Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kwantificeren van de antischimmelactiviteit van peptiden tegen Candida albicans

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64416
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de antischimmelactiviteit van peptiden en andere verbindingen, zoals antischimmelmiddelen met kleine moleculen, tegen Candida albicans. Het gebruik van optische dichtheid in plaats van het tellen van kolonievormende eenheden om groeiremming te kwantificeren, bespaart tijd en middelen.

Abstract

Traditionele methoden voor het uitvoeren van antischimmelgevoeligheidstests voor Candida albicans zijn tijdrovend en missen kwantitatieve resultaten. Een gemeenschappelijke aanpak is bijvoorbeeld gebaseerd op het plateren van cellen die zijn behandeld met verschillende concentraties antischimmelmoleculen op agarplaten en vervolgens het tellen van de kolonies om de relatie tussen molecuulconcentratie en groeiremming te bepalen. Deze methode vereist veel platen en aanzienlijke tijd om de kolonies te tellen. Een andere veel voorkomende aanpak elimineert de platen en het tellen van kolonies door culturen die zijn behandeld met antischimmelmiddelen visueel te inspecteren om de minimale concentratie te identificeren die nodig is om de groei te remmen; visuele inspectie levert echter alleen kwalitatieve resultaten op en informatie over groei bij subremmende concentraties gaat verloren. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van de gevoeligheid van C. albicans voor antischimmelpeptiden. Door te vertrouwen op optische dichtheidsmetingen van culturen, vermindert de methode de tijd en materialen die nodig zijn om kwantitatieve resultaten te verkrijgen over cultuurgroei bij verschillende peptideconcentraties. De incubatie van de schimmel met peptiden wordt uitgevoerd in een 96-well plaat met behulp van een geschikte buffer, met controles die geen groeiremming en volledige groeiremming vertegenwoordigen. Na de incubatie met het peptide worden de resulterende celsuspensies verdund om de peptideactiviteit te verminderen en vervolgens 's nachts gekweekt. Na de nachtelijke groei wordt de optische dichtheid van elke put gemeten en vergeleken met de positieve en negatieve controles om de resulterende groeiremming bij elke peptideconcentratie te berekenen. De resultaten met behulp van deze test zijn vergelijkbaar met de resultaten met behulp van de traditionele methode om de culturen op agarplaten te platen, maar dit protocol vermindert plastic afval en de tijd die wordt besteed aan het tellen van kolonies. Hoewel de toepassingen van dit protocol zich hebben gericht op antischimmelpeptiden, zal de methode ook van toepassing zijn op het testen van andere moleculen met bekende of vermoedelijke antischimmelactiviteit.

Introduction

Candida albicans is een lid van de menselijke microbiota die tal van locaties koloniseert, waaronder de mondholte, huid, maagdarmkanaal en vagina1. Voor patiënten die immuungecompromitteerd zijn als gevolg van ziekten zoals humaan immunodeficiëntievirus (HIV) en immunosuppressieve behandelingen, kan de kolonisatie van C. albicans leiden tot lokale of systemische candidiasis 2,3. Het gebruik van momenteel beschikbare antischimmeltherapieën met kleine moleculen, zoals amfotericine B, azolen of echinocandinen, kan worden bemoeilijkt door oplosbaarheids- en toxiciteitsproblemen en door de resistentie van infecties tegen de therapeutica 4,5. Vanwege de beperkingen van de huidige antischimmelmiddelen zijn onderzoekers voortdurend op zoek naar nieuwe antischimmelmoleculen met activiteit tegen C. albicans.

Antimicrobiële peptiden (AMPs) zijn een potentieel alternatief voor de huidige antischimmelmiddelen met kleine moleculen 6,7,8 en worden voorgesteld minder gevoelig te zijn voor de ontwikkeling van resistentie in vergelijking met geneesmiddelen met kleine moleculen 9. AMPs zijn een diverse set peptiden, maar ze zijn vaak kationisch, met een breed spectrum van activiteit10,11,12. AMPs met activiteit tegen C. albicans omvatten bekende peptiden uit de histatine- en cecropinefamilies 13,14,15, samen met meer recent beschreven peptiden zoals ToAP2, NDBP-5.7 en de histatine 5-variant K11R-K17R16,17. Vanwege hun potentieel voor de behandeling van Candida-infecties, is het identificeren en ontwerpen van nieuwe AMPs die zich richten op C. albicans een belangrijk doel voor veel onderzoeksgroepen.

Als onderdeel van het proces om effectieve AMPs (en andere antischimmelmiddelen) te ontwikkelen die zich richten op C. albicans, wordt in vitro testen vaak gebruikt om veelbelovende peptiden te identificeren. Methoden om antischimmelactiviteit tegen C. albicans te testen, omvatten meestal het incuberen van cellen met seriële verdunningen van de AMPs (in buffer of medium) in 96-well platen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de antischimmelactiviteit na incubatie te beoordelen. Een techniek beschreven door het Clinical Laboratory Standards Institute maakt gebruik van een puur visuele beoordeling van de troebelheid van de putten om de minimale concentratie (MIC) te bepalen voor de volledige remming van de groei (ten minste 50% remming voor geselecteerde antischimmelmiddelen, zoals azolen en echinocandinen) en biedt geen kwantificering van de groei bij sub-MIC-concentraties18 . Een andere veelgebruikte benadering omvat het kwantificeren van de levensvatbaarheid na incubatie met AMPs door de inhoud van de putten op agarplaten te platen, de platen te incuberen en vervolgens het aantal kolonievormende eenheden (CFU's) op de plaat te tellen. Deze methode is gebruikt voor het evalueren van een aantal peptiden, waaronder histatine 5-gebaseerde peptiden, LL-37 en humaan lactoferrine 19,20,21. Deze techniek vereist een relatief groot volume agar en een groot aantal platen en omvat het vervelende tellen van CFU's op de platen. Om meer kwantitatieve gegevens te verkrijgen, terwijl minder plastic afval wordt gegenereerd en het tellen van CFU's wordt vermeden, kan de inhoud van de putten worden gebruikt om vers medium in een andere 96-putplaat te enten. Na het incuberen van de nieuw geënte plaat kan de groei worden gekwantificeerd door de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) te meten op een absorptieplaatlezer. Deze methode is gebruikt om de antischimmelactiviteit van histatine 5 en zijn afbraakfragmenten en celdoordringende peptiden te bepalen 17,22,23,24,25.

Dit protocol beschrijft hoe de antischimmelactiviteit van peptiden kan worden getest en gebruikt de OD600-methode om de vermindering van de levensvatbaarheid van C. albicans als gevolg van peptiden te kwantificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Goedkeuring werd verkregen van de Universiteit van Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) voor het werk met C. albicans in dit protocol (PN 274). De C. albicans stam SC5314 (zie Materiaaltabel) werd gebruikt in deze studie; elke andere soort kan echter ook worden gebruikt.

1. Bereiding van de buffer, het steriele water en het kweekmedium

  1. Bereid steriele 0,1 M natriumfosfaatbuffer (NaPB)26 bij pH 7,4 en verdun tot 2 mM en 1 mM met steriel water. Het bereiden van 100 ml elk van 2 mM NaPB en 1 mM NaPB zal meer dan voldoende zijn voor de meeste toepassingen van dit protocol.
  2. Bereid steriele vloeibare gist-pepton-dextrose (YPD, zie tabel van materialen) medium (10 g/L gistextract, 20 g/L dextrose, 20 g/L pepton). Het voorbereiden van 100 ml YPD is meer dan voldoende voor de meeste toepassingen van dit protocol.
  3. Bereid steriel ultrapuur water. Het bereiden van 100 ml water is meer dan voldoende voor de meeste toepassingen van dit protocol.
    OPMERKING: De buffers, media en water worden gesteriliseerd door autoclaveren bij 121 °C op een vloeistofcyclus gedurende een geschikte tijd op basis van het volume in de containers die worden geautoclaveerd27. Voor flessen met 500 ml moet de belichtingstijd bijvoorbeeld 40 minuten zijn.

2. Inenting, kweken en subcultureren van C. albicans

LET OP: Volg alle institutionele en overheidsvoorschriften voor het werken met C. albicans, dat vaak door academische onderzoeksinstellingen wordt geclassificeerd als een bioveiligheidsniveau (BSL) 2-organisme, ongeacht medicijnresistentie en door de American Type Culture Collection (ATCC) als een BSL1- of BSL2-organisme, afhankelijk van de medicijnresistentie van de stam28.

OPMERKING: Voer de inentings- en kweekgedeelten van deze stap (stappen 2.1-2.2) uit op de dag voordat u begint met het testen op antischimmelactiviteit. Voer indien mogelijk alle protocolstappen uit met de cellen (en de oplossingen die met de cellen worden geïncubeerd) in een bioveiligheidskast.

