Summary
Este protocolo proporciona métodos para generar tejidos cardíacos y esqueléticos diseñados en 3D y describe su uso en modalidades preclínicas de detección de fármacos. Los métodos descritos utilizan un sistema de detección magnética para facilitar la evaluación simultánea de 24 tejidos en paralelo.
Abstract
Modelar con precisión las condiciones saludables y de la enfermedad in vitro es vital para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento y terapéuticas. Para las enfermedades cardíacas y del músculo esquelético, la fuerza contráctil y la cinética constituyen métricas clave para evaluar la función muscular. Los métodos nuevos y mejorados para generar tejidos musculares diseñados (EMT) a partir de células madre pluripotentes inducidas han hecho que el modelado de enfermedades in vitro sea más confiable para los tejidos contráctiles; Sin embargo, la fabricación reproducible de tejidos a partir de cultivos celulares suspendidos y la medición de su contractilidad es un desafío. Tales técnicas a menudo están plagadas de altas tasas de falla y requieren instrumentación compleja y rutinas de análisis de datos personalizadas. Una nueva plataforma y dispositivo que utiliza EMT 3D junto con un ensayo de contractilidad sin etiquetas, altamente paralelo y fácil de automatizar evita muchos de estos obstáculos. La plataforma permite la fabricación fácil y reproducible de EMT 3D utilizando prácticamente cualquier fuente celular. La contractilidad tisular se mide a través de un instrumento que mide simultáneamente 24 tejidos sin la necesidad de complejas rutinas de análisis de software. El instrumento puede medir de manera confiable los cambios de fuerza de micronewton, lo que permite la detección de compuestos dependientes de la dosis para medir el efecto de un fármaco o terapéutico en la producción contráctil. Los tejidos diseñados con este dispositivo son completamente funcionales, generando contracciones y contracciones tetánicas tras la estimulación eléctrica, y se pueden analizar longitudinalmente en cultivo durante semanas o meses. Aquí, mostramos datos de EMT del músculo cardíaco bajo dosis aguda y crónica con tóxicos conocidos, incluido un medicamento (BMS-986094) que se retiró de ensayos clínicos después de muertes de pacientes debido a cardiotoxicidad imprevista. También se presenta una función del músculo esquelético alterada en tejidos diseñados en respuesta al tratamiento con un inhibidor de miosina. Esta plataforma permite al investigador integrar sistemas de modelos de bioingeniería complejos y ricos en información en su flujo de trabajo de descubrimiento de fármacos con una capacitación o habilidades adicionales mínimas requeridas.
Introduction
Los modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se están convirtiendo cada vez más en actores clave en la línea preclínica para el descubrimiento y desarrollo terapéutico, así como la investigación biológica básica y el modelado de enfermedades 1,2,3,4,5. Los tejidos contráctiles, como el músculo cardíaco y esquelético derivado de las iPSCs, tienen un gran potencial para mejorar el poder predictivo de los estudios in vitro en humanos, ya que la evaluación directa de la fuerza contráctil muscular y la cinética son métricas cuantitativas para estudiar la función tisular general 4,6,7,8. Típicamente, las mediciones de la fuerza contráctil se han obtenido indirectamente mediante el seguimiento óptico de la deflexión del sustrato 9,10 o directamente mediante la unión de células/tejidos a un transductor de fuerza4,11,12. Estos métodos, aunque precisos, son inherentemente de bajo rendimiento y, por lo general, requieren operadores altamente calificados para recopilar y analizar datos.
Trabajos anteriores han demostrado que la detección del campo magnético evita estos obstáculos y proporciona un método alternativo para evaluar la función muscular diseñada simultáneamente a través de múltiples construcciones de tejido13. La plataforma de contractilidad 3D Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) se basa en esta tecnología utilizando un dispositivo capaz de medir la contractilidad de los tejidos musculares diseñados de una manera altamente paralela que aprovecha la complejidad de los modelos celulares 3D con un cribado de mayor rendimiento14. La plataforma permite el monitoreo cuantitativo, en tiempo real y sin etiquetas de la función contráctil en tejidos musculares cardíacos y esqueléticos dentro o fuera de una incubadora de cultivo celular estándar, eliminando la necesidad de imágenes y análisis contráctiles basados en óptica. Esta tecnología facilita la comparación directa de líneas celulares sanas y enfermas y permite medir el efecto de un fármaco en los tejidos contráctiles, estableciendo datos cuantificables, in vitro, de seguridad y eficacia para compuestos terapéuticos nuevos y existentes.
Los tejidos musculares 3D diseñados se pueden fabricar entre dos postes de una manera altamente reproducible utilizando la placa de fundición de 24 pocillos consumible Mantarray (Figura 1). Un poste es rígido, mientras que el otro poste es flexible y contiene un pequeño imán. Cuando la construcción del tejido se contrae, desplaza el poste flexible y el imán incrustado. La placa EMT se coloca dentro del instrumento, y el desplazamiento posterior se mide a través de una serie de sensores magnéticos en una placa de circuito debajo del soporte de la placa. Los cambios medidos en el campo magnético se convierten en fuerza contráctil absoluta utilizando un algoritmo matemático. El instrumento emplea velocidades rápidas de muestreo de datos para permitir la recopilación de información detallada sobre la capacidad funcional y la madurez de los tipos de células que se están ensayando, incluida la frecuencia de contracción, la velocidad y el tiempo de desintegración. Estas mediciones funcionales se pueden obtener en los 24 pozos simultáneamente con la plataforma de detección magnética o de forma individual y secuencial utilizando métodos ópticos tradicionales.
Este estudio describe un método altamente reproducible para diseñar músculo esquelético 3D y microtejidos cardíacos en un hidrogel a base de fibrina. Durante una breve reacción de 80 minutos, la trombina cataliza la conversión de fibrinógeno en fibrina, proporcionando un andamio para que las células musculares se desarrollen en cultivo suspendido15. Las células estromales ayudan a remodelar la matriz y los tejidos se vuelven contráctiles a medida que las células musculares forman un sincitio dentro del hidrogel. La contractilidad de estos tejidos se analizó mediante el enfoque de detección magnética, tanto antes como después de la exposición al compuesto, validando esta modalidad para su uso en estudios de fármaco dosis-respuesta. Los mioblastos humanos primarios de una biopsia de donante sano se obtuvieron comercialmente y se cultivaron en 2D de acuerdo con los protocolos del proveedor. Las células se expandieron utilizando un medio de crecimiento del músculo esquelético a través de tres pasajes para generar un número suficiente de células para fabricar tejidos 3D. Las células estromales y los cardiomiocitos derivados de hiPSC se cultivaron de acuerdo con el protocolo del proveedor durante 3 días para permitir la recuperación de la criopreservación antes de fundir células en los tejidos. Se proporcionan resultados representativos que ilustran los tipos de conjuntos de datos que se pueden recopilar utilizando la plataforma de detección magnética. También se abordan las trampas comunes asociadas con la generación de tejidos diseñados utilizando estos métodos.
Protocol
1. Protocolo de cultivo celular
- Cultivo primario de mioblastos humanos
- Diluir la matriz extracelular (ECM) en una proporción de 1:100 en 8 ml de medio DMEM/F12 en hielo.
- Aplicar 8 ml de solución de MPE en un matraz T175 e incubar a 37 °C durante al menos 1 h antes de la siembra celular, pero no más de 24 h. Asegúrese de que la solución ECM cubra todo el fondo del matraz.
- Alícuota 5 mL del medio de crecimiento del músculo esquelético a un tubo cónico de 15 mL.
- Descongele un vial congelado de células (5,0 x 105 mioblastos) en un baño maría a 37 °C durante 2 min o hasta que el hielo se derrita. Rocíe el vial con etanol al 70% y transfiéralo a un gabinete de bioseguridad (BSC).
- Transfiera las celdas al medio alícuota utilizando un P1000. No triturar. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml del medio de crecimiento utilizando una pipeta P1000 para lograr una suspensión de una sola célula.
- Lavar el matraz recubierto de MCE con 15 ml de DPBS. Aspirar DPBS y, a continuación, añadir 30 ml del medio de cultivo al matraz.
- Añadir 4 ml del medio de crecimiento a las células, mezclar y distribuir la suspensión celular en el matraz T-175. Asegúrese de que el volumen total sea de 35 ml. Deslice el matraz suavemente a lo largo de la superficie de trabajo hacia la izquierda y hacia la derecha 5-6 veces, seguido de 5-6 veces hacia adelante y hacia atrás para asegurar una distribución uniforme de las células en la superficie del matraz.
- Introducir el matraz T-175 en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y al 5% deCO2. Cultive las células durante 3 días o hasta que alcancen no más del 70% de confluencia, y luego pase las células.
- Mioblastos humanos primarios de paso
- Diluir la ECM en una proporción de 1:100 en 30 ml de medio DMEM/F12 en hielo.
- Aplicar 10 ml de solución de MCE en tres matraces T225 e incubar a 37 °C durante al menos 1 h antes de la siembra celular, pero no más de 24 h. Asegúrese de que la solución ECM cubra todo el fondo del matraz.
- Lave las celdas con 15 ml de DPBS. Aspirar y añadir el reactivo de disociación de acuerdo con el protocolo del proveedor.
- Una vez que se levantan las células, detenga la reacción de acuerdo con el protocolo del proveedor y recoja las células en un tubo cónico. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml del medio de crecimiento utilizando una pipeta P1000 para lograr una suspensión de una sola célula.
- Lavar el matraz recubierto de ECM con 15 ml de DPBS. Aspirar DPBS y, a continuación, añadir 40 ml del medio de cultivo a cada matraz T225.
- Añadir 14 ml del medio de cultivo a la suspensión celular, mezclar y distribuir 5 ml de la suspensión celular a cada matraz T225. Asegúrese de que el volumen total de cada matraz sea de 45 ml. Deslice el matraz suavemente a lo largo de la superficie de trabajo hacia la izquierda y hacia la derecha 5-6 veces, seguido de 5-6 veces hacia adelante y hacia atrás para asegurar una distribución uniforme.
- Introducir los matraces en la incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% deCO2.
- Cultive las células durante 2-3 días o hasta que alcancen no más del 70% de confluencia, y luego pasen. Dividir las celdas en 1:3 o 1:4 en cada pasaje y sembrar entre 3 x 103 y 1 x 104 células/cm2.
- Cultivo de cardiomiocitos derivado de hiPSC
- Diluir la ECM en una proporción de 1:60 en 12 ml de medio DMEM/F12 en hielo.
- Aplicar 1 ml de la solución de ECM en cada pocillo de dos placas de 6 pocillos e incubar a 37 °C durante al menos 1 h antes de la siembra celular, pero no más de 24 h.
- Descongele un vial congelado de cardiomiocitos en un baño maría a 37 °C durante 2 minutos o hasta que el hielo se derrita.
- Rocíe el vial con etanol al 70% y transfiéralo al BSC.
- Utilice una pipeta p1000 para transferir las células descongeladas a un tubo cónico de 50 ml.
- Enjuague el criovial vacío con 1 ml de medio de recubrimiento a temperatura ambiente (RT) para recuperar las células restantes.
- Dispense lentamente 1 ml de medios de enjuague gota a gota (una gota cada 5 s) en el tubo cónico de las células en el transcurso de 90 s. Agite continuamente el tubo para mezclar las células durante la adición lenta de medios.
- Añadir lentamente 8 ml del medio de recubrimiento utilizando una pipeta serológica de 10 ml al tubo cónico de 50 ml de células.
- Después de dispensar todos los medios, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 3 veces para mezclar bien las células. Contar las células con un hemacitómetro y azul de tripano.
- Centrifugar las células en el tubo cónico de 50 ml a 300 x g durante 3 min.
- Después de que las células hayan sido granuladas, aspirar el sobrenadante.
- Use una pipeta p1000 para transferir 1 ml del medio de recubrimiento al tubo y rompa suavemente el pellet pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces. Resuspender las celdas con un medio de recubrimiento adicional.
- Semilla entre 2-4 x 10 6 células por pocillo de una placa de6 pocillos en 2 mL del medio de recubrimiento.
- Lave las placas de 6 pocillos recubiertas con ECM con DPBS (2 ml/pocillo).
- Pipetear 2 mL de suspensión celular por pocillo de una placa de 6 pocillos. Mueva las placas suavemente a lo largo de la superficie de trabajo hacia la izquierda y hacia la derecha 5-6 veces, seguidas de 5-6 veces hacia adelante y hacia atrás para garantizar una distribución uniforme de las celdas en las superficies de la placa.
- Colocar la placa en la incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% deCO2.
- Repita los pasos 1.3.3-1.3.16 para todos los viales de las células que se vayan a descongelar.
- Cambie a 3-5 ml (dependiendo de la línea celular y la densidad) de medio de mantenimiento al día siguiente después del recubrimiento, y luego cambie el medio cada dos días. Cultive células durante 3-4 días antes de fundirlas en tejidos 3D.
- Cultivo de células estromales
- Aplicar 30 ml de solución de MCE en un matraz T175 e incubar a 37 °C durante al menos 1 h antes de la siembra celular, pero no más de 24 h.
- Alícuota 5 ml del medio de células estromales en un tubo cónico de 15 ml.
- Descongele un vial congelado de células estromales en un baño de agua a 37 °C durante 2 minutos o hasta que el hielo se haya derretido.
- Rocíe el vial con etanol al 70% y transfiéralo al BSC.
- Utilice una pipeta p1000 para añadir lentamente 1 ml del medio de células estromales a las células descongeladas en el vial.
- Transfiera la suspensión celular del vial al medio de descongelación restante en el tubo cónico. Utilice una pipeta serológica de 5 ml para mezclar las células. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 3 veces.
- Cuente las células con un hemacitómetro y azul de tripano. No gire las células hacia abajo.
- Lavar el matraz T175 recubierto de ECM con 15 ml de DPBS.
- Transfiera las células estromales al matraz a una densidad de 3-4 x 103 células/cm2. Deslice el matraz suavemente a lo largo de la superficie de trabajo hacia la izquierda y hacia la derecha 5-6 veces, seguido de 5-6 veces hacia adelante y hacia atrás para asegurar una distribución uniforme de las células en la superficie del matraz.
- Cambie de medio al día siguiente con 45 ml de medio de células estromales calentadas. Cultive las células durante 3-4 días antes de fundirlas en tejidos 3D.
2. Preparación del material
- Fibrinógeno
NOTA: Al reconstituir fibrinógeno, tenga cuidado de maximizar la cantidad de área de superficie sobre la que se coloca el polvo de fibrinógeno. En este protocolo, la cantidad de diluyente utilizado se optimizó al tamaño del recipiente que se utilizaba, es decir, se utilizó el diluyente suficiente para cubrir el fondo del plato. Por ejemplo, coloque 0,5 g de fibrinógeno sobre 10 ml de PBS en un plato de 100 mm en lugar de un tubo de centrífuga de 50 ml. Maximizar la cantidad de área superficial del diluyente reducirá la cantidad de tiempo necesario para reconstituir el fibrinógeno y reducirá la posible aglutinación de proteínas.- Reconstitución
- Transfiera 10 ml de PBS a una placa de cultivo celular de 100 mm y caliente a 37 °C en una incubadora de cultivo celular.
- Coloque 0,5 g de polvo de fibrinógeno sobre toda la superficie del PBS caliente y manténgalo a 37 °C hasta que el fibrinógeno se haya disuelto completamente. Esto no debería tomar más de 2 h. El polvo de disolución puede agitarse suavemente, pero no agite vigorosamente el plato.
- Filtración estéril
- Una vez que el polvo se haya disuelto completamente, pase la solución a través de un filtro de 100 μm y recójala en un tubo cónico de 50 ml para eliminar cualquier grupo de fibrinógeno gelificado.
- Vierta la solución filtrada en una jeringa de 10 ml tapada con un filtro de 0,2 μm. Empuje la solución a través del filtro y recójala en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Es posible que sea necesario cambiar el filtro más de una vez para esterilizar los 10 ml de solución.
- Alícuota 300 ml de fibrinógeno estéril en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -20 °C. Descongelar las alícuotas en hielo o a 4 °C según sea necesario. Evite congelaciones / descongelaciones repetidas.
- Reconstitución
- Trombina
- Añadir 6 ml de PBS y 4 ml dediH2Odirectamente en un vial de trombina (1 KU) para obtener una solución madre de trombina de 100 U/ml.
- Esterilizar el filtro con un filtro de 0,2 μm, alícuota y almacenar a -20 °C en tubos de microcentrífuga de plástico de 1,5 ml a medida que la trombina se adsorbe al vidrio. Evite congelaciones / descongelaciones repetidas.
- Solución de poli(etileneanticipina) (PEI)
PRECAUCIÓN: PEI es tóxico. Use el EPP apropiado según lo designado por el fabricante.
NOTA: PEI se suministra como una solución al 50% p/v. Es muy viscoso y difícil de pipetear. Haga una solución al 0,1% a partir de una solución madre al 10% en lugar de directamente a partir de la solución al 50% p/v.- Mida 5 ml de solución de PEI al 50% p/v en un tubo cónico de 50 ml.
- Añadir 20 ml dediH2Oy mezclar para obtener una solución madre al 10%. Esta solución madre altamente concentrada no se puede filtrar estérilmente.
- Para hacer una solución al 0,1% para cultivo celular, añadir 5 ml de caldo al 10% a 495 ml de diH2O. Filtro estéril con un matraz filtrante de 500 ml y conservar en RT durante no más de 1 semana.
- Glutaraldehído
PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico. Use el EPP apropiado según lo designado por el fabricante.- El glutaraldehído se suministra como una solución al 25%. Para hacer una solución al 0,01%, añadir 40 μL a 99,6 ml de diH2O. Filtro estéril y conservar a 4 °C durante no más de 1 semana.
- Preparación posterior
- Coloque el kit de fundición de tejido consumible dentro de una campana de cultivo estéril. El kit de fundición contiene una tapa, una celosía de postes que contiene 24 pares de postes (un par de postes por pocillo de una placa de 24 pocillos) y un fondo de placa especializado de 24 pocillos que contiene 24 pocillos de fundición. Cada pozo de fundición contiene una zanja en el fondo del pozo para sostener los componentes de la célula / hidrogel y moldearlos en un tejido en forma de tubo a medida que el hidrogel polimeriza (Figura 1B).
- Llene los pocillos de una placa de 24 pocillos con 1.5 mL/pocillo de una solución de PEI al 0.1% y coloque los postes en la placa de modo que las puntas de cada par de postes queden sumergidas. Déjelo reposar durante 10 minutos. PEI depositará una carga positiva en los postes para que las proteínas en el hidrogel se adhieran firmemente a los postes durante la fundición de tejido.
- Llenar los pocillos de una segunda placa de 24 pocillos con 2 mL/pocillo dediH2Oestéril y transferir los postes. Déjalo reposar durante 1 min.
- En una tercera placa de 24 pocillos, llene los pocillos con 1,5 ml/pocillo de glutaraldehído (GA) al 0,01% y transfiera los postes. Déjelo reposar durante 30 minutos. GA fijará la carga positiva de PEI a los postes.
- Mientras los postes se asientan en glutaraldehído, aspirar los pocillos dediH2O, lavar con 2 mL/pocillo de diH 2Oestéril, aspirar, y rellenar con 2 mL/pocillo de diH2O estéril. Se puede usar un plato fresco de 24 pocillos en lugar de enjuagar.
- Cuando hayan pasado 30 minutos, transfiera los postes a los 2 mL/pocillo de diH2O estéril. Déjalo reposar durante 1 min.
- Aspirar eldiH2Oy añadir otros 2 mL/pocillo de diH2O estéril. Déjalo reposar durante 5 min.
- Transfiera los postes a una placa de 24 pocillos para que se sequen (aproximadamente 15 min).
- Una vez seco, vuelva a montar el kit de fundición. Parafilme los bordes para sellar la tapa y la placa juntas y, a continuación, guárdelos a 4 °C durante un máximo de 72 h antes de la siembra de la celda. Es probable que sea posible que los tiempos de almacenamiento más largos, pero no se hayan probado.
3. Protocolo de fundición de tejidos
- Preparación de la placa de fundición
- Enfriar previamente el kit de fundición de tejidos a 4 °C.
- Transfiera un cubo de hielo al BSC. En hielo, preparar 50 μL de solución de trombina (3 μL de stock de trombina + 47 μL de medio EMT) por pocillo para ser echado.
NOTA: Consulte el paso 3.2.1 para obtener detalles sobre el medio EMT. - Retire el kit de fundición refrigerado del refrigerador y colóquelo sobre un bloque frío o hielo dentro de la campana de cultivo celular. Coloque la placa de fundición plana sobre hielo y mueva la celosía del poste de la placa de fundición a una placa nueva y estéril de 24 pocillos.
- Pipetear 50 μL de solución de trombina en cada pocillo preenfriado de la placa de fundición.
- Vuelva a montar el kit y devuélvalo al refrigerador hasta que lo necesite para la fundición de tejido. Lanzar los tejidos dentro de 3 h de trombón además de los pocillos.
- Preparación celular
- Prepare el medio base EMT, el filtro estéril y déjelo en hielo.
NOTA: Si el medio de fundición específico de la célula contiene FBS, use FBS inactivado por calor, ya que puede interactuar con el fibrinógeno y causar polimerización prematura.- Prepare el medio EMT cardíaco: agregue 500 ml de medio RPMI, 10 ml de B27 y 2.5 g de ácido aminocaproico. (Opcional) Agregue un inhibidor ROCK de 10 mM (agréguelo solo al medio EMT utilizado para fundir tejidos y no al volumen completo de 500 ml).
- Prepare un medio EMT esquelético: agregue 50 ml de medio F10 y 0,25 g de ácido aminocaproico (ACA) para los EMT primarios y 0,1 g de ACA para los EMT derivados de iPSC.
- Calentar el reactivo de disociación de grado de cultivo celular a 37 °C. Caliente un volumen igual de medio EMT para diluir el reactivo de disociación.
NOTA: Es fundamental que la proteasa utilizada esté completamente inactivada. La proteasa activa interferirá con la formación de tejido 3D y la adherencia posterior. - Lave las celdas (Figura 1A) con PBS. Use 2 ml/pocillo para una placa de 6 pocillos. Utilice 6 ml, 15 ml y 15 ml para un plato de 100 mm, un matraz T175 y un matraz T225, respectivamente.
- Añadir el reactivo de disociación de grado de cultivo celular calentado para levantar las células e incubar a 37 °C durante 5 min o hasta que las células se hayan levantado. Para cultivos cardíacos, utilice el reactivo de disociación 10x. Para las células estromales y los mioblastos del músculo esquelético, use un reactivo de disociación 1x. Utilizar 1 ml/pocillo para una placa de 6 pocillos, 3 ml para una placa de 100 mm, 8 ml para un matraz T175 y 10 ml para un matraz T225.
- Revise los cultivos cada 2-3 minutos golpeando el lado del plato.
- Una vez que las células se hayan levantado, transfiéralas a un tubo cónico de 50 ml y triture con una pipeta P1000 para garantizar una suspensión de una sola celda.
- Lave la placa o el matraz con un medio EMT adicional para recoger las células restantes y añadirlas al tubo cónico. Utilice 1 ml/pocillo del medio EMT para una placa de 6 pocillos, 2 ml para una placa de 100 mm, 5 ml para un matraz T175 y 5 ml para un matraz T225.
- Triture las celdas para asegurar una suspensión de una sola celda.
- Agregue medio EMT para terminar el proceso de disociación y luego tome muestras de las suspensiones celulares para los recuentos celulares. Utilizar 1 ml/pocillo para una placa de 6 pocillos, 3 ml para una placa de 100 mm, 8 ml para un matraz T175 y 10 ml para un matraz T225.
- Gire las celdas a 200 x g durante 4 min. Realice recuentos celulares utilizando un hemacitómetro y azul de tripano mientras se centrifugan las suspensiones.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio base EMT para eliminar el reactivo de disociación residual.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 4 min. Aspirar el sobrenadante y preparar las suspensiones celulares a las densidades apropiadas.
- Aumentar la longevidad y la función de los EMT del músculo esquelético 3D con la adición de proteínas ECM del 10% -20% en el medio EMT14,16.
- Cardiomiocitos derivados de células madre semilla y sus células estromales a 5 x 10 5 células y7,5 x 104 células por construcción de tejido, respectivamente. Siembra los mioblastos del músculo esquelético a 7.5 x 105 células por construcción de tejido.
- Tejidos cardíacos
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células estromales a una densidad de 2,5 x 106 células por ml en medio EMT y ponerlas en hielo. Use 30 μL de esta suspensión por EMT.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los CM a una densidad de 8,3 x 106 células por ml en medio EMT y ponerlos en hielo. Use 60 μL de esta suspensión por EMT.
- Tejidos del músculo esquelético
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células del músculo esquelético a una densidad de 8,3 x 106 células por ml en medio EMT y ponerlas en hielo. Use 90 μL de esta suspensión por EMT.
- Calcule los volúmenes de cada solución celular necesarios para constituir el número deseado de tejidos (por ejemplo, 60 μL de los CM preparados y 30 μL de las células del estroma preparadas o 90 μL de las células del músculo esquelético por EMT).
- Pipetear los volúmenes calculados de células en un tubo cónico de 15 ml.
- Agregue 10 μL de fibrinógeno por EMT a la suspensión celular y manténgala en hielo.
- Reactivos totales y volúmenes celulares por EMT: Asegúrese de que cada EMT tenga 90 μL de células, 10 μL de fibrinógeno y 50 μL de solución de trombina.
- Prepare el medio base EMT, el filtro estéril y déjelo en hielo.
- Fundición de tejidos
- Transfiera el kit de fundición de tejido a una campana de cultivo celular y retire la tapa (la celosía posterior que contiene postes flexibles y rígidos debe permanecer en la placa de fundición; Figura 1B). Mantenga la placa de fundición con la celosía posterior sobre hielo.
- Mezclar la mezcla célula/fibrinógeno y extraer 100 μL con una pipeta P200.
- Añadir 100 μL de la mezcla a los pocillos preparados con 50 μL de solución de trombina y triturar 5 veces para mezclar bien. No empuje la pipeta más allá de la primera parada y retire la punta después de la trituración para evitar la creación de burbujas.
- En esta etapa, y hasta que la celosía del poste esté lista para ser levantada de la placa de fundición (paso 3.3.10), cualquier movimiento de la red puede comprometer la unión a largo plazo del tejido a los postes. Sostenga tanto la celosía como la placa de fundición simultáneamente usando el dedo índice y el pulgar de una mano para evitar cualquier movimiento de la celosía.
- Repita con una punta P200 fresca para cada tejido hasta que todos los tejidos estén fundidos. Mezcle la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml antes de fundir cada tejido a medida que las células se asientan rápidamente.
- Transfiera con cuidado el kit de semillas a la incubadora, asegurándose de no mover la celosía. El movimiento de la red después de la siembra puede resultar en un menor éxito en la transferencia de tejidos fuera de los pocillos de fundición. Incubar a 37 °C durante 80 min, independientemente del tipo de célula. Esto comenzará la polimerización del hidrogel y permitirá que las proteínas se adhieran a los postes.
- Mientras tanto, prepare una placa fresca de 24 pocillos con 2 ml / pocillo del medio EMT para tejidos cardíacos. Se puede agregar un inhibidor ROCK de 10 mM al medio EMT si se desea. Incubar la placa a 37 °C para calentar el medio.
- Preparar 2 mL/pocillo de medio de crecimiento que contenga 5 g/L de ácido aminocaproico (0,2 mm estéril filtrado) para tejidos primarios del músculo esquelético o 2 g/L de ACA para EMT derivados de iPSC. Incubar la placa a 37 °C para calentar el medio.
- Después de la incubación, añadir suavemente 1 ml del medio EMT al borde de los pocillos de fundición e incubar durante otros 10 minutos a 37 °C, independientemente del tipo de célula. Esto desalojará el hidrogel de los bordes del pozo de fundición y permitirá una fácil transferencia del tejido.
- Después de 10 minutos, levante con cuidado la celosía posterior y transfiera los tejidos de la placa de fundición a una placa preparada de 24 pocillos con medio (Figura 1C). Devolver las placas con tejidos a la incubadora de cultivo celular a 37 °C.
- Mantenimiento
- Después de 24 h, transferir los tejidos moldeados a una placa fresca de 24 pocillos con 2 mL/pocillo del medio EMT (sin el inhibidor ROCK si se incluyó) e incubar a 37 °C. Para las células del músculo esquelético, cambie el medio de crecimiento al medio de diferenciación para promover la fusión de mioblastos.
- Transfiera los tejidos cardíacos a pocillos frescos con 2 mL/pocillo del medio EMT cada 2-3 días.
- Transfiera los tejidos del músculo esquelético a pocillos frescos con un medio de diferenciación de 2 mL/pocillo que contenga 5 g/L de ácido aminocaproico (0,2 mm estéril filtrado) cada 2-3 días. Use 2 g/L de ACA para los tejidos derivados de iPSC.
- Para ayudar en los cambios de medio, transfiera la celosía posterior a una placa fresca de 24 pocillos en lugar de cambiar el medio en la misma placa para evitar dañar los tejidos 3D. Prepare una segunda placa de 24 pocillos con el medio EMT y transfiera los tejidos al medio fresco. Mantenga la placa con el medio antiguo junto con el cultivo activo para usarla para el siguiente cambio de medio. Transfiera la celosía posterior hacia adelante y hacia atrás entre las dos placas durante todo el período de cultivo. Alternativamente, use un plato nuevo para cada cambio de medio.
- Mida la contracción de EMT ya sea a través del seguimiento óptico de la deflexión posterior (Figura 1D) o hardware de detección magnética13,14. Los tejidos cardíacos comienzan a latir espontáneamente después de 3-4 días en cultivo. Los tejidos del músculo esquelético son típicamente contráctiles con estimulación del campo eléctrico después de 7 días en cultivo.
Representative Results
Las células se fundieron en tejidos musculares diseñados en la placa consumible de 2 postes (Figura 1). Los EMT exitosos aparecerán uniformes y la matriz se distribuirá uniformemente entre los puestos (Figura 2A). La matriz también debe envolverse alrededor de ambos postes, produciendo puntos de anclaje equivalentes para el tejido. Las fallas en la fundición son raras con este método y generalmente son obvias con una inspección visual. La producción fallida de EMT puede variar desde fallas catastróficas, como el desprendimiento de tejido de los postes (Figura 2B) hasta defectos estructurales más sutiles, como burbujas de aire y fijación suelta a los postes (Figura 2C, D). Los tejidos con defectos menores aún pueden ser viables, pero los datos de estos tejidos deben examinarse cuidadosamente para garantizar que sean comparables a los EMT no comprometidos. Por ejemplo, las burbujas de aire dentro de un EMT pueden exprimirse a medida que el tejido se compacta con el tiempo, lo que hace que sea una construcción completamente funcional sin deficiencias contráctiles. Sin embargo, estos tejidos deben evaluarse caso por caso, ya que la ubicación de las burbujas de aire puede afectar la recuperación funcional. Las burbujas de aire generadas en los postes, por ejemplo, pueden afectar la unión del tejido, lo que podría impedir la adherencia a largo plazo al poste.
Los tejidos comienzan a compactarse dentro de las primeras 24 h a medida que las células remodelan la matriz dentro del hidrogel (Figura 3). La compactación es un proceso gradual y generalmente procede durante las primeras 2-4 semanas de cultivo. En general, la compactación tisular es consistente entre réplicas técnicas y biológicas (Figura 4). Es normal que algunas líneas celulares compacten la matriz más que otras a medida que los tejidos maduran con el tiempo. El porcentaje de células miogénicas dentro de una construcción influye en la tasa y el grado general de compactación EMT. El contenido miogénico total para las líneas celulares del músculo cardíaco y esquelético debe ser superior al 80% para minimizar la variación entre los tejidos diseñados. Esto es particularmente importante cuando se comparan fuerzas contráctiles y cinética a través de líneas celulares.
Dentro de los primeros días después del yeso, los cardiomiocitos comienzan a latir espontáneamente en cultivo, doblando rítmicamente el poste flexible con cada contracción muscular. Las construcciones del músculo esquelético se contraen en respuesta a la estimulación eléctrica en el día 7 después de comenzar la diferenciación. La estimulación de campo se aplicó a los tejidos del músculo esquelético a través de un estimulador externo conectado a una tapa de electrodo personalizada de 24 pocillos. La tapa, fabricada con un par de electrodos de carbono para cada pozo, se encuentra en la parte superior de la placa de tejidos de 24 pocillos, estimulando simultáneamente cada EMT para inducir contracciones musculares. Los tejidos se marcaron con un estímulo de 10 V durante duraciones de pulso de 10 ms a 1 Hz durante las mediciones funcionales. Los tejidos contráctiles indican mioblastos esqueléticos que se han fusionado, formando miotubos completos con sarcómeros funcionales y maquinaria contráctil. Las manchas de EMT esqueléticas positivas para la cadena pesada de miosina (MyHC) y la distrofina se localiza en la membrana del miotubo, revelando una forma de anillo clásica en el análisis inmunohistoquímico transversal (Figura 5). Una vez que los EMT son funcionales, la contractilidad se puede medir diariamente en el instrumento de detección magnética, la fuerza de seguimiento y la cinética a medida que las construcciones se desarrollan y maduran con el tiempo. Tanto los tejidos del músculo cardíaco como el esquelético permanecen contráctiles durante semanas o meses en cultivo 3D (Figura 6), y se pueden utilizar para una amplia gama de estudios de contractilidad.
El enfoque de detección magnética se puede utilizar para medir simultáneamente los efectos agudos y crónicos de los cardiotóxicos estructurales, como la doxorrubicina (Figura 7) y BMS-986094 (Figura 8), así como otros fármacos que afectan la contractilidad muscular. También se pueden utilizar métodos de seguimiento óptico de detección de contracciones, pero se debe tener cuidado al estudiar los efectos agudos de los fármacos, ya que las mediciones deben tomarse secuencialmente. La longevidad prolongada de los EMT cardíacos y esqueléticos en cultivo 3D permite estudios farmacológicos a largo plazo en estos tejidos. Esto permite a los usuarios explorar los efectos de la dosis repetida, así como la exposición continua a largo plazo a compuestos que pueden mostrar efectos cardiotóxicos con el tiempo, como ocurre con la doxorrubicina. La doxorrubicina (dox) es un fármaco de quimioterapia contra el cáncer17. La cantidad de fármaco administrado a los pacientes varía, dependiendo del tipo de cáncer, la edad del paciente, la altura y el peso del paciente, así como otros factores. Por esta razón, es importante probar el efecto del dox en una amplia gama de concentraciones y programas de entrega. Aquí, los EMT cardíacos se trataron en el transcurso de 27 días con tres concentraciones separadas (0.1 μM, 1 μM y 10 μM) de dox (Figura 7). Los grupos se estratificaron aún más mediante el tratamiento de EMT en cada concentración con un tratamiento en bolo o administración continua con un cambio medio cada 72 h. Los pozos que recibieron tratamientos en bolo de dox fueron expuestos al fármaco en tres puntos de tiempo separados, lo que permitió la recuperación entre las dosis. Las dos dosis más altas de bolo y la exposición continua mostraron un cese inmediato y prolongado de la generación de fuerza contráctil durante todo el estudio. Las concentraciones medias y bajas tuvieron efectos variables sobre los tejidos, dependiendo del método de administración. En la concentración más baja del fármaco, el grupo en bolo no mostró diferencias con los controles. Sin embargo, la fuerza contráctil disminuyó después de 2 semanas de exposición continua. La concentración de rango medio de la droga tuvo un efecto interesante. Mientras que la dosificación continua redujo la fuerza durante los primeros días de tratamiento y duró todo el experimento, el grupo de bolo mostró una recuperación de la fuerza contráctil a los niveles de control cuando el fármaco se lavó después de 3 días. Sin embargo, el segundo bolo del fármaco causó un cese completo de la fuerza, seguido de ninguna recuperación (Figura 7), lo que indica que la dosificación repetida a esta concentración puede tener un efecto cardiotóxico en pacientes tratados con este fármaco. El amplio alcance de este estudio, tanto en tiempo como en condiciones experimentales, destaca la utilidad de los tejidos diseñados en 3D en la detección de toxicidad, ya que permanecen contráctiles y responden a la exposición química durante largos períodos de tiempo, lo que permite estudios farmacológicos a largo plazo dentro de un solo conjunto de tejidos musculares. Esto facilita no solo la identificación de compuestos que pueden tener un efecto cardiotóxico con la exposición crónica, sino también la detección de posibles momentos cardiotóxicos de administración.
Las pruebas de toxicidad in vitro en tejidos musculares humanos diseñados son una forma de ayudar a mantener seguros a los pacientes humanos en los ensayos clínicos. BMS-986094 es un inhibidor de la nucleótido polimerasa (NS5B) utilizado para tratar la hepatitis C. El fármaco estaba en desarrollo clínico de Fase II cuando Bristol-Myers Squibb interrumpió el desarrollo debido a varios casos de insuficiencia cardíaca inesperada en pacientes18,19. Aquí, BMS-986094 se aplicó a los EMT cardíacos para probar si los tejidos musculares diseñados en 3D desarrollarían una reacción cardiotóxica al medicamento (Figura 8). Se aplicaron tres concentraciones diferentes del fármaco y se monitorizaron los tejidos durante 13 días. La fuerza contráctil disminuyó con la adición del fármaco de una manera dependiente de la dosis (Figura 8A). La frecuencia de contracción también se vio afectada significativamente a medida que la frecuencia de latido disminuyó y finalmente se detuvo como se esperaba con la exposición continua al compuesto cardiotóxico (p < 0.05, Figura 8B). Estos resultados demuestran cómo los tejidos musculares humanos diseñados en 3D se pueden utilizar para facilitar la introducción de nuevos medicamentos en el mercado y marcar compuestos que eventualmente fallan debido a la cardiotoxicidad. Además, esta tecnología podría salvar vidas al exponer medicamentos peligrosos antes de que se pongan en pacientes en ensayos clínicos.
La capacidad de medir el efecto de los fármacos aplicados aguda y crónicamente en el tejido contráctil humano es un primer paso vital cuando se investiga la seguridad y eficacia de las terapias. Es importante saber, sin embargo, que la concentración de fármacos aplicados es fisiológicamente relevante y apropiada para las pruebas in vitro . Se utilizaron tejidos del músculo esquelético para establecer un valor de IC50 para la monoxima de 2,3-butanodiona (BDM) en una curva dosis-respuesta completa. Este fármaco es un inhibidor de la ATPasa bien caracterizado de la miosina II20 del músculo esquelético. BDM inhibe las contracciones musculares al prevenir la formación de puentes cruzados de miosina con el filamento de actina en sarcómeros21. Los resultados que se muestran aquí revelan una disminución dependiente de la dosis en la fuerza absoluta cuando se aplica el fármaco y una recuperación completa de la fuerza contráctil cuando se lava el fármaco, lo que indica que el efecto transitorio es prevenir las contracciones musculares y no simplemente matar las células dentro del tejido (Figura 9A). Además, se midió una curva dosis-respuesta completa en las siete concentraciones examinadas, estableciendo un IC50 de 3,2 mM en estos microtejidos humanos (Figura 9B).
Figura 1: Fundición EMT en la placa consumible de 24 pocillos Mantarray de 2 postes . (A) Las células miogénicas y estromales se cultivaron en superficies 2D antes de la fundición de tejidos. (B) Las células se levantan de superficies 2D y se mezclan con proteínas de matriz extracelular para formar hidrogeles en los pocillos de fundición de placas individuales que se muestran en el recuadro. (C) Placa de 24 pocillos que contiene tejidos diseñados en cada pozo. (D) Tejidos representativos que muestran músculo diseñado relajado y contraído, comparando el desplazamiento del poste magnético (barras verdes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fundición EMT exitosa y no exitosa . (A) Tejido muscular diseñado ideal 24 h después de la fundición uniformemente compactado alrededor de los postes con composición homogénea de células / matriz en todo el tejido. (B) EMT fallido que muestra desprendimiento del hidrogel del poste flexible. (C) EMT que contiene burbujas de aire en todo el tejido. (D) Deposición desigual de tejido alrededor de ambos postes. El tejido está ligeramente anclado al poste flexible en un lado. Las barras de escala son de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Compactación en tejido muscular diseñado a lo largo del tiempo. (A) Construcción de EMT mostrada 1 día después del lanzamiento. Los tejidos se transfieren al medio de diferenciación, comenzando el día 0 de fusión celular y compactación de hidrogel. (B-E) El mismo EMT desde el día 7 hasta el día 21 muestra una longitud total ligeramente más corta entre los dos postes a lo largo del tiempo y un ancho más pequeño cuando se mide a través de la sección central del EMT. Las barras de escala son de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diámetro EMT a lo largo del tiempo. Se rastrearon cuatro placas de tejidos durante 21 días, comparando el diámetro de EMT durante toda la compactación. Cada tejido se midió a través de la sección media cada semana utilizando microscopía óptica. Los puntos de tiempo muestran un tamaño EMT consistente entre las placas. La compactación máxima se alcanza en el día 21 a medida que se estabiliza la remodelación de la matriz. La tabla muestra la desviación estándar (% del total) de compactación dentro de cada placa de tejidos y la desviación promedio para todas las placas. Las barras de colores son platos individuales. Las barras de error son SD de los EMT dentro de las placas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inmunohistoquímica de los tejidos del músculo esquelético diseñado. Los EMT se fijaron en el día 10 de cultivo y se incrustaron en parafina. Las secciones transversales delgadas (7 μm) se tiñeron con anticuerpos contra la cadena pesada de miosina y la distrofina antes de la imagen. Verde = MyHC, rojo = distrofina, azul = DAPI. El aumento objetivo es 40X; La barra de escala es de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Fuerza contráctil en tejidos musculares diseñados a lo largo del tiempo. (A) Fuerza de contracción absoluta promedio medida a partir de EMT cardíacos desde el día 7 hasta el día 63 en cultivo; n = 3 por grupo. (B) Fuerza de contracción absoluta promedio en EMT esqueléticos derivados de una línea celular primaria desde el día 7 hasta el día 53 en cultivo; n = 3. Las barras de error son SD para ambos gráficos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tratamiento agudo y crónico con doxorrubicina en el tejido muscular diseñado. Se administraron tres concentraciones de dosis separadas de dox, 0,1 μM, 1 μM y 10 μM, en bolo o administradas continuamente a tejidos musculares diseñados en el transcurso de 27 días. Las dosis en bolo del fármaco se agregaron en los cambios de medios en los días 0, 12 y 24, anotadas por las flechas verdes en el eje X. El medicamento se agregó a los medios en cada cambio de medio para una dosificación continua, notada por las flechas negras y verdes en el eje X. El cambio porcentual en la fuerza de los valores basales (tratamiento previo al medicamento) está en el eje Y, y el tiempo en días de tratamiento está en el eje X. Naranja claro = control continuo DMSO, naranja oscuro = control del bolo DMSO, verde claro = 0.1 μM dox continuo, verde oscuro = 0.1 μM bolo dox, azul claro = 1 μM dox continuo, azul oscuro = 1 μM Dox bolo dox, amarillo claro = 10 μM dox continuo, amarillo oscuro = 10 μM dox bolo. Las barras de error son SD; n = 3 por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Tratamiento crónico con BMS-986094 en tejido muscular diseñado. Los EMT fueron tratados con 0.4 μM (verde), 2 μM (azul oscuro) y 10 μM (azul claro) BMS-986094 durante 13 días. (A) La fuerza de contracción contráctil (eje Y) disminuye en todas las concentraciones del fármaco en los primeros 2 días, mientras que los tejidos de control en DMSO continúan fortaleciéndose con el tiempo (eje X). (B) La frecuencia cardíaca, o frecuencia de contracción, cesa de una manera similar dependiente de la dosis en conjunto con un cese de la fuerza contráctil que se muestra en el gráfico A. Los tejidos de control en DMSO (gris) mantienen una frecuencia de latido regular durante todo el experimento. Las barras de error son SD; n = 3 por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Dosis-respuesta a BDM en tejidos musculares esqueléticos diseñados . (A) La fuerza de contracción absoluta disminuye de manera dependiente de la dosis cuando los EMT primarios derivados de células se exponen a la 2,3-butanodiona monoxima (BDM) el día 16 en cultivo 3D. La fuerza de contracción absoluta vuelve a los valores cercanos a los valores basales cuando se lava el medicamento. (B) La fuerza de contracción absoluta normalizada a los valores basales disminuye de manera dependiente de la dosis cuando se expone a BDM, produciendo una curva dosis-respuesta completa y un valor IC50 ; n = 4 por dosis. Las barras de error son SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este estudio describe métodos para generar tejidos cardíacos y esqueléticos diseñados en 3D dentro de un kit de fundición consumible de 24 pocillos. Al seguir estos métodos, es posible lograr consistentemente una gama completa de 24 tejidos sin fallas de fundición para la posterior detección de fármacos. Las consideraciones críticas para lograr tal resultado son garantizar que durante la fundición todos los pasos se realicen en hielo para evitar la polimerización prematura de los hidrogeles, la eliminación del reactivo de disociación celular antes de la fundición del tejido, la mezcla completa de la célula y la suspensión de hidrogel para cada tejido, el reemplazo de las puntas de pipeta entre los tejidos y el uso de FBS inactivado por calor (si se usa en absoluto). Además, es importante asegurarse de que la celosía posterior no se mueva una vez que comience la fundición y se transfiera suavemente una vez que se hayan formado los hidrogeles.
Las principales modificaciones incluyen el uso de diferentes tipos de células para lograr EMT cardíacos versus esqueléticos y el dopaje de hidrogeles con concentraciones variables de proteínas de la membrana basal para promover la maduración celular y la estabilidad del tejido. Los efectos beneficiosos de dicho dopaje deben probarse caso por caso, pero se ha demostrado que mejoran los resultados funcionales y la longevidad de los tejidos en ciertas circunstancias14,16,22. También es digno de mención que las densidades celulares enumeradas son una guía y pueden necesitar ser optimizadas para diferentes líneas celulares. Las composiciones alternativas de hidrogel también podrían considerarse como un medio para modificar las propiedades estructurales y funcionales de los EMT logrados23,24,25. El microambiente muscular nativo también contiene tipos de células de soporte para promover la vascularización, inervación y deposición de matriz para apoyar a los miocitos en forma y función26,27. Si bien el sistema descrito aquí actualmente incorpora fibroblastos en tejidos cardíacos 3D, los tipos de células adicionales pueden crear un modelo fisiológico más relevante para estudiar la seguridad y eficacia de los compuestos terapéuticos in vitro. Anteriormente, una gama de tipos de células de soporte se han integrado con éxito en tejidos de ingeniería 3D que presentan una plantilla emocionante para futuros estudios utilizando la plataforma de contractilidad de detección magnética28,29,30.
La solución de problemas para este protocolo se centra en la formación de tejidos poco confiables o inconsistentes durante el proceso de fundición. Se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas en los hidrogeles a medida que se funden y al mismo tiempo se facilita la distribución uniforme de las células durante la mezcla. Es probable que se necesiten experimentos de optimización para cada nuevo tipo de célula para identificar las densidades celulares ideales, las proporciones celulares y la composición de la matriz.
Una limitación importante para esta técnica es el número significativo de células requeridas para establecer una placa completa de 24 EMT. Para los datos presentados aquí, se utilizaron 15 millones de cardiomiocitos y 18 millones de mioblastos esqueléticos por placa. Ciertos investigadores pueden no tener acceso a grupos tan grandes de material celular, lo que puede inhibir su capacidad para usar esta plataforma en toda su extensión. Si los usuarios finales no tienen acceso al hardware de detección magnética, las mediciones de las deflexiones posteriores deben realizarse ópticamente, lo que reduce significativamente el rendimiento y evita el registro simultáneo de contracciones musculares en múltiples pocillos. Sin embargo, el hardware Mantarray supera estas limitaciones para ofrecer el primer sistema comercial capaz de realizar un análisis continuo y no invasivo de la contracción de EMT simultáneamente en múltiples construcciones.
La detección magnética en 24 pozos facilita los estudios longitudinales del desarrollo funcional de EMT en tiempo real y permite la medición precisa de las respuestas agudas a la manipulación química, ambiental o genética. Si bien la detección magnética tiene varias ventajas, como la medición simultánea en múltiples tejidos, y no requiere un análisis de datos complicado, los métodos de detección óptica permiten la medición simultánea de métricas fisiológicas como el flujo de calcio o el mapeo de voltaje. Sin embargo, conjuntos de datos como los que se ilustran en la sección de resultados demuestran la amplitud de aplicaciones que esta tecnología tiene en el espacio de desarrollo de fármacos. Dado que pocos ensayos en el mercado ofrecen los medios para realizar una evaluación directa de la producción contráctil en el músculo diseñado, estos métodos tienen el potencial de revolucionar la línea de desarrollo preclínico.
Disclosures
Todos los autores son empleados y accionistas de Curi Bio Inc., la compañía que comercializa el hardware Mantarray y el software asociado.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por fondos de la Administración de Alimentos y Medicamentos (U01 FD006676-01 otorgado al Instituto de Ciencias de la Salud y el Medio Ambiente) y por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (HL151094 al Dr. Geisse). Agradecemos al Dr. Alec S. T. Smith por su ayuda con la preparación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary - DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary - MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
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