Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד קנדידה אלביקנס

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64416
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ותרכובות אחרות, כגון חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות, כנגד קנדידה אלביקנס. השימוש בו בצפיפות אופטית במקום לספור יחידות יוצרות מושבה כדי לכמת עיכוב גדילה חוסך זמן ומשאבים.

Abstract

שיטות מסורתיות לביצוע בדיקות רגישות אנטי פטרייתיות לקנדידה אלביקנס גוזלות זמן רב וחסרות תוצאות כמותיות. לדוגמה, גישה נפוצה מסתמכת על ציפוי תאים המטופלים בריכוזים שונים של מולקולות אנטי פטרייתיות על לוחות אגר ולאחר מכן ספירת המושבות כדי לקבוע את הקשר בין ריכוז מולקולות ועיכוב גדילה. שיטה זו דורשת לוחות רבים וזמן ניכר לספירת המושבות. גישה נפוצה נוספת מבטלת את הצלחות ואת ספירת המושבות על ידי בדיקה חזותית של תרבויות שטופלו בחומרים אנטי פטרייתיים כדי לזהות את הריכוז המינימלי הדרוש לעיכוב הצמיחה; עם זאת, בדיקה חזותית מניבה תוצאות איכותיות בלבד, ומידע על גדילה בריכוזים תת-מעכבים הולך לאיבוד. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת הרגישות של C. albicans לפפטידים אנטי פטרייתיים. על ידי הסתמכות על מדידות צפיפות אופטיות של תרביות, השיטה מפחיתה את הזמן והחומרים הדרושים להשגת תוצאות כמותיות על גידול תרביות בריכוזי פפטידים שונים. הדגירה של הפטרייה עם פפטידים מתבצעת בצלחת של 96 בארות באמצעות חיץ מתאים, כאשר בקרות אינן מייצגות עיכוב גדילה ועיכוב גדילה מלא. לאחר הדגירה עם הפפטיד, מתלי התאים המתקבלים מדוללים כדי להפחית את פעילות הפפטיד ואז גדלים בן לילה. לאחר גדילה בין לילה, הצפיפות האופטית של כל באר נמדדת ומושווה לבקרות החיוביות והשליליות כדי לחשב את עיכוב הצמיחה המתקבל בכל ריכוז פפטידים. התוצאות באמצעות בדיקה זו דומות לתוצאות בשיטה המסורתית של ציפוי התרבויות על צלחות אגר, אך פרוטוקול זה מפחית את פסולת הפלסטיק ואת הזמן המושקע בספירת מושבות. למרות שהיישומים של פרוטוקול זה התמקדו בפפטידים אנטי פטרייתיים, השיטה תהיה ישימה גם לבדיקת מולקולות אחרות עם פעילות אנטי פטרייתית ידועה או חשודה.

Introduction

קנדידה אלביקנס היא חלק מהמיקרוביוטה האנושית שמאכלסת מקומות רבים, כולל חלל הפה, העור, מערכת העיכול והנרתיק1. עבור חולים מדוכאי חיסון עקב מחלות כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) וטיפולים מדכאי חיסון, הנשאות של C. albicans עלולה להוביל לקנדידה מקומית או מערכתית 2,3. השימוש בטיפולים אנטי-פטרייתיים במולקולות קטנות הזמינות כיום, כגון אמפוטריצין B, אזולים או אכינוקנדינים, יכול להיות מסובך על ידי בעיות מסיסות ורעילות ועל ידי עמידות של זיהומים לטיפולים 4,5. בשל המגבלות של חומרים אנטי פטרייתיים הנוכחיים, החוקרים מחפשים ללא הרף מולקולות אנטי פטרייתיות חדשות עם פעילות נגד C. albicans.

פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) הם חלופה פוטנציאלית לחומרים האנטי-פטרייתיים הנוכחיים של מולקולות קטנות 6,7,8 ומוצעים להיות פחות רגישים להתפתחות עמידות בהשוואה לתרופות בעלות מולקולות קטנות 9. AMPs הם קבוצה מגוונת של פפטידים, אבל הם לעתים קרובות קטיוניים, עם ספקטרום רחב של פעילות10,11,12. AMPs עם פעילות נגד C. albicans כוללים פפטידים ידועים ממשפחות היסטטין וצקרופין 13,14,15, יחד עם פפטידים שתוארו לאחרונה כמו ToAP2, NDBP-5.7, וגרסת היסטטין 5 K11R-K17R 16,17. בשל הפוטנציאל שלהם לטיפול בזיהומי קנדידה, זיהוי ועיצוב AMPs חדשים המכוונים ל- C. albicans הוא יעד חשוב עבור קבוצות מחקר רבות.

כחלק מהתהליך לפיתוח AMPs יעילים (וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים) המכוונים ל- C. albicans, בדיקות חוץ גופיות משמשות בדרך כלל לזיהוי פפטידים מבטיחים. שיטות לבדיקת פעילות אנטי-פטרייתית נגד C. albicans כוללות בדרך כלל דגירה של תאים עם דילול סדרתי של AMPs (בחיץ או בתווך) בלוחות 96 בארות. קיימות מספר שיטות להערכת הפעילות האנטי פטרייתית לאחר הדגירה. טכניקה שתוארה על ידי מכון התקנים למעבדה קלינית משתמשת בהערכה חזותית טהורה של עכירות הבארות כדי לקבוע את הריכוז המינימלי (MIC) לעיכוב מוחלט של הצמיחה (עיכוב של לפחות 50% עבור חומרים אנטי פטרייתיים נבחרים, כמו azoles ו echinocandins) ואינה מספקת כימות של צמיחה בריכוזים sub-MIC18 . גישה נפוצה נוספת כוללת כימות הכדאיות לאחר הדגירה עם AMPs על ידי ציפוי תכולת הבארות על לוחות אגר, דגירה על הצלחות, ולאחר מכן ספירת מספר יחידות יוצרות מושבה (CFUs) על הצלחת. שיטה זו שימשה להערכת מספר פפטידים, כולל פפטידים מבוססי היסטטין 5, LL-37, ולקטופריןאנושי 19,20,21. טכניקה זו דורשת נפח גדול יחסית של אגר ומספר גבוה של צלחות וכרוכה בספירה מייגעת של CFUs על הצלחות. כדי לקבל נתונים כמותיים יותר תוך יצירת פחות פסולת פלסטיק והימנעות מספירת CFUs, ניתן להשתמש בתכולת הבארות כדי לחסן מדיום טרי בצלחת נוספת בת 96 בארות. לאחר הדגירה על הצלחת שזה עתה חוסנה, ניתן לכמת את הגידול על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) בקורא לוחות ספיגה. שיטה זו שימשה לקביעת הפעילות האנטי פטרייתית של היסטטין 5 ומקטעי הפירוק שלו ופפטידים חודרי תאים 17,22,23,24,25.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבדוק את הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ומשתמש בשיטת OD600 כדי לכמת את הפחתת הכדאיות של C. albicans עקב פפטידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

התקבל אישור מאוניברסיטת מרילנד, קולג 'פארק, ועדת בטיחות ביולוגית מוסדית (IBC) לעבודה עם C. albicans בפרוטוקול זה (PN 274). זן C. albicans SC5314 (ראה טבלת חומרים) שימש במחקר הנוכחי; עם זאת, ניתן להשתמש גם בכל זן אחר.

1. הכנת החיץ, המים הסטריליים ומדיום התרבית

  1. הכינו חיץ סטרילי של נתרן פוספט 0.1 מ' (NaPB)26 ב-pH 7.4, ודללו ל-2 מ"מ ו-1 מ"מ במים סטריליים. הכנת 100 מ"ל כל אחד של 2 mM NaPB ו 1 mM NaPB יהיה יותר ממספיק עבור רוב היישומים של פרוטוקול זה.
  2. הכינו שמרים נוזליים סטריליים-פפטון-דקסטרוז (YPD, ראו טבלת חומרים) בינוניים (10 גרם/ליטר תמצית שמרים, 20 גרם/ליטר דקסטרוז, 20 גרם/ליטר פפטון). הכנת 100 מ"ל של YPD יהיה יותר ממספיק עבור רוב היישומים של פרוטוקול זה.
  3. הכינו מים סטריליים טהורים במיוחד. הכנת 100 מ"ל מים תהיה די והותר לרוב היישומים של פרוטוקול זה.
    הערה: החוצצים, המדיה והמים מעוקרים על ידי autoclaving ב 121 ° C במחזור נוזלי לזמן מתאים בהתבסס על נפח במיכלים להיות autoclaved27. לדוגמה, עבור בקבוקים המכילים 500 מ"ל, זמן החשיפה צריך להיות 40 דקות.

2. חיסון, תרבית וטיפוח משנה של C. albicans

זהירות: עקוב אחר כל התקנות המוסדיות והממשלתיות לעבודה עם C. albicans, המסווג לעתים קרובות על ידי מוסדות מחקר אקדמיים כאורגניזם ברמת בטיחות ביולוגית (BSL) 2 ללא קשר לעמידות לתרופות ועל ידי אוסף תרביות הסוג האמריקאי (ATCC) כאורגניזם BSL1 או BSL2, בהתאם לעמידות לתרופות של הזן28.

הערה: בצע את חלקי החיסון והטיפוח של שלב זה (שלבים 2.1-2.2) יום לפני תחילת הבדיקה לפעילות אנטי פטרייתית. במידת האפשר, בצע את כל שלבי הפרוטוקול עם התאים (והתמיסות שיודגרו עם התאים) בארון בטיחות ביולוגית.

  1. יש לחסן את זן C. albicans הרצוי ל-10 מ"ל של תווך YPD בצינורית תרבית.
    הערה: ניתן לחסן את התרבית ממלאי מקפיא או מצלחת אגר, אך יש להשתמש במקור עקבי לכל הנתונים שיושוו.
  2. הגדל את התרבית בן לילה (~ 12-16 שעות) ב 30 ° C ו 230 סל"ד על שייקר סיבובי.
  3. תת-תרבות תרבות הלילה של C. albicans, ולגדול OD600 של ~ 1.0-1.2.
    1. מדוד את OD600 של תרבית הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר UV (ראה טבלת חומרים).
    2. בהתבסס על OD 600 של תרבית הלילה, השתמש בתרבית הלילה כדי לחסן תת-תרבות ב OD600 של 0.1 ב10 מ"ל של YPD.
    3. גדל את תת-התרבות ב 30 ° C על שייקר סיבובי ב 230 סל"ד עד OD600 מגיע ~ 1.0-1.2, אשר צפוי לקחת 4-6 שעות. השלם את שלב 3 (הכנת תמיסות פפטידיות) בזמן שתת-התרבות גדלה; תת-התרבות תדולל לשימוש בבדיקה בשלב 4.

3. הכנת תמיסות הפפטיד בצלחת 96 בארות

הערה: שלב זה עשוי להיעשות מראש, אם פתרונות מלאי הפפטיד יציבים במהלך האחסון. בדרך כלל, תמיסות הפפטיד מאוחסנות בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. ניתן להפשיר אותם באמבט מים בטמפרטורת החדר לפני שממשיכים לשלב הבא.

  1. לקבוע את הריכוז הגבוה ביותר של כל פפטיד להיבדק בבדיקה. זה ישתנה בהתאם לפפטידים שנבחרו. עבור הנתונים המוצגים בסעיף התוצאות המייצגות, נבדקו היסטטין 5 ואנלוגים מהונדסים22 , והריכוז הגבוה ביותר שנבדק היה 50 מיקרומטר.
    הערה: הריכוז הגבוה ביותר שיש לבדוק נקבע באמצעות נתונים המדווחים בספרות או על ידי ביצוע ניסויים מקדימים על פני טווח רחב של ריכוזי פפטידים. במידת האפשר, יש לבחור את הריכוז הגבוה ביותר לצפייה במישור להפחתה מלאה בכדאיות בריכוזים הגבוהים ביותר שנבדקו ומישור ללא ירידה בכדאיות בריכוזים הנמוכים ביותר שנבדקו, המאפשר כימות של כל טווח פעילות הפפטידים.
  2. ממיסים כל פפטיד במים סטריליים בריכוז כפול מהריכוז הגבוה הרצוי. עבור הנתונים המוצגים בסעיף התוצאות המייצגות, 150 μL של 100 מיקרומטר פתרונות של histatin 5 אנלוגים מהונדסים הוכנו במים סטריליים.
    הערה: אם פפטיד אינו מסיס במים, ייתכן שיהיה צורך במסיסות בממס אחר לפני שלב זה. דימתיל סולפוקסיד (DMSO) משמש בדרך כלל להמסת פפטידים בריכוז גבוה לפני דילול לריכוז העבודה. ודא כי הריכוז הסופי של DMSO הוא 1% (v/v) או נמוך יותר29 וכי ממסים חלופיים אינם משפיעים על הצמיחה של התאים. כמו כן, ודא כי ריכוז הממס נשמר קבוע בכל הבארות בשלבים 3.4-3.5.
  3. הוסף 40 μL של תמיסות מלאי הפפטיד הרצויות לבאר הראשונה (עמודה 1) של כל שורה בלוח תרבית בעל 96 בארות בעלות תחתית עגולה (ראה טבלת חומרים). צלחת זו היא צלחת 1 (איור 1).
    הערה: בכל לוח יש שמונה שורות המשמשות לבדיקת פפטידים. שורות אלה יכולות לשמש עבור פפטידים שונים או עבור העתקים של אותם פפטידים. כלול רק פפטיד אחד בכל שורה.
  4. הוסף 20 μL של מים סטריליים אולטרה-טהורים לעמודה 2 לעמודה 12 של השורות המכילות פפטיד (איור 1).
    הערה: אם מלאי הפפטיד הוכן עם ממס שאינו מים טהורים בשלב 3.2, יש להחליף את המים הסטריליים בשלב זה בממס הקיים במלאי הפפטיד שנוסף לעמודה הראשונה. לדוגמה, אם הפפטיד היה מסיס ב-DMSO ומלאי הפפטיד מכיל 1% (v/v) DMSO במים, יש להוסיף מים המכילים 1% DMSO לעמודה 2 לעמודה 12.
  5. דללו באופן סדרתי את תמיסות מלאי הפפטידים, לרוחב הצלחת לעמודה 10 (איור 1).
    הערה: במקום לבצע את הדילולים הסדרתיים בצלחת כמתואר להלן, ניתן לבצע את הדילולים גם בצינורות מיקרו-צנטריפוגות ולהעביר לצלחת בעלת 96 הקידוחים.
    1. מוציאים 20 μL מעמודה 1, מעבירים אותה לעמודה 2 ומערבבים על-ידי פיטום למעלה ולמטה. עמודה 2 מכילה כעת 40 μL של תמיסת פפטיד בדילול של 1:2 של הריכוז בעמודה 1.
    2. הסר 20 μL מעמודה 2, העבר אותה לעמודה 3, וערבב על-ידי פיפטציה למעלה ולמטה, כך שעמודה 3 מכילה כעת 40 μL של תמיסת פפטיד בדילול של 1:4 של הריכוז בעמודה 1.
    3. חזור על תהליך זה עד שעמודה 10 מכילה 40 μL של תמיסת פפטיד בדילול של 1:512 של הריכוז בעמודה 1.
    4. הסר 20 μL של תמיסת פפטיד מעמודה 10 והשלך אותה. כל עמודה מכילה כעת 20 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד (עמודות 1-10) או מים (עמודה 11 ועמודה 12).
      הערה: הבארות בטור 11 משמשות כבקרות סטריליות, והבארות בטור 12 משמשות כבקרות שאינן מכילות פפטידים.

4. דילול תת-התרבות C. albicans

הערה: התחל שלב זה לאחר שתרבות המשנה הגיעה ל- OD600 של ~1.0-1.2 (שלב 2.3.3).

  1. מעבירים את תת-התרבית לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגה במינון 3,900 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגרוף את התאים. הסר את supernatant על ידי pipetting או decanting.
  2. להשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל של 2 mM NaPB (שלב 1.1), ולהעביר את המתלה לצינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל.
  3. גלולה את התאים (כמו בשלב 4.1), להשליך את supernatant, ושוב להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של 2 mM NaPB.
  4. חזור על שלב 4.3 פעמיים נוספות כדי להשאיר את התאים שטופים ב 1 מ"ל של 2 mM NaPB.
  5. קבע את צפיפות התא של התרחיף השטוף, וחשב את גורם הדילול הדרוש לקבלת צפיפות תאים של 5 x 105 תאים / מ"ל. ריכוז זה יוביל בסופו של דבר להוספת 1 x 104 תאים לכל באר של צלחת 96 בארות.
    הערה: ניתן לקבוע את צפיפות התאים של המתלה באמצעות מספר שיטות, כולל המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעקומה סטנדרטית של צפיפות תאים לעומת OD600 עבור הזן המעניין שגדל בתנאים רלוונטיים. עקומה זו הוכנה באמצעות המוציטומטר (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את צפיפות התאים של מתלים עם ערכי OD600 משתנים.
  6. לדלל את תרחיף התא ל 5 x 105 תאים / מ"ל ב 2 mM NaPB. הכנת 10 מ"ל של השעיה מדוללת זו תהיה די והותר להשלמת מחקר זה.

5. דגירה של C. albicans עם תמיסות פפטידיות והכנת התאים לכימות הכדאיות

  1. הוסף 20 μL של מתלה C. albicans המדולל (שלב 4.6) לעמודות 1-10 ולעמודה 12 של כל שורה (איור 1).
    הערה: ריכוז הפפטיד הסופי בעמודה הראשונה הוא כעת מחצית מריכוז מלאי הפפטידים. במחקר הנוכחי, ריכוז הפפטיד הסופי היה 50 מיקרומטר בשלב זה. תרחיף התא הסופי בכל באר מכיל 2.5 x 105 תאים / מ"ל. עמודות 1-10 משמשות כבארות ניסוי להערכת הפעילות האנטי-פטרייתית בריכוזי פפטידים שונים, ועמודה 12 משמשת כבקרה לגדילה ללא פפטידים.
  2. הוסף 20 μL של 2 mM NaPB לעמודה 11. לכל הבארות יש כעת ריכוז סופי של 1 mM NaPB. טור 11 משמש כבקרת סטריליות.
  3. מכסים את צלחת 1 (המכילה גם תאים וגם פפטידים), ודגרו עליה בטמפרטורה של 30°C למשך 30 דקות.
    הערה: זמן דגירה של 30 דקות מספיק לפפטידים רבים 17,21,22,30, אך ניתן להגדיל את זמן הדגירה ל-60 דקות אם רוצים לקחת בחשבון פפטידים שעשויים לדרוש זמן רב יותר כדי להפעיל את הפעילות האנטי-פטרייתית שלהם 25,31,32.
  4. הכינו צלחת תרבית חדשה בת 96 בארות (צלחת 2) לשימוש בכימות הכדאיות (איור 2).
    הערה: יש להכין את צלחת התרבית במהלך הדגירה של צלחת 1.
    1. הוסף 100 μL של YPD (שלב 1.2) לכל הבארות של הצלחת.
    2. הוסף 100 μL של 2 mM NaPB (שלב 1.1) לכל בארות הצלחת.
  5. מדללים את הדגימות בצלחת 1 (המכילה תאים ופפטידים), ומעבירים לצלחת 2 (המכילה תווך וחיץ).
    1. שלפו את צלחת 1 מהאינקובטור לאחר 30 דקות הדגירה.
    2. דללו כל באר של לוח 1 על-ידי הוספת 280 μL של 1 mM NaPB (שלב 1.1) לקבלת נפח כולל של 320 μL בכל באר (איור 2).
    3. ערבבו את כל הבארות המכילות תאים ופפטידים על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי להבטיח שכל התאים מרחפים מחדש ולא נראים תאים מיושבים בתחתית הבארות.
    4. מעבירים 8 μL מכל באר בצלחת 1 לבאר המתאימה של צלחת 2. נפח זה מעביר כ-250 תאים מכל באר של לוח 1 לתוך לוח 2 (איור 2).
  6. מכסים את צלחת 2 ודגרים על שייקר צלחת מיקרוטיטר (ראו טבלת חומרים) ב-350 סל"ד למשך 17 שעות ב-30°C.

Figure 1
איור 1: הכנת צלחת 1 לדגירת דילולים סדרתיים פפטידים עם תאים. דילולים סדרתיים של הפפטיד נעשים במים, ותאי C. albicans מתווספים לצלחת 1. צבע כחול מציין כי פפטיד נמצא בבאר, ואפור מציין באר עם מים וללא פפטיד . בארות המכילות תאים מסומנות בתבנית של נקודות שחורות. לאחר שלבים אלה, הצלחת מודגרת כדי לאפשר לפפטיד להפעיל את פעילותו האנטי פטרייתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכנת צלחת 2 לכימות הירידה בכדאיות עקב הפפטיד. YPD בינוני ו- NaPB מתווספים לצלחת 2. לאחר דילול תכולת צלחת 1, אליקוט מכל באר מועבר מצלחת 1 לצלחת 2. לאחר מכן, לוח 2 מודגר כדי לאפשר לכל תא בר קיימא לגדול לצורך כימות על ידי מדידת OD600. עבור לוח 2, בארות המכילות רק YPD ו- NaPB מוצגות בכתום. בארות המכילות אליציטוטים מלוח 1 מעורבבים עם YPD ו-NaPB מוצגים בירוק. ראו את המקרא באיור 1 לתיאור הצבעים בלוח 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. קביעת פעילות אנטי פטרייתית

  1. השג קריאות OD600 עבור כל באר בלוח 2.
    1. מוציאים את צלחת 2 מהאינקובטור לאחר 17 שעות של דגירה.
    2. ערבבו את כל הבארות בצלחת 2 על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי להבטיח שכל התאים מרחפים מחדש ולא נראים תאים מיושבים בתחתית הבארות.
      הערה: הימנע מיצירת בועות במהלך שלב זה, מכיוון שהן עלולות להפריע לקריאות OD600 . אם נוצרות בועות, לעתים קרובות ניתן להקפיץ אותן עם קצה פיפט יבש או להסיר אותן באמצעות שני קצוות פיפט כדי להרים אותן מהבאר.
    3. השתמש בקורא לוחות ספיגה (ראה טבלת חומרים) באורך גל של 600 ננומטר כדי לקבל את OD600 עבור כל באר.
  2. חשב את עיכוב הצמיחה (באחוזים), והתווה אותו כדי לקבוע את השפעת הפפטידים על צמיחת C. albicans.
    1. עבור כל באר, חשב את הירידה בכדאיות בהשוואה לבקרה (באחוזים) באמצעות המשוואה הבאה 17,22,23:
      Equation 1
      כאשר OD עם פפטיד הוא OD 600 של באר המכילה ריכוז נתון של פפטיד , רקע OD הוא OD 600 של עמודה 11 באותה שורה (פקד שאינו מכיל תאים), וכן
      ODno peptide הוא OD600 של עמודה 12 באותה שורה (פקד המכיל תאים וללא פפטיד).
    2. לדוגמה, השתמש בביטוי הבא כדי לחשב את הפחתת הכדאיות בבאר B5 מערכי OD600 עבור שורה B:
      Equation 2
  3. התווה את הירידה בכדאיות כפונקציה של ריכוז הפפטידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש במדידות OD600 לכימות הירידה בגדילה כתוצאה מפפטידים אנטי פטרייתיים חוסך זמן משמעותי בהשוואה לציפוי דגימות וספירת CFU. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה דורשת השלמת השלבים בשלושה ימים שונים. ביום הראשון, יש צורך בכשעה כדי להכין את החוצצים והמדיה (לא כולל זמן העיקור) ולחסן את תרבית ההתחלה של C. albicans לדגירת לילה. ביום השני, השלבים דורשים 5-6 שעות (כולל זמן subculturing) כדי להכין צלחת 96 בארות עבור הדגירה 17 שעות. ביום השלישי, ניתן להשלים את השלבים תוך פחות משעה אחת. החלק של הפרוטוקול הכולל איסוף נתונים כמותיים על כדאיות דורש כ -30 דקות של עבודה (בתוספת 17 שעות של דגירה). לעומת זאת, ציפוי הדגימות על אגר וספירת ה- CFUs עבור העתק יחיד של התוכן של כל צלחת 96 בארות ידרשו יותר מ -3 שעות עבודה (בתוספת 24 שעות של דגירה), וכתוצאה מכך יותר מ -2.5 שעות פחות זמן הדרוש כדי להשלים את כימות הכדאיות באמצעות פרוטוקול זה. חיסכון בזמן זה יוגבר אם יהיה צורך במספר לוחות של 96 בארות בניסוי.

הפרוטוקול המתואר שימש להערכת הפעילות האנטי פטרייתית של היסטטין 5 ומספר גרסאות של היסטטין 5 המכילות שינויים בשאריות הליזין. לאחר הדגירה של הפפטידים עם תאי C. albicans בשלב 5, הפעילות האנטי-פטרייתית כומתה הן באמצעות שיטת ספירת CFU והן באמצעות הפרוטוקול המתואר המשלב מדידות OD600 (איור 3). חשוב לציין כי שתי השיטות הניבו תוצאות דומות עבור כל הפפטידים, אם כי לכל פפטיד היה ריכוז אחד עם הבדל מובהק סטטיסטית בירידה בכדאיות שנקבעה על ידי שתי השיטות. בכל אחד מהמקרים הללו, נתוני OD600 הראו ירידה נמוכה יותר בכדאיות מאשר נתוני CPU, מה שמצביע על כך שיש להשתמש בשיטה אחת כאשר הנתונים יושוו. חשוב לציין, נתונים המשתמשים בקריאות OD600 ניתנים לשחזור במידה רבה, כפי שעולה מסטיות התקן הקטנות בדרך כלל של המשוכפלים באיור 3 והתוצאות שפורסמו באמצעות פרוטוקול זה 17,22,23,24,25.

Figure 3
איור 3: השוואה בין השיטות המסורתיות (CFU) והמתוארות (OD) לכימות הירידה בגדילת תאי C. albicans. הפפטיד (A) היסטטין 5 (Hst-5) והגרסאות של היסטטין 5 (B) K5R, (C) K11R, (D) K13R ו-(E) K17R (עם שינוי ליזין לארגינין בשאריות שצוינו) הודגרו עם תאי C. albicans בריכוזים של 50 מיקרומטר עד 0.20 מיקרומטר, כמתואר בפרוטוקול. לאחר שלב 5.5.3, הדגימות הוסרו לציפוי על אגר (העתק אחד לכל ניסוי) או הועברו לצלחת חדשה (שני עותקים משוכפלים לכל ניסוי) כדי להמשיך את הפרוטוקול. הנתונים מייצגים את הממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים (N = 3 נקודות נתונים עבור נתוני CPU, N = 6 נקודות נתונים עבור נתוני OD), וקווי השגיאה מציינים את סטיית התקן של הנתונים. ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן השוואות מרובות של טוקי (α = 0.05) בוצע כדי לזהות הבדלים סטטיסטיים בין שתי השיטות. ריכוזי פפטידים, עם הבדל מובהק סטטיסטית, מצוינים על ידי כוכבית (*) על החלקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי פטרייתית של AMPs כנגד הפתוגן הפטרייתי C. albicans. גישה חלופית נפוצה אחת לבדיקת פפטידים וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים היא מיקרודילול מרק המתואר בתקן M2718 של מכון התקנים למעבדות קליניות (CLSI), אך תקן זה מתמקד בהשגת תוצאות חזותיות איכותיות במקום בתוצאות כמותיות. גישה חלופית נוספת היא להשתמש בשיטה דומה לזו המתוארת בפרוטוקול זה כדי להכין פפטידים ולדגור עליהם עם תאים ולאחר מכן לצלחת את תכולת הבארות על אגר כדי לספור את מספר CFUs ולכמת את ההשפעה של הפפטידים. כפי שצוין בסעיף התוצאות המייצגות, שימוש זה ב- OD600 למדידת גדילת תאים בפרוטוקול זה מפחית באופן משמעותי את עומס הזמן בהשוואה לציפוי וספירה של CFU. ביטול הצורך בציפוי תכולת בארות על אגר מפחית גם את כמות פסולת הפלסטיק הנוצרת על ידי פרוטוקול בדיקת הפפטידים.

מספר היבטים של פרוטוקול זה חשובים להצלחתו. מאחר שפפטידים אנטי-מיקרוביאליים קטיוניים רבים מתפקדים פחות טוב בריכוזי מלחים פיזיולוגיים בבדיקות שבוצעו במבחנה 8,32,33,34, נבחר מאגר NaPB של 1 מילימטר לבדיקה זו. בנוסף, הפפטידים ותאי C. albicans מודגרים לזמן קצר (30 דקות) בחיץ ולא זמן רב במדיום גדילה. זה מקטין את פוטנציאל הצמיחה והחלוקה של התאים, מה שישפיע על הכימות הבא של התאים בני קיימא שנותרו לאחר הדגירה עם הפפטידים. לאחר הדגירה של הפפטידים עם התאים, הבארות מדוללות כדי להפחית את ריכוז הפפטיד ובכך להקטין את הפוטנציאל להמשך פעילות אנטי פטרייתית מעבר לדגירה הרצויה של 30 דקות35. הפוטנציאל להמשך פעילות הפפטידים מצטמצם עוד יותר על ידי העברת תמיסת התא-פפטיד לצלחת המכילה תווך YPD; פפטידים רבים מאבדים את פעילותם בתווך YPD (נתונים שלא פורסמו), אולי בגלל נוכחותם של קטיונים חד-ערכיים ודו-ערכיים, אשר ידועים כמפחיתים את פעילותם של חלק מהפפטידים האנטי-מיקרוביאליים 6,7,34,36. עם זאת, היעדר פעילות במדיום YPD אינו הכרחי להצלחת הפרוטוקול. לבסוף, תאי C. albicans גדלים ב 30 ° C עבור השלבים הרלוונטיים בפרוטוקול. על ידי גידול התאים בטמפרטורה זו, התאים צריכים להיות בעיקר במורפולוגיה של שמרים, אשר חשובה לקבלת הערכות מדויקות של מספר התאים בשלב 2 ושלב 4 ולכימות אמין של הפחתת הכדאיות בשלב 6.

משתמשים עלולים להיתקל באתגרים במהלך פרוטוקול זה, כולל זיהום עם אורגניזמים מיקרוביאליים לא רצויים או אידוי של נוזל מהבארות בשולי צלחת 96 הקידוחים. הפרוטוקול כולל בארות לבקרות סטריליות כדי לזהות אם התרחש זיהום; זיהום פוסל את תוצאות הבדיקה. אם המשתמשים מבחינים בזיהום, יש להקפיד לוודא שכל המאגרים והמדיה מעוקרים כראוי וכי נעשה שימוש בטכניקה סטרילית נכונה בעת פיפטינג37. עבודה בארון בטיחות ביולוגית תפחית גם את פוטנציאל הזיהום. אידוי נוזלים מבארות הקצה של לוחות 96 בארות הוא אתגר ידוע עם לוחות מיקרוטיטר38 ועלול להשפיע על תוצאות פרוטוקול זה. בעוד שזמן הדגירה הקצר של התאים עם הפפטיד בשלב 5.3 לא צפוי להוביל לבעיות עם השפעות קצה, הדגירה הארוכה יותר של התאים הנותרים בשלב 5.6 עלולה להוביל לשמירה על אידוי. אם נצפה אידוי, שימוש בלוחות שונים של 96 בארות או מילוי החלל סביב הבארות במים עשויים להפחית את האידוי38. משתמשים יכולים גם לשקול לא להשתמש בשורה A ובשורה H ובעמודה 1 ובעמודה 12 של הלוח כדי להשיג נתונים, ובמקום זאת למלא אותם במים, בינוניים או חיץ.

שינויים בהיבטים רבים של הפרוטוקול אפשריים. לדוגמה, ניתן להשתמש בחיץ (או מדיום) אחר בעת הדגירה של התאים והפפטידים יחד (שלבים 4-5.3), או מדיום תרבית פטרייתי אחר יכול לשמש לגדילת תאים לאחר הדגירה עם הפפטידים (שלבים 5.4-5.6). השימוש במאגרים ובמדיה חלופיים עשוי לאפשר השוואת ביצועים עם שיטות אחרות שפורסמו בספרות או עם תקן CLSI18 ויהיה חשוב לבדיקת פפטידים בתנאים המחקים את השימוש המיועד שלהם in vivo . שינוי נוסף שחלק מהמשתמשים עשויים למצוא מועיל הוא לדלל את הפפטידים לאורך שורות הצלחת ולא לאורך העמודות. שינוי הכיוון יפחית את מספר הריכוזים שניתן לבדוק עבור פפטיד נתון, אך הוא יאפשר לבדוק יותר פפטידים בצלחת אחת, מה שיכול להיות שימושי עבור ניסויים הדורשים בדיקה של מספר רב של פפטידים שונים.

חשוב לקבל נתוני העתקה עבור כל פפטיד שנבדק בפרוטוקול זה. הכללת העתקים טכניים ביום נתון של בדיקות מאפשרת להבין את השונות של הפרוטוקול. בנוסף, ביצוע שכפולים ביולוגיים חשוב כדי להבין את השונות משונות אקראית בגדילת תאים. מעבדת המחברים משיגה בדרך כלל לפחות שש נקודות נתונים משוכפלות עבור פפטיד נתון. הבדיקה מתבצעת על מינימום של 2 ימים שונים, ומינימום של שני עותקים טכניים כלולים בכל יום. בדרך כלל, שלושה עותקים משוכפלים מבוצעים בכל אחד משני ימים שונים או שני עותקים משוכפלים בכל אחד משלושה ימים שונים. איור 3 מראה כי פרוטוקול זה מפיק נתונים עקביים עם סטיות תקן קטנות כאשר הוא מבוצע כראוי.

אופיו הפשוט של פרוטוקול זה מאפשר להתאים אותו לשימוש בניסויים רבים שאינם מתוארים ישירות בפרוטוקול. לדוגמה, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לבדיקת שמרים אחרים, כולל מיני קנדידה אחרים. עם זאת, הוא אינו מתאים היטב למינים נימיים או למינים דימורפיים הגדלים במורפולוגיה הנימית שלהם. הפרוטוקול יכול להיות מותאם גם לשימוש עם חומרים אנטי פטרייתיים שאינם פפטידים, כגון תרופות במולקולות קטנות, או תערובות של פפטידים שונים או מקטעי פפטידים. לדוגמה, פרוטוקולים דומים שימשו בעבר לבדיקת תרופות של מולקולות קטנות, כולל אמפוטריצין B, פלוקונזול וקספונגין, כנגד שמרי היסטופלזמה 39. המחברים השתמשו בפרוטוקול כדי להשוות את הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים לא מפורקים עם מאגרים של מקטעי פפטידים שנוצרו על ידי פרוטאוליזה של הפפטיד17,22. הרחבה נוספת של פרוטוקול זה תהיה לחקור את הקינטיקה של הפעילות האנטי פטרייתית של AMPs. פרוטוקול זה משתמש בזמן דגירה של 30 דקות עבור הפפטידים כדי להפעיל את הפעילות האנטי פטרייתית שלהם, אבל זמני דגירה קצרים או ארוכים יותר יכולים לשמש כדי לקבוע טוב יותר את הזמן הדרוש לפפטידים כדי להפחית את הכדאיות של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03DE029270, T32AI089621B), הקרן הלאומית למדע (CBET 1511718), מחלקת החינוך (GAANN-P200A180093), ומענק זרעים חוצה קמפוסים של אוניברסיטת מרילנד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates (round bottom) VWR 10062-902
Absorbance microplate reader N/A N/A Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314 ATCC  MYA-2876 Other C. albicans may also be used
Hemocytometer N/A N/A Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker VWR 2620-926
Peptide(s) N/A N/A Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors VWR 18900-320 Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic Fisher Scientific BP332-500 For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific BP329-500 For making NaPB
UV spectrophotometer N/A N/A Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder BD Life Sciences 242820 May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Tags

ביולוגיה גיליון 191 קנדידה אלביקנס פפטידים פפטידים מיקרוביאליים אנטי פטרייתי בדיקת רגישות שמרים צפיפות אופטית
כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד <em>קנדידה אלביקנס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P.,… More

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P., Karlsson, A. J. Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans. J. Vis. Exp. (191), e64416, doi:10.3791/64416 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter