Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantificering af peptiders svampedræbende aktivitet mod Candida albicans

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64416
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Summary

Denne protokol beskriver en metode til opnåelse af kvantitative data om antifungal aktivitet af peptider og andre forbindelser, såsom småmolekylære svampedræbende midler, mod Candida albicans. Dens brug af optisk densitet i stedet for at tælle kolonidannende enheder til kvantificering af væksthæmning sparer tid og ressourcer.

Abstract

Traditionelle metoder til udførelse af svampedræbende modtagelighedstest for Candida albicans er tidskrævende og mangler kvantitative resultater. For eksempel er en fælles tilgang afhængig af plettering af celler behandlet med forskellige koncentrationer af svampedræbende molekyler på agarplader og derefter tælle kolonierne for at bestemme forholdet mellem molekylekoncentration og væksthæmning. Denne metode kræver mange plader og betydelig tid til at tælle kolonierne. En anden almindelig tilgang eliminerer pladerne og tællingen af kolonier ved visuelt at inspicere kulturer behandlet med svampedræbende midler for at identificere den minimumskoncentration, der kræves for at hæmme væksten; Imidlertid giver visuel inspektion kun kvalitative resultater, og information om vækst ved subhæmmende koncentrationer går tabt. Denne protokol beskriver en metode til måling af C. albicans modtagelighed for svampedræbende peptider. Ved at stole på optiske densitetsmålinger af kulturer reducerer metoden den tid og de materialer, der er nødvendige for at opnå kvantitative resultater på kulturvækst ved forskellige peptidkoncentrationer. Inkubationen af svampen med peptider udføres i en 96-brøndplade under anvendelse af en passende buffer, hvor kontroller ikke repræsenterer væksthæmning og fuldstændig væksthæmning. Efter inkubationen med peptidet fortyndes de resulterende cellesuspensioner for at reducere peptidaktiviteten og dyrkes derefter natten over. Efter vækst natten over måles den optiske tæthed af hver brønd og sammenlignes med de positive og negative kontroller for at beregne den resulterende væksthæmning ved hver peptidkoncentration. Resultaterne ved hjælp af dette assay er sammenlignelige med resultaterne ved hjælp af den traditionelle metode til plettering af kulturerne på agarplader, men denne protokol reducerer plastaffald og den tid, der bruges på at tælle kolonier. Selvom anvendelserne af denne protokol har fokuseret på svampedræbende peptider, vil metoden også være anvendelig til test af andre molekyler med kendt eller mistænkt svampedræbende aktivitet.

Introduction

Candida albicans er medlem af den menneskelige mikrobiota, der koloniserer adskillige steder, herunder mundhulen, huden, mave-tarmkanalen og vagina1. For patienter, der er immunkompromitterede på grund af sygdomme som human immundefektvirus (HIV) og immunsuppressive behandlinger, kan koloniseringen af C. albicans føre til lokal eller systemisk candidiasis 2,3. Anvendelsen af aktuelt tilgængelige småmolekylære svampedræbende midler, såsom amphotericin B, azoler eller echinocandiner, kan kompliceres af opløseligheds- og toksicitetsproblemer og af infektioners resistens over for terapeutiskemidler 4,5. På grund af begrænsningerne i de nuværende svampedræbende midler søger forskere løbende efter nye svampedræbende molekyler med aktivitet mod C. albicans.

Antimikrobielle peptider (AMP'er) er et potentielt alternativ til de nuværende småmolekylære svampemidler 6,7,8 og foreslås at være mindre modtagelige for udvikling af resistens sammenlignet med småmolekylære lægemidler 9. AMP'er er et forskelligartet sæt peptider, men de er ofte kationiske med et bredt spektrum af aktivitet10,11,12. AMP'er med aktivitet mod C. albicans omfatter velkendte peptider fra histatin- og cecropinfamilierne 13,14,15 sammen med nyere beskrevne peptider som ToAP2, NDBP-5.7 og histatin 5-varianten K11R-K17R 16,17. På grund af deres potentiale til behandling af Candida-infektioner er identifikation og design af nye AMP'er, der er målrettet mod C. albicans, et vigtigt mål for mange forskningsgrupper.

Som en del af processen med at udvikle effektive AMP'er (og andre svampedræbende midler), der er målrettet mod C. albicans, anvendes in vitro-test almindeligvis til at identificere lovende peptider. Metoder til test af svampedræbende aktivitet mod C. albicans involverer typisk inkubation af celler med serielle fortyndinger af AMP'erne (i buffer eller medium) i 96-brøndplader. Der findes flere metoder til vurdering af svampedræbende aktivitet efter inkubation. En teknik beskrevet af Clinical Laboratory Standards Institute anvender en rent visuel vurdering af brøndenes turbiditet til at bestemme minimumskoncentrationen (MIC) for fuldstændig hæmning af væksten (mindst 50 % hæmning for udvalgte svampedræbende midler som azoler og echinocandiner) og giver ingen kvantificering af væksten ved subMIC-koncentrationer18 . En anden almindeligt anvendt fremgangsmåde indebærer kvantificering af levedygtigheden efter inkubation med AMP'er ved at plettere indholdet af brøndene på agarplader, inkubere pladerne og derefter tælle antallet af kolonidannende enheder (CFU'er) på pladen. Denne metode er blevet anvendt til evaluering af en række peptider, herunder histatin 5-baserede peptider, LL-37 og humant lactoferrin 19,20,21. Denne teknik kræver et relativt stort volumen agar og et stort antal plader og involverer kedelig optælling af CFU'er på pladerne. For at opnå mere kvantitative data og samtidig generere mindre plastaffald og undgå at tælle CFU'er, kan indholdet af brøndene bruges til at inokulere frisk medium i en anden 96-brøndplade. Efter inkubation af den nyligt podede plade kan væksten kvantificeres ved måling af den optiske densitet ved 600 nm (OD600) på en absorbanspladelæser. Denne metode er blevet anvendt til at bestemme den svampedræbende aktivitet af histatin 5 og dets nedbrydningsfragmenter og cellepenetrerende peptider 17,22,23,24,25.

Denne protokol beskriver, hvordan man tester peptiders svampedræbende aktivitet og bruger OD600-metoden til at kvantificere reduktionen i levedygtighed af C. albicans på grund af peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Der blev opnået godkendelse fra University of Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) til arbejdet med C. albicans i denne protokol (PN 274). C. albicans-stammen SC5314 (se materialetabel) blev anvendt i denne undersøgelse; Der kan dog også anvendes enhver anden stamme.

1. Fremstilling af buffer, sterilt vand og dyrkningsmedium

  1. Der fremstilles steril 0,1 M natriumphosphatbuffer (NaPB)26 ved pH 7,4, og der fortyndes til 2 mM og 1 mM med sterilt vand. Forberedelse af 100 ml hver af 2 mM NaPB og 1 mM NaPB vil være mere end tilstrækkeligt til de fleste anvendelser af denne protokol.
  2. Forbered steril flydende gær-pepton-dextrose (YPD, se materialetabel) medium (10 g / L gærekstrakt, 20 g / L dextrose, 20 g / L pepton). Forberedelse af 100 ml YPD vil være mere end tilstrækkeligt til de fleste anvendelser af denne protokol.
  3. Forbered sterilt ultrarent vand. Forberedelse af 100 ml vand vil være mere end tilstrækkeligt til de fleste anvendelser af denne protokol.
    BEMÆRK: Buffere, medier og vand steriliseres ved autoklavering ved 121 °C på en væskecyklus i et passende tidsrum baseret på volumenet i beholderne, der autoklaveres27. For flasker, der indeholder 500 ml, skal eksponeringstiden for eksempel være 40 min.

2. Podning, dyrkning og subkultur af C. albicans

FORSIGTIG: Følg alle institutionelle og statslige regler for at arbejde med C. albicans, som ofte klassificeres af akademiske forskningsinstitutioner som en biosikkerhedsniveau (BSL) 2 organisme uanset lægemiddelresistens og af American Type Culture Collection (ATCC) som en BSL1 eller BSL2 organisme, afhængigt af stammens lægemiddelresistens28.

BEMÆRK: Udfør podnings- og dyrkningsdelene af dette trin (trin 2.1-2.2) dagen før testen for svampedræbende aktivitet påbegyndes. Hvis det er muligt, skal du udføre alle protokoltrin med cellerne (og de opløsninger, der vil blive inkuberet med cellerne) i et biosikkerhedsskab.

  1. Pod den ønskede C. albicans-stamme i 10 ml YPD-medium i et dyrkningsrør.
    BEMÆRK: Kulturen kan podes fra en frysebestand eller fra en agarplade, men der skal bruges en konsistent kilde til alle data, der sammenlignes.
  2. Dyrk kulturen natten over (~ 12-16 timer) ved 30 ° C og 230 o / min på en roterende ryster.
  3. Subkultur natten over kultur af C. albicans, og vokse til en OD600 af ~ 1,0-1,2.
    1. Mål OD600 for natkulturen ved hjælp af et UV-spektrofotometer (se materialetabel).
    2. Baseret på OD 600 i overnatningskulturen skal du bruge natkulturen til at inokulere en subkultur ved en OD600 på 0,1 i10 ml YPD.
    3. Dyrk subkulturen ved 30 ° C på en roterende ryster ved 230 o / min, indtil OD600 når ~ 1,0-1,2, hvilket sandsynligvis vil tage 4-6 timer. Gennemfør trin 3 (fremstilling af peptidopløsninger), mens subkulturen vokser; Subkulturen fortyndes til brug i analysen i trin 4.

3. Fremstilling af peptidopløsningerne i en plade med 96 brønde

BEMÆRK: Dette trin kan udføres på forhånd, hvis peptidstamopløsningerne er stabile under opbevaring. Peptidopløsningerne opbevares typisk ved -20 °C indtil brug. De kan optøes i et vandbad ved stuetemperatur, inden de fortsætter til næste trin.

  1. Bestem den højeste koncentration af hvert peptid, der skal testes i analysen. Dette vil variere afhængigt af de valgte peptider. For de data, der blev præsenteret i afsnittet om repræsentative resultater, blev histatin 5 og konstruerede analoger22 testet, og den højeste testede koncentration var 50 μM.
    BEMÆRK: Den højeste koncentration, der skal testes, bestemmes ved hjælp af data rapporteret i litteraturen eller ved at udføre indledende eksperimenter over en bred vifte af peptidkoncentrationer. Når det er muligt, bør den højeste koncentration vælges for at observere et plateau for en fuldstændig reduktion af levedygtigheden ved de højeste testede koncentrationer og et plateau for ingen reduktion af levedygtigheden ved de laveste testede koncentrationer, hvilket gør det muligt at kvantificere hele spektret af peptidaktivitet.
  2. Hvert peptid opløses i sterilt vand ved to gange den ønskede højeste koncentration. For de data, der blev præsenteret i afsnittet om repræsentative resultater, blev 150 μL 100 μM-opløsninger af histatin 5 og konstruerede analoger fremstillet i sterilt vand.
    BEMÆRK: Hvis et peptid ikke er opløseligt i vand, kan opløselighed i et andet opløsningsmiddel være nødvendigt før dette trin. Dimethylsulfoxid (DMSO) anvendes almindeligvis til at opløse peptider i en høj koncentration før fortynding til arbejdskoncentrationen. Sørg for, at den endelige koncentration af DMSO er 1% (v/v) eller lavere29 , og at alternative opløsningsmidler ikke påvirker cellernes vækst. Sørg også for, at opløsningsmiddelkoncentrationen holdes konstant i alle brønde i trin 3.4-3.5.
  3. Der tilsættes 40 μL af de ønskede peptidstamopløsninger til det første hul (kolonne 1) i hver række i en 96-brønds, rundbundet kulturplade (se materialetabel). Denne plade er plade 1 (figur 1).
    BEMÆRK: Hver plade har otte rækker, der bruges til test af peptider. Disse rækker kan bruges til forskellige peptider eller til replikater af de samme peptider. Medtag kun et enkelt peptid i hver række.
  4. Der tilsættes 20 μL sterilt ultrarent vand til kolonne 2 til kolonne 12 i rækkerne indeholdende peptid (figur 1).
    BEMÆRK: Hvis peptidstammerne blev fremstillet med et andet opløsningsmiddel end rent vand i trin 3.2, skal det sterile vand i dette trin erstattes med opløsningsmidlet i peptidstammen tilsat til den første kolonne. For eksempel, hvis peptidet blev opløseligt i DMSO, og peptidstammen indeholder 1% (v / v) DMSO i vand, skal vand indeholdende 1% DMSO tilsættes til kolonne 2 til kolonne 12.
  5. Fortynd peptidstamopløsningerne serielt over pladen til kolonne 10 (figur 1).
    BEMÆRK: I stedet for at udføre de serielle fortyndinger i pladen som beskrevet nedenfor, kunne fortyndingerne også udføres i mikrocentrifugerør og overføres til 96-brøndpladen.
    1. 20 μL fjernes fra kolonne 1, overføres til kolonne 2, og blandes ved pipettering op og ned. Kolonne 2 indeholder nu 40 μL peptidopløsning ved en 1:2 fortynding af koncentrationen i kolonne 1.
    2. 20 μL fjernes fra kolonne 2, overføres til kolonne 3, og blandes ved pipettering op og ned, så kolonne 3 nu indeholder 40 μL peptidopløsning ved en 1:4 fortynding af koncentrationen i kolonne 1.
    3. Denne proces gentages, indtil kolonne 10 indeholder 40 μL peptidopløsning ved en 1:512 fortynding af koncentrationen i kolonne 1.
    4. 20 μL peptidopløsning fjernes fra kolonne 10 og kasseres. Hver kolonne indeholder nu 20 μL peptidopløsning (kolonne 1-10) eller vand (kolonne 11 og kolonne 12).
      BEMÆRK: Hullerne i kolonne 11 fungerer som sterilitetskontrol, og hullerne i kolonne 12 fungerer som kontroller, der ikke indeholder peptid.

4. Fortynding af C. albicans-subkulturen

BEMÆRK: Start dette trin, når subkulturen har nået en OD600 på ~ 1,0-1,2 (trin 2.3.3).

  1. Overfør subkulturen til et 15 ml centrifugerør, og centrifuger ved 3.900 x g i 3 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne. Supernatanten fjernes ved pipettering eller dekantering.
  2. Pellet resuspenderes med 1 ml 2 mM NaPB (trin 1.1), og suspensionen overføres til et 1,7 ml centrifugerør.
  3. Pellet cellerne (som i trin 4.1), kassér supernatanten, og genopslæm pellet i 1 ml 2 mM NaPB.
  4. Gentag trin 4.3 yderligere to gange for at efterlade de vaskede celler i 1 ml 2 mM NaPB.
  5. Celletætheden af den vaskede suspension bestemmes, og den fortyndingsfaktor, der er nødvendig for at opnå en celledensitet på 5 x 105 celler/ml, beregnes. Denne koncentration vil i sidste ende føre til tilsætning af 1 x 104 celler til hver brønd på 96-brøndpladen.
    BEMÆRK: Suspensionens celletæthed kan bestemmes ved hjælp af en række metoder, herunder et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. En standardkurve for celletæthed versus OD600 for den stamme, der blev dyrket under relevante forhold, blev anvendt til nærværende undersøgelse. Denne kurve blev fremstillet under anvendelse af et hæmocytometer (se materialetabel) til bestemmelse af celletætheden af suspensioner med varierende OD600-værdier .
  6. Fortynd cellesuspensionen til 5 x 105 celler/ml i 2 mM NaPB. Klargøring af 10 ml af denne fortyndede suspension vil være mere end tilstrækkeligt til at afslutte denne undersøgelse.

5. Inkubation af C. albicans med peptidopløsninger og fremstilling af cellerne til kvantificering af levedygtighed

  1. Der tilsættes 20 μL af suspensionen af fortyndet C. albicans (trin 4.6 ) i kolonne 1-10 og kolonne 12 i hver række (figur 1).
    BEMÆRK: Den endelige peptidkoncentration i den første kolonne er nu halvdelen af peptidstamkoncentrationen. I denne undersøgelse var den endelige peptidkoncentration 50 μM på dette tidspunkt. Den endelige cellesuspension i hvert hul indeholder 2,5 x 105 celler/ml. Kolonne 1-10 tjener som eksperimentelle brønde til evaluering af svampedræbende aktivitet ved forskellige peptidkoncentrationer, og kolonne 12 tjener som en kontrol for vækst uden peptid.
  2. Der tilsættes 20 μL 2 mM NaPB til kolonne 11. Alle brøndene har nu en slutkoncentration på 1 mM NaPB. Kolonne 11 tjener som sterilitetskontrol.
  3. Dækplade 1 (indeholdende både celler og peptid), og inkuber den ved 30 °C i 30 minutter.
    BEMÆRK: En inkubationstid på 30 min er tilstrækkelig for mange peptider 17,21,22,30, men inkubationstiden kan øges til 60 min, hvis det ønskes for at tage højde for peptider, der kan kræve længere tid at udøve deres svampedræbende aktivitet 25,31,32.
  4. Forbered en ny 96-brønds kulturplade (plade 2) til brug ved kvantificering af levedygtigheden (figur 2).
    BEMÆRK: Kulturpladen skal fremstilles under inkubationen af plade 1.
    1. Der tilsættes 100 μL YPD (trin 1.2) til alle pladens huller.
    2. Der tilsættes 100 μL 2 mM NaPB (trin 1.1) til alle pladens huller.
  5. Fortynd prøverne i plade 1 (indeholdende celler og peptider) og overfør dem til plade 2 (indeholdende medium og buffer).
    1. Hent plade 1 fra inkubatoren efter 30 minutters inkubation.
    2. Hvert hul på plade 1 fortyndes ved tilsætning af 280 μL 1 mM NaPB (trin 1.1) til et samlet volumen på 320 μL i hvert hul (figur 2).
    3. Bland alle huller, der indeholder celler og peptider, ved at pipettere op og ned for at sikre, at alle cellerne resuspenderes, og at ingen bundfældede celler er synlige i bunden af brøndene.
    4. Der overføres 8 μL fra hvert hul i plade 1 til det tilsvarende hul på plade 2. Dette volumen overfører ca. 250 celler fra hver brønd i plade 1 til plade 2 (figur 2).
  6. Plade 2 dækkes og inkuberes på en mikrotiterpladeryster (se materialetabel) ved 350 o/min i 17 timer ved 30 °C.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling af plade 1 til inkubation af peptidserielle fortyndinger med celler. Serielle fortyndinger af peptidet fremstilles i vand, og C. albicans-celler tilsættes til plade 1. En blå farve indikerer, at peptid er til stede i brønden, og grå indikerer en brønd med vand og intet peptid. Brønde indeholdende celler er angivet med et mønster af sorte prikker. Efter disse trin inkuberes pladen for at tillade peptidet at udøve sin svampedræbende aktivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fremstilling af plade 2 til kvantificering af reduktionen i levedygtighed som følge af peptidet. YPD-medium og NaPB tilsættes til plade 2. Efter fortynding af indholdet af plade 1 overføres en prøve fra hvert hul fra plade 1 til plade 2. Plade 2 inkuberes derefter for at tillade levedygtige celler at vokse til kvantificering ved at måle OD600. For plade 2 vises huller, der kun indeholder YPD og NaPB, med orange. Huller, der indeholder alikvoter fra plade 1 blandet med YPD og NaPB, er vist med grønt. Se forklaringen til figur 1 for beskrivelsen af farverne på plade 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Bestemmelse af svampedræbende aktivitet

  1. Få OD600-aflæsninger for hvert hul i plade 2.
    1. Fjern plade 2 fra inkubatoren efter 17 timers inkubation.
    2. Bland alle brøndene i plade 2 ved at pipettere op og ned for at sikre, at alle cellerne er opslæmmet, og at ingen bundfældede celler er synlige i bunden af brøndene.
      BEMÆRK: Undgå at generere bobler under dette trin, da de kan forstyrre OD600-aflæsningerne . Hvis der dannes bobler, kan de ofte poppes med en tør pipetspids eller fjernes ved hjælp af to pipetspidser til at løfte dem ud af brønden.
    3. Der anvendes en absorbanspladelæser (se materialetabel) ved en bølgelængde på 600 nm for at opnå OD600 for hvert hul.
  2. Beregn hæmningen af væksten (i procent), og plot den for at bestemme peptidernes virkning på væksten af C. albicans.
    1. For hvert hul beregnes reduktionen i levedygtighed sammenlignet med kontrollen (i procent) ved hjælp af følgende ligning 17,22,23:
      Equation 1
      hvor OD med peptid er OD 600 i et hul, der indeholder en given koncentration af peptid, erOD-baggrund OD600 i kolonne 11 i samme række (kontrol uden celler), og
      OD intet peptid er OD600 i kolonne 12 i samme række (kontrol indeholdende celler og intet peptid).
    2. Brug f.eks. følgende udtryk til at beregne reduktionen i levedygtigheden i brønd B5 ud fra OD600-værdierne for række B:
      Equation 2
  3. Reduktionen i levedygtighed afbildes som funktion af peptidkoncentrationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Brug af OD600-målinger til at kvantificere reduktionen i vækst på grund af svampedræbende peptider sparer betydelig tid sammenlignet med plettering af prøver og tælling af CFU'er. Metoden beskrevet i denne protokol kræver, at trinene udføres på tre forskellige dage. På den første dag er ca. 1 time nødvendig for at forberede buffere og medier (ikke inklusive steriliseringstiden) og inokulere startkulturen af C. albicans til inkubation natten over. På den anden dag kræver trinene 5-6 timer (inklusive subkultureringstid) for at forberede en 96-brøndplade til 17 timers inkubation. På den tredje dag kan trinene afsluttes på mindre end 1 time. Den del af protokollen, der involverer indsamling af kvantitative data om levedygtighed, kræver ca. 30 minutters arbejde (plus 17 timers inkubation). I modsætning hertil ville plettering af prøverne på agar og tælling af CFU'erne for en enkelt replikat af indholdet af hver 96-brøndplade kræve over 3 timers arbejde (plus 24 timers inkubation), hvilket resulterer i over 2,5 timer mindre tid, der er nødvendig for at fuldføre kvantificeringen af levedygtighed ved hjælp af denne protokol. Disse tidsbesparelser ville blive forstærket, hvis der var behov for flere 96-brøndsplader i et eksperiment.

Den beskrevne protokol blev anvendt til at analysere den svampedræbende aktivitet af histatin 5 og flere varianter af histatin 5 indeholdende modifikationer ved lysinresterne. Efter inkubation af peptiderne med C. albicans-cellerne i trin 5 blev den svampedræbende aktivitet kvantificeret ved hjælp af både CFU-tællemetoden og den beskrevne protokol, der inkorporerede OD600-målinger (figur 3). Det er vigtigt, at de to metoder gav lignende resultater for alle peptider, selvom hvert peptid havde en koncentration med en statistisk signifikant forskel i reduktionen i levedygtighed bestemt af de to metoder. I hvert af disse tilfælde viste OD600-dataene en lavere reduktion i levedygtigheden end CFU-dataene, hvilket indikerer, at der skal anvendes en enkelt metode, når dataene sammenlignes. Det er vigtigt, at data, der anvender OD600-aflæsningerne, er meget reproducerbare, som det fremgår af de generelt små standardafvigelser for replikaterne i figur 3 og offentliggjorte resultater ved hjælp af denne protokol 17,22,23,24,25.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af de traditionelle (CFU) og beskrevne (OD) metoder til kvantificering af reduktionen i C. albicans cellevækst. Peptidet (A) histatin 5 (Hst-5) og varianterne af histatin 5 (B) K5R, (C) K11R, (D) K13R og (E) K17R (med lysin til argininmodifikation ved de angivne rester) blev inkuberet med C. albicans celler i koncentrationer på 50 μM til 0,20 μM, som beskrevet i protokollen. Efter trin 5.5.3 blev prøverne fjernet til plettering på agar (en replikat for hvert forsøg) eller overført til en ny plade (to replikater for hvert forsøg) for at fortsætte protokollen. Dataene repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter (N = 3 datapunkter for CFU-data, N = 6 datapunkter for OD-data), og fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen for dataene. En tovejsanalyse af varians (ANOVA) med Tukeys multiple sammenligningstest (α = 0,05) blev udført for at identificere statistiske forskelle mellem de to metoder. Peptidkoncentrationer med en statistisk signifikant forskel er noteret med en stjerne (*) på plottene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en effektiv tilgang til opnåelse af kvantitative data om AMPs svampedræbende aktivitet mod svampepatogenet C. albicans. En almindelig alternativ tilgang til test af peptider og andre svampedræbende midler er bouillonmikrofortyndingen beskrevet i Clinical Laboratory Standards Institute's (CLSI) standard M2718, men denne standard fokuserer på at opnå kvalitative visuelle resultater i stedet for kvantitative resultater. En anden alternativ tilgang er at anvende en metode svarende til den, der er beskrevet i denne protokol, til at fremstille peptider og inkubere dem med celler og derefter plade indholdet af brøndene på agar for at tælle antallet af CFU'er og kvantificere effekten af peptiderne. Som nævnt i afsnittet om repræsentative resultater reducerer denne brug af OD600 til måling af cellevækst i denne protokol væsentligt tidsbyrden sammenlignet med plettering og tælling af CFU'er. Eliminering af behovet for at plade indholdet af brønde på agar reducerer også mængden af plastaffald, der genereres af peptidtestprotokollen.

Flere aspekter af denne protokol er vigtige for dens succes. Da mange kationiske antimikrobielle peptider klarer sig dårligt i fysiologiske saltkoncentrationer i assays udført in vitro 8,32,33,34, blev der valgt en 1 mM NaPB-buffer til dette assay. Derudover inkuberes peptiderne og C. albicans-cellerne i kort tid (30 min) i buffer snarere end lang tid i vækstmedium. Dette reducerer den potentielle vækst og deling af cellerne, hvilket ville påvirke den efterfølgende kvantificering af de levedygtige celler, der er tilbage efter inkubationen med peptiderne. Efter inkubation af peptiderne med cellerne fortyndes brøndene for at reducere koncentrationen af peptidet, hvilket reducerer potentialet for svampedræbende aktivitet, der fortsætter ud over den ønskede 30 minutters inkubation35. Potentialet for peptidernes fortsatte aktivitet reduceres yderligere ved at overføre cellepeptidopløsningen til en plade indeholdende YPD-medium; mange peptider mister deres aktivitet i YPD-mediet (upublicerede data), muligvis på grund af tilstedeværelsen af mono- og divalente kationer, som vides at reducere aktiviteten af nogle antimikrobielle peptider 6,7,34,36. Manglende aktivitet i YPD-mediet er imidlertid ikke nødvendig for protokollens succes. Endelig dyrkes C. albicans-cellerne ved 30 °C i de relevante trin i protokollen. Ved at dyrke cellerne ved denne temperatur skal cellerne primært være i gærmorfologien, hvilket er vigtigt for at opnå nøjagtige estimater af antallet af celler i trin 2 og trin 4 og for pålidelig kvantificering af reduktionen i levedygtighed i trin 6.

Brugere kan støde på udfordringer under denne protokol, herunder forurening med uønskede mikrobielle organismer eller fordampning af væske fra brøndene på kanterne af 96-brøndpladen. Protokollen omfatter brønde til sterilitetskontrol for at identificere, om der er sket kontaminering; Kontaminering ugyldiggør analyseresultaterne. Hvis brugerne observerer kontaminering, skal det sikres, at alle buffere og medier steriliseres korrekt, og at der anvendes korrekt steril teknik ved pipettering37. Arbejde i et biosikkerhedsskab vil også reducere risikoen for forurening. Fordampning af væske fra kantbrøndene på 96-brøndsplader er en kendt udfordring med mikrotiterplader38 og kan påvirke resultaterne af denne protokol. Mens den korte inkubationstid for cellerne med peptidet i trin 5.3 sandsynligvis ikke vil føre til problemer med kanteffekter, kan den længere inkubation af de resterende levedygtige celler i trin 5.6 føre til overholdelse af fordampning. Hvis der observeres fordampning, kan brug af forskellige 96-brøndplader eller fyldning af rummet omkring brøndene med vand reducere fordampningen38. Brugere kan også overveje ikke at bruge række A og række H og kolonne 1 og kolonne 12 på pladen til at hente data, men i stedet fylde dem med vand, medium eller buffer.

Det er muligt at ændre mange aspekter af protokollen. For eksempel kan en anden buffer (eller medium) anvendes ved inkubation af celler og peptider sammen (trin 4-5.3), eller et andet svampekulturmedium kan anvendes til cellevækst efter inkubation med peptiderne (trin 5.4-5.6). Brugen af alternative buffere og medier kan give mulighed for benchmarking med andre metoder, der er offentliggjort i litteraturen, eller med CLSI-standard18 og vil være vigtig for testning af peptider under betingelser, der efterligner deres tilsigtede in vivo-anvendelse . En anden ændring, som nogle brugere kan finde nyttige, er at fortynde peptiderne ned ad pladens rækker snarere end på tværs af kolonnerne. Ændring af orienteringen ville reducere antallet af koncentrationer, der kunne testes for et givet peptid, men det ville gøre det muligt at teste flere peptider i en enkelt plade, hvilket kunne være nyttigt til eksperimenter, der kræver test af et stort antal forskellige peptider.

Det er vigtigt at opnå replikate data for hvert peptid, der testes i denne protokol. Inkludering af tekniske replikater på en given testdag giver mulighed for at forstå protokollens variabilitet. Derudover er det vigtigt at udføre biologiske replikater for at forstå variabiliteten fra tilfældig variation i cellernes vækst. Forfatternes laboratorium opnår typisk mindst seks replikate datapunkter for et givet peptid. Testning udføres på mindst 2 forskellige dage, og mindst to tekniske replikater er inkluderet hver dag. Normalt udføres tre replikater på hver af 2 forskellige dage eller to replikater på hver af 3 forskellige dage. Figur 3 viser, at denne protokol producerer konsistente data med små standardafvigelser, når den udføres korrekt.

Den enkle karakter af denne protokol gør det muligt at tilpasse den til brug i mange eksperimenter, der ikke er direkte beskrevet i protokollen. For eksempel kan protokollen let tilpasses til test af andre gær, herunder andre Candida-arter. Det er imidlertid ikke velegnet til filamentøse arter eller dimorfe arter, der vokser i deres trådformede morfologi. Protokollen kan også tilpasses til brug med ikke-peptid svampedræbende midler, såsom småmolekylære lægemidler eller blandinger af forskellige peptider eller peptidfragmenter. For eksempel er lignende protokoller tidligere blevet brugt til at teste småmolekylære lægemidler, herunder amphotericin B, fluconazol og caspofungin, mod histoplasmagær 39. Forfatterne har brugt protokollen til at sammenligne den svampedræbende aktivitet af ikke-nedbrudte peptider med puljer af peptidfragmenter dannet ved proteolyse af peptidet 17,22. En anden udvidelse af denne protokol ville være at undersøge kinetikken af AMPs svampedræbende aktivitet. Denne protokol bruger en inkubationstid på 30 minutter for peptiderne til at udøve deres svampedræbende aktivitet, men kortere eller længere inkubationstider kan bruges til bedre at bestemme den tid, der kræves for peptiderne at reducere cellernes levedygtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), National Science Foundation (CBET 1511718), Department of Education (GAANN-P200A180093) og et University of Maryland Cross-Campus Seed Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates (round bottom) VWR 10062-902
Absorbance microplate reader N/A N/A Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314 ATCC  MYA-2876 Other C. albicans may also be used
Hemocytometer N/A N/A Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker VWR 2620-926
Peptide(s) N/A N/A Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors VWR 18900-320 Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic Fisher Scientific BP332-500 For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific BP329-500 For making NaPB
UV spectrophotometer N/A N/A Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder BD Life Sciences 242820 May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Tags

Biologi udgave 191 Candida albicans peptider antimikrobielle peptider svampedræbende følsomhedstest gær optisk densitet
Kvantificering af peptiders svampedræbende aktivitet mod <em>Candida albicans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P.,… More

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P., Karlsson, A. J. Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans. J. Vis. Exp. (191), e64416, doi:10.3791/64416 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter