Summary
このプロトコルは、カン ジダ・アルビカンスに対するペプチドおよび他の化合物(例えば、小分子抗真菌剤)の抗真菌活性に関する定量的データを得るための方法を記載する。増殖阻害を定量化するためにコロニー形成単位をカウントするのではなく、光学密度を使用することで、時間とリソースを節約できます。
Abstract
カン ジダ・アルビカンスの 抗真菌感受性試験を実施する従来の方法は時間がかかり、定量的な結果が得られません。たとえば、一般的なアプローチは、寒天プレート上で異なる濃度の抗真菌分子で処理された細胞をプレーティングし、コロニーをカウントして分子濃度と増殖阻害の関係を決定することに依存しています。この方法では、コロニーを数えるのに多くのプレートとかなりの時間が必要です。別の一般的なアプローチは、抗真菌剤で処理された培養物を視覚的に検査して成長を阻害するのに必要な最小濃度を特定することにより、プレートとコロニーのカウントを排除します。しかし、目視検査では定性的な結果しか得られず、亜阻害濃度での増殖に関する情報は失われます。このプロトコルは、抗真菌ペプチドに対する C.アルビカンスの 感受性を測定するための方法を記載している。培養物の光学密度測定に依存することにより、この方法は、異なるペプチド濃度での培養増殖に関する定量結果を得るために必要な時間と材料を削減します。真菌とペプチドとのインキュベーションは、適切なバッファーを使用して96ウェルプレートで行われ、コントロールは成長阻害なしおよび完全な成長阻害を表します。ペプチドとのインキュベーションに続いて、得られた細胞懸濁液を希釈してペプチド活性を低下させ、次いで一晩増殖させる。一晩増殖後、各ウェルの光学濃度を測定し、ポジティブおよびネガティブコントロールと比較して、各ペプチド濃度で得られた増殖阻害を計算する。このアッセイを使用した結果は、培養物を寒天プレートにプレーティングする従来の方法を使用した結果に匹敵しますが、このプロトコルにより、プラスチック廃棄物とコロニーのカウントに費やす時間が削減されます。このプロトコルのアプリケーションは抗真菌ペプチドに焦点を当てていますが、この方法は、既知または疑われる抗真菌活性を持つ他の分子の試験にも適用できます。
Introduction
カンジダ・アルビカンスは、口腔、皮膚、胃腸管、膣など、多くの場所にコロニーを形成するヒト微生物叢のメンバーです1。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)や免疫抑制治療などの疾患のために免疫不全の患者の場合、C.アルビカンスのコロニー形成は局所的または全身性カンジダ症につながる可能性があります2,3。アムホテリシンB、アゾール、またはエキノカンジンなどの現在利用可能な低分子抗真菌治療薬の使用は、溶解性および毒性の問題、ならびに治療薬に対する感染の耐性によって複雑になる可能性があります4,5。現在の抗真菌剤の限界のために、研究者はC.アルビカンスに対して活性を有する新しい抗真菌分子を継続的に探索している。
抗菌ペプチド(AMP)は、現在の低分子抗真菌剤6,7,8の潜在的な代替物であり、低分子薬物9と比較して耐性の発生の影響を受けにくいことが提案されています。AMPは多様なペプチドのセットですが、多くの場合陽イオンであり、幅広い活性スペクトルを持っています10、11、12。C.アルビカンスに対する活性を有するAMPには、ヒスタチンおよびセクロピンファミリー13,14,15の周知のペプチド、ならびにToAP2、NDBP-5.7、およびヒスタチン5変異体K11R-K17R16,17などのより最近記載されたペプチドが含まれる。カンジダ感染症の治療に潜在的であるため、C.アルビカンスを標的とする新しいAMPの同定と設計は、多くの研究グループにとって重要な目標です。
C.アルビカンスを標的とする効果的なAMP(および他の抗真菌剤)を開発するプロセスの一環として、有望なペプチドを同定するためにin vitro試験が一般的に使用されます。C. albicansに対する抗真菌活性を試験する方法は、通常、96ウェルプレート中でAMPの段階希釈(バッファーまたは培地中)で細胞をインキュベートすることを含みます。インキュベーション後の抗真菌活性を評価するためにいくつかの方法が利用可能です。臨床検査標準研究所によって記述された技術は、ウェルの濁度の純粋に視覚的評価を使用して、成長の完全な阻害(アゾールやエキノカンジンなどの選択された抗真菌剤の少なくとも50%阻害)の最小濃度(MIC)を決定し、サブMIC濃度での成長の定量化を提供しません18.別の一般的に使用されるアプローチでは、寒天プレート上にウェルの内容物をプレーティングし、プレートをインキュベートし、プレート上のコロニー形成単位(CFU)の数をカウントすることにより、AMPとのインキュベーション後の生存率を定量化します。この方法は、ヒスタチン5ベースのペプチド、LL-37、およびヒトラクトフェリン19、20、21を含む多数のペプチドを評価するために使用されています。この技術は、比較的大量の寒天と多数のプレートを必要とし、プレート上のCFUの面倒なカウントを伴います。プラスチック廃棄物の発生を減らし、CFUのカウントを回避しながら、より定量的なデータを取得するには、ウェルの内容物を使用して、別の96ウェルプレートに新鮮な培地を接種することができます。新たに接種したプレートをインキュベートした後、成長は、吸光度プレートリーダー上で600nm(OD600)における光学密度を測定することによって定量化することができる。この方法は、ヒスタチン5およびその分解断片ならびに細胞透過性ペプチド17、22、23、24、25の抗真菌活性を決定するために使用されている。
このプロトコルは、ペプチドの抗真菌活性を試験する方法を説明し、OD600 法を使用して、ペプチドによる C.アルビカンスの 生存率の低下を定量化します。
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Protocol
メリーランド大学カレッジパーク校の施設バイオセーフティ委員会(IBC)から、このプロトコル(PN 274)での C.アルビカンス との作業について承認が得られました。 C.アルビカンス 株SC5314( 材料の表を参照)を本研究では使用しました。しかしながら、任意の他の株も使用され得る。
1.緩衝液、滅菌水、培地の調製
- pH 7.4で滅菌済みの0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(NaPB)26 を調製し、滅菌水で2 mMおよび1 mMに希釈します。2 mM NaPBと1 mM NaPBのそれぞれ100 mLを調製するだけで、このプロトコルのほとんどのアプリケーションには十分すぎるほどです。
- 滅菌液体酵母-ペプトン-デキストロース(YPD、 材料表を参照)培地(10 g / L酵母エキス、20 g / Lデキストロース、20 g / Lペプトン)を準備します。100 mLのYPDを調製するだけで、このプロトコルのほとんどのアプリケーションには十分すぎるほどです。
- 滅菌済みの超純水を用意します。100 mLの水を調製するだけで、このプロトコルのほとんどのアプリケーションには十分すぎるほどです。
注:バッファー、培地、および水は、オートクレーブされる容器内の容量に基づいて、液体サイクルで121°Cで適切な時間オートクレーブ滅菌されます27。たとえば、500 mLを含むボトルの場合、暴露時間は40分である必要があります。
2. C. アルビカンスの接種・培養・継代培養
注意:学術研究機関によって薬剤耐性に関係なくバイオセーフティレベル(BSL)2生物として分類され、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)によってBSL1またはBSL2生物として分類されることが多い C.アルビカンスを扱うためのすべての制度的および政府の規制に従ってください、株28の薬剤耐性に応じて。
注:このステップの接種および培養部分(ステップ2.1〜2.2)は、抗真菌活性のテストを開始する前日に実行してください。可能であれば、バイオセーフティキャビネット内の細胞(および細胞とともにインキュベートされる溶液)を使用して、すべてのプロトコルステップを実行します。
- 目的の C.アルビカンス 株を培養チューブ内の10 mLのYPD培地に接種します。
注:培養液は冷凍庫ストックまたは寒天プレートから接種できますが、比較するすべてのデータには一貫したソースを使用する必要があります。 - ロータリーシェーカーで30°C、230rpmで一晩(~12-16時間)培養物を成長させます。
- C. albicansの一晩培養物を継代培養し、~1.0-1.2のOD600に増殖させる。
- UV分光光度計を用いて一晩培養のOD600 を測定する( 材料表参照)。
- 一晩培養のOD600に基づいて、一晩培養を使用して、10mL のYPD中に0.1のOD600 で継代培養を接種する。
- 継代培養液を30°C、ロータリーシェーカーで230rpmで、OD600 が~1.0-1.2に達するまで成長させますが、これには4-6時間かかる可能性があります。継代培養が成長している間にステップ3(ペプチド溶液の調製)を完了します。継代培養は、ステップ4のアッセイで使用するために希釈されます。
3. 96ウェルプレートでのペプチド溶液の調製
注:このステップは、ペプチドストック溶液が保存中に安定している場合、事前に行うことができます。典型的には、ペプチド溶液は、使用するまで−20°Cで保存される。次のステップに進む前に、室温の水浴で解凍できます。
- アッセイで試験する各ペプチドの最高濃度を決定します。これは、選択されたペプチドに基づいて変化する。代表的な結果セクションに提示されたデータについて、ヒスタチン5および操作された類似体22 が試験され、試験された最高濃度は50μMであった。
注:試験する最高濃度は、文献で報告されたデータを使用するか、広範囲のペプチド濃度にわたって予備実験を行うことによって決定されます。可能であれば、最高濃度を選択して、試験した最高濃度で生存率を完全に低下させるプラトーを観察し、試験した最低濃度で生存率を低下させないプラトーを観察し、ペプチド活性の全範囲を定量できるようにする必要があります。 - 各ペプチドを所望の最高濃度の2倍の滅菌水に溶解する。代表的な結果セクションに提示されたデータについて、ヒスタチン5および操作された類似体の150μLの100μM溶液を滅菌水中で調製した。
注:ペプチドが水に溶けない場合は、このステップの前に別の溶媒への可溶化が必要になる場合があります。ジメチルスルホキシド(DMSO)は、使用濃度に希釈する前にペプチドを高濃度で可溶化するために一般的に使用されます。DMSOの最終濃度が1%(v / v)または29 以下であり、代替溶媒が細胞の成長に影響を与えないことを確認してください。また、ステップ3.4〜3.5ですべてのウェルで溶媒濃度が一定に保たれていることを確認してください。 - 40 μLの目的のペプチドストック溶液を、96ウェルの丸底培養プレートの各行の最初のウェル(カラム1)に追加します( 材料の表を参照)。このプレートはプレート1です(図1)。
注:各プレートには、ペプチドのテストに使用される8つの列があります。これらの行は、異なるペプチドまたは同じペプチドの複製に使用できます。各行に単一のペプチドのみを含めます。 - ペプチドを含む列のカラム2からカラム12に滅菌超純水20 μLを加えます(図1)。
注:ステップ3.2でペプチドストックを純水以外の溶媒で調製した場合、このステップの滅菌水は、最初のカラムに追加されたペプチドストックに存在する溶媒と交換する必要があります。たとえば、ペプチドがDMSOに可溶化され、ペプチドストックが水中に1%(v/v)のDMSOを含む場合、1%のDMSOを含む水を列2から列12に追加する必要があります。 - プレート全体のペプチドストック溶液をカラム10まで順次希釈します(図1)。
注:以下に説明するようにプレート内で段階希釈を行うのではなく、マイクロ遠心チューブで希釈を行い、96ウェルプレートに移すこともできます。- カラム1から20 μLを取り出し、カラム2に移し、上下にピペッティングして混合します。カラム2には、カラム1の濃度の1:2希釈で40 μLのペプチド溶液が含まれています。
- カラム2から20 μLを取り出し、カラム3に移し、上下にピペッティングして混合するため、カラム3にはカラム1の濃度の1:4希釈で40 μLのペプチド溶液が含まれます。
- カラム10に40 μLのペプチド溶液がカラム1の濃度の1:512希釈で含まれるまで、このプロセスを繰り返します。
- カラム10から20 μLのペプチド溶液を除去し、廃棄します。各カラムには、20 μLのペプチド溶液(カラム1〜10)または水(カラム11およびカラム12)が含まれています。
注:カラム11のウェルは無菌コントロールとして機能し、カラム12のウェルはペプチドを含まないコントロールとして機能します。
4. C.アルビカンス 継代培養の希釈
注: 継代培養が ~1.0-1.2 の OD600 に達した後に、この手順を開始します (手順 2.3.3)。
- 継代培養液を15 mL遠沈管に移し、3,900 x g で室温で3分間遠心分離し、細胞をペレット化します。ピペッティングまたはデカントによって上清を除去します。
- ペレットを1 mLの2 mM NaPBで再懸濁し(ステップ1.1)、懸濁液を1.7 mL遠沈管に移します。
- 細胞をペレット化し(ステップ4.1と同様)、上清を廃棄し、ペレットを1mLの2mM NaPBに再度再懸濁する。
- ステップ4.3をさらに2回繰り返して、洗浄した細胞を1 mLの2 mM NaPB中に残します。
- 洗浄した懸濁液の細胞密度を決定し、5 x 105 細胞/mLの細胞密度を得るために必要な希釈係数を計算します。この濃度は、最終的に96ウェルプレートの各ウェルに1 x 104 細胞を添加することにつながります。
注:懸濁液の細胞密度は、血球計算盤または自動細胞カウンターを含む多くの方法を使用して決定できます。関連する条件下で増殖させた目的の株の細胞密度対OD600の標準曲線を本研究に使用しました。この曲線は、血球計算盤(材料の表を参照)を使用して作成し、OD600値を変化させた懸濁液の細胞密度を決定しました。 - 細胞懸濁液を2 mM NaPB中で5 x 105 細胞/mLに希釈します。この希釈懸濁液を10mL調製するだけで、この研究を完了するのに十分すぎるほどです。
5.ペプチド溶液による C.アルビカンスの インキュベーションと生存率の定量化のための細胞の調製
- 希釈した C.アルビカンス 懸濁液20 μL(ステップ4.6)を各行の列1〜10および列12に追加します(図1)。
注:最初の列の最終ペプチド濃度は、ペプチドストック濃度の半分になりました。本研究では、この時点で最終的なペプチド濃度は50μMであった。各ウェルの最終細胞懸濁液には、2.5 x 105 細胞/mLが含まれています。カラム1〜10は、異なるペプチド濃度での抗真菌活性を評価するための実験ウェルとして機能し、カラム12は、ペプチドを含まない増殖のコントロールとして機能します。 - 20 μLの2 mM NaPBをカラム11に追加します。現在、すべてのウェルの最終濃度は1 mM NaPBです。カラム11は、無菌性コントロールとして機能する。
- カバープレート1(細胞とペプチドの両方を含む)をカバーし、30°Cで30分間インキュベートします。
注:多くのペプチド17、21、22、30では30分のインキュベーション時間で十分ですが、抗真菌活性を発揮するのに長い時間を必要とする可能性のあるペプチドを説明するために、必要に応じてインキュベーション時間を60分に増やすことができます25,31,32。 - 生存率の定量に使用するために、新しい96ウェル培養プレート(プレート2)を準備します(図2)。
注:培養プレートは、プレート1のインキュベーション中に準備する必要があります。- プレートのすべてのウェルに100 μLのYPDを追加します(ステップ1.2)。
- プレートのすべてのウェルに100 μLの2 mM NaPBを加えます(ステップ1.1)。
- サンプルをプレート1(細胞とペプチドを含む)で希釈し、プレート2(培地とバッファーを含む)に移します。
- 30分間のインキュベーション後にインキュベーターからプレート1を取り出します。
- プレート1の各ウェルに280 μLの1 mM NaPBを加えて希釈し(ステップ1.1)、各ウェルに合計320 μLの容量を与えます(図2)。
- 細胞とペプチドを含むすべてのウェルを上下にピペッティングして混合し、すべての細胞が再懸濁され、ウェルの底に沈降細胞が見えないようにします。
- プレート1の各ウェルからプレート2の対応するウェルに8 μLを移します。このボリュームは、プレート1の各ウェルからプレート2に約250個の細胞を移します(図2)。
- プレート2を覆い、マイクロタイタープレートシェーカー( 材料の表を参照)で350rpmで30°Cで17時間インキュベートします。
図1:細胞とのペプチド段階希釈のインキュベーションのためのプレート1の調製。ペプチドの段階希釈を水中で行い、C.アルビカンス細胞をプレート1に添加します。青色はペプチドがウェルに存在し、灰色は水を含みペプチドがないウェルを示す。細胞を含むウェルは黒い点のパターンで示されます。これらのステップの後、プレートをインキュベートして、ペプチドがその抗真菌活性を発揮できるようにします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ペプチドに起因する生存率の低下を定量化するためのプレート2の調製。YPD培地とNaPBをプレート2に加えます。プレート1の内容物を希釈した後、各ウェルからのアリコートをプレート1からプレート2に移す。次いで、プレート2をインキュベートして、OD600を測定することによって定量化のために任意の生細胞を増殖させる。プレート2では、YPDとNaPBのみを含むウェルはオレンジ色で示されています。YPDおよびNaPBと混合されたプレート1からのアリコートを含むウェルは緑色で示されています。プレート1の色の説明については、図1の凡例を参照してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6.抗真菌活性の測定
- プレート2の各ウェルのOD600 の読み取り値を取得します。
- 17時間のインキュベーション後にプレート2をインキュベーターから取り出します。
- プレート2のすべてのウェルを上下にピペッティングして混合し、すべての細胞が再懸濁され、ウェルの底に沈降した細胞が見えないようにします。
注意: OD600 の読み取り値に干渉する可能性があるため、この手順では気泡を発生させないでください。気泡が形成された場合は、多くの場合、乾いたピペットチップで弾くか、2つのピペットチップを使用してウェルから持ち上げて取り除くことができます。 - 波長600 nmの吸光度プレートリーダー( 材料の表を参照)を使用して、各ウェルのOD600 を取得します。
- 成長の阻害を(パーセンテージで)計算し、それをプロットして、 C.アルビカンスの成長に対するペプチドの効果を決定します。
- 各ウェルについて、以下の式17、22、23を使用して、対照と比較した生存率の低下(パーセンテージとして)を計算します。
ここで、ペプチドを含むODは、所与の濃度のペプチドを含むウェルのOD600であり、ODバックグラウンドは、同じ行の列11(細胞を含まない対照)のOD600であり、
ペプチドなしのODは、同じ行の列12のOD600である(ペプチドを含まない細胞を含む対照)。 - たとえば、次の式を使用して、行 B の OD600 値から井戸 B5 の生存率の低下を計算します。
- 各ウェルについて、以下の式17、22、23を使用して、対照と比較した生存率の低下(パーセンテージとして)を計算します。
- 生存率の低下をペプチド濃度の関数としてプロットする。
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Representative Results
OD600 測定を使用して抗真菌ペプチドによる増殖の減少を定量化することで、サンプルのメッキやCFUのカウントと比較して時間を大幅に節約できます。このプロトコルで説明されている方法では、3つの異なる日に手順を完了する必要があります。初日に、バッファーと培地(滅菌時間を含まない)を調製し、一晩インキュベーションするために C.アルビカンスの 出発培養物を接種するのに約1時間必要です。2日目には、ステップは17時間のインキュベーションのために96ウェルプレートを準備するために5〜6時間(継代培養時間を含む)を必要とします。3日目には、ステップは1時間以内に完了することができます。生存率に関する定量的データを収集することを含むプロトコルの部分は、約30分の作業(および17時間のインキュベーション)を必要とします。対照的に、寒天上にサンプルをプレーティングし、各96ウェルプレートの内容物の1回の複製でCFUをカウントするには、3時間以上の作業(および24時間のインキュベーション)が必要であり、このプロトコルを使用して生存率の定量化を完了するために必要な時間が2.5時間以上短縮されます。これらの時間の節約は、実験で複数の96ウェルプレートが必要な場合に増幅されます。
記載されたプロトコールは、リジン残基における修飾を含むヒスタチン5およびヒスタチン5のいくつかの変異体の抗真菌活性をアッセイするために使用された。ステップ5でC.アルビカンス細胞とペプチドをインキュベートした後、CFU計数法とOD600測定値を組み込んだ記載のプロトコールの両方を使用して抗真菌活性を定量しました(図3)。重要なことに、2つの方法はすべてのペプチドについて同様の結果をもたらしましたが、各ペプチドは1つの濃度を持ち、2つの方法によって決定された生存率の低下に統計的に有意な差がありました。これらの各ケースにおいて、OD600データはCFUデータよりも生存率の低下が低く、データを比較するときに単一の方法を使用する必要があることを示しています。重要なことに、OD600の読み取り値を使用したデータは、図3の反復の標準偏差が一般的に小さく、このプロトコル17、22、23、24、25を使用して公表されている結果によって示されるように、再現性が高いことです。
図3:C.アルビカンス細胞増殖の減少を定量化するための従来の(CFU)および記載された(OD)方法の比較。ペプチド(A)ヒスタチン5(Hst-5)およびヒスタチン5(B)K5R、(C)K11R、(D)K13R、および(E)K17Rの変異体を、プロトコルに記載されているように、50μM〜0.20μMの濃度でC.アルビカンス細胞とインキュベートした。ステップ5.5.3の後、寒天上でのプレーティングのためにサンプルを除去するか(実験ごとに1回の複製)、または新しいプレートに移して(実験ごとに2回の反復)、プロトコルを継続しました。データは3つの独立した実験の平均を表し(CFUデータの場合はN = 3データポイント、ODデータの場合はN = 6データポイント)、エラーバーはデータの標準偏差を示します。2つの方法間の統計的差異を特定するために、Tukeyの多重比較検定(α = 0.05)を使用した二元配置分散分析(ANOVA)を実行しました。統計的に有意な差のあるペプチド濃度は、プロット上のアスタリスク(*)で示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、真菌病原体 C.アルビカンスに対するAMPの抗真菌活性に関する定量的データを取得するための効率的なアプローチを説明しています。ペプチドやその他の抗真菌剤を試験するための一般的な代替アプローチの1つは、臨床検査標準研究所(CLSI)の標準M2718に記載されているブロス微量希釈ですが、この標準は定量的結果ではなく定性的な視覚的結果を得ることに焦点を当てています。別の代替アプローチは、このプロトコルに記載されている方法と同様の方法を使用してペプチドを調製し、それらを細胞とインキュベートし、次に寒天上にウェルの内容物をプレートしてCFUの数をカウントし、ペプチドの効果を定量化することです。代表的な結果のセクションで述べたように、このプロトコルで細胞増殖を測定するためのOD600 の使用は、CFUのプレーティングおよびカウントと比較して時間的負担を大幅に軽減します。ウェルの内容物を寒天にプレーティングする必要がなくなるため、ペプチド検査プロトコルによって発生するプラスチック廃棄物の量も削減されます。
このプロトコルのいくつかの側面は、その成功にとって重要です。多くのカチオン性抗菌ペプチドは、in vitroで実施されるアッセイにおいて生理的塩濃度で劣悪な8、32、33、34を奏するため、このアッセイには1mM NaPBバッファーが選択されました。さらに、ペプチドおよびC.アルビカンス細胞は、増殖培地中で長時間インキュベートするのではなく、緩衝液中で短時間(30分)インキュベートされる。これは、細胞の潜在的な増殖および分裂を減少させ、ペプチドとのインキュベーション後に残っている生存細胞のその後の定量化に影響を及ぼすであろう。細胞とのペプチドのインキュベーションに続いて、ウェルを希釈してペプチドの濃度を低下させ、所望の30分間のインキュベーションを超えて継続する抗真菌活性の可能性を減少させる35。ペプチドの継続的な活性の可能性は、細胞 - ペプチド溶液をYPD培地を含むプレートに移すことによってさらに減少する。多くのペプチドは、おそらくいくつかの抗菌ペプチドの活性を低下させることが知られている一価および二価の陽イオンの存在のために、YPD培地(未発表データ)においてそれらの活性を失う6、7、34、36。しかしながら、YPD培地における活性の欠如は、プロトコルの成功に必要ではない。最後に、C.アルビカンス細胞をプロトコルの関連ステップのために30°Cで増殖させます。この温度で細胞を増殖させることにより、細胞は主に酵母の形態にあるはずであり、これはステップ2およびステップ4における細胞数の正確な推定値を得るために、ならびにステップ6における生存率の低下を確実に定量化するために重要である。
このプロトコルでは、望ましくない微生物による汚染や、96ウェルプレートの端にあるウェルからの液体の蒸発など、課題に直面する可能性があります。プロトコルには、汚染が発生したかどうかを特定するための無菌管理用のウェルが含まれています。汚染はアッセイ結果を無効にします。ユーザーが汚染を観察した場合、すべてのバッファーと媒体が適切に滅菌され、ピペッティング時に適切な滅菌技術が使用されるように注意する必要があります37。バイオセーフティキャビネットで作業することで、汚染の可能性も減少します。96ウェルプレートのエッジウェルからの液体の蒸発は、マイクロタイタープレート38 の既知の課題であり、このプロトコルの結果に影響を与える可能性があります。ステップ5.3でのペプチドを含む細胞のインキュベーション時間が短いことは、エッジ効果の問題につながる可能性は低いですが、ステップ5.6での残りの生存細胞のインキュベーションが長いと、蒸発の観察につながる可能性があります。蒸発が観察される場合、異なる96ウェルプレートを使用するか、またはウェルの周囲の空間を水で満たすことは、蒸発を減少させ得る38。ユーザーは、データを取得するためにプレートの行Aと行H、列1と列12を使用せず、代わりに水、培地、またはバッファーで満たすことも検討できます。
プロトコルの多くの側面を変更することが可能です。例えば、細胞とペプチドを一緒にインキュベートする場合に異なるバッファー(または培地)を使用するか(ステップ4〜5.3)、またはペプチドとのインキュベーション後の細胞増殖に別の真菌培養培地を使用することができる(ステップ5.4〜5.6)。代替バッファーおよび培地の使用は、文献で公開されている他の方法またはCLSI標準18 によるベンチマークを可能にする可能性があり、意図された in vivo 使用を模倣する条件下でペプチドを試験するために重要であろう。一部のユーザーが役立つと思われる別の変更は、ペプチドをカラム全体ではなくプレートの列の下に希釈することです。向きを変えると、特定のペプチドについて試験できる濃度の数が減りますが、より多くのペプチドを1つのプレートで試験できるため、多数の異なるペプチドの試験を必要とする実験に役立ちます。
このプロトコルでテストされた各ペプチドの複製データを取得することが重要です。テストの特定の日に技術的な反復を含めることで、プロトコルの変動性を理解できます。さらに、生物学的複製を行うことは、細胞の成長におけるランダムな変動からの変動性を理解するために重要です。著者らの研究室では、通常、特定のペプチドについて少なくとも6つの反復データポイントを取得します。テストは最低2つの異なる日に実行され、各日に最低2回の技術反復が含まれます。通常、3回の反復は2つの異なる日のそれぞれに、または2回の反復は3つの異なる日のそれぞれに実行されます。 図3 は、このプロトコルが適切に実行された場合、小さな標準偏差で一貫性のあるデータを生成することを示しています。
このプロトコルの単純な性質により、プロトコルに直接記載されていない多くの実験での使用に適合させることができます。例えば、このプロトコルは、他のカンジダ種を含む他の酵母の試験に容易に適合させることができる。ただし、糸状形態で成長する糸状種や二形種にはあまり適していません。このプロトコルは、低分子薬物などの非ペプチド抗真菌剤、または異なるペプチドまたはペプチドフラグメントの混合物での使用にも適合させることができます。たとえば、同様のプロトコルは、ヒストプラズマ酵母に対してアムホテリシンB、フルコナゾール、カスポファンギンなどの低分子薬物をテストするために以前に使用されてきました39。著者らは、このプロトコルを使用して、非分解ペプチドの抗真菌活性を、ペプチドのタンパク質分解によって形成されたペプチド断片のプールと比較しました17,22。このプロトコルの別の拡張は、AMPの抗真菌活性の動態を調査することです。このプロトコルでは、ペプチドが抗真菌活性を発揮するために30分のインキュベーション時間を使用しますが、ペプチドが細胞の生存率を低下させるのに必要な時間をより適切に決定するために、インキュベーション時間を短くまたは長くすることができます。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(R03DE029270、T32AI089621B)、国立科学財団(CBET 1511718)、教育省(GAANN-P200A180093)、およびメリーランド大学クロスキャンパスシード助成金の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
References
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