Summary
该协议描述了一种获取肽和其他化合物（例如小分子抗真菌剂）抗真菌活性的定量数据的方法，用于对抗 白色念珠菌。它使用光密度而不是计数集落形成单位来量化生长抑制，从而节省时间和资源。
Abstract
对 白色念珠菌 进行抗真菌药敏试验的传统方法既耗时又缺乏定量结果。例如，一种常见的方法依赖于在琼脂平板上用不同浓度的抗真菌分子处理的细胞，然后计数菌落以确定分子浓度与生长抑制之间的关系。这种方法需要许多板和大量时间来计数菌落。另一种常见的方法通过目视检查用抗真菌剂处理的培养物来确定抑制生长所需的最低浓度，从而消除平板和菌落计数;然而，目视检查只能产生定性结果，并且丢失了亚抑制浓度下生长的信息。该协议描述了一种测量 白色念珠菌 对抗真菌肽的敏感性的方法。通过依靠培养物的光密度测量，该方法减少了获得不同肽浓度下培养物生长定量结果所需的时间和材料。使用适当的缓冲液在96孔板中将真菌与肽孵育，对照代表无生长抑制和完全生长抑制。与肽孵育后，将所得细胞悬液稀释以降低肽活性，然后生长过夜。过夜生长后，测量每个孔的光密度并与阳性和阴性对照进行比较，以计算每个肽浓度下产生的生长抑制。使用该测定的结果与使用在琼脂平板上接种培养物的传统方法的结果相当，但该协议减少了塑料浪费和计数菌落所花费的时间。尽管该协议的应用集中在抗真菌肽上，但该方法也适用于测试具有已知或疑似抗真菌活性的其他分子。
Introduction
白色念珠 菌是人类微生物群的成员，该微生物群定植于许多位置，包括口腔、皮肤、胃肠道和阴道1.对于因人类免疫缺陷病毒（HIV）和免疫抑制治疗等疾病而免疫功能低下的患者，白色念珠菌的定植可能导致局部或全身 念珠菌 病2，3。使用目前可用的小分子抗真菌疗法，如两性霉素 B、唑类或棘白菌素类药物，可能会因溶解度和毒性问题以及感染对治疗药物的耐药性而变得复杂4，5。由于当前抗真菌剂的局限性，研究人员不断寻找对 白色念珠菌具有活性的新抗真菌分子。
抗菌肽（AMP）是当前小分子抗真菌剂6，7，8的潜在替代品，并且与小分子药物相比，被认为不易产生耐药性9。AMP是一组不同的肽，但它们通常是阳离子的，具有广泛的活性10，11，12。具有抗白色念珠菌活性的AMP包括来自组抑素和cecropin家族13，14，15的众所周知的肽，以及最近描述的肽，如ToAP2，NDBP-5.7和组抑素5变体K11R-K17R 16，17。由于它们具有治疗念珠菌感染的潜力，因此识别和设计针对白色念珠菌的新AMP是许多研究小组的重要目标。
作为开发靶向白色念珠菌的有效AMP（和其他抗真菌剂）的过程的一部分，体外测试通常用于鉴定有前途的肽。测试针对白色念珠菌的抗真菌活性的方法通常涉及在96孔板中用连续稀释的AMP（缓冲液或培养基）孵育细胞。有几种方法可用于评估孵育后的抗真菌活性。临床实验室标准协会描述的一种技术使用对孔浊度的纯目视评估来确定完全抑制生长的最小浓度（MIC）（对于选定的抗真菌剂，如唑类和棘白菌素类药物至少抑制50%），并且不提供亚MIC浓度下生长的定量18.另一种常用的方法包括通过将孔的内容物铺在琼脂平板上，孵育平板，然后计数平板上菌落形成单位（CFU）的数量来量化AMP孵育后的活力。该方法已用于评估许多肽，包括基于组抑素5的肽LL-37和人乳铁蛋白19，20，21。该技术需要相对大量的琼脂和大量的平板，并且涉及平板上CFU的繁琐计数。为了获得更多定量数据，同时产生更少的塑料废物并避免计数CFU，可以使用孔的内容物在另一个96孔板中接种新鲜培养基。孵育新接种的板后，可以通过在吸光度酶标仪上测量600nm处的光密度（OD600）来量化生长。该方法已用于测定组抑素5及其降解片段和细胞穿透肽17，22，23，24，25的抗真菌活性。
该协议描述了如何测试肽的抗真菌活性，并使用OD600 方法来量化由于肽引起的 白色念珠菌 活力的降低。
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Protocol
马里兰大学帕克分校机构生物安全委员会（IBC）批准了该议定书中白色 念珠菌 的工作（PN 274）。本研究使用了 白色念珠菌菌 株SC5314（见 材料表）;但是，也可以使用任何其他菌株。
1. 缓冲液、无菌水和培养基的制备
- 在pH 7.4下制备无菌0.1M磷酸钠缓冲液（NaPB）26 ，并用无菌水稀释至2mM和1mM。对于该协议的大多数应用，制备 2 mM NaPB 和 1 mM NaPB 各 100 mL 绰绰有余。
- 制备无菌液体酵母-蛋白胨-葡萄糖（YPD，见 材料表）培养基（10 g / L酵母提取物，20 g / L葡萄糖，20 g / L蛋白胨）。制备 100 mL YPD 对于该协议的大多数应用来说绰绰有余。
- 准备无菌超纯水。对于该方案的大多数应用来说，制备 100 mL 的水将绰绰有余。
注意：缓冲液，培养基和水通过在121°C下在液体循环中高压灭菌适当的时间，根据被高压灭菌的容器中的体积27。例如，对于含有 500 mL 的瓶子，暴露时间应为 40 分钟。
2. 白色念珠菌的接种、培养和传代
注意：遵守所有处理 白色念珠菌的机构和政府法规，无论耐药性如何，学术研究机构通常将其归类为生物安全级（BSL）2生物体，而美国类型培养物保藏（ATCC）将其归类为BSL1或BSL2生物体，具体取决于菌株28的耐药性。
注意：在开始抗真菌活性测试的前一天执行此步骤的接种和培养部分（步骤2.1-2.2）。如果可能，在生物安全柜中对细胞（以及将与细胞一起孵育的溶液）执行所有方案步骤。
- 将所需的 白色念 珠菌菌株接种到培养管中的 10 mL YPD 培养基中。
注意：培养物可以从冷冻原液或琼脂平板中接种，但必须对将要比较的所有数据使用一致的来源。 - 在旋转振荡器上以30°C和230rpm培养培养物过夜（~12-16小时）。
- 传代培养 白色念珠菌的过夜培养，并生长到~1.0-1.2的OD600 。
- 使用紫外分光光度计测量过夜培养物的OD600 （参见 材料表）。
- 基于过夜培养物的OD 600，使用过夜培养物以OD600 在10mL YPD中接种0.1的传代培养物。
- 在30°C的旋转振荡器上以230rpm的速度生长传代培养物，直到OD600 达到~1.0-1.2，这可能需要4-6小时。在传代培养物生长的同时完成步骤3（肽溶液的制备）;传代培养物将被稀释以用于步骤4中的测定。
3.在96孔板中制备肽溶液
注意：如果肽储备溶液在储存期间稳定，则可以提前完成此步骤。通常，肽溶液储存在-20°C直至使用。它们可以在室温水浴中解冻，然后再进行下一步。
- 确定测定中要测试的每种肽的最高浓度。这将根据所选的肽而有所不同。对于代表性结果部分提供的数据，测试了组抑素5和工程类似物22 ，测试的最高浓度为50μM。
注意：要测试的最高浓度是使用文献中报告的数据或通过在广泛的肽浓度范围内进行初步实验来确定的。如果可能，应选择最高浓度以观察在测试的最高浓度下完全降低活力的平台，以及在测试的最低浓度下不降低活力的平台，从而可以定量整个肽活性范围。 - 将每种肽以所需最高浓度的两倍溶解在无菌水中。对于代表性结果部分提供的数据，在无菌水中制备150 μL 100 μM组抑素5和工程类似物溶液。
注意：如果肽不溶于水，则在此步骤之前可能需要在另一种溶剂中溶解。二甲基亚砜（DMSO）通常用于在稀释到工作浓度之前溶解高浓度的肽。确保DMSO的最终浓度为1%（v / v）或更低的29 ，并且替代溶剂不会影响细胞的生长。此外，确保步骤3.4-3.5中所有孔中的溶剂浓度保持恒定。 - 将 40 μL 所需肽储备溶液加入 96 孔圆底培养板中每行的第一孔（第 1 列）（参见 材料表）。该板是板1（图1）。
注意：每个板有八行，用于测试肽。这些行可用于不同的肽或相同肽的重复。每行仅包含一种肽。 - 将 20 μL 无菌超纯水加入含有肽的行的第 2 列至第 12 列（图 1）。
注意：如果在步骤3.2中用纯水以外的溶剂制备肽储备液，则应将此步骤中的无菌水替换为添加到第一列的肽储备液中存在的溶剂。例如，如果肽在DMSO中溶解，并且肽原液在水中含有1%（v/v）DMSO，则必须将含有1%DMSO的水添加到第2列至第12列。 - 将板上的肽储备溶液连续稀释至第10列（图1）。
注意：与其如下所述在板中进行连续稀释，不如在微量离心管中进行稀释并转移到96孔板中。- 从第 1 列中取出 20 μL，将其转移到第 2 列，然后上下移液混合。第 2 列现在包含 40 μL 肽溶液，稀释比例为 1：2。
- 从第 2 列中取出 20 μL，将其转移到第 3 列，然后上下移液混合，因此第 3 列现在含有 40 μL 肽溶液，稀释比例为 1：4 的第 1 列中的浓度。
- 重复此过程，直到第 10 列含有 40 μL 肽溶液，稀释度为 1：512。
- 从第 10 列中取出 20 μL 肽溶液并丢弃。每根色谱柱现在包含 20 μL 肽溶液（第 1-10 列）或水（第 11 列和第 12 列）。
注意：第11列中的孔用作无菌对照，第12列中的孔用作不含肽的对照。
4. 白色念珠菌 亚培养物的稀释
注意：在传代培养物达到~1.0-1.2的OD600 （步骤2.3.3）后开始此步骤。
- 将传代培养物转移到 15 mL 离心管中，并在室温下以 3，900 x g 离心 3 分钟以沉淀细胞。通过移液或倾析除去上清液。
- 用 1 mL 的 2 mM NaPB（步骤 1.1）重悬沉淀，并将悬浮液转移到 1.7 mL 离心管中。
- 沉淀细胞（如步骤4.1所示），弃去上清液，然后再次将沉淀重悬于1mL的2mM NaPB中。
- 再重复步骤4.3两次，将洗涤的细胞留在1mL的2mM NaPB中。
- 确定洗涤悬浮液的细胞密度，并计算获得5 x 105 细胞/ mL细胞密度所需的稀释因子。该浓度最终将导致向96孔板的每个孔中添加1 x 104 个细胞。
注意：可以使用多种方法确定悬浮液的细胞密度，包括血细胞计数器或自动细胞计数器。本研究使用在相关条件下生长的目标菌株的细胞密度与OD600 的标准曲线。该曲线使用血细胞计数器（参见 材料表）制备，以确定具有不同OD600 值的悬浮液的细胞密度。 - 在 2 mM NaPB 中将细胞悬液稀释至 5 x 105 个细胞/mL。制备 10 mL 的这种稀释悬浮液足以完成本研究。
5.用肽溶液孵育 白色念珠菌 并制备细胞以定量活力
- 将 20 μL 稀释的 白色念珠菌 悬浮液（步骤 4.6）添加到每行的第 1-10 列和第 12 列（图 1）。
注意：第一列中的最终肽浓度现在是肽储备浓度的一半。对于本研究，此时最终肽浓度为50μM。每个孔中的最终细胞悬液含有 2.5 x 105 个 细胞/mL。第1-10列用作实验孔，用于评估不同肽浓度下的抗真菌活性，第12列用作无肽生长的对照。 - 向第 11 列中加入 20 μL 2 mM NaPB。现在所有孔的最终浓度均为1 mM NaPB。第 11 列用作无菌对照。
- 盖板1（含有细胞和肽），并在30°C下孵育30分钟。
注意：对于许多肽17，21，22，30，30的孵育时间就足够了，但是如果需要，孵育时间可以增加到60分钟，以考虑可能需要更长时间才能发挥其抗真菌活性的肽25，31，32。 - 准备一个新的96孔培养板（板2）用于量化活力（图2）。
注意：培养板应在板1的孵育期间制备。- 向板的所有孔中加入 100 μL YPD（步骤 1.2）。
- 向板的所有孔中加入 100 μL 2 mM NaPB（步骤 1.1）。
- 稀释板1（含有细胞和肽）中的样品，然后转移到板2（含有培养基和缓冲液）中。
- 孵育30分钟后从培养箱中取出板1。
- 通过加入 280 μL 1 mM NaPB（步骤 1.1）稀释板 1 的每个孔，使每个孔中的总体积为 320 μL（图 2）。
- 通过上下移液混合所有含有细胞和肽的孔，以确保所有细胞都重悬，并且在孔底部看不到沉淀的细胞。
- 将 8 μL 从板 1 中的每个孔转移到板 2 的相应孔中。该体积将大约250个细胞从板1的每个孔转移到板2中（图2）。
- 盖上板2并在30°C下以350rpm在微量滴定板振荡器（参见 材料表）上孵育17小时。
图 1：用于用细胞孵育肽系列稀释液的板 1 的制备。在水中连续稀释肽，并将白色念珠菌细胞添加到板1中。蓝色表示孔中存在肽，灰色表示有水且没有肽的孔。含有细胞的孔用黑点图案表示。在这些步骤之后，将板孵育以使肽发挥其抗真菌活性。请点击此处查看此图的大图。
图2：用于定量肽引起的活性降低的板2的制备。将YPD培养基和NaPB添加到板2中。稀释板1的内容物后，将每个孔的等分试样从板1转移到板2。然后将板2孵育，通过测量OD600使任何活细胞生长以进行定量。对于板2，仅包含YPD和NaPB的孔以橙色显示。含有来自板 1 的等分试样与 YPD 和 NaPB 混合的孔以绿色显示。有关图版 1 上颜色的说明，请参见图 1 图例。请点击此处查看此图的大图。
6.抗真菌活性的测定
- 获得板 2 中每个孔的 OD600 读数。
- 孵育17小时后，从培养箱中取出板2。
- 通过上下移液混合板2中的所有孔，以确保所有细胞都重悬，并且在孔底部看不到沉淀的细胞。
注意：在此步骤中避免产生气泡，因为它们可能会干扰OD600 读数。如果形成气泡，通常可以用干移液器吸头弹出，或者使用两个移液器吸头将其从孔中取出。 - 使用波长为600nm的吸光度酶标仪（参见 材料表）获得每个孔的OD600 。
- 计算生长抑制（以百分比表示），并绘制它以确定肽对 白色念珠菌生长的影响。
- 对于每个孔，使用以下公式17，22，23计算与对照相比活性的降低（以百分比表示）：
其中含肽的OD是含有给定浓度肽的孔的OD 600，OD背景是同一行第11列的OD600（不含细胞的对照），并且
OD无肽是同一行中第12列的OD600（含细胞且无肽的对照）。 - 例如，使用以下表达式根据行 B 的 OD600 值计算 B5 井活力的降低：
- 对于每个孔，使用以下公式17，22，23计算与对照相比活性的降低（以百分比表示）：
- 将活力降低绘制为肽浓度的函数。
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Representative Results
与电镀样品和计数CFU相比，使用OD600 测量来量化抗真菌肽引起的生长减少可节省大量时间。本协议中描述的方法需要在三个不同的日子内完成这些步骤。在第一天，大约需要1小时来制备缓冲液和培养基（不包括灭菌时间）并接种 白色念珠菌 的起始培养物以进行过夜孵育。在第二天，步骤需要5-6小时（包括传代时间）以准备用于17小时孵育的96孔板。第三天，这些步骤可以在不到1小时内完成。涉及收集活性定量数据的协议部分需要大约30分钟的工作（加上17小时的孵育）。相比之下，将样品铺在琼脂上并计数每个 96 孔板内容物的单次重复的 CFU 将需要超过 3 小时的工作（加上 24 小时的孵育），导致使用该协议完成活力定量所需的时间减少 2.5 小时以上。如果在实验中需要多个96孔板，这些时间节省将被放大。
所述方案用于测定组抑素5和含有赖氨酸残基修饰的组抑素5的几种变体的抗真菌活性。在步骤5中将肽与白色念珠菌细胞孵育后，使用CFU计数方法和包含OD600测量的所述方案量化抗真菌活性（图3）。重要的是，这两种方法对所有肽产生了相似的结果，尽管每种肽都有一个浓度，并且在两种方法确定的活性降低方面存在统计学上的显着差异。在每种情况下，OD600数据的活性降低程度都低于CFU数据，这表明在比较数据时必须使用单一方法。重要的是，使用OD600读数的数据具有高度可重复性，如图3中重复的通常较小的标准偏差以及使用该协议17，22，23，24，25的已发表结果所示。
图 3：用于量化 白色念珠菌 细胞生长减少的传统 （CFU） 和描述 （OD） 方法的比较。 肽（A）组抑素5（Hst-5）和组抑素5（B）K5R，（C）K11R，（D）K13R和（E）K17R的变体（在指定的残基处具有赖氨酸到精氨酸修饰）与 白色念珠菌 细胞一起以50μM至0.20μM的浓度孵育，如协议中所述。在步骤5.5.3之后，取出样品以在琼脂上铺板（每个实验一个重复）或转移到新平板（每个实验重复两个重复）以继续方案。数据表示三个独立实验的平均值（CFU 数据的 N = 3 个数据点，OD 数据的 N = 6 个数据点），误差条表示数据的标准偏差。使用Tukey多重比较检验（α = 0.05）进行双向方差分析（ANOVA），以确定两种方法之间的统计差异。具有统计学显着差异的肽浓度在图上用星号（*）表示。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议描述了一种有效的方法，用于获取有关AMP对真菌病原体 白色念珠菌的抗真菌活性的定量数据。测试肽和其他抗真菌剂的一种常见替代方法是临床实验室标准协会（CLSI）标准M2718中描述的肉汤微量稀释，但该标准侧重于获得定性视觉结果而不是定量结果。另一种替代方法是使用类似于本协议中描述的方法制备肽并将其与细胞孵育，然后将孔的内容物铺在琼脂上以计数CFU的数量并量化肽的作用。如代表性结果部分所述，与电镀和计数CFU相比，在该协议中使用OD600 测量细胞生长大大减少了时间负担。无需将孔的内容物铺在琼脂上，还可以减少肽测试方案产生的塑料废物量。
该协议的几个方面对其成功很重要。由于许多阳离子抗菌肽在体外进行的测定中在生理盐浓度下表现不佳 8，32，33，34，因此选择1 mM NaPB缓冲液进行该测定。此外，肽和白色念珠菌细胞在缓冲液中短时间（30分钟）孵育，而不是在生长培养基中长时间孵育。这减少了细胞的潜在生长和分裂，这将影响与肽孵育后剩余的活细胞的后续定量。在肽与细胞孵育后，将孔稀释以降低肽的浓度，从而降低抗真菌活性持续超过所需的30分钟孵育的可能性35。通过将细胞肽溶液转移到含有YPD培养基的平板上，进一步降低了肽持续活性的潜力;许多肽在YPD培养基中失去活性（未发表的数据），可能是由于单价和二价阳离子的存在，已知这些阳离子会降低某些抗菌肽的活性6，7，34，36。然而，YPD培养基中缺乏活性对于协议的成功并不是必需的。最后，将白色念珠菌细胞在30°C下生长，用于方案中的相关步骤。通过在此温度下生长细胞，细胞应主要处于酵母形态中，这对于准确估计步骤2和步骤4中的细胞数量以及可靠地定量步骤6中活力的降低非常重要。
用户在此协议期间可能会遇到挑战，包括被不需要的微生物污染或96孔板边缘的液体蒸发。该协议包括用于无菌控制的孔，以确定是否发生了污染;污染使测定结果无效。如果用户观察到污染，则必须注意确保所有缓冲液和培养基都经过适当灭菌，并且在移液时使用适当的无菌技术37。在生物安全柜中工作也将减少污染的可能性。从96孔板的边缘孔中蒸发液体是微量滴定板38 的已知挑战，并且可能影响该协议的结果。虽然步骤5.3中肽的细胞孵育时间短不太可能导致边缘效应问题，但步骤5.6中剩余活细胞的孵育时间较长可能导致观察到蒸发。如果观察到蒸发，使用不同的96孔板或用水填充井周围的空间可能会减少蒸发38。用户还可以考虑不使用板的A行和H行以及第1列和第12列来获取数据，而是用水，培养基或缓冲液填充它们。
可以修改协议的许多方面。例如，当将细胞和肽孵育在一起时，可以使用不同的缓冲液（或培养基）（步骤4-5.3），或者另一种真菌培养基可用于与肽孵育后的细胞生长（步骤5.4-5.6）。使用替代缓冲液和培养基可以允许使用文献中发表的其他方法或CLSI标准18 进行基准测试，并且对于在模拟其 预期 体内使用的条件下测试肽非常重要。一些用户可能会发现有用的另一种修改是将肽稀释到板的行而不是跨列。改变方向将减少可以测试给定肽的浓度数量，但它将允许在单个板中测试更多肽，这对于需要测试大量不同肽的实验可能很有用。
获取在该方案中测试的每种肽的重复数据很重要。包括在给定测试日期的技术重复可以了解协议的可变性。此外，进行生物学复制对于了解细胞生长中随机变化的变异性非常重要。作者的实验室通常获得给定肽的至少六个重复数据点。测试至少在2个不同的日子进行，每天至少包括两个技术重复。通常，在 2 个不同日子中的每一天进行 3 个重复，或在 3 个不同日子中的每一天进行 2 个重复。 图3 显示，当正确执行时，该协议会产生具有小标准偏差的一致数据。
该协议的简单性质使其适用于协议中未直接描述的许多实验。例如，该方案可以很容易地用于测试其他酵母，包括其他念珠菌物种。然而，它不太适合丝状物种或在其丝状形态中生长的二态物种。该方案还可以适用于非肽抗真菌剂，例如小分子药物，或不同肽或肽片段的混合物。例如，以前已使用类似的方案来测试小分子药物，包括两性霉素B，氟康唑和卡泊芬净，以对抗组织胞浆菌酵母39。作者使用该协议将未降解肽的抗真菌活性与肽17，22蛋白水解形成的肽片段池进行比较。该协议的另一个扩展将是探索AMP的抗真菌活性的动力学。该方案使用30分钟的孵育时间使肽发挥其抗真菌活性，但可以使用更短或更长的孵育时间来更好地确定肽降低细胞活力所需的时间。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（R03DE029270，T32AI089621B），美国国家科学基金会（CBET 1511718），教育部（GAANN-P200A180093）和马里兰大学跨校区种子资助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
References
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