  1. Ent de gewenste C. albicans-stam in 10 ml YPD-medium in een kweekbuis.
    OPMERKING: De cultuur kan worden ingeënt uit een vriezervoorraad of uit een agarplaat, maar er moet een consistente bron worden gebruikt voor alle gegevens die worden vergeleken.
  2. Kweek de cultuur 's nachts (~12-16 uur) bij 30 °C en 230 tpm op een roterende schudder.
  3. Subcultuur is de nachtcultuur van C. albicans, en groeit tot een OD600 van ~1,0-1,2.
    1. Meet de OD600 van de nachtcultuur met behulp van een UV-spectrofotometer (zie materiaaltabel).
    2. Gebruik op basis van de OD 600 van de nachtcultuur de nachtcultuur om een subcultuur in te enten bij een OD600 van 0,1 in10 ml YPD.
    3. Laat de subcultuur groeien op 30 °C op een roterende schudder bij 230 tpm totdat de OD600 ~ 1,0-1,2 bereikt, wat waarschijnlijk 4-6 uur zal duren. Voltooi stap 3 (bereiding van peptide-oplossingen) terwijl de subcultuur groeit; De subcultuur wordt verdund voor gebruik in de test in stap 4.

3. Bereiding van de peptide-oplossingen in een plaat met 96 putten

OPMERKING: Deze stap kan van tevoren worden uitgevoerd als de peptidevoorraadoplossingen stabiel zijn tijdens opslag. Meestal worden de peptideoplossingen bewaard bij −20 °C tot gebruik. Ze kunnen worden ontdooid in een waterbad op kamertemperatuur voordat ze doorgaan naar de volgende stap.

  1. Bepaal de hoogste concentratie van elk peptide dat in de test moet worden getest. Dit zal variëren op basis van de geselecteerde peptiden. Voor de gegevens in de sectie representatieve resultaten werden histatine 5 en engineered analogen22 getest en de hoogste geteste concentratie was 50 μM.
    OPMERKING: De hoogste te testen concentratie wordt bepaald met behulp van gegevens die in de literatuur zijn gerapporteerd of door voorlopige experimenten uit te voeren over een breed scala aan peptideconcentraties. Indien mogelijk moet de hoogste concentratie worden gekozen om een plateau te observeren voor een volledige vermindering van de levensvatbaarheid bij de hoogste geteste concentraties en een plateau voor geen vermindering van de levensvatbaarheid bij de laagste geteste concentraties, waardoor het volledige bereik van peptideactiviteit kan worden gekwantificeerd.
  2. Los elk peptide op in steriel water met tweemaal de gewenste hoogste concentratie. Voor de gegevens in de rubriek representatieve resultaten werden 150 μL 100 μM-oplossingen van histatine 5 en technische analogen bereid in steriel water.
    OPMERKING: Als een peptide niet oplosbaar is in water, kan oplosbaarheid in een ander oplosmiddel nodig zijn voorafgaand aan deze stap. Dimethylsulfoxide (DMSO) wordt vaak gebruikt om peptiden in een hoge concentratie op te lossen voordat ze worden verdund tot de werkconcentratie. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van de DMSO 1% (v/v) of lager29 is en dat alternatieve oplosmiddelen de groei van de cellen niet beïnvloeden. Zorg er ook voor dat de oplosmiddelconcentratie constant wordt gehouden in alle putten in stappen 3.4-3.5.
  3. Voeg 40 μL van de gewenste peptide-stamoplossingen toe aan de eerste put (kolom 1) van elke rij in een 96-put, ronde bodemkweekplaat (zie materiaaltabel). Deze plaat is Plaat 1 (Figuur 1).
    OPMERKING: Elke plaat heeft acht rijen die worden gebruikt voor het testen van peptiden. Deze rijen kunnen worden gebruikt voor verschillende peptiden of voor replicaties van dezelfde peptiden. Neem slechts één peptide op in elke rij.
  4. Voeg 20 μl steriel ultrapuur water toe aan kolom 2 van kolom 12 van de rijen peptide (figuur 1).
    OPMERKING: Als de peptidevoorraden in stap 3.2 zijn bereid met een ander oplosmiddel dan zuiver water, moet het steriele water in deze stap worden vervangen door het oplosmiddel dat aanwezig is in de peptidevoorraad die aan de eerste kolom is toegevoegd. Als het peptide bijvoorbeeld is opgelost in DMSO en de peptidevoorraad 1% (v/v) DMSO in water bevat, moet water met 1% DMSO worden toegevoegd aan kolom 2 van kolom 12.
  5. Verdun de peptide-stamoplossingen serieel over de plaat tot kolom 10 (figuur 1).
    OPMERKING: In plaats van de seriële verdunningen in de plaat uit te voeren zoals hieronder beschreven, kunnen de verdunningen ook worden uitgevoerd in microcentrifugebuizen en worden overgebracht naar de 96-putplaat.
    1. Verwijder 20 μL uit kolom 1, breng het over naar kolom 2 en meng door op en neer te pipetteren. Kolom 2 bevat nu 40 μl peptideoplossing bij een verdunning van 1:2 van de concentratie in kolom 1.
    2. Verwijder 20 μL uit kolom 2, breng het over naar kolom 3 en meng door op en neer te pipetteren, zodat kolom 3 nu 40 μL peptideoplossing bevat bij een verdunning van 1:4 van de concentratie in kolom 1.
    3. Herhaal dit proces totdat kolom 10 40 μl peptideoplossing bevat bij een verdunning van 1:512 van de concentratie in kolom 1.
    4. Verwijder 20 μL peptideoplossing uit kolom 10 en gooi deze weg. Elke kolom bevat nu 20 μL peptideoplossing (kolommen 1-10) of water (kolom 11 en kolom 12).
      OPMERKING: De putten in kolom 11 dienen als steriliteitscontroles en de putten in kolom 12 dienen als controles die geen peptide bevatten.

4. Verdunning van de subcultuur C. albicans

OPMERKING: Begin met deze stap nadat de subcultuur een OD600 van ~1,0-1,2 heeft bereikt (stap 2.3.3).

  1. Breng de subcultuur over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 3.900 x g om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant door pipetteren of decanteren.
  2. Resuspensie van de pellet met 1 ml 2 mM NaPB (stap 1.1) en breng de suspensie over in een centrifugebuis van 1,7 ml.
  3. Pellet de cellen (zoals in stap 4.1), gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet opnieuw in 1 ml 2 mM NaPB.
  4. Herhaal stap 4.3 nog twee keer om de gewassen cellen in 1 ml 2 mM NaPB te laten staan.
  5. Bepaal de celdichtheid van de gewassen suspensie en bereken de verdunningsfactor die nodig is om een celdichtheid van 5 x 105 cellen / ml te verkrijgen. Deze concentratie zal uiteindelijk leiden tot het toevoegen van 1 x 104 cellen aan elke put van de 96-well plaat.
    OPMERKING: De celdichtheid van de suspensie kan worden bepaald met behulp van een aantal methoden, waaronder een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Voor deze studie werd een standaardcurve van celdichtheid versus OD600 gebruikt voor de stam van belang die onder relevante omstandigheden werd gekweekt. Deze curve werd voorbereid met behulp van een hemocytometer (zie tabel met materialen) om de celdichtheid van suspensies met variërende OD600-waarden te bepalen.
  6. Verdun de celsuspensie tot 5 x 105 cellen/ml in 2 mM NaPB. Het bereiden van 10 ml van deze verdunde suspensie zal meer dan voldoende zijn om deze studie te voltooien.

5. Incubatie van C. albicans met peptideoplossingen en voorbereiding van de cellen voor de kwantificering van de levensvatbaarheid

  1. Voeg 20 μL van de verdunde C. albicans-suspensie (stap 4.6 ) toe aan de kolommen 1-10 en kolom 12 van elke rij (figuur 1).
    OPMERKING: De uiteindelijke peptideconcentratie in de eerste kolom is nu de helft van de peptidevoorraadconcentratie. Voor de huidige studie was de uiteindelijke peptideconcentratie op dit punt 50 μM. De uiteindelijke celsuspensie in elke put bevat 2,5 x 105 cellen / ml. Kolommen 1-10 dienen als experimentele putten om de antischimmelactiviteit bij verschillende peptideconcentraties te evalueren, en kolom 12 dient als een controle voor groei zonder peptide.
  2. Voeg 20 μL 2 mM NaPB toe aan kolom 11. Alle putten hebben nu een eindconcentratie van 1 mM NaPB. Kolom 11 dient als steriliteitscontrole.
  3. Dek plaat 1 af (die zowel cellen als peptide bevat) en incubeer deze bij 30 °C gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Een incubatietijd van 30 minuten is voldoende voor veel peptiden 17,21,22,30, maar de incubatietijd kan indien gewenst worden verhoogd tot 60 minuten om rekening te houden met peptiden die mogelijk een langere tijd nodig hebben om hun antischimmelactiviteit uit te oefenen 25,31,32.
  4. Maak een nieuwe kweekplaat met 96 putten (plaat 2) klaar voor gebruik bij het kwantificeren van de levensvatbaarheid (figuur 2).
    OPMERKING: De kweekplaat moet worden voorbereid tijdens de incubatie van plaat 1.
    1. Voeg 100 μL YPD (stap 1.2) toe aan alle putjes van de plaat.
    2. Voeg 100 μL 2 mM NaPB (stap 1.1) toe aan alle putjes van de plaat.
  5. Verdun de monsters in plaat 1 (met cellen en peptiden) en breng ze over naar plaat 2 (met medium en buffer).
    1. Haal plaat 1 uit de incubator na de 30 minuten incubatie.
    2. Verdun elk putje van plaat 1 door 280 μl 1 mM NaPB (stap 1.1) toe te voegen voor een totaal volume van 320 μl in elk putje (figuur 2).
    3. Meng alle putjes met cellen en peptiden door op en neer te pipetteren om ervoor te zorgen dat alle cellen worden geresuspendeerd en er geen bezonken cellen zichtbaar zijn op de bodem van de putten.
    4. Breng 8 μL over van elke put in plaat 1 naar de overeenkomstige put van plaat 2. Dit volume brengt ongeveer 250 cellen over van elke put van plaat 1 naar plaat 2 (figuur 2).
  6. Dek plaat 2 af en incubeer op een microtiterplaatschudder (zie materiaaltabel) bij 350 tpm gedurende 17 uur bij 30 °C.

Figure 1
Figuur 1: Bereiding van plaat 1 voor de incubatie van peptide seriële verdunningen met cellen. Seriële verdunningen van het peptide worden gemaakt in water en C. albicans-cellen worden toegevoegd aan plaat 1. Een blauwe kleur geeft aan dat peptide aanwezig is in de put, en grijs duidt op een put met water en geen peptide. Putjes met cellen worden aangeduid met een patroon van zwarte stippen. Na deze stappen wordt de plaat geïncubeerd om het peptide zijn antischimmelactiviteit te laten uitoefenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Voorbereiding van plaat 2 voor het kwantificeren van de vermindering van de levensvatbaarheid als gevolg van het peptide. YPD-medium en NaPB worden toegevoegd aan Plaat 2. Na verdunning van de inhoud van plaat 1 wordt een aliquot uit elke put overgebracht van plaat 1 naar plaat 2. Plaat 2 wordt vervolgens geïncubeerd om levensvatbare cellen te laten groeien voor kwantificering door de OD600 te meten. Voor plaat 2 worden putjes met alleen YPD en NaPB in oranje weergegeven. Putjes met aliquots uit plaat 1 gemengd met de YPD en NaPB worden in het groen weergegeven. Zie de legenda van figuur 1 voor de beschrijving van de kleuren op plaat 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Bepaling van antischimmelactiviteit

  1. Verkrijg OD600-metingen voor elke put in plaat 2.
    1. Verwijder plaat 2 uit de incubator na 17 uur incubatie.
    2. Meng alle putjes in plaat 2 door op en neer te pipetteren om ervoor te zorgen dat alle cellen worden geresuspendeerd en dat er geen bezonken cellen zichtbaar zijn op de bodem van de putjes.
      OPMERKING: Vermijd het genereren van bubbels tijdens deze stap, omdat deze de OD600-metingen kunnen verstoren. Als er bubbels ontstaan, kunnen ze vaak worden gepopt met een droge pipetpunt of worden verwijderd door twee pipetpunten te gebruiken om ze uit de put te tillen.
    3. Gebruik een absorptieplaatlezer (zie materiaaltabel) bij een golflengte van 600 nm om de OD600 voor elke put te verkrijgen.
  2. Bereken de remming van de groei (als een percentage) en plot deze om het effect van de peptiden op de groei van C. albicans te bepalen.
    1. Bereken voor elke put de vermindering van de levensvatbaarheid ten opzichte van de controle (als percentage) met behulp van de volgende vergelijking 17,22,23:
      Equation 1
      waarbij OD met peptide de OD 600 is van een put die een bepaalde concentratie peptide bevat, od-achtergrond de OD600 van kolom 11 in dezelfde rij is (controle zonder cellen), en
      OD no peptide is de OD600 van kolom 12 in dezelfde rij (controle die cellen bevat en geen peptide).
    2. Gebruik bijvoorbeeld de volgende expressie om de vermindering van de levensvatbaarheid in put B5 te berekenen op basis van de OD600-waarden voor rij B:
      Equation 2
  3. Plot de vermindering van de levensvatbaarheid als een functie van de peptideconcentratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gebruik van OD600-metingen om de vermindering van de groei als gevolg van antischimmelpeptiden te kwantificeren, bespaart aanzienlijke tijd in vergelijking met het plateren van monsters en het tellen van CFU's. De methode die in dit protocol wordt beschreven, vereist het voltooien van de stappen op drie verschillende dagen. Op de eerste dag is ongeveer 1 uur nodig om de buffers en media voor te bereiden (exclusief de sterilisatietijd) en de startcultuur van C. albicans te enten voor nachtelijke incubatie. Op de tweede dag hebben de stappen 5-6 uur nodig (inclusief subculturatietijd) om een 96-well-plaat voor te bereiden voor de incubatie van 17 uur. Op de derde dag kunnen de stappen in minder dan 1 uur worden voltooid. Het deel van het protocol dat betrekking heeft op het verzamelen van de kwantitatieve gegevens over levensvatbaarheid vereist ongeveer 30 minuten werk (plus 17 uur incubatie). Daarentegen zou het plateren van de monsters op agar en het tellen van de CFU's voor een enkele replicatie van de inhoud van elke 96-putplaat meer dan 3 uur werk vereisen (plus 24 uur incubatie), wat resulteert in meer dan 2,5 uur minder tijd die nodig is om de kwantificering van de levensvatbaarheid met behulp van dit protocol te voltooien. Deze tijdsbesparing zou worden versterkt als er meerdere 96-putplaten nodig waren in een experiment.

Het beschreven protocol werd gebruikt om de antischimmelactiviteit van histatine 5 en verschillende varianten van histatine 5 met modificaties aan de lysineresiduen te testen. Na het incuberen van de peptiden met de C. albicans-cellen in stap 5, werd de antischimmelactiviteit gekwantificeerd met behulp van zowel de CFU-telmethode als het beschreven protocol met OD600-metingen (figuur 3). Belangrijk is dat de twee methoden vergelijkbare resultaten opleverden voor alle peptiden, hoewel elk peptide één concentratie had met een statistisch significant verschil in de vermindering van de levensvatbaarheid bepaald door de twee methoden. In elk van deze gevallen vertoonden de OD600-gegevens een lagere vermindering van de levensvatbaarheid dan de CFU-gegevens, wat aangeeft dat een enkele methode moet worden gebruikt wanneer de gegevens worden vergeleken. Belangrijk is dat gegevens met behulp van de OD600-metingen zeer reproduceerbaar zijn, zoals aangegeven door de over het algemeen kleine standaardafwijkingen van de replicaties in figuur 3 en gepubliceerde resultaten met behulp van dit protocol 17,22,23,24,25.

Figure 3
Figuur 3: Vergelijking van de traditionele (CFU) en beschreven (OD) methoden voor het kwantificeren van de vermindering van de celgroei van C. albicans. Het peptide (A) histatine 5 (Hst-5) en de varianten van histatine 5 (B) K5R, (C) K11R, (D) K13R en (E) K17R (met lysine naar arginine modificatie bij de aangegeven residuen) werden geïncubeerd met C. albicans cellen in concentraties van 50 μM tot 0,20 μM, zoals beschreven in het protocol. Na stap 5.5.3 werden de monsters verwijderd voor plating op agar (één replicaat voor elk experiment) of overgebracht naar een nieuwe plaat (twee replicaties voor elk experiment) om het protocol voort te zetten. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten (N = 3 gegevenspunten voor CFU-gegevens, N = 6 gegevenspunten voor OD-gegevens) en de foutbalken geven de standaarddeviatie van de gegevens aan. Een tweerichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Tukey's meervoudige vergelijkingstest (α = 0,05) werd uitgevoerd om statistische verschillen tussen de twee methoden te identificeren. Peptideconcentraties met een statistisch significant verschil worden genoteerd door een sterretje (*) op de percelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een efficiënte aanpak voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de antischimmelactiviteit van AMPs tegen de schimmelpathogeen C. albicans. Een veel voorkomende alternatieve benadering voor het testen van peptiden en andere antischimmelmiddelen is de bouillonmicroverdunning die wordt beschreven in de standaard M2718 van het Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), maar deze standaard richt zich op het verkrijgen van kwalitatieve visuele resultaten in plaats van kwantitatieve resultaten. Een andere alternatieve benadering is om een methode te gebruiken die vergelijkbaar is met de methode die in dit protocol wordt beschreven om peptiden te bereiden en ze te incuberen met cellen en vervolgens de inhoud van de putten op agar te plaatsen om het aantal CFU's te tellen en het effect van de peptiden te kwantificeren. Zoals opgemerkt in de sectie representatieve resultaten, vermindert dit gebruik van OD600 voor het meten van celgroei in dit protocol de tijdslast aanzienlijk in vergelijking met het plateren en tellen van CFU's. Het elimineren van de noodzaak om de inhoud van putten op agar te plaatsen, vermindert ook de hoeveelheid plastic afval die wordt gegenereerd door het peptide-testprotocol.

Verschillende aspecten van dit protocol zijn belangrijk voor het succes ervan. Aangezien veel kationische antimicrobiële peptiden slecht presteren in fysiologische zoutconcentraties in assays uitgevoerd in vitro 8,32,33,34, werd een 1 mM NaPB-buffer geselecteerd voor deze test. Bovendien worden de peptiden en C. albicans-cellen gedurende een korte tijd (30 min) in buffer geïncubeerd in plaats van een lange tijd in groeimedium. Dit vermindert de potentiële groei en deling van de cellen, wat van invloed zou zijn op de daaropvolgende kwantificering van de levensvatbare cellen die overblijven na de incubatie met de peptiden. Na de incubatie van de peptiden met de cellen worden de putten verdund om de concentratie van het peptide te verminderen, waardoor het potentieel voor antischimmelactiviteit na de gewenste incubatie van 30 minuten wordt verminderd35. Het potentieel voor voortdurende activiteit van de peptiden wordt verder verminderd door de celpeptideoplossing over te brengen naar een plaat met YPD-medium; veel peptiden verliezen hun activiteit in het YPD-medium (ongepubliceerde gegevens), mogelijk vanwege de aanwezigheid van mono- en tweewaardige kationen, waarvan bekend is dat ze de activiteit van sommige antimicrobiële peptiden verminderen 6,7,34,36. Een gebrek aan activiteit in het YPD-medium is echter niet noodzakelijk voor het succes van het protocol. Ten slotte worden de C. albicans-cellen gekweekt bij 30 °C voor de relevante stappen in het protocol. Door de cellen bij deze temperatuur te laten groeien, moeten de cellen zich voornamelijk in de gistmorfologie bevinden, wat belangrijk is voor het verkrijgen van nauwkeurige schattingen van het aantal cellen in stap 2 en stap 4 en voor de betrouwbare kwantificering van de vermindering van de levensvatbaarheid in stap 6.

Gebruikers kunnen tijdens dit protocol uitdagingen tegenkomen, waaronder besmetting met ongewenste microbiële organismen of de verdamping van vloeistof uit de putten aan de randen van de 96-putplaat. Het protocol bevat putten voor steriliteitscontroles om te identificeren of er besmetting is opgetreden; Besmetting maakt de testresultaten ongeldig. Als gebruikers besmetting waarnemen, moet ervoor worden gezorgd dat alle buffers en media op de juiste manier worden gesteriliseerd en dat de juiste steriele techniek wordt gebruikt bij het pipetteren37. Werken in een bioveiligheidskast vermindert ook de kans op besmetting. De verdamping van vloeistof uit de randputten van 96-putplaten is een bekende uitdaging bij microtiterplaten38 en kan de resultaten van dit protocol beïnvloeden. Hoewel de korte incubatietijd van de cellen met het peptide in stap 5.3 waarschijnlijk niet zal leiden tot problemen met randeffecten, kan de langere incubatie van de resterende levensvatbare cellen in stap 5.6 leiden tot het waarnemen van verdamping. Als verdamping wordt waargenomen, kan het gebruik van verschillende 96-putplaten of het vullen van de ruimte rond de putten met water de verdamping verminderen38. Gebruikers kunnen ook overwegen om rij A en rij H en kolom 1 en kolom 12 van de plaat niet te gebruiken om gegevens te verkrijgen, maar ze in plaats daarvan te vullen met water, medium of buffer.

Wijzigingen in vele aspecten van het protocol zijn mogelijk. Een andere buffer (of medium) kan bijvoorbeeld worden gebruikt bij het incuberen van de cellen en peptiden samen (stappen 4-5.3), of een ander schimmelkweekmedium kan worden gebruikt voor celgroei na incubatie met de peptiden (stappen 5.4-5.6). Het gebruik van alternatieve buffers en media kan benchmarking mogelijk maken met andere in de literatuur gepubliceerde methoden of met de CLSI-norm18 en zal belangrijk zijn voor het testen van peptiden onder omstandigheden die het beoogde in vivo gebruik nabootsen. Een andere wijziging die sommige gebruikers nuttig kunnen vinden, is om de peptiden in de rijen van de plaat te verdunnen in plaats van over de kolommen. Het veranderen van de oriëntatie zou het aantal concentraties verminderen dat voor een bepaald peptide kan worden getest, maar het zou het mogelijk maken om meer peptiden in een enkele plaat te testen, wat nuttig zou kunnen zijn voor experimenten die het testen van een groot aantal verschillende peptiden vereisen.

Het verkrijgen van replicatiegegevens voor elk peptide dat in dit protocol wordt getest, is belangrijk. Het opnemen van technische replicaties op een bepaalde testdag maakt het mogelijk om de variabiliteit van het protocol te begrijpen. Bovendien is het uitvoeren van biologische replicaties belangrijk om de variabiliteit van willekeurige variatie in de groei van cellen te begrijpen. Het laboratorium van de auteurs verkrijgt meestal ten minste zes replicatiegegevenspunten voor een bepaald peptide. Het testen wordt uitgevoerd op minimaal 2 verschillende dagen en op elke dag zijn er minimaal twee technische replica's inbegrepen. Gewoonlijk worden drie replica's uitgevoerd op elk van de 2 verschillende dagen of twee replica's op elk van de 3 verschillende dagen. Figuur 3 laat zien dat dit protocol consistente gegevens oplevert met kleine standaardafwijkingen wanneer het goed wordt uitgevoerd.

De eenvoudige aard van dit protocol maakt het mogelijk om het aan te passen voor gebruik in veel experimenten die niet direct in het protocol worden beschreven. Het protocol kan bijvoorbeeld gemakkelijk worden aangepast voor het testen van andere gisten, waaronder andere Candida-soorten. Het is echter niet goed geschikt voor filamenteuze soorten of dimorfe soorten die groeien in hun filamenteuze morfologie. Het protocol kan ook worden aangepast voor gebruik met niet-peptide antischimmelmiddelen, zoals geneesmiddelen met kleine moleculen, of mengsels van verschillende peptiden of peptidefragmenten. Soortgelijke protocollen zijn bijvoorbeeld eerder gebruikt om geneesmiddelen met kleine moleculen, waaronder amfotericine B, fluconazol en caspofungine, te testen tegen Histoplasma-gisten 39. De auteurs hebben het protocol gebruikt om de antischimmelactiviteit van niet-afgebroken peptiden te vergelijken met pools van peptidefragmenten gevormd door proteolyse van het peptide17,22. Een andere uitbreiding van dit protocol zou zijn om de kinetiek van de antischimmelactiviteit van AMPs te onderzoeken. Dit protocol gebruikt een incubatietijd van 30 minuten voor de peptiden om hun antischimmelactiviteit uit te oefenen, maar kortere of langere incubatietijden kunnen worden gebruikt om de tijd die nodig is voor de peptiden om de levensvatbaarheid van cellen te verminderen beter te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), de National Science Foundation (CBET 1511718), het Department of Education (GAANN-P200A180093) en een Cross-Campus Seed Grant van de Universiteit van Maryland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates (round bottom) VWR 10062-902
Absorbance microplate reader N/A N/A Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314 ATCC  MYA-2876 Other C. albicans may also be used
Hemocytometer N/A N/A Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker VWR 2620-926
Peptide(s) N/A N/A Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors VWR 18900-320 Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic Fisher Scientific BP332-500 For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific BP329-500 For making NaPB
UV spectrophotometer N/A N/A Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder BD Life Sciences 242820 May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Tags

Biologie Candida albicans peptiden antimicrobiële peptiden antischimmel gevoeligheidstesten gist optische dichtheid
Kwantificeren van de antischimmelactiviteit van peptiden tegen <em>Candida albicans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P.,… More

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P., Karlsson, A. J. Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans. J. Vis. Exp. (191), e64416, doi:10.3791/64416 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter