Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करना

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64416
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Summary

यह प्रोटोकॉल कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ पेप्टाइड्स और अन्य यौगिकों, जैसे छोटे अणु एंटिफंगल एजेंटों की एंटिफंगल गतिविधि पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विकास अवरोध को मापने के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गणना के बजाय ऑप्टिकल घनत्व का इसका उपयोग समय और संसाधनों को बचाता है।

Abstract

कैंडिडा अल्बिकन्स के लिए एंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण करने के पारंपरिक तरीके समय लेने वाले हैं और मात्रात्मक परिणामों की कमी है। उदाहरण के लिए, एक सामान्य दृष्टिकोण आगर प्लेटों पर एंटिफंगल अणुओं की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज की जाने वाली प्लेटिंग कोशिकाओं पर निर्भर करता है और फिर अणु एकाग्रता और विकास निषेध के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए कॉलोनियों की गिनती करता है। इस विधि को कॉलोनियों की गिनती के लिए कई प्लेटों और पर्याप्त समय की आवश्यकता होती है। एक और सामान्य दृष्टिकोण विकास को रोकने के लिए आवश्यक न्यूनतम एकाग्रता की पहचान करने के लिए एंटिफंगल एजेंटों के साथ इलाज की गई संस्कृतियों का नेत्रहीन निरीक्षण करके प्लेटों और कॉलोनियों की गिनती को समाप्त करता है; हालांकि, दृश्य निरीक्षण केवल गुणात्मक परिणाम उत्पन्न करता है, और उप-निरोधात्मक सांद्रता में विकास पर जानकारी खो जाती है। यह प्रोटोकॉल एंटीफंगल पेप्टाइड्स के लिए सी अल्बिकन्स की संवेदनशीलता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व माप पर भरोसा करके, विधि विभिन्न पेप्टाइड सांद्रता पर संस्कृति विकास पर मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय और सामग्री को कम करती है। पेप्टाइड्स के साथ कवक का इनक्यूबेशन एक उपयुक्त बफर का उपयोग करके 96-वेल प्लेट में किया जाता है, जिसमें नियंत्रण कोई विकास निषेध और पूर्ण विकास निषेध का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। पेप्टाइड के साथ इनक्यूबेशन के बाद, परिणामस्वरूप सेल निलंबन पेप्टाइड गतिविधि को कम करने के लिए पतला हो जाता है और फिर रात भर उगाया जाता है। रात भर के विकास के बाद, प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व को मापा जाता है और प्रत्येक पेप्टाइड एकाग्रता पर परिणामी विकास अवरोध की गणना करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना की जाती है। इस परख का उपयोग करने वाले परिणाम आगर प्लेटों पर संस्कृतियों को चढ़ाने की पारंपरिक विधि का उपयोग करने वाले परिणामों के बराबर हैं, लेकिन यह प्रोटोकॉल प्लास्टिक कचरे और कॉलोनियों की गिनती पर खर्च किए गए समय को कम करता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों ने एंटिफंगल पेप्टाइड्स पर ध्यान केंद्रित किया है, विधि ज्ञात या संदिग्ध एंटिफंगल गतिविधि वाले अन्य अणुओं के परीक्षण पर भी लागू होगी।

Introduction

कैंडिडा अल्बिकन्स मानव माइक्रोबायोटा का एक सदस्य है जो मौखिक गुहा, त्वचा, जठरांत्र संबंधी मार्ग और योनि1 सहित कई स्थानों को उपनिवेशित करता है। उन रोगियों के लिए जो मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) और इम्यूनोसप्रेसिव उपचार जैसी बीमारियों के कारण इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड हैं, सी अल्बिकन्स के उपनिवेशीकरण से स्थानीय या प्रणालीगत कैंडिडिआसिस 2,3 हो सकता है। वर्तमान में उपलब्ध छोटे-अणु एंटिफंगल चिकित्सीय, जैसे एम्फोटेरिसिन बी, एज़ोल्स, या एचिनोकैंडिन का उपयोग, घुलनशीलता और विषाक्तता के मुद्दों और चिकित्सीय 4,5 के लिए संक्रमण के प्रतिरोध से जटिल हो सकता है। वर्तमान एंटिफंगल एजेंटों की सीमाओं के कारण, शोधकर्ता लगातार सी अल्बिकन्स के खिलाफ गतिविधि के साथ नए एंटिफंगल अणुओं की खोज कर रहे हैं।

रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी) वर्तमान छोटे-अणु एंटिफंगलएजेंट6,7,8 के लिए एक संभावित विकल्प हैं और छोटे-अणु दवाओं की तुलना में प्रतिरोध के विकास के लिए कम संवेदनशील होने का प्रस्तावहै। एएमपी पेप्टाइड्स का एक विविध सेट है, लेकिन वे अक्सर धनिक होते हैं, जिसमें गतिविधि10,11,12 का व्यापक स्पेक्ट्रम होता है। अल्बिकन्स के खिलाफ गतिविधि वाले एएमपी में हिस्टोटिन और सेक्रोपिन परिवारों13,14,15 से प्रसिद्ध पेप्टाइड्स शामिल हैं, साथ ही हाल ही में वर्णित पेप्टाइड्स जैसे टीओएपी 2, एनडीबीपी -5.7, और हिस्टाटिन 5 संस्करण के 11 आर-के 17 आर 16,17। कैंडिडा संक्रमण के इलाज के लिए उनकी क्षमता के कारण, सी अल्बिकन्स को लक्षित करने वाले नए एएमपी की पहचान करना और डिजाइन करना कई शोध समूहों के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है।

प्रभावी एएमपी (और अन्य एंटिफंगल एजेंट) विकसित करने की प्रक्रिया के हिस्से के रूप में जो सी अल्बिकन्स को लक्षित करते हैं, इन विट्रो परीक्षण का उपयोग आमतौर पर आशाजनक पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए किया जाता है। अल्बिकन्स के खिलाफ एंटिफंगल गतिविधि का परीक्षण करने के तरीकों में आमतौर पर 96-वेल प्लेटों में एएमपी (बफर या मध्यम में) के सीरियल कमजोर पड़ने वाली कोशिकाओं को शामिल किया जाता है। इनक्यूबेशन के बाद एंटिफंगल गतिविधि का आकलन करने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। नैदानिक प्रयोगशाला मानक संस्थान द्वारा वर्णित एक तकनीक विकास के पूर्ण निषेध के लिए न्यूनतम एकाग्रता (एमआईसी) निर्धारित करने के लिए कुओं की टर्बिडिटी के विशुद्ध रूप से दृश्य मूल्यांकन का उपयोग करती है (चयनित एंटिफंगल एजेंटों के लिए कम से कम 50% अवरोध, जैसे एज़ोल्स और एचिनोकैंडिन) और उप-एमआईसी सांद्रता18 पर विकास का कोई परिमाणीकरण प्रदान नहीं करता है। . एक अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले दृष्टिकोण में एएमपी के साथ इनक्यूबेशन के बाद व्यवहार्यता को निर्धारित करना शामिल है, जिसमें आगर प्लेटों पर कुओं की सामग्री चढ़ाना, प्लेटों को इनक्यूबेट करना और फिर प्लेट पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की संख्या की गणना करना शामिल है। इस विधि का उपयोग कई पेप्टाइड्स के मूल्यांकन के लिए किया गया है, जिसमें हिस्टैटिन 5-आधारित पेप्टाइड्स, एलएल -37 और मानव लैक्टोफेरिन 19,20,21 शामिल हैं। इस तकनीक के लिए अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में आगर और प्लेटों की एक उच्च संख्या की आवश्यकता होती है और इसमें प्लेटों पर सीएफयू की थकाऊ गिनती शामिल होती है। कम प्लास्टिक कचरे को उत्पन्न करते समय अधिक मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने और सीएफयू की गिनती से बचने के लिए, कुओं की सामग्री का उपयोग एक और 96-वेल प्लेट में ताजा माध्यम को टीका लगाने के लिए किया जा सकता है। नई टीका प्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद, अवशोषण प्लेट रीडर पर 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर विकास की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस विधि का उपयोग हिस्टाटिन 5 की एंटिफंगल गतिविधि और इसके अवक्रमण टुकड़े और सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स 17,22,23,24,25 को निर्धारित करने के लिए किया गया है।

यह प्रोटोकॉल बताता है कि पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि का परीक्षण कैसे किया जाए और पेप्टाइड्स के कारण सी अल्बिकन्स की व्यवहार्यता में कमी को निर्धारित करने के लिए ओडी600 विधि का उपयोग किया जाए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल (पीएन 274) में सी अल्बिकन्स के साथ काम करने के लिए मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क, संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) से अनुमोदन प्राप्त किया गया था। वर्तमान अध्ययन में सी अल्बिकन्स स्ट्रेन एससी 5314 ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था; हालांकि, किसी अन्य तनाव का भी उपयोग किया जा सकता है।

1. बफर, बाँझ पानी और संस्कृति माध्यम की तैयारी

  1. पीएच 7.4 पर बाँझ 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (एनएपीबी) 26 तैयार करें, और बाँझ पानी के साथ 2 एमएम और 1 एमएम तक पतला करें। 2 mM NaPB और 1 mM NaPB में से प्रत्येक में 100 एमएल तैयार करना इस प्रोटोकॉल के अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त से अधिक होगा।
  2. बाँझ तरल खमीर-पेप्टोन-डेक्सट्रोज (वाईपीडी, सामग्री की तालिका देखें) माध्यम (10 ग्राम / एल खमीर निकालने, 20 ग्राम / एल डेक्सट्रोज, 20 ग्राम / एल पेप्टोन) तैयार करें। वाईपीडी के 100 एमएल तैयार करना इस प्रोटोकॉल के अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त से अधिक होगा।
  3. बाँझ अल्ट्राप्योर पानी तैयार करें। 100 एमएल पानी तैयार करना इस प्रोटोकॉल के अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त से अधिक होगा।
    नोट: बफर, मीडिया और पानी को 121 डिग्री सेल्सियस पर तरल चक्र पर आटोक्लेविंग द्वारा उचित समय के लिए निष्फल किया जाता है, जो कंटेनरों में मात्रा के आधार परहोता है। उदाहरण के लिए, 500 एमएल वाली बोतलों के लिए, एक्सपोजर समय 40 मिनट होना चाहिए।

2. सी अल्बिकन्स का टीकाकरण, संवर्धन और उप-संवर्धन

अल्बिकन्स के साथ काम करने के लिए सभी संस्थागत और सरकारी नियमों का पालन करें, जिसे अक्सर अकादमिक अनुसंधान संस्थानों द्वारा दवा प्रतिरोध की परवाह किए बिना जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) 2 जीव के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी) द्वारा बीएसएल 1 या बीएसएल 2 जीव के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जो तनाव28 के दवा प्रतिरोध पर निर्भर करता है।

नोट: एंटिफंगल गतिविधि के लिए परीक्षण शुरू करने से पहले दिन इस चरण (चरण 2.1-2.2) के टीकाकरण और संवर्धन भागों का प्रदर्शन करें। यदि संभव हो, तो जैव सुरक्षा कैबिनेट में कोशिकाओं (और कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किए जाने वाले समाधान) के साथ सभी प्रोटोकॉल चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. एक कल्चर ट्यूब में 10 एमएल वाईपीडी माध्यम में वांछित सी अल्बिकन्स तनाव को टीका लगाएं।
    नोट: संस्कृति को फ्रीजर स्टॉक से या एगर प्लेट से टीका लगाया जा सकता है, लेकिन तुलना किए जाने वाले सभी डेटा के लिए एक सुसंगत स्रोत का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. संस्कृति को रात भर (~ 12-16 घंटे) 30 डिग्री सेल्सियस और 230 आरपीएम पर रोटरी शेकर पर उगाएं।
  3. उपसंस्कृति सी अल्बिकन्स की रातोंरात संस्कृति है, और ~ 1.0-1.2 के ओडी600 तक बढ़ती है।
    1. यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके रात भर की संस्कृति के ओडी600 को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. रातोंरात संस्कृति के ओडी600 के आधार पर, वाईपीडी के 10 एमएल में 0.1 के ओडी600 पर एक उपसंस्कृति को टीका लगाने के लिए रात भर की संस्कृति का उपयोग करें।
    3. 230 आरपीएम पर रोटरी शेकर पर 30 डिग्री सेल्सियस पर उपसंस्कृति उगाएं जब तककि ओडी 600 ~ 1.0-1.2 तक नहीं पहुंच जाता है, जिसमें 4-6 घंटे लगने की संभावना है। पूर्ण चरण 3 (पेप्टाइड समाधान की तैयारी) जबकि उपसंस्कृति बढ़ रही है; चरण 4 में परख में उपयोग के लिए उपसंस्कृति को पतला किया जाएगा।

3. 96-वेल प्लेट में पेप्टाइड समाधान की तैयारी

नोट: यह कदम समय से पहले किया जा सकता है, अगर भंडारण के दौरान पेप्टाइड स्टॉक समाधान स्थिर हैं। आमतौर पर, पेप्टाइड समाधान उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होते हैं। उन्हें अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान पानी के स्नान में पिघलाया जा सकता है।

  1. परख में परीक्षण किए जाने वाले प्रत्येक पेप्टाइड की उच्चतम सांद्रता निर्धारित करें। यह चयनित पेप्टाइड्स के आधार पर अलग-अलग होगा। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत डेटा के लिए, हिस्टाटिन 5 और इंजीनियर एनालॉग्स 22 का परीक्षण किया गया था, और परीक्षण की गई उच्चतम एकाग्रता 50 μM थी।
    नोट: परीक्षण की जाने वाली उच्चतम एकाग्रता साहित्य में रिपोर्ट किए गए डेटा का उपयोग करके या पेप्टाइड सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर प्रारंभिक प्रयोग करके निर्धारित की जाती है। जब संभव हो, परीक्षण की गई उच्चतम सांद्रता पर व्यवहार्यता में पूर्ण कमी के लिए एक पठार का निरीक्षण करने के लिए उच्चतम एकाग्रता का चयन किया जाना चाहिए और परीक्षण की गई सबसे कम सांद्रता पर व्यवहार्यता में कोई कमी नहीं होने के लिए एक पठार, जिससे पेप्टाइड गतिविधि की पूरी श्रृंखला का परिमाणीकरण हो सके।
  2. प्रत्येक पेप्टाइड को बाँझ पानी में वांछित उच्चतम सांद्रता से दोगुना घोलें। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत आंकड़ों के लिए, 100 μM के 150 μL हिस्टैटिन 5 और इंजीनियर एनालॉग्स को बाँझ पानी में तैयार किया गया था।
    नोट: यदि एक पेप्टाइड पानी में घुलनशील नहीं है, तो इस चरण से पहले दूसरे विलायक में घुलनशीलता आवश्यक हो सकती है। डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) का उपयोग आमतौर पर कार्यशील एकाग्रता को पतला करने से पहले पेप्टाइड्स को उच्च एकाग्रता पर घुलनशील करने के लिए किया जाता है। सुनिश्चित करें कि डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 1% (वी / वी) याकम 29 है और वैकल्पिक सॉल्वैंट्स कोशिकाओं के विकास को प्रभावित नहीं करते हैं। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि चरण 3.4-3.5 में सभी कुओं में विलायक एकाग्रता स्थिर रखी गई है।
  3. 96-अच्छी तरह से, गोल-तल वाली संस्कृति प्लेट में प्रत्येक पंक्ति के पहले कुएं (कॉलम 1) में वांछित पेप्टाइड स्टॉक समाधानों का 40 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह प्लेट प्लेट 1 (चित्रा 1) है।
    नोट: प्रत्येक प्लेट में आठ पंक्तियाँ होती हैं जिनका उपयोग पेप्टाइड्स के परीक्षण के लिए किया जाता है। इन पंक्तियों का उपयोग विभिन्न पेप्टाइड्स के लिए या एक ही पेप्टाइड्स की प्रतिकृति के लिए किया जा सकता है। प्रत्येक पंक्ति में केवल एक पेप्टाइड शामिल करें।
  4. पेप्टाइड युक्त पंक्तियों के कॉलम 2 से कॉलम 12 में बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के 20 μL जोड़ें (चित्रा 1)।
    नोट: यदि पेप्टाइड स्टॉक चरण 3.2 में शुद्ध पानी के अलावा एक विलायक के साथ तैयार किए गए थे, तो इस चरण में बाँझ पानी को पहले कॉलम में जोड़े गए पेप्टाइड स्टॉक में मौजूद विलायक के साथ बदल दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि पेप्टाइड को डीएमएसओ में घुलनशील किया गया था और पेप्टाइड स्टॉक में पानी में 1% (वी / वी) डीएमएसओ होता है, तो कॉलम 2 से कॉलम 12 में 1% डीएमएसओ युक्त पानी जोड़ा जाना चाहिए।
  5. प्लेट में पेप्टाइड स्टॉक समाधानों को क्रमबद्ध रूप से कॉलम 10 (चित्रा 1) में पतला करें।
    नोट: नीचे वर्णित प्लेट में सीरियल कमजोर पड़ने के बजाय, कमजोर पड़ने को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में भी किया जा सकता है और 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया जा सकता है।
    1. कॉलम 1 से 20 μL निकालें, इसे कॉलम 2 में स्थानांतरित करें, और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। कॉलम 2 में अब कॉलम 1 में एकाग्रता के 1: 2 कमजोर पड़ने पर पेप्टाइड समाधान का 40 μL होता है।
    2. कॉलम 2 से 20 μL निकालें, इसे कॉलम 3 में स्थानांतरित करें, और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, इसलिए कॉलम 3 में अब कॉलम 1 में एकाग्रता के 1: 4 कमजोर पड़ने पर पेप्टाइड समाधान का 40 μL है।
    3. इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि कॉलम 10 में कॉलम 1 में एकाग्रता के 1:512 कमजोर पड़ने पर पेप्टाइड समाधान का 40 μL न हो।
    4. कॉलम 10 से पेप्टाइड समाधान के 20 μL निकालें और इसे छोड़ दें। प्रत्येक कॉलम में अब पेप्टाइड समाधान (कॉलम 1-10) या पानी (कॉलम 11 और कॉलम 12) के 20 μL होते हैं।
      नोट: कॉलम 11 में कुएं बाँझपन नियंत्रण के रूप में काम करते हैं, और कॉलम 12 में कुएं बिना पेप्टाइड वाले नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।

4. सी अल्बिकन्स उपसंस्कृति का कमजोर पड़ना

नोट: उपसंस्कृति ~ 1.0-1.2 (चरण 2.3.3) के ओडी600 तक पहुंचने के बाद इस चरण को शुरू करें।

  1. उपसंस्कृति को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 3,900 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को पाइपिंग या डिकेंट करके हटा दें।
  2. 2 mM NaPB (चरण 1.1) के 1 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें, और निलंबन को 1.7 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. कोशिकाओं को गोली मार दें (चरण 4.1 में), सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और फिर से 2 mM NaPB के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. 2 mM NaPB के 1 एमएल में धुली हुई कोशिकाओं को छोड़ने के लिए चरण 4.3 को दो अतिरिक्त बार दोहराएं।
  5. धुले हुए निलंबन के सेल घनत्व का निर्धारण करें, और 5 x 105 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने वाले कारक की गणना करें। यह एकाग्रता अंततः 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 x 104 कोशिकाओं को जोड़ने का कारण बनेगी।
    नोट: निलंबन का सेल घनत्व कई तरीकों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन के लिए प्रासंगिक परिस्थितियों में उगाए गए रुचि के तनाव के लिए सेल घनत्व बनाम ओडी600 का एक मानक वक्र उपयोग किया गया था। यह वक्र अलग-अलग ओडी600 मानों के साथ निलंबन के सेल घनत्व को निर्धारित करने के लिए हेमोसाइटोमीटर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके तैयार किया गया था।
  6. सेल निलंबन को 2 mM NaPB में 5 x 105 कोशिकाओं / mL तक पतला करें। इस पतला निलंबन के 10 एमएल तैयार करना इस अध्ययन को पूरा करने के लिए पर्याप्त से अधिक होगा।

5. पेप्टाइड समाधान के साथ सी अल्बिकन्स की इनक्यूबेशन और व्यवहार्यता की मात्रा का परिमाणीकरण के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. प्रत्येक पंक्ति के कॉलम 1-10 और कॉलम 12 में पतला सी अल्बिकन्स सस्पेंशन (चरण 4.6) का 20 μL जोड़ें (चित्रा 1)।
    नोट: पहले कॉलम में अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता अब पेप्टाइड स्टॉक एकाग्रता का आधा है। वर्तमान अध्ययन के लिए, इस बिंदु पर अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता 50 μM थी। प्रत्येक कुएं में अंतिम सेल निलंबन में 2.5 x 105 कोशिकाएं / कॉलम 1-10 विभिन्न पेप्टाइड सांद्रता पर एंटिफंगल गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगात्मक कुओं के रूप में काम करते हैं, और कॉलम 12 बिना पेप्टाइड के विकास के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
  2. कॉलम 11 में 2 mM NaPB का 20 μL जोड़ें। सभी कुओं में अब 1 mM NaPB की अंतिम सांद्रता है। कॉलम 11 बाँझपन नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
  3. कवर प्लेट 1 (कोशिकाओं और पेप्टाइड दोनों से युक्त), और इसे 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: 30 मिनट का इनक्यूबेशन समय कई पेप्टाइड्स17,21,22,30 के लिए पर्याप्त है, लेकिन पेप्टाइड्स के लिए वांछित होने पर इनक्यूबेशन समय को 60 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है, जिन्हें अपनी एंटिफंगल गतिविधि 25,31,32 को बढ़ाने के लिए अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है।
  4. व्यवहार्यता को निर्धारित करने में उपयोग के लिए एक नई 96-वेल कल्चर प्लेट (प्लेट 2) तैयार करें (चित्रा 2)।
    नोट: संस्कृति प्लेट प्लेट 1 के इनक्यूबेशन के दौरान तैयार किया जाना चाहिए।
    1. प्लेट के सभी कुओं में 100 μL YPD (चरण 1.2) जोड़ें।
    2. प्लेट के सभी कुओं में 2 mM NaPB (चरण 1.1) का 100 μL जोड़ें।
  5. प्लेट 1 (कोशिकाओं और पेप्टाइड्स युक्त) में नमूनों को पतला करें, और प्लेट 2 (मध्यम और बफर युक्त) में स्थानांतरित करें।
    1. इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद इनक्यूबेटर से प्लेट 1 पुनर्प्राप्त करें।
    2. प्लेट 1 के प्रत्येक कुएं में 320 μL की कुल मात्रा के लिए 1 mM NaPB (चरण 1.1) के 280 μL जोड़कर प्रत्येक कुएं को पतला करें (चित्र 2)।
    3. कोशिकाओं और पेप्टाइड्स युक्त सभी कुओं को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी कोशिकाएं फिर से निलंबित हो जाएं और कुओं के तल पर कोई स्थिर कोशिकाएं दिखाई न दें।
    4. प्लेट 1 में प्रत्येक कुएं से प्लेट 2 के संबंधित कुएं में 8 μL स्थानांतरित करें। यह मात्रा प्लेट 1 के प्रत्येक कुएं से लगभग 250 कोशिकाओं को प्लेट 2 (चित्रा 2) में स्थानांतरित करती है।
  6. प्लेट 2 को कवर करें और 30 डिग्री सेल्सियस पर 17 घंटे के लिए 350 आरपीएम पर माइक्रोटिटर प्लेट शेकर ( सामग्री की तालिका देखें) पर इनक्यूबेट करें।

Figure 1
चित्रा 1: कोशिकाओं के साथ पेप्टाइड सीरियल कमजोर पड़ने के इनक्यूबेशन के लिए प्लेट 1 की तैयारी। पेप्टाइड के सीरियल कमजोर पड़ने को पानी में बनाया जाता है, और सी अल्बिकन्स कोशिकाओं को प्लेट 1 में जोड़ा जाता है। एक नीला रंग इंगित करता है कि पेप्टाइड कुएं में मौजूद है, और ग्रे पानी के साथ एक कुएं को इंगित करता है और कोई पेप्टाइड नहीं है। कुओं युक्त कोशिकाओं को काले बिंदुओं के पैटर्न के साथ इंगित किया जाता है। इन चरणों के बाद, पेप्टाइड को अपनी एंटिफंगल गतिविधि को बढ़ाने की अनुमति देने के लिए प्लेट को इनक्यूबेट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पेप्टाइड के कारण व्यवहार्यता में कमी को निर्धारित करने के लिए प्लेट 2 की तैयारी। प्लेट 2 में वाईपीडी माध्यम और एनएपीबी जोड़े जाते हैं। प्लेट 1 की सामग्री को पतला करने के बाद, प्रत्येक कुएं से एक एलिकोट को प्लेट 1 से प्लेट 2 में स्थानांतरित किया जाता है। प्लेट 2 को तब ओडी600 को मापकर परिमाणीकरण के लिए किसी भी व्यवहार्य कोशिकाओं को बढ़ने की अनुमति देने के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। प्लेट 2 के लिए, केवल वाईपीडी और एनएपीबी वाले कुओं को नारंगी रंग में दिखाया गया है। वाईपीडी और एनएपीबी के साथ मिश्रित प्लेट 1 से एलिकोट युक्त कुओं को हरे रंग में दिखाया गया है। प्लेट 1 पर रंगों के विवरण के लिए चित्रा 1 किंवदंती देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. एंटिफंगल गतिविधि का निर्धारण

  1. प्लेट 2 में प्रत्येक कुएं के लिए ओडी600 रीडिंग प्राप्त करें।
    1. इनक्यूबेशन के 17 घंटे के बाद इनक्यूबेटर से प्लेट 2 को हटा दें।
    2. प्लेट 2 में सभी कुओं को ऊपर और नीचे करके मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी कोशिकाएं फिर से निलंबित हो जाएं और कुओं के तल पर कोई स्थिर कोशिकाएं दिखाई न दें।
      नोट: इस चरण के दौरान बुलबुले उत्पन्न करने से बचें, क्योंकि वे ओडी600 रीडिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं। यदि बुलबुले बनते हैं, तो उन्हें अक्सर सूखे पिपेट टिप के साथ पॉप किया जा सकता है या उन्हें कुएं से बाहर निकालने के लिए दो पिपेट युक्तियों का उपयोग करके हटाया जा सकता है।
    3. प्रत्येक कुएं केलिए ओडी 600 प्राप्त करने के लिए 600 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक अवशोषण प्लेट रीडर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
  2. विकास के अवरोध की गणना करें (प्रतिशत के रूप में), और सी अल्बिकन्स के विकास पर पेप्टाइड्स के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इसे प्लॉट करें।
    1. प्रत्येक कुएं के लिए, निम्नलिखित समीकरण 17,22,23 का उपयोग करके नियंत्रण (प्रतिशत के रूप में) की तुलना में व्यवहार्यता में कमी की गणना करें:
      Equation 1
      जहां पेप्टाइड के साथ ओडी पेप्टाइड की दी गई एकाग्रता वाले कुएं का ओडी600 है, ओडीपृष्ठभूमि उसी पंक्ति में कॉलम 11 का ओडी600 है (नियंत्रण जिसमें कोई कोशिका नहीं है), और
      ओडीनो पेप्टाइड एक ही पंक्ति में कॉलम 12 का ओडी600 है (कोशिकाओं और कोई पेप्टाइड युक्त नियंत्रण)।
    2. उदाहरण के लिए, पंक्ति बी के लिए ओडी600 मानों से वेल बी 5 में व्यवहार्यता में कमी की गणना करने के लिए निम्नलिखित अभिव्यक्ति का उपयोग करें:
      Equation 2
  3. पेप्टाइड एकाग्रता के कार्य के रूप में व्यवहार्यता में कमी को प्लॉट करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एंटिफंगल पेप्टाइड्स के कारण विकास में कमी को मापने के लिए ओडी600 माप का उपयोग करने से नमूने चढ़ाना और सीएफयू की गिनती की तुलना में पर्याप्त समय बचता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि को तीन अलग-अलग दिनों में चरणों को पूरा करने की आवश्यकता होती है। पहले दिन, बफर और मीडिया (नसबंदी समय सहित नहीं) तैयार करने और रात भर के इनक्यूबेशन के लिए सी अल्बिकन्स की शुरुआती संस्कृति को टीका लगाने के लिए लगभग 1 घंटे की आवश्यकता होती है। दूसरे दिन, 17 घंटे की इनक्यूबेशन के लिए 96-वेल प्लेट तैयार करने के लिए चरणों को 5-6 घंटे (उप-संवर्धन समय सहित) की आवश्यकता होती है। तीसरे दिन, चरणों को 1 घंटे से भी कम समय में पूरा किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के जिस हिस्से में व्यवहार्यता पर मात्रात्मक डेटा एकत्र करना शामिल है, उसे लगभग 30 मिनट के काम की आवश्यकता होती है (साथ ही इनक्यूबेशन का 17 घंटे)। इसके विपरीत, एगर पर नमूने चढ़ाना और प्रत्येक 96-वेल प्लेट की सामग्री की एकल प्रतिकृति के लिए सीएफयू की गिनती करने के लिए 3 घंटे से अधिक काम (प्लस 24 घंटे इनक्यूबेशन) की आवश्यकता होगी, जिसके परिणामस्वरूप इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके व्यवहार्यता की मात्रा का निर्धारण पूरा करने के लिए 2.5 घंटे कम समय की आवश्यकता होगी। यदि एक प्रयोग में कई 96-वेल प्लेटों की आवश्यकता होती है तो इन समय बचत को बढ़ाया जाएगा।

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग हिस्टाटिन 5 की एंटिफंगल गतिविधि और लाइसिन अवशेषों में संशोधन वाले हिस्टैटिन 5 के कई रूपों की परख के लिए किया गया था। चरण 5 में सी अल्बिकन्स कोशिकाओं के साथ पेप्टाइड्स को इनक्यूबेट करने के बाद, एंटिफंगल गतिविधि को सीएफयू गिनती विधि और ओडी600 माप (चित्रा 3) को शामिल करने वाले वर्णित प्रोटोकॉल दोनों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, दो विधियों ने सभी पेप्टाइड्स के लिए समान परिणाम उत्पन्न किए, हालांकि प्रत्येक पेप्टाइड में दो तरीकों द्वारा निर्धारित व्यवहार्यता में कमी में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर के साथ एक एकाग्रता थी। इनमें से प्रत्येक मामले में, ओडी600 डेटा ने सीएफयू डेटा की तुलना में व्यवहार्यता में कम कमी दिखाई, यह दर्शाता है कि डेटा की तुलना करते समय एक ही विधि का उपयोग किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, ओडी600 रीडिंग का उपयोग करने वाला डेटा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, जैसा कि चित्रा 3 में प्रतिकृति के आम तौर पर छोटे मानक विचलन द्वारा इंगित किया गया है और इस प्रोटोकॉल 17,22,23,24,25 का उपयोग करके परिणाम प्रकाशित किए गए हैं।

Figure 3
चित्रा 3: सी अल्बिकन्स सेल विकास में कमी को निर्धारित करने के लिए पारंपरिक (सीएफयू) और वर्णित (ओडी) विधियों की तुलना। पेप्टाइड (ए) हिस्टाटिन 5 (एचएसटी -5) और हिस्टोटिन 5 (बी) के 5 आर, (सी) के 11 आर, (डी) के 13 आर, और (ई) के 17 आर (संकेतित अवशेषों पर लाइसिन से आर्जिनिन संशोधन के साथ) के वेरिएंट को सी अल्बिकन्स कोशिकाओं के साथ 50 μM से 0.20 μM की सांद्रता पर इनक्यूबेट किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। चरण 5.5.3 के बाद, नमूनों को आगर (प्रत्येक प्रयोग के लिए एक प्रतिकृति) पर चढ़ाना के लिए हटा दिया गया था या प्रोटोकॉल को जारी रखने के लिए एक नई प्लेट (प्रत्येक प्रयोग के लिए दो प्रतिकृतियां) में स्थानांतरित कर दिया गया था। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है (सीएफयू डेटा के लिए एन = 3 डेटा पॉइंट, ओडी डेटा के लिए एन = 6 डेटा पॉइंट), और त्रुटि पट्टियां डेटा के मानक विचलन को इंगित करती हैं। दो विधियों के बीच सांख्यिकीय अंतर की पहचान करने के लिए टुकी के कई तुलना परीक्षण (α = 0.05) के साथ विचरण (एनोवा) का दो-तरफ़ा विश्लेषण किया गया था। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर के साथ पेप्टाइड सांद्रता भूखंडों पर एक तारांकन (*) द्वारा नोट की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल फंगल रोगज़नक़ सी अल्बिकन्स के खिलाफ एएमपी की एंटिफंगल गतिविधि पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण का वर्णन करता है। पेप्टाइड्स और अन्य एंटिफंगल एजेंटों के परीक्षण के लिए एक आम वैकल्पिक दृष्टिकोण नैदानिक प्रयोगशाला मानक संस्थान (सीएलएसआई) मानक एम 2718 में वर्णित शोरबा माइक्रोडायल्यूशन है, लेकिन यह मानक मात्रात्मक परिणामों के बजाय गुणात्मक दृश्य परिणाम प्राप्त करने पर केंद्रित है। एक अन्य वैकल्पिक दृष्टिकोण पेप्टाइड्स तैयार करने और उन्हें कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि के समान एक विधि का उपयोग करना है और फिर सीएफयू की संख्या की गणना करने और पेप्टाइड्स के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एगर पर कुओं की सामग्री को प्लेट करना है। जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया गया है, इस प्रोटोकॉल में सेल वृद्धि को मापने के लिए ओडी600 का यह उपयोग प्लेटिंग और गिनती सीएफयू की तुलना में समय के बोझ को काफी कम कर देता है। आगर पर कुओं की सामग्री को प्लेट करने की आवश्यकता को समाप्त करने से पेप्टाइड-परीक्षण प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न प्लास्टिक कचरे की मात्रा भी कम हो जाती है।

इस प्रोटोकॉल के कई पहलू इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। चूंकि कई धनिक रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स विट्रो 8,32,33,34 में किए गए परीक्षणों में शारीरिक नमक सांद्रता में खराब प्रदर्शन करते हैं, इसलिए इस परख के लिए 1 एमएम एनएपीबी बफर का चयन किया गया था। इसके अतिरिक्त, पेप्टाइड्स और सी अल्बिकन्स कोशिकाओं को विकास माध्यम में लंबे समय के बजाय बफर में थोड़े समय (30 मिनट) के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। यह कोशिकाओं के संभावित विकास और विभाजन को कम करता है, जो पेप्टाइड्स के साथ इनक्यूबेशन के बाद शेष व्यवहार्य कोशिकाओं के बाद के परिमाणीकरण को प्रभावित करेगा। कोशिकाओं के साथ पेप्टाइड्स के इनक्यूबेशन के बाद, पेप्टाइड की एकाग्रता को कम करने के लिए कुओं को पतला किया जाता है, जिससे एंटिफंगल गतिविधि की क्षमता 30 मिनट इनक्यूबेशन35 से परे जारी रहती है। पेप्टाइड्स की निरंतर गतिविधि की क्षमता को सेल-पेप्टाइड समाधान को वाईपीडी माध्यम युक्त प्लेट में स्थानांतरित करके और कम कर दिया जाता है; कई पेप्टाइड्स वाईपीडी माध्यम (अप्रकाशित डेटा) में अपनी गतिविधि खो देते हैं, संभवतः मोनो- और डिवेलेंट पिंजरों की उपस्थिति के कारण, जो कुछ रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स 6,7,34,36 की गतिविधि को कम करने के लिए जाने जाते हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल की सफलता के लिए वाईपीडी माध्यम में गतिविधि की कमी आवश्यक नहीं है। अंत में, प्रोटोकॉल में प्रासंगिक चरणों के लिए सी अल्बिकन्स कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है। इस तापमान पर कोशिकाओं को बढ़ाकर, कोशिकाओं को मुख्य रूप से खमीर आकृति विज्ञान में होना चाहिए, जो चरण 2 और चरण 4 में कोशिकाओं की संख्या का सटीक अनुमान प्राप्त करने और चरण 6 में व्यवहार्यता में कमी के विश्वसनीय परिमाणीकरण के लिए महत्वपूर्ण है।

उपयोगकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल के दौरान चुनौतियों का सामना करना पड़ सकता है, जिसमें अवांछित माइक्रोबियल जीवों के साथ संदूषण या 96-वेल प्लेट के किनारों पर कुओं से तरल का वाष्पीकरण शामिल है। प्रोटोकॉल में बाँझपन नियंत्रण के लिए कुएं शामिल हैं ताकि यह पता लगाया जा सके कि संदूषण हुआ है या नहीं; संदूषण परख परिणामों को अमान्य करता है। यदि उपयोगकर्ता संदूषण का निरीक्षण करते हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि सभी बफर और मीडिया ठीक से निष्फल हैं औरपाइपिंग करते समय उचित बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाता है। जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करने से संदूषण की संभावना भी कम हो जाएगी। 96-वेल प्लेटों के किनारे के कुओं से तरल का वाष्पीकरण माइक्रोटिटरप्लेट38 के साथ एक ज्ञात चुनौती है और इस प्रोटोकॉल के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। जबकि चरण 5.3 में पेप्टाइड के साथ कोशिकाओं के छोटे इनक्यूबेशन समय से किनारे के प्रभाव के साथ समस्याएं होने की संभावना नहीं है, चरण 5.6 में शेष व्यवहार्य कोशिकाओं की लंबी इनक्यूबेशन से वाष्पीकरण का पालन हो सकता है। यदि वाष्पीकरण देखा जाता है, तो विभिन्न 96-वेल प्लेटों का उपयोग करना या कुओं के आसपास की जगह को पानी से भरना वाष्पीकरण को कम कर सकताहै। उपयोगकर्ता डेटा प्राप्त करने के लिए प्लेट के पंक्ति ए और पंक्ति एच और कॉलम 1 और कॉलम 12 का उपयोग नहीं करने पर भी विचार कर सकते हैं, इसके बजाय उन्हें पानी, मध्यम या बफर से भर सकते हैं।

प्रोटोकॉल के कई पहलुओं में संशोधन संभव हैं। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं और पेप्टाइड्स को एक साथ (चरण 4-5.3) करते समय एक अलग बफर (या माध्यम) का उपयोग किया जा सकता है, या पेप्टाइड्स (चरण 5.4-5.6) के साथ इनक्यूबेशन के बाद सेल विकास के लिए एक अन्य फंगल कल्चर माध्यम का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक बफर और मीडिया का उपयोग साहित्य में या सीएलएसआई मानक18 में प्रकाशित अन्य तरीकों के साथ बेंचमार्किंग की अनुमति दे सकता है और उन शर्तों के तहत पेप्टाइड्स के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण होगा जो विवो उपयोग में उनके इच्छित की नकल करते हैं। एक और संशोधन जो कुछ उपयोगकर्ताओं को सहायक लग सकता है, वह है कॉलम के बजाय प्लेट की पंक्तियों के नीचे पेप्टाइड्स को पतला करना। अभिविन्यास को बदलने से सांद्रता की संख्या कम हो जाएगी जिसे किसी दिए गए पेप्टाइड के लिए परीक्षण किया जा सकता है, लेकिन यह एक प्लेट में अधिक पेप्टाइड्स का परीक्षण करने की अनुमति देगा, जो बड़ी संख्या में विभिन्न पेप्टाइड्स के परीक्षण की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल में परीक्षण किए गए प्रत्येक पेप्टाइड के लिए प्रतिकृति डेटा प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। परीक्षण के किसी दिए गए दिन तकनीकी प्रतिकृतियों को शामिल करने से प्रोटोकॉल की परिवर्तनशीलता को समझने की अनुमति मिलती है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के विकास में यादृच्छिक भिन्नता से परिवर्तनशीलता को समझने के लिए जैविक प्रतिकृति का प्रदर्शन करना महत्वपूर्ण है। लेखकों की प्रयोगशाला आमतौर पर किसी दिए गए पेप्टाइड के लिए कम से कम छह प्रतिकृति डेटा बिंदु प्राप्त करती है। परीक्षण कम से कम 2 अलग-अलग दिनों में किया जाता है, और प्रत्येक दिन कम से कम दो तकनीकी प्रतिकृतियां शामिल होती हैं। आमतौर पर, 2 अलग-अलग दिनों में से प्रत्येक पर तीन प्रतिकृतियां की जाती हैं या 3 अलग-अलग दिनों में से प्रत्येक पर दो प्रतिकृतियां की जाती हैं। चित्रा 3 से पता चलता है कि यह प्रोटोकॉल ठीक से प्रदर्शन किए जाने पर छोटे मानक विचलन के साथ सुसंगत डेटा उत्पन्न करता है।

इस प्रोटोकॉल की सरल प्रकृति इसे प्रोटोकॉल में सीधे वर्णित नहीं किए गए कई प्रयोगों में उपयोग के लिए अनुकूलित करने की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल को अन्य कैंडिडा प्रजातियों सहित अन्य खमीर के परीक्षण के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, यह फिलामेंटस प्रजातियों या उनके फिलामेंटस आकृति विज्ञान में बढ़ने वाली द्विरूपी प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है। प्रोटोकॉल को गैर-पेप्टाइड एंटिफंगल एजेंटों, जैसे कि छोटे-अणु दवाओं, या विभिन्न पेप्टाइड्स या पेप्टाइड टुकड़ों के मिश्रण के साथ उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हिस्टोप्लाज्मा यीस्ट39 के खिलाफ एम्फोटेरिसिन बी, फ्लुकोनाज़ोल और कैस्पोफुंगिन सहित छोटे-अणु दवाओं का परीक्षण करने के लिए पहले इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है। लेखकों ने प्रोटोकॉल का उपयोग पेप्टाइड17,22 के प्रोटियोलिसिस द्वारा गठित पेप्टाइड टुकड़ों के पूल के साथ गैर-अवक्रमित पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि की तुलना करने के लिए किया है। इस प्रोटोकॉल का एक और विस्तार एएमपी की एंटिफंगल गतिविधि के कैनेटीक्स का पता लगाना होगा। यह प्रोटोकॉल पेप्टाइड्स के लिए अपनी एंटिफंगल गतिविधि को बढ़ाने के लिए 30 मिनट के इनक्यूबेशन समय का उपयोग करता है, लेकिन कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम करने के लिए पेप्टाइड्स के लिए आवश्यक समय को बेहतर ढंग से निर्धारित करने के लिए कम या लंबे इनक्यूबेशन समय का उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (R03DE029270, T32AI089621B), नेशनल साइंस फाउंडेशन (CBET 1511718), शिक्षा विभाग (GAANN-P200A180093), और मैरीलैंड क्रॉस-कैंपस बीज अनुदान विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates (round bottom) VWR 10062-902
Absorbance microplate reader N/A N/A Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314 ATCC  MYA-2876 Other C. albicans may also be used
Hemocytometer N/A N/A Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker VWR 2620-926
Peptide(s) N/A N/A Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors VWR 18900-320 Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic Fisher Scientific BP332-500 For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific BP329-500 For making NaPB
UV spectrophotometer N/A N/A Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder BD Life Sciences 242820 May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Tags

जीव विज्ञान अंक 191 कैंडिडा अल्बिकन्स पेप्टाइड्स रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स एंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण खमीर ऑप्टिकल घनत्व
<em>कैंडिडा अल्बिकन्स</em> के खिलाफ पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P.,… More

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P., Karlsson, A. J. Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans. J. Vis. Exp. (191), e64416, doi:10.3791/64416 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter