Summary
이 프로토콜은 칸 디다 알비칸스에 대한 펩타이드 및 소분자 항진균제와 같은 기타 화합물의 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명합니다. 성장 억제를 정량화하기 위해 집락 형성 단위를 세는 대신 광학 밀도를 사용하면 시간과 자원을 절약할 수 있습니다.
Abstract
칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균성 감수성 검사를 수행하는 전통적인 방법은 시간이 많이 걸리고 정량적 결과가 부족합니다. 예를 들어, 일반적인 접근법은 한천 플레이트에 다양한 농도의 항진균 분자로 처리된 세포를 도금한 다음 콜로니를 계수하여 분자 농도와 성장 억제 사이의 관계를 결정하는 데 의존합니다. 이 방법은 식민지를 세는 데 많은 판과 상당한 시간이 필요합니다. 또 다른 일반적인 접근법은 성장을 억제하는 데 필요한 최소 농도를 확인하기 위해 항진균제로 처리된 배양물을 육안으로 검사하여 플레이트와 콜로니 계수를 제거합니다. 그러나 육안 검사는 정성적 결과만 생성하며 하위 억제 농도에서의 성장에 대한 정보는 손실됩니다. 이 프로토콜은 항진균 펩타이드에 대한 C. albicans의 감수성을 측정하는 방법을 설명합니다. 배양의 광학 밀도 측정에 의존함으로써 이 방법은 다양한 펩타이드 농도에서 배양 성장에 대한 정량적 결과를 얻는 데 필요한 시간과 재료를 줄입니다. 펩타이드를 사용한 곰팡이의 배양은 적절한 완충액을 사용하여 96웰 플레이트에서 수행되며, 대조군은 성장 억제 없음 및 완전한 성장 억제를 나타냅니다. 펩티드와 함께 배양한 후, 생성된 세포 현탁액을 희석하여 펩티드 활성을 감소시킨 다음 밤새 성장시킵니다. 하룻밤 성장 후, 각 웰의 광학 밀도를 측정하고 양성 및 음성 대조군과 비교하여 각 펩티드 농도에서 결과적인 성장 억제를 계산합니다. 이 분석을 사용한 결과는 한천 플레이트에 배양물을 도금하는 전통적인 방법을 사용한 결과와 비슷하지만 이 프로토콜은 플라스틱 폐기물과 집락 계수에 소요되는 시간을 줄입니다. 이 프로토콜의 적용은 항진균 펩타이드에 초점을 맞추었지만 이 방법은 항진균 활성이 알려지거나 의심되는 다른 분자를 테스트하는 데에도 적용할 수 있습니다.
Introduction
칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 구강, 피부, 위장관 및 질을 포함한 수많은 위치에 서식하는 인간 미생물총의 일원입니다1. 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 면역억제 치료와 같은 질병으로 인해 면역이 저하된 환자의 경우, C. albicans의 집락화는 국소 또는 전신 칸디다증을 유발할 수 있다 2,3. 암포테리신 B, 아졸 또는 에키노칸딘과 같은 현재 이용가능한 소분자 항진균 치료제의 사용은 용해도 및 독성 문제와 치료제에 대한 감염의 저항성에 의해 복잡해질 수 있다 4,5. 현재 항진균제의 한계로 인해 연구자들은 C. albicans에 대한 활성을 가진 새로운 항진균 분자를 지속적으로 찾고 있습니다.
항균 펩티드(AMP)는 현재의 소분자 항진균제6,7,8에 대한 잠재적인 대안이며, 소분자 약물9에 비해 내성 발달에 덜 민감한 것으로 제안된다. AMP는 다양한 펩타이드 세트이지만 종종 양이온성이며 광범위한 활성 스펙트럼을 가지고 있습니다10,11,12. C. albicans에 대한 활성을 가진 AMP에는 Histatin 및 cecropin 계열 13,14,15의 잘 알려진 펩타이드와 ToAP2, NDBP-5.7 및 히스타틴 5 변이체 K11R-K17R 16,17과 같은 최근에 설명된 펩타이드가 포함됩니다. 칸디다 감염을 치료할 수 있는 잠재력으로 인해 C. albicans를 표적으로 하는 새로운 AMP를 식별하고 설계하는 것은 많은 연구 그룹에서 중요한 목표입니다.
C. albicans를 표적으로 하는 효과적인 AMP(및 기타 항진균제)를 개발하는 과정의 일환으로, 체외 검사는 일반적으로 유망한 펩타이드를 식별하는 데 사용됩니다. C. albicans에 대한 항진균 활성을 테스트하는 방법은 일반적으로 96웰 플레이트에서 AMP(완충액 또는 배지)의 연속 희석액으로 세포를 배양하는 것을 포함합니다. 배양 후 항진균 활성을 평가하기 위해 몇 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 임상검사표준협회(Clinical Laboratory Standards Institute)에서 기술한 기술은 웰의 탁도를 시각적으로 평가하여 완전한 성장 억제(아졸 및 에키노칸딘과 같은 선택된 항진균제의 경우 최소 50% 억제)를 측정하며, MIC 이하 농도에서 성장을 정량화하지 않는다18 . 일반적으로 사용되는 또 다른 접근법은 한천 플레이트에 웰의 내용물을 도금하고 플레이트를 배양한 다음 플레이트의 집락 형성 단위(CFU) 수를 계산하여 AMP로 배양한 후 생존력을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 히스타틴 5계 펩티드, LL-37 및 인간 락토페린 19,20,21을 포함하는 다수의 펩티드를 평가하기 위해 사용되어 왔다. 이 기술은 상대적으로 많은 양의 한천과 많은 수의 플레이트가 필요하며 플레이트의 CFU를 지루하게 계산해야합니다. 플라스틱 폐기물을 줄이고 CFU 계산을 피하면서 더 많은 정량적 데이터를 얻기 위해 웰의 내용물을 사용하여 다른 96웰 플레이트에 새로운 배지를 접종할 수 있습니다. 새로 접종된 플레이트를 인큐베이션한 후, 흡광도 플레이트 판독기 상에서 600 nm(OD600)에서의 광학 밀도를 측정함으로써 성장을 정량화할 수 있다. 이 방법은 히스타틴 5 및 그의 분해 단편 및 세포 침투 펩티드 17,22,23,24,25의 항진균 활성을 결정하는 데 사용되었습니다.
이 프로토콜은 펩타이드의 항진균 활성을 테스트하는 방법을 설명하고 OD600 방법을 사용하여 펩타이드로 인한 C. albicans 의 생존력 감소를 정량화합니다.
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Protocol
이 프로토콜(PN 274)에서 C. albicans 를 사용한 작업에 대해 메릴랜드 대학교 칼리지 파크, 기관 생물안전 위원회(IBC)로부터 승인을 받았습니다. C. albicans 균주 SC5314 ( 재료 표 참조)를 본 연구에 사용하였다; 그러나, 임의의 다른 균주가 또한 사용될 수 있다.
1. 완충액, 멸균수 및 배양액의 제조
- pH 7.4에서 멸균 된 0.1M 인산 나트륨 완충액 (NaPB) 26 을 준비하고 멸균 수로 2mM 및 1mM로 희석합니다. 2 mM NaPB 및 1 mM NaPB 각각을 100 mL 제조하는 것은 이 프로토콜의 대부분의 적용에 충분할 것이다.
- 멸균 액체 효모-펩톤-포도당(YPD, 재료 표 참조) 배지(10g/L 효모 추출물, 20g/L 포도당, 20g/L 펩톤)를 준비합니다. 100mL의 YPD를 준비하는 것은 이 프로토콜의 대부분의 응용 분야에 충분합니다.
- 멸균 된 초순수를 준비하십시오. 100mL의 물을 준비하는 것은 이 프로토콜의 대부분의 응용 분야에 충분합니다.
참고: 완충액, 매체 및 물은 오토클레이브되는 용기 내의 부피에 기초하여 적절한 시간 동안 액체 사이클 상에서 121°C에서 오토클레이빙에 의해 멸균된다27. 예를 들어, 500mL가 들어 있는 병의 경우 노출 시간은 40분이어야 합니다.
2. C. albicans의 접종, 배양 및 계대배양
주의: 학술 연구 기관에서 약물 내성에 관계없이 생물 안전성 수준(BSL) 2 유기체로, American Type Culture Collection(ATCC)에서 균주28의 약물 내성에 따라 BSL1 또는 BSL2 유기체로 분류하는 C. albicans를 사용하기 위한 모든 기관 및 정부 규정을 따르십시오.
참고: 항진균 활성 테스트를 시작하기 전날에 이 단계(2.1-2.2단계)의 접종 및 배양 부분을 수행합니다. 가능하면 생물 안전 캐비닛에서 세포(및 세포와 함께 배양될 용액)로 모든 프로토콜 단계를 수행합니다.
- 원하는 C. albicans 균주를 배양 튜브의 YPD 배지 10mL에 접종합니다.
참고: 배양액은 냉동실 스톡 또는 한천 플레이트에서 접종할 수 있지만 비교할 모든 데이터에 대해 일관된 소스를 사용해야 합니다. - 회전식 셰이커에서 30°C 및 230rpm에서 하룻밤(~12-16시간) 배양물을 성장시킵니다.
- 하룻밤 배양 C. albicans, 그리고 ~1.0-1.2의 OD600 으로 자랍니다.
- UV 분광광도계를 사용하여 하룻밤 배양의OD600 을 측정한다( 재료 표 참조).
- 하룻밤 배양의 OD600에 기초하여, 하룻밤 배양을 사용하여 10 mL의 YPD 중 0.1의OD600에서 계대배양물을 접종한다.
- OD600 이 ~1.0-1.2에 도달할 때까지 회전 셰이커에서 230rpm의 회전 셰이커에서 4-6°C에서 계대 배양을 성장시킵니다. 계대배양이 성장하는 동안 3단계(펩타이드 용액 준비)를 완료하고; 계대배양은 단계 4의 분석에 사용하기 위해 희석될 것이다.
3. 96-웰 플레이트에서 펩타이드 용액의 제조
참고: 이 단계는 펩타이드 원액이 보관 중에 안정적인 경우 미리 수행될 수 있습니다. 전형적으로, 펩티드 용액은 사용까지 -20°C에서 저장된다. 다음 단계로 진행하기 전에 실온 수조에서 해동할 수 있습니다.
- 분석에서 테스트할 각 펩타이드의 최고 농도를 결정합니다. 이것은 선택된 펩티드에 따라 달라질 것이다. 대표 결과 섹션에 제시된 데이터에 대해 히스타틴 5 및 조작된 유사체22 를 테스트했으며 테스트된 최고 농도는 50μM였습니다.
참고: 테스트할 최고 농도는 문헌에 보고된 데이터를 사용하거나 광범위한 펩타이드 농도에 대해 예비 실험을 수행하여 결정됩니다. 가능한 경우, 테스트된 최고 농도에서 생존율이 완전히 감소하는 고원과 테스트된 최저 농도에서 생존력이 감소하지 않는 고원을 관찰하기 위해 가장 높은 농도를 선택하여 전체 범위의 펩타이드 활성을 정량화할 수 있어야 합니다. - 각 펩타이드를 원하는 최고 농도의 두 배로 멸균수에 용해시킵니다. 대표 결과 섹션에 제시된 데이터의 경우, 히스타틴 5 및 조작된 유사체의 100μM 용액 150μL를 멸균수에서 준비했습니다.
참고: 펩타이드가 물에 용해되지 않는 경우 이 단계 전에 다른 용매에 가용화해야 할 수 있습니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 일반적으로 작동 농도로 희석하기 전에 펩타이드를 고농도로 가용화하는 데 사용됩니다. DMSO의 최종 농도가 1%(v/v) 이하인지확인하십시오 29 대체 용매가 세포의 성장에 영향을 미치지 않는지 확인하십시오. 또한 3.4-3.5 단계의 모든 웰에서 용매 농도가 일정하게 유지되는지 확인하십시오. - 원하는 펩타이드 스톡 용액 40μL를 96웰 둥근 바닥 배양 플레이트의 각 행의 첫 번째 웰(컬럼 1)에 추가합니다( 재료 표 참조). 이 플레이트는 플레이트 1입니다(그림 1).
참고: 각 플레이트에는 펩타이드 테스트에 사용되는 8개의 행이 있습니다. 이러한 행은 서로 다른 펩타이드 또는 동일한 펩타이드의 복제에 사용할 수 있습니다. 각 행에 단일 펩타이드만 포함합니다. - 20μL의 멸균 초순수를 펩타이드가 포함된 행의 컬럼 2에서 컬럼 12에 추가합니다(그림 1).
참고: 3.2단계에서 순수 이외의 용매로 펩타이드 스톡을 제조한 경우 이 단계의 멸균수를 첫 번째 컬럼에 추가된 펩타이드 스톡에 존재하는 용매로 교체해야 합니다. 예를 들어, 펩타이드가 DMSO에 가용화되고 펩타이드 스톡이 물에 1%(v/v) DMSO를 포함하는 경우 1% DMSO를 포함하는 물을 컬럼 2 내지 컬럼 12에 첨가해야 합니다. - 플레이트를 가로질러 펩타이드 스톡 용액을 컬럼 10까지 연속적으로 희석합니다(그림 1).
참고: 아래에 설명된 대로 플레이트에서 연속 희석을 수행하는 대신 미세 원심분리기 튜브에서 희석을 수행하고 96웰 플레이트로 옮길 수도 있습니다.- 컬럼 1에서 20 μL를 제거하고 컬럼 2로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 컬럼 2에는 이제 컬럼 1 농도의 1:2 희석으로 40μL의 펩타이드 용액이 포함되어 있습니다.
- 컬럼 2에서 20μL를 제거하고 컬럼 3으로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합하면 컬럼 3에 컬럼 1 농도의 1:4 희석으로 40μL의 펩타이드 용액이 포함됩니다.
- 컬럼 10에 컬럼 1 농도의 1:512 희석으로 40μL의 펩타이드 용액이 포함될 때까지 이 과정을 반복합니다.
- 컬럼 10에서 20μL의 펩타이드 용액을 제거하고 폐기합니다. 이제 각 컬럼에는 20μL의 펩타이드 용액(컬럼 1-10) 또는 물(컬럼 11 및 컬럼 12)이 포함됩니다.
참고: 컬럼 11의 웰은 멸균 대조군 역할을 하고 컬럼 12의 웰은 펩타이드를 포함하지 않는 대조군 역할을 합니다.
4. C. albicans 하위 문화의 희석
참고: 계대배양이 ~1.0-1.2의 OD600 에 도달한 후 이 단계를 시작합니다(2.3.3단계).
- 계대배양물을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고, 실온에서 3분 동안 3,900 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 피펫팅 또는 디캔팅으로 상층액을 제거합니다.
- 펠릿을 2mM NaPB 1mL(단계 1.1)로 재현탁하고 현탁액을 1.7mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 세포를 펠렛화하고(단계 4.1에서와 같이), 상청액을 버리고, 펠렛을 다시 1 mL의 2 mM NaPB에 재현탁시킨다.
- 단계 4.3을 추가로 2회 반복하여 세척된 세포를 2 mM NaPB 1 mL에 남겨둔다.
- 세척된 현탁액의 세포 밀도를 결정하고 5 x 105 cells/mL의 세포 밀도를 얻는 데 필요한 희석 계수를 계산합니다. 이러한 농도는 궁극적으로 1 x 104 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하는 것으로 이어질 것이다.
참고: 현탁액의 세포 밀도는 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 포함한 여러 방법을 사용하여 결정할 수 있습니다. 관련 조건 하에서 성장한 관심 균주에 대한 세포 밀도 대OD600의 표준 곡선을 본 연구에 사용하였다. 이 곡선은 다양한OD600 값을 갖는 현탁액의 세포 밀도를 결정하기 위해 혈구계(재료 표 참조)를 사용하여 제조하였다. - 세포 현탁액을 2mM NaPB에서 5 x 105 cells/mL로 희석합니다. 이 희석된 현탁액 10mL를 준비하는 것만으로도 이 연구를 완료하기에 충분할 것입니다.
5. 펩타이드 용액을 사용한 C. albicans 의 배양 및 생존력 정량화를 위한 세포 준비
- 희석된 C. albicans 현탁액(4.6단계)을 각 행의 열 1-10 및 열 12에 20μL를 추가합니다(그림 1).
참고: 첫 번째 열의 최종 펩타이드 농도는 이제 펩타이드 스톡 농도의 절반입니다. 본 연구의 경우, 이 시점에서 최종 펩티드 농도는 50 μM이었다. 각 웰의 최종 세포 현탁액에는 2.5 x 105 cells/mL가 포함됩니다. 컬럼 1-10은 다양한 펩타이드 농도에서 항진균 활성을 평가하기 위한 실험 웰 역할을 하고, 컬럼 12는 펩타이드가 없는 성장에 대한 대조군 역할을 합니다. - 20μL의 2mM NaPB를 컬럼 11에 추가합니다. 모든 웰은 이제 1mM NaPB의 최종 농도를 갖습니다. 컬럼 11은 무균 제어 역할을 합니다.
- 플레이트 1(세포 및 펩티드 둘 다 함유)을 커버하고, 이를 30°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
참고: 30분의 배양 시간은 많은 펩티드 17,21,22,30에 대해 충분하지만, 항진균 활성을 발휘하기 위해 더 긴 시간을 필요로 할 수 있는 펩티드를 설명하기 위해 원하는 경우 배양 시간을 60분으로 증가시킬 수 있다 25,31,32. - 생존율을 정량화하는 데 사용할 새로운 96-웰 배양 플레이트(플레이트 2)를 준비합니다(그림 2).
참고: 배양 플레이트는 플레이트 1의 배양 중에 준비해야 합니다.- 플레이트의 모든 웰에 100 μL의 YPD (단계 1.2)를 추가하십시오.
- 100 μL의 2 mM NaPB (단계 1.1)를 플레이트의 모든 웰에 첨가한다.
- 플레이트 1(세포 및 펩타이드 포함)의 샘플을 희석하고 플레이트 2(배지 및 완충액 포함)로 옮깁니다.
- 배양 30분 후 배양기에서 플레이트 1을 회수합니다.
- 각 웰에 총 부피 320μL에 대해 1mM NaPB 280μL(단계 1.1)를 추가하여 플레이트 1의 각 웰을 희석합니다(그림 2).
- 세포와 펩타이드가 포함된 모든 웰을 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 모든 세포가 재현탁되고 웰 바닥에 침전된 세포가 보이지 않도록 합니다.
- 플레이트 1의 각 웰에서 플레이트 2의 해당 웰로 8μL를 옮깁니다. 이 부피는 플레이트 1의 각 웰에서 플레이트 2로 약 250개의 세포를 전달합니다(그림 2).
- 플레이트 2를 덮고 30°C에서 17시간 동안 350rpm으로 마이크로타이터 플레이트 쉐이커( 재료 표 참조) 상에서 인큐베이션합니다.
그림 1: 세포와 함께 펩타이드 연속 희석액의 인큐베이션을 위한 플레이트 1의 준비. 펩티드의 연속 희석은 물에서 이루어지며, C. albicans 세포는 플레이트 1에 첨가된다. 파란색은 펩타이드가 웰에 존재함을 나타내고 회색은 물이 있고 펩타이드가 없는 웰을 나타냅니다. 세포를 포함하는 웰은 검은 점들의 패턴으로 표시됩니다. 이러한 단계 후, 플레이트는 펩타이드가 항진균 활성을 발휘할 수 있도록 배양됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 펩타이드에 의한 생존율 감소를 정량화하기 위한 플레이트 2의 제조. YPD 배지 및 NaPB를 플레이트 2에 첨가한다. 플레이트 1의 내용물을 희석한 후, 각 웰로부터의 분취량을 플레이트 1에서 플레이트 2로 옮긴다. 플레이트 2는 이어서OD600을 측정하여 정량화를 위해 임의의 생존 세포가 성장할 수 있도록 인큐베이션한다. 플레이트 2의 경우 YPD 및 NaPB만 포함하는 웰이 주황색으로 표시됩니다. YPD 및 NaPB와 혼합된 플레이트 1로부터의 분취량을 함유하는 웰은 녹색으로 표시된다. 플레이트 1의 색상에 대한 설명은 그림 1의 범례를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 항진균 활성의 결정
- 플레이트600 의 각 웰에 대한 OD 2 판독값을 얻습니다.
- 배양 17시간 후 인큐베이터에서 플레이트 2를 제거합니다.
- 플레이트 2의 모든 웰을 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 모든 세포가 재현탁되고 웰 바닥에 침전된 세포가 보이지 않도록 합니다.
알림: 기포는 OD600 판독값을 방해할 수 있으므로 이 단계에서 기포를 생성하지 마십시오. 기포가 형성되면 종종 마른 피펫 팁으로 터뜨리거나 두 개의 피펫 팁을 사용하여 우물에서 들어 올려 제거할 수 있습니다. - 600 nm의 파장에서 흡광도 플레이트 리더 ( 재료 표 참조)를 사용하여 각 웰에 대한 OD600 을 얻습니다.
- 성장 억제(백분율)를 계산하고 이를 플로팅하여 펩타이드가 C. albicans의 성장에 미치는 영향을 결정합니다.
- 각 웰에 대해 다음 방정식 17,22,23을 사용하여 대조군과 비교하여 생존율 감소를 백분율로 계산합니다.
여기서 펩티드를 갖는 OD는 주어진 농도의 펩티드를 함유하는 웰의 OD600이고, OD배경은 같은 행에 있는 컬럼 11의 OD600이고,
OD는 동일한 행에 있는 컬럼 12의OD600 이다(대조군은 세포 및 펩타이드를 포함하지 않음). - 예를 들어, 다음 표현식을 사용하여 행 B의 OD600 값에서 Well B5의 생존율 감소를 계산합니다.
- 각 웰에 대해 다음 방정식 17,22,23을 사용하여 대조군과 비교하여 생존율 감소를 백분율로 계산합니다.
- 생존력의 감소를 펩티드 농도의 함수로 표시합니다.
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Representative Results
항진균 펩타이드로 인한 성장 감소를 정량화하기 위해 OD600 측정을 사용하면 도금 샘플 및 CFU 계수에 비해 상당한 시간을 절약할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 서로 다른 3일에 단계를 완료해야 합니다. 첫날에는 완충액과 배지(멸균 시간 제외)를 준비하고 하룻밤 배양을 위해 C. albicans 의 시작 배양을 접종하는 데 약 1시간이 필요합니다. 둘째 날에, 단계는 17시간 인큐베이션을 위한 96-웰 플레이트를 제조하기 위해 5-6시간(계대배양 시간 포함)을 필요로 한다. 셋째 날에는 1 시간 이내에 단계를 완료 할 수 있습니다. 생존력에 대한 정량적 데이터 수집과 관련된 프로토콜 부분에는 약 30분의 작업(17시간의 배양 포함)이 필요합니다. 대조적으로, 한천에 샘플을 도금하고 각 96웰 플레이트 내용물의 단일 복제에 대한 CFU를 계산하려면 3시간 이상의 작업(24시간의 배양 포함)이 필요하므로 이 프로토콜을 사용하여 생존력 정량화를 완료하는 데 필요한 시간이 2.5시간 이상 단축됩니다. 이러한 시간 절약은 실험에 여러 개의 96웰 플레이트가 필요한 경우 증폭됩니다.
설명된 프로토콜은 히스타틴 5 및 라이신 잔기에서 변형을 포함하는 히스타틴 5의 여러 변이체의 항진균 활성을 분석하는 데 사용되었습니다. 5단계에서 펩타이드를 C. albicans 세포와 함께 배양한 후, CFU 계수 방법과 OD600 측정을 통합한 설명된 프로토콜을 모두 사용하여 항진균 활성을 정량화했습니다(그림 3). 중요하게도, 두 가지 방법은 모든 펩타이드에 대해 유사한 결과를 생성했지만, 각 펩타이드는 두 가지 방법에 의해 결정된 생존력 감소에서 통계적으로 유의미한 차이를 갖는 하나의 농도를 가졌습니다. 이러한 각각의 경우에서, OD600 데이터는 CFU 데이터보다 생존율의 감소가 더 낮았으며, 이는 데이터가 비교될 때 단일 분석법이 사용되어야 함을 나타낸다. 중요한 것은 OD600 판독값을 사용하는 데이터는 그림 3의 반복실험의 일반적으로 작은 표준 편차와 이 프로토콜 17,22,23,24,25를 사용하여 발표된 결과로 알 수 있듯이 재현성이 높다는 것입니다.
그림 3: C. albicans 세포 성장의 감소를 정량화하기 위한 전통적인(CFU) 및 기술된(OD) 방법의 비교. 펩티드 (A) 히스타틴 5 (Hst-5) 및 히스타틴 5의 변이체 (B) K5R, (C) K11R, (D) K13R, 및 (E) K17R (지시된 잔기에서 리신에서 아르기닌으로의 변형과 함께)을 프로토콜에 기재된 바와 같이, 50 μM 내지 0.20 μM의 농도로 C. albicans 세포와 함께 배양하였다. 단계 5.5.3 후, 샘플을 한천 상에서 플레이팅하기 위해 제거하거나 (각 실험에 대해 1 회 복제) 새로운 플레이트 (각 실험에 대해 2 회 복제)로 옮겨 프로토콜을 계속하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험(CFU 데이터의 경우 N = 3 데이터 포인트, OD 데이터의 경우 N = 6 데이터 포인트)의 평균을 나타내고 오차 막대는 데이터의 표준 편차를 나타냅니다. Tukey의 다중 비교 검정(α = 0.05)을 사용한 이원 분산 분석(ANOVA)을 수행하여 두 방법 간의 통계적 차이를 식별했습니다. 통계적으로 유의미한 차이가 있는 펩타이드 농도는 플롯에 별표(*)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 진균 병원체 C. albicans에 대한 AMP의 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 얻기 위한 효율적인 접근 방식을 설명합니다. 펩타이드 및 기타 항진균제를 검사하는 일반적인 대안 접근법 중 하나는 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute)의 표준 M2718에 설명된 브로스 미세 희석이지만 이 표준은 정량적 결과 대신 정성적 시각적 결과를 얻는 데 중점을 둡니다. 또 다른 대안적 접근법은 이 프로토콜에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 제조하고 세포와 함께 배양한 다음 웰의 내용물을 한천에 플레이트하여 CFU의 수를 계산하고 펩티드의 효과를 정량화하는 것입니다. 대표적인 결과 섹션에서 언급했듯이, 이 프로토콜에서 세포 성장을 측정하기 위한 OD600 의 사용은 도금 및 계수 CFU에 비해 시간 부담을 실질적으로 감소시킵니다. 우물의 내용물을 한천에 도금할 필요가 없어지면 펩타이드 테스트 프로토콜에 의해 생성되는 플라스틱 폐기물의 양도 줄어듭니다.
이 프로토콜의 여러 측면은 성공을 위해 중요합니다. 많은 양이온성 항균 펩타이드가 시험관 내 8,32,33,34에서 수행된 분석에서 생리학적 염 농도에서 저조한 성능을 나타내기 때문에, 이 분석을 위해 1 mM NaPB 완충액이 선택되었다. 추가적으로, 펩티드 및 C. albicans 세포는 성장 배지에서 오랜 시간이 아닌 완충액에서 짧은 시간(30분) 동안 배양됩니다. 이는 세포의 잠재적인 성장 및 분열을 감소시키며, 이는 펩티드와 함께 배양한 후 남아 있는 생존 가능한 세포의 후속 정량화에 영향을 미칠 수 있습니다. 펩티드를 세포와 함께 배양한 후, 웰을 희석하여 펩티드의 농도를 감소시키고, 원하는 30분 배양35분 이상 계속되는 항진균 활성의 가능성을 감소시킨다. 펩티드의 지속적인 활성에 대한 잠재력은 세포-펩티드 용액을 YPD 배지를 함유하는 플레이트로 이동시킴으로써 더욱 감소된다; 많은 펩티드는 YPD 배지에서 그의 활성을 잃는다 (미공개 데이터), 아마도 일부 항균 펩티드 6,7,34,36의 활성을 감소시키는 것으로 알려진 일가 및 2가 양이온의 존재 때문일 수 있다. 그러나 프로토콜의 성공을 위해 YPD 매체의 활동 부족이 필요한 것은 아닙니다. 마지막으로, C. albicans 세포는 프로토콜의 관련 단계를 위해 30°C에서 성장합니다. 이 온도에서 세포를 성장시킴으로써, 세포는 주로 효모 형태에 있어야하며, 이는 2 단계 및 4 단계에서 세포 수의 정확한 추정을 얻고 6 단계에서 생존율 감소의 신뢰성있는 정량화를 위해 중요하다.
사용자는 이 프로토콜 중에 원치 않는 미생물 유기체에 의한 오염 또는 96웰 플레이트 가장자리의 웰에서 액체가 증발하는 등의 문제에 직면할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 오염이 발생했는지 확인하기 위한 무균 제어용 우물이 포함됩니다. 오염은 분석 결과를 무효화합니다. 사용자가 오염을 관찰하는 경우, 모든 완충액과 배지가 적절하게 멸균되고 피펫팅 시 적절한 멸균 기술이 사용되도록 주의해야 합니다37. 생물 안전 캐비닛에서 작업하면 오염 가능성도 줄일 수 있습니다. 96-웰 플레이트의 에지 웰로부터의 액체의 증발은 마이크로타이터 플레이트(38 )에 대한 공지된 도전이며, 이 프로토콜의 결과에 영향을 미칠 수 있다. 5.3 단계에서 펩타이드를 사용한 세포의 짧은 배양 시간은 에지 효과에 대한 문제를 일으키지 않을 수 있지만, 5.6 단계에서 나머지 생존 세포의 배양이 길어지면 증발을 관찰 할 수 있습니다. 증발이 관찰되는 경우, 다른 96-웰 플레이트를 사용하거나 웰 주위의 공간을 물로 채우면 증발이 감소할 수 있다(38). 사용자는 또한 플레이트의 행 A와 행 H, 열 1 및 열 12를 사용하여 데이터를 얻지 않고 대신 물, 매체 또는 버퍼로 채우는 것을 고려할 수 있습니다.
프로토콜의 여러 측면을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 세포와 펩타이드를 함께 배양할 때 다른 완충액(또는 배지)을 사용할 수 있거나(단계 4-5.3), 펩타이드와 함께 배양한 후 세포 성장을 위해 다른 곰팡이 배양 배지를 사용할 수 있습니다(단계 5.4-5.6). 대체 완충액 및 배지를 사용하면 문헌에 발표된 다른 방법 또는 CLSI 표준18 로 벤치마킹할 수 있으며 의도된 생체 내 사용을 모방하는 조건에서 펩타이드를 테스트하는 데 중요할 것입니다. 일부 사용자가 도움이 될 수 있는 또 다른 수정은 펩타이드를 컬럼을 가로지르지 않고 플레이트의 행 아래로 희석하는 것입니다. 방향을 변경하면 주어진 펩타이드에 대해 테스트할 수 있는 농도의 수가 줄어들지만 단일 플레이트에서 더 많은 펩타이드를 테스트할 수 있으므로 많은 수의 다른 펩타이드를 테스트해야 하는 실험에 유용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 테스트된 각 펩타이드에 대한 복제 데이터를 얻는 것이 중요합니다. 주어진 테스트 날짜에 기술 복제를 포함하면 프로토콜의 가변성을 이해할 수 있습니다. 또한 생물학적 복제를 수행하는 것은 세포 성장의 무작위 변이로 인한 변동성을 이해하는 데 중요합니다. 저자의 실험실은 일반적으로 주어진 펩타이드에 대해 최소 6개의 복제 데이터 포인트를 얻습니다. 테스트는 최소 2일의 다른 날에 수행되며 매일 최소 2개의 기술 복제가 포함됩니다. 일반적으로 서로 다른 2일에 각각 3번의 반복실험이 수행되거나 3일에 각각 2번의 반복실험이 수행됩니다. 그림 3 은 이 프로토콜이 적절하게 수행될 때 작은 표준 편차로 일관된 데이터를 생성한다는 것을 보여줍니다.
이 프로토콜의 간단한 특성으로 인해 프로토콜에 직접 설명되지 않은 많은 실험에서 사용하도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 다른 칸디다 종을 포함한 다른 효모를 테스트하는 데 쉽게 적용될 수 있습니다. 그러나 필라멘트 형태로 자라는 필라멘트 종 또는 이형성 종에는 적합하지 않습니다. 상기 프로토콜은 또한 비펩타이드 항진균제, 예컨대 소분자 약물, 또는 상이한 펩티드 또는 펩티드 단편의 혼합물과 함께 사용하도록 적응될 수 있다. 예를 들어, 암포테리신 B, 플루코나졸, 카스포펑진을 포함한 소분자 약물을 히스토플라스마 효모에 대해 테스트하기 위해 유사한 프로토콜이 이전에 사용되었다39. 저자들은 이 프로토콜을 사용하여 분해되지 않은 펩타이드의 항진균 활성을 펩타이드17,22의 단백질 분해에 의해 형성된 펩타이드 단편 풀과 비교했습니다. 이 프로토콜의 또 다른 확장은 AMP의 항진균 활성의 동역학을 탐구하는 것입니다. 이 프로토콜은 펩타이드가 항진균 활성을 발휘하기 위해 30분의 배양 시간을 사용하지만, 펩타이드가 세포의 생존력을 감소시키는 데 필요한 시간을 더 잘 결정하기 위해 더 짧거나 더 긴 배양 시간을 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 (R03DE029270, T32AI089621B), 국립 과학 재단 (CBET 1511718), 교육부 (GAANN-P200A180093) 및 메릴랜드 대학교 크로스 캠퍼스 종자 보조금의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
References
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