ikke har tilgang til magnetisk sensormaskinvare, må målinger av etteravbøyninger utføres optisk, noe som reduserer gjennomstrømningen betydelig og forhindrer samtidig registrering av muskelkontraksjoner over flere brønner. Mantarray-maskinvaren overvinner imidlertid disse begrensningene for å tilby det første kommersielle systemet som er i stand til kontinuerlig, ikke-invasiv analyse av EMT-sammentrekning samtidig på tvers av flere konstruksjoner.
Magnetisk sensing over 24 brønner muliggjør langsgående studier av EMT-funksjonell utvikling i sanntid og muliggjør nøyaktig måling av akutte responser på kjemisk, miljømessig eller genetisk manipulasjon. Mens magnetisk sensing har flere fordeler, for eksempel samtidig måling over flere vev, og ikke krever komplisert dataanalyse, muliggjør optiske deteksjonsmetoder samtidig måling av fysiologiske beregninger som kalsiumfluks eller spenningskartlegging. Imidlertid viser datasett som de som er illustrert i resultatseksjonen bredden av applikasjoner denne teknologien har i stoffutviklingsområdet. Gitt at få analyser på markedet gir midler til å utføre en direkte vurdering av kontraktil produksjon i konstruert muskel, holder disse metodene potensialet til å revolusjonere den prekliniske utviklingsrørledningen.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte og egenkapitaleiere i Curi Bio Inc., selskapet som kommersialiserer Mantarray-maskinvaren og tilhørende programvare.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av finansiering fra Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tildelt Health and Environmental Sciences Institute) og ved finansiering fra National Institutes of Health (HL151094 til Dr. Geisse). Vi takker Dr. Alec S. T. Smith for hans hjelp med utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary - DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary - MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
- Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
- Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
- Scheraga, H. A.
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
- Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
- Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
- Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
- Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
- Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
- Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
- Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
- Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
- Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
- Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
- Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
