Summary
Dieses Protokoll stellt Methoden zur Erzeugung von 3D-konstruiertem Herz- und Skelettmuskelgewebe bereit und beschreibt deren Verwendung in präklinischen Arzneimittel-Screening-Modalitäten. Die beschriebenen Methoden verwenden ein magnetisches Sensorsystem, um die gleichzeitige Beurteilung von 24 Geweben parallel zu ermöglichen.
Abstract
Die genaue Modellierung von Gesundheits- und Krankheitszuständen in vitro ist für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien und Therapeutika von entscheidender Bedeutung. Bei Herz- und Skelettmuskelerkrankungen sind Kontraktionskraft und Kinetik wichtige Metriken für die Beurteilung der Muskelfunktion. Neue und verbesserte Methoden zur Erzeugung von künstlich hergestelltem Muskelgewebe (EMTs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen haben die In-vitro-Krankheitsmodellierung für kontraktile Gewebe zuverlässiger gemacht. Die reproduzierbare Herstellung von Geweben aus suspendierten Zellkulturen und die Messung ihrer Kontraktilität ist jedoch eine Herausforderung. Solche Techniken sind oft mit hohen Ausfallraten behaftet und erfordern komplexe Instrumentierung und maßgeschneiderte Datenanalyseroutinen. Eine neue Plattform und ein neues Gerät, das 3D-EMTs in Verbindung mit einem markierungsfreien, hochparallelen und automatisierungsfreundlichen Kontraktilitätstest verwendet, umgehen viele dieser Hindernisse. Die Plattform ermöglicht die einfache und reproduzierbare Herstellung von 3D-EMTs unter Verwendung praktisch jeder Zellquelle. Die Kontraktilität des Gewebes wird dann über ein Instrument gemessen, das gleichzeitig 24 Gewebe misst, ohne dass komplexe Software-Analyseroutinen erforderlich sind. Das Gerät kann Kraftänderungen im Mikronewton zuverlässig messen, was ein dosisabhängiges Wirkstoff-Screening ermöglicht, um die Wirkung eines Medikaments oder Therapeutikums auf die kontraktile Leistung zu messen. Technisch hergestellte Gewebe, die mit diesem Gerät hergestellt werden, sind voll funktionsfähig, erzeugen bei elektrischer Stimulation zuckende und tetanische Kontraktionen und können in Kultur über Wochen oder Monate longitudinal analysiert werden. Hier zeigen wir Daten von Herzmuskel-EMTs unter akuter und chronischer Dosierung mit bekannten Giftstoffen, einschließlich eines Medikaments (BMS-986094), das nach Todesfällen von Patienten aufgrund unerwarteter Kardiotoxizität aus klinischen Studien gezogen wurde. Eine veränderte Funktion der Skelettmuskulatur in künstlich hergestellten Geweben als Reaktion auf die Behandlung mit einem Myosininhibitor wird ebenfalls vorgestellt. Diese Plattform ermöglicht es dem Forscher, komplexe, informationsreiche biotechnologisch hergestellte Modellsysteme in seinen Arbeitsablauf in der Wirkstoffforschung zu integrieren, ohne dass zusätzliche Schulungen oder Fähigkeiten erforderlich sind.
Introduction
Induzierte pluripotente Stammzellmodelle (iPSC) werden zunehmend zu wichtigen Akteuren in der präklinischen Pipeline für die therapeutische Entdeckung und Entwicklung sowie für die biologische Grundlagenforschung und die Modellierung von Krankheiten 1,2,3,4,5. Kontraktile Gewebe wie Herz- und Skelettmuskeln, die aus iPS-Zellen gewonnen werden, bergen ein großes Potenzial für die Verbesserung der Vorhersagekraft menschlicher In-vitro-Studien, da die direkte Bewertung der Muskelkontraktionskraft und -kinetik quantitative Metriken zur Untersuchung der Gesamtgewebefunktion sind 4,6,7,8. Typischerweise wurden Messungen der kontraktilen Kraft entweder indirekt durch optische Verfolgung der Substratdurchbiegung 9,10 oder direkt durch Anheften von Zellen/Geweben an einen Kraftaufnehmer4,11,12 erhalten. Diese Methoden sind zwar genau, haben aber von Natur aus einen geringen Durchsatz und erfordern in der Regel hochqualifizierte Bediener zum Sammeln und Analysieren von Daten.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Magnetfeldsensorik diese Hindernisse umgeht und eine alternative Methode zur gleichzeitigen Beurteilung der künstlichen Muskelfunktion über mehrere Gewebekonstrukte hinweg darstellt13. Die Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D-Kontraktilitätsplattform baut auf dieser Technologie auf und verwendet ein Gerät, das in der Lage ist, die Kontraktilität von künstlich hergestelltem Muskelgewebe auf hochparallele Weise zu messen, das die Komplexität von 3D-Zellmodellen mit einem Hochdurchsatz-Screeningnutzt 14. Die Plattform ermöglicht eine markierungsfreie, quantitative Echtzeitüberwachung der kontraktilen Funktion in Herz- und Skelettmuskelgewebe innerhalb oder außerhalb eines Standard-Zellkultur-Inkubators, wodurch die Notwendigkeit einer optisch-basierten kontraktilen Bildgebung und Analyse entfällt. Diese Technologie erleichtert den direkten Vergleich von gesunden und erkrankten Zelllinien und ermöglicht die Messung der Wirkung eines Arzneimittels auf kontraktile Gewebe, wodurch quantifizierbare In-vitro-Sicherheits- und Wirksamkeitsdaten für neue und bestehende therapeutische Verbindungen ermittelt werden.
Technisch hergestelltes 3D-Muskelgewebe kann mit der 24-Well-Gussplatte von Mantarray auf hochgradig reproduzierbare Weise zwischen zwei Pfosten hergestellt werden (Abbildung 1). Ein Pfosten ist starr, während der andere Pfosten flexibel ist und einen kleinen Magneten enthält. Wenn sich das Gewebekonstrukt zusammenzieht, verschiebt es den flexiblen Pfosten und den eingebetteten Magneten. Die EMT-Platte befindet sich innerhalb des Instruments, und die Nachverschiebung wird über eine Reihe von Magnetsensoren auf einer Leiterplatte unterhalb des Plattenhalters gemessen. Die gemessenen Änderungen des Magnetfeldes werden mit Hilfe eines mathematischen Algorithmus in absolute Kontraktionskraft umgerechnet. Das Gerät verwendet schnelle Datenabtastraten, um detaillierte Informationen über die Funktionsfähigkeit und den Reifegrad der untersuchten Zelltypen zu sammeln, einschließlich Kontraktionshäufigkeit, Geschwindigkeit und Zerfallszeit. Diese funktionellen Messungen können über alle 24 Wells hinweg gleichzeitig mit der magnetischen Sensorplattform oder einzeln und sequentiell mit herkömmlichen optischen Methoden durchgeführt werden.
Diese Studie beschreibt eine hochgradig reproduzierbare Methode zur Herstellung von 3D-Skelettmuskel- und Herzmikrogewebe in einem Hydrogel auf Fibrinbasis. Während einer kurzen, 80-minütigen Reaktion katalysiert Thrombin die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin und bietet ein Gerüst für die Entwicklung von Muskelzellen in suspendierter Kultur15. Stromazellen helfen beim Umbau der Matrix und Gewebe werden kontraktil, da Muskelzellen ein Synzytium innerhalb des Hydrogels bilden. Die Kontraktilität dieser Gewebe wurde unter Verwendung des magnetischen Sensoransatzes sowohl vor als auch nach der Exposition gegenüber Verbindungen analysiert, wodurch diese Modalität für die Verwendung in Dosis-Wirkungs-Arzneimittelstudien validiert wurde. Primäre menschliche Myoblasten aus einer gesunden Spenderbiopsie wurden kommerziell gewonnen und gemäß den Protokollen des Anbieters in 2D kultiviert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Skelettmuskelwachstumsmediums durch drei Passagen expandiert, um eine ausreichende Zellzahl für die Herstellung von 3D-Geweben zu erzeugen. Stromazellen und hiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten wurden 3 Tage lang gemäß dem Protokoll des Herstellers kultiviert, um eine Erholung von der Kryokonservierung zu ermöglichen, bevor Zellen in Gewebe gegossen wurden. Es werden repräsentative Ergebnisse bereitgestellt, die die Arten von Datensätzen veranschaulichen, die mit der magnetischen Sensorplattform gesammelt werden können. Häufige Fallstricke, die mit der Erzeugung von künstlich hergestelltem Gewebe mit diesen Methoden verbunden sind, werden ebenfalls angesprochen.
Protocol
1. Protokoll der Zellkultur
- Primäre humane Myoblastenkultur
- Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrix (ECM) im Verhältnis 1:100 in 8 ml DMEM/F12-Medium auf Eis.
- 8 ml ECM-Lösung werden auf einen T175-Kolben gegeben und vor der Zellaussaat mindestens 1 h bei 37 °C, jedoch nicht länger als 24 h, inkubiert. Stellen Sie sicher, dass die ECM-Lösung den gesamten Kolbenboden abdeckt.
- Aliquot 5 ml des Skelettmuskelwachstumsmediums in ein 15 ml konisches Röhrchen.
- Tauen Sie ein gefrorenes Fläschchen mit Zellen (5,0 x 10,5 Myoblasten) in einem Wasserbad bei 37 °C für 2 Minuten auf oder bis das Eis gerade geschmolzen ist. Besprühen Sie das Fläschchen mit 70% Ethanol und geben Sie es in eine Biosicherheitswerkbank (BSC).
- Übertragen Sie die Zellen mit einem P1000 in das aliquotierte Medium. Nicht reiben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml des Wachstumsmediums mit einer P1000-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Waschen Sie den ECM-beschichteten Kolben mit 15 ml DPBS. Saugen Sie DPBS ab und geben Sie dann 30 ml des Wachstumsmediums in den Kolben.
- 4 ml des Wachstumsmediums in die Zellen geben, mischen und die Zellsuspension in den T-175-Kolben verteilen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 35 ml beträgt. Schieben Sie den Kolben 5-6 Mal vorsichtig entlang der Arbeitsfläche nach links und rechts, gefolgt von 5-6 Mal vorwärts und rückwärts, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Kolbenoberfläche zu gewährleisten.
- Der T-175-Kolben wird bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Zellkulturinkubator gegeben. Kultivieren Sie die Zellen 3 Tage lang oder bis sie nicht mehr als 70% Konfluenz erreichen, und passieren Sie dann die Zellen.
- Passieren von primären humanen Myoblasten
- Verdünnen Sie die ECM im Verhältnis 1:100 in 30 ml DMEM/F12-Medium auf Eis.
- 10 ml der ECM-Lösung werden auf drei T225-Kolben gegeben und vor der Zellaussaat mindestens 1 h bei 37 °C inkubiert, jedoch nicht länger als 24 h. Stellen Sie sicher, dass die ECM-Lösung den gesamten Kolbenboden abdeckt.
- Waschen Sie die Zellen mit 15 ml DPBS. Aspirieren Sie das Dissoziationsreagenz und fügen Sie es gemäß dem Protokoll des Herstellers hinzu.
- Sobald die Zellen angehoben sind, stoppen Sie die Reaktion gemäß dem Protokoll des Herstellers und sammeln Sie die Zellen in einem konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml des Wachstumsmediums mit einer P1000-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Waschen Sie den ECM-beschichteten Kolben mit 15 ml DPBS. Aspirieren Sie DPBS und geben Sie dann 40 ml des Wachstumsmediums in jeden T225-Kolben.
- 14 ml des Wachstumsmediums werden in die Zellsuspension gegeben, gemischt und 5 ml der Zellsuspension auf jeden T225-Kolben verteilt. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen in jedem Kolben 45 ml beträgt. Schieben Sie den Kolben 5-6 Mal vorsichtig entlang der Arbeitsfläche nach links und rechts, gefolgt von 5-6 Mal vorwärts und rückwärts, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
- Die Kolben werden bei 37 °C und 5 % CO2 in den Zellkultur-Inkubator gestellt.
- Kulturzellen für 2-3 Tage oder bis sie nicht mehr als 70% Konfluenz erreichen, und dann Passage. Teilen Sie die Zellen bei jedem Durchgang im Verhältnis 1:3 oder 1:4 auf und säen Sie zwischen 3 x 103 und 1 x 104 Zellen/cm2.
- hiPSC-abgeleitete Kardiomyozytenkultur
- Verdünnen Sie die ECM im Verhältnis 1:60 in 12 ml DMEM/F12-Medium auf Eis.
- 1 ml der ECM-Lösung wird auf jede Vertiefung von zwei 6-Well-Platten aufgetragen und bei 37 °C mindestens 1 h vor der Zellaussaat, jedoch nicht länger als 24 h, inkubiert.
- Tauen Sie ein gefrorenes Fläschchen mit Kardiomyozyten in einem Wasserbad bei 37 °C für 2 Minuten auf oder bis das Eis gerade geschmolzen ist.
- Besprühen Sie die Durchstechflasche mit 70% Ethanol und geben Sie sie in die BSC.
- Verwenden Sie eine p1000-Pipette, um die aufgetauten Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen zu überführen.
- Spülen Sie das leere Kryo mit 1 ml Beschichtungsmedium bei Raumtemperatur (RT), um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen.
- Geben Sie die 1 ml des Spülmediums im Laufe von 90 s langsam tropfenweise (ein Tropfen alle 5 s) in das konische Röhrchen der Zellen ab. Schwenken Sie das Röhrchen kontinuierlich, um die Zellen während der langsamen Medienzugabe zu mischen.
- Geben Sie langsam 8 ml des Beschichtungsmediums mit einer serologischen 10-ml-Pipette in das konische 50-ml-Zellröhrchen.
- Nachdem alle Medien dosiert wurden, pipettieren Sie vorsichtig 3 Mal auf und ab, um die Zellen gründlich zu mischen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer und Trypanblau.
- Zentrifugieren Sie die Zellen im konischen 50-ml-Röhrchen bei 300 x g für 3 min.
- Nachdem die Zellen pelletiert wurden, saugen Sie den Überstand ab.
- Verwenden Sie eine p1000-Pipette, um 1 ml des Beschichtungsmediums in das Röhrchen zu übertragen, und brechen Sie das Pellet vorsichtig auf, indem Sie 3-5 Mal langsam auf und ab pipettieren. Resuspendieren Sie die Zellen mit einem zusätzlichen Beschichtungsmedium.
- Säen Sie zwischen 2-4 x 106 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte in 2 ml des Beschichtungsmediums.
- Waschen Sie die ECM-beschichteten 6-Well-Platten mit DPBS (2 ml/Well).
- Pipettieren Sie 2 ml Zellsuspension pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Bewegen Sie die Platten 5-6 Mal vorsichtig entlang der Arbeitsfläche nach links und rechts, gefolgt von 5-6 Mal vorwärts und rückwärts, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf den Plattenoberflächen zu gewährleisten.
- Legen Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO2 in den Zellkultur-Inkubator.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3-1.3.16 für alle Durchstechflaschen der aufzutauenden Zellen.
- Wechseln Sie am nächsten Tag nach der Beschichtung auf 3-5 ml (abhängig von Zelllinie und Dichte) des Erhaltungsmediums und wechseln Sie das Medium dann jeden zweiten Tag. Kultivieren Sie die Zellen 3-4 Tage lang, bevor Sie sie in 3D-Gewebe gießen.
- Stroma-Zellkultur
- 30 ml der ECM-Lösung werden in einen T175-Kolben gegeben und vor der Zellaussaat mindestens 1 h bei 37 °C inkubiert, jedoch nicht länger als 24 h.
- Aliquotieren Sie 5 ml des Stromazellmediums in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Tauen Sie ein gefrorenes Fläschchen mit Stromazellen in einem Wasserbad bei 37 °C für 2 Minuten auf oder bis das Eis gerade geschmolzen ist.
- Besprühen Sie die Durchstechflasche mit 70% Ethanol und geben Sie sie in die BSC.
- Verwenden Sie eine p1000-Pipette, um langsam 1 ml des Stromazellmediums zu den aufgetauten Zellen in der Durchstechflasche zu geben.
- Übertragen Sie die Zellsuspension aus der Durchstechflasche auf das verbleibende Auftaumedium im konischen Röhrchen. Verwenden Sie eine serologische 5-ml-Pipette, um die Zellen zu mischen. 3 mal auf und ab pipettieren.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer und Trypanblau. Spin-down-Zellen nicht.
- Waschen Sie den ECM-beschichteten T175-Kolben mit 15 ml DPBS.
- Übertragen Sie die Stromazellen mit einer Dichte von 3-4 x 103 Zellen/cm2 in den Kolben. Schieben Sie den Kolben 5-6 Mal vorsichtig entlang der Arbeitsfläche nach links und rechts, gefolgt von 5-6 Mal vorwärts und rückwärts, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Kolbenoberfläche zu gewährleisten.
- Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag mit 45 ml erwärmtem Stromazellmedium. Kultivieren Sie die Zellen 3-4 Tage lang, bevor Sie sie in 3D-Gewebe gießen.
2. Materialvorbereitung
- Fibrinogen
HINWEIS: Achten Sie bei der Rekonstitution von Fibrinogen darauf, die Oberfläche zu maximieren, auf der das Fibrinogenpulver geschichtet wird. In diesem Protokoll wurde die Menge des verwendeten Verdünnungsmittels auf die Größe des verwendeten Behälters optimiert, d.h. es wurde gerade genug Verdünnungsmittel verwendet, um den Boden der Schale zu bedecken. Schichten Sie beispielsweise 0,5 g Fibrinogen über 10 ml PBS in einer 100-mm-Schale anstelle eines 50-ml-Zentrifugenröhrchens. Die Maximierung der Oberfläche des Verdünnungsmittels verringert die Zeit, die für die Rekonstitution des Fibrinogens benötigt wird, und verringert die potenzielle Verklumpung von Protein.- Wiederherstellung
- 10 ml PBS in eine 100-mm-Zellkulturschale geben und in einem Zellkulturinkubator auf 37 °C erwärmen.
- 0,5 g Fibrinogenpulver auf die gesamte Oberfläche des warmen PBS auftragen und bei 37 °C aufbewahren, bis sich das Fibrinogen vollständig aufgelöst hat. Dies sollte nicht länger als 2 Stunden dauern. Das sich auflösende Pulver kann vorsichtig geschwenkt werden, aber schütteln Sie die Schüssel nicht kräftig.
- Sterilfiltration
- Sobald sich das Pulver vollständig aufgelöst hat, lassen Sie die Lösung durch einen 100-μm-Filter laufen und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen, um Klumpen von geliertem Fibrinogen zu entfernen.
- Gießen Sie die filtrierte Lösung in eine 10-ml-Spritze, die mit einem 0,2-μm-Filter verschlossen ist. Schieben Sie die Lösung durch den Filter und sammeln Sie sie in einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen. Der Filter muss möglicherweise mehr als einmal gewechselt werden, um alle 10 ml Lösung zu sterilisieren.
- Aliquot 300 ml steriles Fibrinogen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 °C lagern. Tauen Sie die Aliquote je nach Bedarf auf Eis oder bei 4 °C auf. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren/Auftauen.
- Wiederherstellung
- Thrombin
- Fügen Sie 6 ml PBS und 4 ml diH2O direkt in eine Durchstechflasche Thrombin (1 KU) hinzu, um eine 100 U / ml Thrombin-Stammlösung herzustellen.
- Filter mit einem 0,2-μm-Filter sterilisieren, aliquot und bei -20 °C in 1,5-ml-Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen lagern, da Thrombin an Glas adsorbiert. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren/Auftauen.
- Poly(ethylenimin)-Lösung (PEI)
ACHTUNG: PEI ist giftig. Verwenden Sie die vom Hersteller angegebene geeignete PSA.
HINWEIS: PEI wird als 50% w/v-Lösung geliefert. Es ist hochviskos und schwer zu pipettieren. Stellen Sie eine 0,1%ige Lösung aus einer 10%igen Stammlösung her, anstatt direkt aus der 50%igen w/v-Lösung.- Messen Sie 5 ml 50% w/v PEI-Lösung in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
- Fügen Sie 20 ml diH2O hinzu und mischen Sie, um eine 10%ige Stammlösung zu erhalten. Diese hochkonzentrierte Stammlösung kann nicht steril filtriert werden.
- Um eine 0,1%ige Lösung für die Zellkultur herzustellen, geben Sie 5 ml 10% Brühe zu 495 ml diH2O. Sterilfilter mit einem 500 ml Filterkolben und lagern Sie ihn nicht länger als 1 Woche bei RT.
- Glutaraldehyd
ACHTUNG: Glutaraldehyd ist giftig. Verwenden Sie die vom Hersteller angegebene geeignete PSA.- Glutaraldehyd wird als 25% ige Lösung geliefert. Um eine 0,01%ige Lösung herzustellen, fügen Sie 40 μl zu 99,6 ml diH2O. Sterilfilter hinzu und lagern Sie es nicht länger als 1 Woche bei 4 °C.
- Nach der Vorbereitung
- Legen Sie das abgenutzte Gewebegussset in eine sterile Kulturhaube. Das Gießset enthält einen Deckel, ein Pfostengitter mit 24 Pfostenpaaren (ein Pfostenpaar pro Vertiefung einer 24-Well-Platte) und einen speziellen 24-Well-Plattenboden mit 24 Gießvertiefungen. Jede Gießvertiefung enthält einen Graben im Boden der Vertiefung, um die Zell-/Hydrogelkomponenten aufzunehmen und sie beim Polymerisieren des Hydrogels zu einem röhrenförmigen Gewebe zu formen (Abbildung 1B).
- Füllen Sie die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1,5 ml/Well einer 0,1%igen PEI-Lösung und legen Sie die Pfosten so in die Platte, dass die Spitzen jedes Pfostenpaares untergetaucht sind. Lassen Sie es 10 Minuten einwirken. PEI lagert eine positive Ladung auf den Pfosten ab, so dass Proteine im Hydrogel während des Gewebegusses fest an den Pfosten haften.
- Füllen Sie die Vertiefungen einer zweiten 24-Well-Platte mit 2 ml/Well sterilem diH2O und übertragen Sie die Pfosten. 1 Minute ruhen lassen.
- Füllen Sie die Vertiefungen in einer dritten 24-Well-Platte mit 1,5 ml/Well mit 0,01 % Glutaraldehyd (GA) und übertragen Sie die Pfosten. Lassen Sie es 30 Minuten ruhen. GA fixiert die positive Ladung von PEI an den Pfosten.
- Während die Pfosten in Glutaraldehyd sitzen, saugen Sie die diH 2 O-Vertiefungen ab, waschen Sie sie mit 2 ml/Well sterilem diH2 O, saugen Sie sie ab und füllen Sie sie mit 2 ml/Well sterilem diH2O nach. Anstelle des Spülens kann eine frische 24-Well-Platte verwendet werden.
- Wenn 30 Minuten abgelaufen sind, übertragen Sie die Pfosten auf die 2 ml/Well von sterilem diH2O. 1 Minute ruhen lassen.
- Saugen Sie das diH2O ab und fügen Sie weitere 2 ml/Well sterilesdiH2Ohinzu. 5 Minuten ruhen lassen.
- Übertragen Sie die Pfosten zum Trocknen auf eine 24-Well-Platte (ca. 15 Minuten).
- Bauen Sie das Gießset nach dem Trocknen wieder zusammen. Die Ränder mit Parafolie versehen, um den Deckel und die Platte miteinander zu verschließen, und dann vor der Zellaussaat bis zu 72 Stunden bei 4 °C lagern. Längere Lagerzeiten sind wahrscheinlich möglich, wurden aber nicht getestet.
3. Protokoll des Gewebegusses
- Vorbereitung der Gießplatte
- Kühlen Sie das Gewebeguss-Kit bei 4 °C vor.
- Übertragen Sie einen Eimer Eis in die BSC. Bereiten Sie auf Eis 50 μl Thrombinlösung (3 μl Thrombinvorrat + 47 μl EMT-Medium) pro zu gießender Vertiefung vor.
HINWEIS: Weitere Informationen zum EMT-Medium finden Sie in Schritt 3.2.1. - Nehmen Sie das gekühlte Gießset aus dem Kühlschrank und legen Sie es auf einen kalten Block oder Eis in der Zellkulturhaube. Legen Sie die Gießplatte flach auf Eis und bewegen Sie das Pfostengitter von der Gießplatte auf eine neue, sterile 24-Well-Platte.
- Pipettieren Sie 50 μl Thrombinlösung in jede vorgekühlte Vertiefung der Gießplatte.
- Bauen Sie das Kit wieder zusammen und stellen Sie es wieder in den Kühlschrank, bis es für den Gewebeguss benötigt wird. Gießen Sie das Gewebe innerhalb von 3 Stunden von Thrombin zusätzlich zu den Vertiefungen.
- Präparation der Zellen
- Bereiten Sie das EMT-Basismedium und den Sterilfilter vor und lassen Sie es auf Eis liegen.
HINWEIS: Wenn zellspezifisches Gießmedium FBS enthält, verwenden Sie hitzeinaktiviertes FBS, da es mit Fibrinogen interagieren und eine vorzeitige Polymerisation verursachen kann.- Bereiten Sie kardiales EMT-Medium vor: Fügen Sie 500 ml RPMI-Medium, 10 ml B27 und 2,5 g Aminocapronsäure hinzu. (Fakultativ) Fügen Sie 10 mM ROCK-Inhibitor hinzu (fügen Sie nur das EMT-Medium hinzu, das zum Gießen von Geweben verwendet wird, und nicht das gesamte Volumen von 500 ml).
- Bereiten Sie das Skelett-EMT-Medium vor: Fügen Sie 50 ml F10-Medium und 0,25 g Aminocapronsäure (ACA) für primäre EMTs und 0,1 g ACA für iPSC-abgeleitete EMTs hinzu.
- Das Dissoziationsreagenz in Zellkulturqualität wird auf 37 °C erwärmt. Erwärmen Sie ein gleiches Volumen EMT-Medium, um das Dissoziationsreagenz zu verdünnen.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die verwendete Protease vollständig inaktiviert ist. Aktive Protease stört die 3D-Gewebebildung und die Postadhärenz. - Waschen Sie die Zellen (Abbildung 1A) mit PBS. Verwenden Sie 2 ml/Well für eine 6-Well-Platte. Verwenden Sie 6 ml, 15 ml und 15 ml für eine 100-mm-Schale, einen T175-Kolben bzw. einen T225-Kolben.
- Fügen Sie das erwärmte Dissoziationsreagenz in Zellkulturqualität hinzu, um die Zellen anzuheben, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten oder bis sich die Zellen angehoben haben. Verwenden Sie für Herzkulturen das 10-fache Dissoziationsreagenz. Verwenden Sie für Stromazellen und Skelettmuskelmyoblasten ein 1-faches Dissoziationsreagenz. Verwenden Sie 1 ml/Well für eine 6-Well-Platte, 3 mL für eine 100-mm-Schale, 8 mL für einen T175-Kolben und 10 ml für einen T225-Kolben.
- Überprüfen Sie die Kulturen alle 2-3 Minuten, indem Sie auf die Seite der Platte klopfen.
- Sobald sich die Zellen angehoben haben, übertragen Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen und trituieren Sie mit einer P1000-Pipette, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten.
- Waschen Sie die Platte oder den Kolben mit einem zusätzlichen EMT-Medium, um die restlichen Zellen aufzufangen und in das konische Röhrchen zu geben. Verwenden Sie 1 ml/Well des EMT-Mediums für eine 6-Well-Platte, 2 mL für eine 100-mm-Schale, 5 mL für einen T175-Kolben und 5 ml für einen T225-Kolben.
- Trituieren Sie die Zellen, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
- Fügen Sie EMT-Medium hinzu, um den Dissoziationsprozess zu beenden, und entnehmen Sie dann Proben der Zellsuspensionen für die Zellzählung. Verwenden Sie 1 ml/Well für eine 6-Well-Platte, 3 mL für eine 100-mm-Schale, 8 mL für einen T175-Kolben und 10 ml für einen T225-Kolben.
- Schleudern Sie die Zellen bei 200 x g für 4 min. Führen Sie Zellzählungen mit einem Hämazytometer und Trypanblau durch, während die Suspensionen zentrifugiert werden.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml EMT-Basismedium, um das restliche Dissoziationsreagenz zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 4 min. Saugen Sie den Überstand ab und bereiten Sie die Zellsuspensionen in den entsprechenden Dichten vor.
- Erhöhen Sie die Langlebigkeit und Funktion von 3D-Skelettmuskel-EMTs durch die Zugabe von 10%-20% ECM-Proteinen im EMT-Medium14,16.
- Samenstammzell-abgeleitete Kardiomyozyten und ihre Stromazellen mit 5 x 10 5 Zellen bzw.7,5 x 104 Zellen pro Gewebekonstrukt. Säen Sie die Skelettmuskel-Myoblasten mit 7,5 x 105 Zellen pro Gewebekonstrukt.
- Herzgewebe
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Stromazellen mit einer Dichte von 2,5 x 106 Zellen pro ml in EMT-Medium und legen Sie sie auf Eis. Verwenden Sie 30 μl dieser Suspension pro EMT.
- Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die CMs mit einer Dichte von 8,3 x 106 Zellen pro ml in EMT-Medium und legen Sie sie auf Eis. Verwenden Sie 60 μl dieser Suspension pro EMT.
- Skelettmuskelgewebe
- Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Skelettmuskelzellen mit einer Dichte von 8,3 x 106 Zellen pro ml in EMT-Medium und legen Sie sie auf Eis. Verwenden Sie 90 μl dieser Suspension pro EMT.
- Berechnen Sie die Volumina jeder Zelllösung, die erforderlich sind, um die gewünschte Anzahl von Geweben zu bilden (z. B. 60 μl der vorbereiteten CMs und 30 μl der vorbereiteten Stromazellen oder 90 μl der Skelettmuskelzellen pro EMT).
- Pipettieren Sie die berechneten Zellvolumina in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Geben Sie 10 μl Fibrinogen pro EMT in die Zellsuspension und halten Sie sie auf Eis.
- Gesamtreagenzien und Zellvolumina pro EMT: Stellen Sie sicher, dass jedes EMT 90 μl Zellen, 10 μl Fibrinogen und 50 μl Thrombinlösung enthält.
- Bereiten Sie das EMT-Basismedium und den Sterilfilter vor und lassen Sie es auf Eis liegen.
- Gewebeabguss
- Übertragen Sie das Gewebegusskit auf eine Zellkulturhaube und entfernen Sie den Deckel (Pfostengitter mit flexiblen und starren Pfosten sollte auf der Gießplatte verbleiben; Abbildung 1B). Halten Sie die Gussplatte mit Pfostengitter flach auf Eis.
- Mischen Sie das Zell-Fibrinogen-Gemisch und ziehen Sie 100 μl mit einer P200-Pipette auf.
- 100 μl der Mischung in Vertiefungen geben, die mit 50 μl Thrombinlösung vorbereitet wurden, und 5 Mal trituieren, um gut zu mischen. Schieben Sie die Pipette nicht über den ersten Anschlag hinaus und entfernen Sie die Spitze nach der Verreibung, um Blasen zu vermeiden.
- In diesem Stadium und bis das Pfostengitter bereit ist, von der Gussplatte abgehoben zu werden (Schritt 3.3.10), kann jede Bewegung des Gitters die langfristige Befestigung des Gewebes an den Pfosten beeinträchtigen. Halten Sie sowohl das Gitter als auch die Gusslochplatte gleichzeitig mit dem Zeigefinger und dem Daumen einer Hand fest, um eine Bewegung des Gitters zu vermeiden.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit einer frischen P200-Spitze für jedes Gewebe, bis alle Gewebe gegossen sind. Mischen Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen, bevor Sie jedes Gewebe gießen, da sich die Zellen schnell absetzen.
- Übertragen Sie das ausgesäte Kit vorsichtig in den Inkubator und achten Sie darauf, das Gitter nicht zu bewegen. Die Bewegung des Gitters nach der Aussaat kann zu einem verringerten Erfolg bei der Übertragung von Geweben aus den Gießvertiefungen führen. Inkubation bei 37 °C für 80 min, unabhängig vom Zelltyp. Dadurch beginnt die Polymerisation des Hydrogels und es können sich Proteine an die Pfosten anlagern.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine frische 24-Well-Platte mit 2 ml/Well des EMT-Mediums für Herzgewebe vor. 10 mM ROCK-Inhibitor kann dem EMT-Medium zugesetzt werden, falls gewünscht. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, um das Medium zu erwärmen.
- Bereiten Sie 2 ml/Well Wachstumsmedium mit 5 g/l Aminocapronsäure (0,2 mm steril filtriert) für primäres Skelettmuskelgewebe oder 2 g/l ACA für iPSC-abgeleitete EMTs vor. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, um das Medium zu erwärmen.
- Nach der Inkubation vorsichtig 1 ml des EMT-Mediums an den Rand der Gießvertiefungen geben und weitere 10 Minuten bei 37 °C inkubieren, unabhängig vom Zelltyp. Dadurch wird das Hydrogel von den Rändern des Gusskörpers gelöst und eine einfache Übertragung des Gewebes ermöglicht.
- Heben Sie nach 10 Minuten das Pfostengitter vorsichtig an und übertragen Sie das Gewebe von der Gießplatte auf eine vorbereitete 24-Well-Platte mit Medium (Abbildung 1C). Legen Sie die Platten mit den Geweben bei 37 °C wieder in den Zellkulturinkubator.
- Instandhaltung
- Nach 24 h wird das Gipsgewebe auf eine frische 24-Well-Platte mit 2 ml/Well des EMT-Mediums (ohne den ROCK-Inhibitor, falls enthalten) übertragen und bei 37 °C inkubiert. Schalten Sie bei Skelettmuskelzellen das Wachstumsmedium auf das Differenzierungsmedium um, um die Myoblastenfusion zu fördern.
- Übertragen Sie das Herzgewebe alle 2-3 Tage mit 2 ml / Well des EMT-Mediums in frische Vertiefungen.
- Übertragen Sie das Skelettmuskelgewebe alle 2-3 Tage in frische Vertiefungen mit 2 ml/Well Differenzierungsmedium, das 5 g/l Aminocapronsäure (0,2 mm steril filtriert) enthält. Verwenden Sie 2 g/l ACA für iPSC-abgeleitete Gewebe.
- Um Mediumswechsel zu unterstützen, übertragen Sie das Pfostengitter auf eine frische 24-Well-Platte, anstatt das Medium in derselben Platte zu wechseln, um eine Beschädigung des 3D-Gewebes zu vermeiden. Bereiten Sie eine zweite 24-Well-Platte mit dem EMT-Medium vor und übertragen Sie das Gewebe auf das frische Medium. Bewahren Sie die Platte mit dem alten Medium neben der aktiven Kultur auf, um sie für den nächsten Medienwechsel zu verwenden. Übertragen Sie das Pfostengitter während der gesamten Kulturperiode zwischen den beiden Platten hin und her. Alternativ können Sie für jeden Medienwechsel einen frischen Teller verwenden.
- Messen Sie die EMT-Kontraktion entweder durch optische Nachführung der Nachablenkung (Abbildung 1D) oder durch magnetische Sensorhardware13,14. Herzgewebe beginnt nach 3-4 Tagen in Kultur spontan zu schlagen. Skelettmuskelgewebe ist typischerweise kontraktil mit elektrischer Feldstimulation nach 7 Tagen in Kultur.
Representative Results
Die Zellen wurden in der 2-Post-Verbrauchsplatte in künstlich hergestelltes Muskelgewebe gegossen (Abbildung 1). Erfolgreiche Rettungssanitäter werden einheitlich angezeigt, und die Matrix wird gleichmäßig auf die Pfosten verteilt (Abbildung 2A). Die Matrix sollte sich auch um beide Pfosten wickeln, um gleichwertige Ankerpunkte für das Gewebe zu erzeugen. Fehler beim Gießen sind bei dieser Methode selten und bei einer Sichtprüfung in der Regel offensichtlich. Eine erfolglose EMT-Produktion kann von katastrophalen Ausfällen, wie z. B. Gewebeablösung von den Pfosten (Abbildung 2B), bis hin zu subtileren strukturellen Fehlern wie Luftblasen und loser Befestigung an den Pfosten reichen (Abbildung 2C, D). Gewebe mit geringfügigen Mängeln können immer noch lebensfähig sein, aber die Daten dieser Gewebe sollten sorgfältig untersucht werden, um sicherzustellen, dass sie mit nicht kompromittierten EMTs vergleichbar sind. Zum Beispiel können Luftblasen innerhalb eines EMT herausgedrückt werden, wenn sich das Gewebe im Laufe der Zeit verdichtet, wodurch ein voll funktionsfähiges Konstrukt ohne kontraktile Mängel entsteht. Diese Gewebe müssen jedoch von Fall zu Fall beurteilt werden, da die Lage der Luftblasen die funktionelle Erholung beeinträchtigen kann. Luftblasen, die beispielsweise an den Pfosten erzeugt werden, können die Gewebeanhaftung beeinträchtigen, was die langfristige Haftung an der Pfosten behindern könnte.
Das Gewebe beginnt sich innerhalb der ersten 24 Stunden zu verdichten, wenn die Zellen die Matrix innerhalb des Hydrogels umgestalten (Abbildung 3). Die Verdichtung ist ein schrittweiser Prozess und verläuft in der Regel in den ersten 2-4 Wochen der Kultur. Insgesamt ist die Gewebeverdichtung zwischen technischen und biologischen Replikaten konsistent (Abbildung 4). Es ist normal, dass einige Zelllinien die Matrix stärker verdichten als andere, da das Gewebe im Laufe der Zeit reift. Der prozentuale Anteil myogener Zellen innerhalb eines Konstrukts beeinflusst die Geschwindigkeit und den Gesamtgrad der EMT-Verdichtung. Der myogene Gesamtgehalt sowohl für Herz- als auch für Skelettmuskelzelllinien sollte über 80% liegen, um die Variation zwischen den künstlich hergestellten Geweben zu minimieren. Dies ist besonders wichtig, wenn kontraktile Kräfte und Kinetik über Zelllinien hinweg verglichen werden.
Innerhalb der ersten Tage nach dem Casting beginnen die Kardiomyozyten spontan in Kultur zu schlagen und biegen den flexiblen Pfosten bei jeder Muskelkontraktion rhythmisch. Die Skelettmuskelkonstruktionen ziehen sich als Reaktion auf die elektrische Stimulation am 7. Tag nach Beginn der Differenzierung zusammen. Die Feldstimulation wurde über einen externen Stimulator, der an einem speziellen 24-Well-Elektrodendeckel befestigt war, auf das Skelettmuskelgewebe angewendet. Der Deckel, der mit einem Paar Kohlenstoffelektroden für jede Vertiefung hergestellt ist, sitzt auf der 24-Well-Gewebeplatte und stimuliert gleichzeitig jede EMT, um Muskelkontraktionen zu induzieren. Die Gewebe wurden mit einem 10-V-Stimulus für 10 ms Pulsdauern bei 1 Hz während funktioneller Messungen getaktet. Kontraktile Gewebe deuten auf skelettale Myoblasten hin, die verschmolzen sind und Myotuben mit funktionellen Sarkomeren und kontraktilen Maschinen bilden. Skelett-EMTs färben sich positiv auf Myosin Heavy Chain (MyHC) und Dystrophin ist auf der Myotube-Membran lokalisiert und zeigt eine klassische Ringform in der immunhistochemischen Querschnittsanalyse (Abbildung 5). Sobald EMTs funktionsfähig sind, kann die Kontraktilität täglich im magnetischen Sensorinstrument, die Auflagekraft und die Kinetik gemessen werden, während sich die Konstrukte im Laufe der Zeit entwickeln und reifen. Sowohl das Herz- als auch das Skelettmuskelgewebe bleiben in der 3D-Kultur wochen- bis monatelang kontraktil (Abbildung 6) und können für eine Vielzahl von Kontraktilitätsstudien verwendet werden.
Der magnetische Detektionsansatz kann verwendet werden, um gleichzeitig akute und chronische Wirkungen von strukturellen Kardiotoxika wie Doxorubicin (Abbildung 7) und BMS-986094 (Abbildung 8) sowie anderen Arzneimitteln, die die Muskelkontraktilität beeinflussen, zu messen. Optische Tracking-Methoden zur Kontraktionserkennung können ebenfalls verwendet werden, aber bei der Untersuchung akuter Arzneimittelwirkungen ist Vorsicht geboten, da die Messungen sequentiell durchgeführt werden müssen. Die verlängerte Langlebigkeit von Herz- und Skelett-EMTs in 3D-Kultur ermöglicht langfristige Arzneimittelstudien in diesen Geweben. Dies ermöglicht es den Anwendern, die Auswirkungen einer wiederholten Dosierung sowie eine fortgesetzte, langfristige Exposition gegenüber Verbindungen zu untersuchen, die im Laufe der Zeit kardiotoxische Wirkungen zeigen können, wie dies bei Doxorubicin der Fall ist. Doxorubicin (Dox) ist ein Chemotherapeutikum gegen Krebs17. Die Menge des Medikaments, das den Patienten verabreicht wird, hängt von der Art des Krebses, dem Alter des Patienten, der Größe und dem Gewicht des Patienten sowie anderen Faktoren ab. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Wirkung von Dox über einen weiten Bereich von Konzentrationen und Lieferplänen zu testen. Hier wurden kardiale EMTs über einen Zeitraum von 27 Tagen mit drei separaten Konzentrationen (0,1 μM, 1 μM und 10 μM) Dox behandelt (Abbildung 7). Die Gruppen wurden weiter geschichtet, indem EMTs in jeder Konzentration entweder mit einer Bolusbehandlung oder einer kontinuierlichen Verabreichung mit einem mittleren Wechsel alle 72 h behandelt wurden. Wells, denen Bolusbehandlungen mit Dox verabreicht wurden, wurden dem Medikament zu drei verschiedenen Zeitpunkten ausgesetzt, was eine Erholung zwischen den Dosierungen ermöglichte. Die beiden höchsten Bolusdosen und die kontinuierliche Exposition zeigten während der gesamten Studie ein sofortiges und anhaltendes Aufhören der kontraktilen Krafterzeugung. Die mittleren und niedrigsten Konzentrationen hatten je nach Verabreichungsmethode unterschiedliche Auswirkungen auf das Gewebe. In der niedrigsten Konzentration des Arzneimittels zeigte die Bolusgruppe keinen Unterschied zu den Kontrollen. Die Kontraktionskraft nahm jedoch nach 2 Wochen kontinuierlicher Exposition ab. Die mittlere Konzentration des Arzneimittels hatte einen interessanten Effekt. Während die kontinuierliche Dosierung die Kraft in den ersten Tagen der Behandlung reduzierte und während des gesamten Experiments anhielt, zeigte die Bolusgruppe eine Erholung der kontraktilen Kraft zurück auf das Kontrollniveau, wenn das Medikament nach 3 Tagen ausgewaschen wurde. Der zweite Bolus des Arzneimittels verursachte jedoch ein vollständiges Aufhören der Kraft, gefolgt von keiner Erholung (Abbildung 7), was darauf hindeutet, dass eine wiederholte Dosierung in dieser Konzentration bei Patienten, die mit diesem Arzneimittel behandelt wurden, eine kardiotoxische Wirkung haben kann. Der breite Umfang dieser Studie, sowohl unter zeitlichen als auch unter experimentellen Bedingungen, unterstreicht den Nutzen von 3D-Geweben beim Toxizitätsscreening, da sie über längere Zeiträume kontraktil bleiben und auf chemische Exposition reagieren, was langfristige Arzneimittelstudien innerhalb eines einzigen Satzes von Muskelgeweben ermöglicht. Dies erleichtert nicht nur die Identifizierung von Verbindungen, die bei chronischer Exposition eine kardiotoxische Wirkung haben können, sondern auch die Erkennung potenzieller kardiotoxischer Verabreichungszeitpunkte.
In-vitro-Toxizitätstests in künstlich hergestelltem menschlichem Muskelgewebe sind eine Möglichkeit, die Sicherheit menschlicher Patienten in klinischen Studien zu gewährleisten. BMS-986094 ist ein Nukleotidpolymerase (NS5B)-Inhibitor zur Behandlung von Hepatitis C. Das Medikament befand sich in der klinischen Phase-II-Entwicklung, als Bristol-Myers Squibb die Entwicklung aufgrund mehrerer Fälle von unerwarteter Herzinsuffizienz bei Patienten abbrach18,19. Hier wurde BMS-986094 auf kardiale EMTs angewendet, um zu testen, ob 3D-manipuliertes Muskelgewebe eine kardiotoxische Reaktion auf das Medikament entwickeln würde (Abbildung 8). Es wurden drei verschiedene Konzentrationen des Arzneimittels angewendet, und die Gewebe wurden über 13 Tage überwacht. Die kontraktile Kraft sank mit der Zugabe des Arzneimittels dosisabhängig (Abbildung 8A). Die Twitch-Frequenz wurde ebenfalls signifikant beeinflusst, da sich die Schlagrate verlangsamte und schließlich wie erwartet aufhörte, wenn die Exposition gegenüber der kardiotoxischen Verbindung fortgesetzt wurde (p < 0,05, Abbildung 8B). Diese Ergebnisse zeigen, wie 3D-modifiziertes menschliches Muskelgewebe verwendet werden kann, um die Markteinführung neuer Medikamente zu erleichtern und Verbindungen zu kennzeichnen, die aufgrund von Kardiotoxizität versagen. Darüber hinaus könnte diese Technologie potenziell Leben retten, indem sie gefährliche Medikamente freilegt, bevor sie in klinischen Studien an Patienten verabreicht werden.
Die Fähigkeit, die Wirkung von akuten und chronisch angewendeten Medikamenten auf menschliches kontraktiles Gewebe zu messen, ist ein wichtiger erster Schritt bei der Untersuchung von Therapeutika auf Sicherheit und Wirksamkeit. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass die Konzentration der verwendeten Arzneimittel physiologisch relevant und für In-vitro-Tests geeignet ist. Skelettmuskelgewebe wurde verwendet, um einen IC50-Wert für 2,3-Butandionmonoxim (BDM) in einer vollen Dosis-Wirkungs-Kurve zu ermitteln. Dieses Medikament ist ein gut charakterisierter ATPase-Inhibitor des Skelettmuskels Myosin-II20. BDM hemmt Muskelkontraktionen, indem es die Bildung von Myosin-Querbrücken mit dem Aktinfilament in Sarkomeren verhindert21. Die hier gezeigten Ergebnisse zeigen eine dosisabhängige Abnahme der absoluten Kraft bei der Anwendung des Arzneimittels und eine vollständige Wiederherstellung der kontraktilen Kraft beim Auswaschen des Arzneimittels, was darauf hindeutet, dass der vorübergehende Effekt Muskelkontraktionen verhindert und nicht nur Zellen im Gewebe abtötet (Abbildung 9A). Darüber hinaus wurde eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve über die sieben untersuchten Konzentrationen gemessen, die einen IC50 von 3,2 mM in diesen menschlichen Mikrogeweben ergab (Abbildung 9B).
Abbildung 1: EMT-Guss in der 2-Pfosten-Mantarray-Verbrauchsplatte mit 24 Wells . (A) Myogene und Stromazellen wurden vor dem Gewebeguss auf 2D-Oberflächen kultiviert. (B) Zellen werden von 2D-Oberflächen abgehoben und mit extrazellulären Matrixproteinen vermischt, um Hydrogele in den einzelnen Plattengussvertiefungen zu bilden, die im Ausschnitt gezeigt sind. (C) 24-Well-Platte, die in jeder Vertiefung technische Gewebe enthält. (D) Repräsentative Gewebe mit entspannten und kontrahierten Muskeln, Vergleich der Verschiebung des Magnetpfostens (grüne Balken). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Erfolgreiches und erfolgloses EMT-Casting . (A) Ideales künstlich hergestelltes Muskelgewebe 24 h nach dem Gießen, gleichmäßig verdichtet um die Pfosten mit homogener Zell-/Matrixzusammensetzung im gesamten Gewebe. (B) Fehlgeschlagene EMT, die eine Ablösung des Hydrogels vom flexiblen Pfosten zeigt. (C) EMT, die Luftblasen im gesamten Gewebe enthält. (D) Ungleiche Gewebeablagerung um beide Pfosten. Das Gewebe ist auf einer Seite locker am flexiblen Pfosten verankert. Die Maßstabsbalken sind 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Verdichtung im künstlichen Muskelgewebe im Laufe der Zeit. (A) EMT-Konstrukt, das 1 Tag nach dem Gießen gezeigt wird. Das Gewebe wird ab Tag 0 der Zellfusion und Hydrogelverdichtung in das Differenzierungsmedium überführt. (B-E) Die gleiche EMT an Tag 7 bis Tag 21 zeigt eine etwas kürzere Gesamtlänge zwischen den beiden Pfosten im Laufe der Zeit und eine geringere Breite, wenn sie durch den mittleren Abschnitt der EMT gemessen wird. Die Maßstabsbalken sind 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: EMT-Durchmesser im Zeitverlauf. Vier Gewebeplatten wurden über 21 Tage verfolgt, wobei der EMT-Durchmesser während der gesamten Verdichtung verglichen wurde. Jedes Gewebe wurde jede Woche mittels optischer Mikroskopie durch den Mittelteil vermessen. Zeitpunkte zeigen eine konsistente EMT-Größe zwischen den Platten. Die maximale Verdichtung wird am 21. Tag erreicht, wenn der Matrixumbau stabilisiert wird. Die Tabelle zeigt die Standardabweichung (% der Gesamtmenge) der Verdichtung innerhalb jeder Gewebeplatte und die durchschnittliche Abweichung für alle Platten. Farbige Balken sind einzelne Platten. Fehlerbalken sind SD von EMTs innerhalb von Platten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Immunhistochemie des künstlich hergestellten Skelettmuskelgewebes. EMTs wurden am 10. Tag der Kultur fixiert und in Paraffin eingebettet. Dünne Querschnitte (7 μm) wurden vor der Bildgebung mit Antikörpern gegen Myosin, schwere Ketten und Dystrophin gefärbt. Grün = MyHC, Rot = Dystrophin, Blau = DAPI. Die Objektivvergrößerung beträgt 40-fach; Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Kontraktile Kraft in künstlich hergestelltem Muskelgewebe im Laufe der Zeit. (A) Durchschnittliche absolute Zuckenkraft, gemessen von kardialen EMTs von Tag 7 bis Tag 63 in Kultur; n = 3 pro Gruppe. (B) Durchschnittliche absolute Zuckenkraft in Skelett-EMTs, die von einer primären Zelllinie an Tag 7 bis Tag 53 in Kultur abgeleitet wurden; n = 3. Fehlerbalken sind SD für beide Diagramme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Akute und chronische Doxorubicin-Behandlung im künstlich hergestellten Muskelgewebe. Drei separate Dosiskonzentrationen von Dox, 0,1 μM, 1 μM und 10 μM, wurden entweder im Bolus verabreicht oder kontinuierlich über einen Zeitraum von 27 Tagen an künstlich hergestelltes Muskelgewebe verabreicht. Bolusdosen des Arzneimittels wurden bei Medienwechseln an den Tagen 0, 12 und 24 hinzugefügt, was durch die grünen Pfeile auf der X-Achse gekennzeichnet ist. Das Medikament wurde bei jedem Medienwechsel zur kontinuierlichen Dosierung in das Medium gegeben, was durch die schwarzen und grünen Pfeile auf der X-Achse gekennzeichnet ist. Die prozentuale Änderung der Kraft gegenüber den Ausgangswerten (vor der medikamentösen Behandlung) befindet sich auf der Y-Achse und die Zeit in Tagen der Behandlung auf der X-Achse. Hellorange = DMSO-kontinuierliche Kontrolle, dunkelorange = DMSO-Bolus-Kontrolle, hellgrün = 0,1 μM dox kontinuierlich, dunkelgrün = 0,1 μM dox Bolus, hellblau = 1 μM dox kontinuierlich, dunkelblau = 1 μM Dox-Bolus, hellgelb = 10 μM dox kontinuierlich, dunkelgelb = 10 μM dox Bolus. Fehlerbalken sind SD; n = 3 pro Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Chronische Behandlung mit BMS-986094 in künstlich hergestelltem Muskelgewebe. EMTs wurden über 13 Tage mit 0,4 μM (grün), 2 μM (dunkelblau) und 10 μM (hellblau) BMS-986094 behandelt. (A) Die kontraktile Zuckenkraft (Y-Achse) nimmt bei allen Wirkstoffkonzentrationen in den ersten 2 Tagen ab, während das Kontrollgewebe in DMSO mit der Zeit weiter stärker wird (X-Achse). (B) Die Herzschlagfrequenz oder Zuckenfrequenz hört dosisabhängig auf, zusammen mit einem Ende der kontraktilen Kraft, die in Grafik A gezeigt wird. Kontrollgewebe in DMSO (grau) behalten während des gesamten Experiments eine regelmäßige Schlagrate bei. Fehlerbalken sind SD; n = 3 pro Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Dosis-Wirkungs-Verhältnis gegenüber BDM in künstlich hergestelltem Skelettmuskelgewebe . (A) Die absolute Zuckenkraft nimmt dosisabhängig ab, wenn primäre zellabgeleitete EMTs am Tag 16 in 3D-Kultur 2,3-Butandionmonoxim (BDM) ausgesetzt werden. Die absolute Zuckenkraft kehrt zu den Ausgangswerten zurück, wenn das Medikament ausgewaschen wird. (B) Die absolute Zuckungskraft, die auf Ausgangswerte normiert ist, nimmt dosisabhängig ab, wenn sie BDM ausgesetzt wird, was eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve und einen IC50-Wert ergibt. n = 4 pro Dosis. Fehlerbalken sind SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Diese Studie beschreibt Methoden zur Erzeugung von 3D-konstruiertem Herz- und Skelettmuskelgewebe in einem 24-Well-Gusskit. Durch die Befolgung dieser Methoden ist es möglich, konsistent ein komplettes Array von 24 Geweben ohne Gipsfehler für das anschließende Wirkstoff-Screening zu erhalten. Entscheidende Überlegungen, um ein solches Ergebnis zu erzielen, sind die Sicherstellung, dass während des Gießens alle Schritte auf Eis durchgeführt werden, um eine vorzeitige Polymerisation der Hydrogele zu verhindern, die Entfernung des Zelldissoziationsreagenzes vor dem Gewebeguss, das gründliche Mischen der Zell- und Hydrogelsuspension für jedes Gewebe, der Austausch der Pipettenspitzen zwischen den Geweben und die Verwendung von hitzeinaktiviertem FBS (falls überhaupt verwendet). Außerdem ist darauf zu achten, dass das Pfostengitter nach Beginn des Gießens nicht bewegt und nach der Bildung von Hydrogelen schonend übertragen wird.
Zu den wichtigsten Modifikationen gehören die Verwendung verschiedener Zelltypen, um kardiale versus skelettale EMTs zu erreichen, und die Dotierung von Hydrogelen mit variablen Konzentrationen von Basalmembranproteinen, um die Zellreifung und Gewebestabilität zu fördern. Die positiven Auswirkungen eines solchen Dopings müssen von Fall zu Fall getestet werden, es hat sich jedoch gezeigt, dass es unter bestimmten Umständen die funktionellen Ergebnisse und die Langlebigkeit des Gewebes verbessert14,16,22. Bemerkenswert ist auch, dass die aufgeführten Zelldichten ein Richtwert sind und möglicherweise für verschiedene Zelllinien optimiert werden müssen. Alternative Hydrogelzusammensetzungen könnten auch als Mittel zur Modifizierung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der erreichten EMTs23,24,25 in Betracht gezogen werden. Die native Muskelmikroumgebung enthält auch unterstützende Zelltypen zur Förderung der Vaskularisierung, Innervation und Matrixablagerung, um Myozyten in Form und Funktion zu unterstützen26,27. Während das hier beschriebene System derzeit Fibroblasten in 3D-Herzgewebe einbaut, können zusätzliche Zelltypen ein physiologisch relevanteres Modell schaffen, um die Sicherheit und Wirksamkeit von therapeutischen Verbindungen in vitro zu untersuchen. Zuvor wurde eine Reihe von unterstützenden Zelltypen erfolgreich in 3D-Gewebe integriert, was eine aufregende Vorlage für zukünftige Studien unter Verwendung der magnetischen Sensor-Kontraktilitätsplattform28,29,30 darstellt.
Die Fehlerbehebung für dieses Protokoll konzentriert sich auf die Bildung von unzuverlässigem oder inkonsistentem Gewebe während des Gießprozesses. Es muss darauf geachtet werden, dass sich beim Gießen keine Blasen in den Hydrogelen bilden und gleichzeitig eine gleichmäßige Verteilung der Zellen während des Mischens ermöglicht wird. Optimierungsexperimente werden wahrscheinlich für jeden neuen Zelltyp erforderlich sein, um ideale Zelldichten, Zellverhältnisse und Matrixzusammensetzung zu identifizieren.
Eine wesentliche Einschränkung für diese Technik ist die signifikante Anzahl von Zellen, die erforderlich sind, um eine vollständige Platte von 24 EMTs zu etablieren. Für die hier vorgestellten Daten wurden 15 Millionen Kardiomyozyten und 18 Millionen Skelettmyoblasten pro Platte verwendet. Bestimmte Forscher haben möglicherweise keinen Zugang zu solch großen Pools an zellulärem Material, was ihre Fähigkeit beeinträchtigen kann, diese Plattform in vollem Umfang zu nutzen. Wenn Endbenutzer keinen Zugang zu magnetischer Sensorhardware haben, müssen Messungen der Nachablenkungen optisch durchgeführt werden, was den Durchsatz erheblich reduziert und die gleichzeitige Aufzeichnung von Muskelkontraktionen über mehrere Vertiefungen hinweg verhindert. Die Mantarray-Hardware überwindet diese Einschränkungen jedoch und bietet das erste kommerzielle System, das in der Lage ist, die EMT-Kontraktion gleichzeitig über mehrere Konstrukte hinweg kontinuierlich und nicht-invasiv zu analysieren.
Die magnetische Sensorik in 24 Bohrlöchern ermöglicht Längsschnittstudien der EMT-Funktionsentwicklung in Echtzeit und ermöglicht eine genaue Messung akuter Reaktionen auf chemische, umweltbedingte oder genetische Manipulationen. Während die magnetische Sensorik mehrere Vorteile bietet, wie z. B. die gleichzeitige Messung über mehrere Gewebe hinweg, und keine komplizierte Datenanalyse erfordert, ermöglichen optische Detektionsmethoden die gleichzeitige Messung physiologischer Metriken wie Kalziumfluss oder Spannungszuordnung. Datensätze, wie sie im Abschnitt "Ergebnisse" dargestellt sind, zeigen jedoch die Bandbreite der Anwendungen, die diese Technologie im Bereich der Arzneimittelentwicklung hat. Angesichts der Tatsache, dass nur wenige Assays auf dem Markt die Möglichkeit bieten, eine direkte Bewertung der kontraktilen Leistung in künstlich hergestellten Muskeln durchzuführen, haben diese Methoden das Potenzial, die präklinische Entwicklungspipeline zu revolutionieren.
Disclosures
Alle Autoren sind Mitarbeiter und Anteilseigner von Curi Bio Inc., dem Unternehmen, das die Mantarray-Hardware und die dazugehörige Software vermarktet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel der Food and Drug Administration (U01 FD006676-01, vergeben an das Health and Environmental Sciences Institute) und durch Mittel der National Institutes of Health (HL151094 an Dr. Geisse) unterstützt. Wir danken Dr. Alec S. T. Smith für seine Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary - DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary - MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
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