Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantifisering av antifungal aktivitet av peptider mot Candida albicans

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64416
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å oppnå kvantitative data om antifungal aktivitet av peptider og andre forbindelser, slik som småmolekylære antifungale midler, mot Candida albicans. Bruken av optisk tetthet i stedet for å telle kolonidannende enheter for å kvantifisere veksthemming sparer tid og ressurser.

Abstract

Tradisjonelle metoder for å utføre antifungal følsomhetstesting for Candida albicans er tidkrevende og mangler kvantitative resultater. For eksempel er en vanlig tilnærming avhengig av plating celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av antifungale molekyler på agarplater og deretter telle koloniene for å bestemme forholdet mellom molekylkonsentrasjon og veksthemming. Denne metoden krever mange plater og betydelig tid for å telle koloniene. En annen vanlig tilnærming eliminerer plater og telling av kolonier ved visuelt å inspisere kulturer behandlet med antifungale midler for å identifisere minimumskonsentrasjonen som kreves for å hemme veksten; Visuell inspeksjon gir imidlertid bare kvalitative resultater, og informasjon om vekst ved subinhibitoriske konsentrasjoner går tapt. Denne protokollen beskriver en metode for å måle følsomheten til C. albicans til antifungale peptider. Ved å stole på optiske tetthetsmålinger av kulturer, reduserer metoden tiden og materialene som trengs for å oppnå kvantitative resultater på kulturvekst ved forskjellige peptidkonsentrasjoner. Inkubasjonen av sopp med peptider utføres i en 96-brønnplate ved bruk av en passende buffer, med kontroller som ikke representerer veksthemming og fullstendig veksthemming. Etter inkubasjonen med peptidet fortynnes de resulterende cellesuspensjonene for å redusere peptidaktiviteten og vokser deretter over natten. Etter vekst over natten måles den optiske tettheten til hver brønn og sammenlignes med de positive og negative kontrollene for å beregne den resulterende veksthemmingen ved hver peptidkonsentrasjon. Resultatene som bruker denne analysen er sammenlignbare med resultatene ved bruk av den tradisjonelle metoden for plating av kulturene på agarplater, men denne protokollen reduserer plastavfall og tiden brukt på å telle kolonier. Selv om anvendelsene av denne protokollen har fokusert på antifungale peptider, vil metoden også være anvendelig for testing av andre molekyler med kjent eller mistenkt antifungal aktivitet.

Introduction

Candida albicans er medlem av den menneskelige mikrobiota som koloniserer mange steder, inkludert munnhulen, huden, mage-tarmkanalen og skjeden1. For pasienter som er immunkompromitterte på grunn av sykdommer som humant immunsviktvirus (HIV) og immunsuppressiv behandling, kan kolonisering av C. albicans føre til lokal eller systemisk candidiasis 2,3. Bruken av tilgjengelige småmolekylære antifungale terapier, som amfotericin B, azoler eller echinocandiner, kan kompliseres av løselighet og toksisitetsproblemer og ved resistens av infeksjoner til terapeutika 4,5. På grunn av begrensningene i dagens antifungale midler, søker forskere kontinuerlig etter nye antifungale molekyler med aktivitet mot C. albicans.

Antimikrobielle peptider (AMP) er et potensielt alternativ til dagens småmolekylære antifungale midler 6,7,8 og foreslås å være mindre utsatt for utvikling av resistens sammenlignet med småmolekylære legemidler 9. AMP-er er et mangfoldig sett med peptider, men de er ofte kationiske, med et bredt spekter av aktivitet10,11,12. AMPs med aktivitet mot C. albicans inkluderer kjente peptider fra histatin- og cecropinfamiliene 13,14,15, sammen med mer nylig beskrevne peptider som ToAP2, NDBP-5.7 og histatin 5-varianten K11R-K17R16,17. På grunn av deres potensial for behandling av Candida-infeksjoner, er identifisering og design av nye AMPer som retter seg mot C. albicans et viktig mål for mange forskningsgrupper.

Som en del av prosessen for å utvikle effektive AMPs (og andre antifungale midler) som retter seg mot C. albicans, brukes in vitro-testing ofte til å identifisere lovende peptider. Metoder for å teste antifungal aktivitet mot C. albicans involverer vanligvis inkuberende celler med serielle fortynninger av AMPs (i buffer eller medium) i 96-brønnplater. Flere metoder er tilgjengelige for å vurdere antifungal aktivitet etter inkubasjon. En teknikk beskrevet av Clinical Laboratory Standards Institute bruker en rent visuell vurdering av brønnens turbiditet for å bestemme minimumskonsentrasjonen (MIC) for fullstendig hemming av vekst (minst 50% hemming for utvalgte antifungale midler, som azoler og echinocandiner) og gir ingen kvantifisering av vekst ved sub-MIC konsentrasjoner18 . En annen vanlig tilnærming innebærer å kvantifisere levedyktigheten etter inkubasjon med AMP ved plating av innholdet i brønnene på agarplater, inkubere platene og deretter telle antall kolonidannende enheter (CFUer) på platen. Denne metoden har blitt brukt til å evaluere en rekke peptider, inkludert histatin 5-baserte peptider, LL-37 og humant laktoferrin 19,20,21. Denne teknikken krever et relativt stort volum agar og et høyt antall plater og innebærer kjedelig telling av CFU på platene. For å oppnå mer kvantitative data samtidig som det genereres mindre plastavfall og unngår å telle CFUer, kan innholdet i brønnene brukes til å inokulere ferskt medium i en annen 96-brønnsplate. Etter inkubering av den nylig inokulerte platen, kan veksten kvantifiseres ved å måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) på en absorbansplateleser. Denne metoden har blitt brukt til å bestemme den antifungale aktiviteten til histatin 5 og dens nedbrytningsfragmenter og cellepenetrerende peptider 17,22,23,24,25.

Denne protokollen beskriver hvordan man tester den antifungale aktiviteten til peptider og bruker OD600-metoden for å kvantifisere reduksjonen i levedyktigheten til C. albicans på grunn av peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkjenning ble innhentet fra University of Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) for arbeidet med C. albicans i denne protokollen (PN 274). C. albicans-stammen SC5314 (se materialfortegnelse) ble brukt i denne studien; Imidlertid kan enhver annen belastning også brukes.

1. Klargjøring av buffer, sterilt vann og kulturmedium

  1. Tilbered steril 0,1 M natriumfosfatbuffer (NaPB)26 ved pH 7,4, og fortynn til 2 mM og 1 mM med sterilt vann. Klargjøring av 100 ml hver av 2 mM NaPB og 1 mM NaPB vil være mer enn tilstrekkelig for de fleste applikasjoner av denne protokollen.
  2. Forbered steril flytende gjær-pepton-dekstrose (YPD, se materialfortegnelse) medium (10 g / l gjærekstrakt, 20 g / l dekstrose, 20 g / l pepton). Klargjøring av 100 ml YPD vil være mer enn tilstrekkelig for de fleste anvendelser av denne protokollen.
  3. Forbered sterilt ultrarent vann. Forberedelse av 100 ml vann vil være mer enn tilstrekkelig for de fleste applikasjoner av denne protokollen.
    MERK: Bufferne, mediet og vannet steriliseres ved autoklavering ved 121 °C på en væskesyklus i passende tid basert på volumet i beholderne som autoklaveres27. For eksempel, for flasker som inneholder 500 ml, bør eksponeringstiden være 40 min.

2. Inokulering, dyrking og subkulturering av C. albicans

FORSIKTIG: Følg alle institusjonelle og statlige forskrifter for arbeid med C. albicans, som ofte klassifiseres av akademiske forskningsinstitusjoner som en biosikkerhetsnivå (BSL) 2-organisme uavhengig av stoffresistens og av American Type Culture Collection (ATCC) som en BSL1- eller BSL2-organisme, avhengig av stoffresistensen til stammen28.

MERK: Utfør inokulasjons- og dyrkingsdelene av dette trinnet (trinn 2.1-2.2) dagen før du begynner testingen for antifungal aktivitet. Hvis mulig, utfør alle protokolltrinnene med cellene (og løsningene som skal inkuberes med cellene) i et biosikkerhetsskap.

  1. Inokuler den ønskede C. albicans-stammen i 10 ml YPD-medium i et kulturrør.
    MERK: Kulturen kan inokuleres fra et fryselager eller fra en agarplate, men en konsistent kilde må brukes for alle data som skal sammenlignes.
  2. Dyrk kulturen over natten (~ 12-16 timer) ved 30 ° C og 230 o / min på en roterende shaker.
  3. Subkultur over natten kultur C. albicans, og vokse til en OD600 av ~ 1,0-1,2.
    1. Mål OD600 av nattens kultur ved hjelp av et UV-spektrofotometer (se materialfortegnelse).
    2. Basert på OD 600 av natten kultur, bruk over natten kultur for å inokulere en subkultur på en OD600 på 0,1 i10 ml YPD.
    3. Dyrk subkulturen ved 30 ° C på en roterende shaker ved 230 o / min til OD600 når ~ 1,0-1,2, som sannsynligvis vil ta 4-6 timer. Fullfør trinn 3 (forberedelse av peptidløsninger) mens subkulturen vokser; Subkulturen vil bli fortynnet for bruk i analysen i trinn 4.

3. Fremstilling av peptidløsninger i en 96-brønnsplate

MERK: Dette trinnet kan gjøres på forhånd hvis peptidstamløsningene er stabile under lagring. Peptidoppløsningene lagres vanligvis ved −20 °C inntil bruk. De kan tines i et vannbad ved romtemperatur før du går videre til neste trinn.

  1. Bestem den høyeste konsentrasjonen av hvert peptid som skal testes i analysen. Dette vil variere basert på de valgte peptidene. For dataene som ble presentert i den representative resultatdelen, ble histatin 5 og konstruerte analoger22 testet, og den høyeste konsentrasjonen testet var 50 μM.
    MERK: Den høyeste konsentrasjonen som skal testes, bestemmes ved hjelp av data rapportert i litteraturen eller ved å utføre foreløpige eksperimenter over et bredt spekter av peptidkonsentrasjoner. Når det er mulig, bør den høyeste konsentrasjonen velges for å observere et platå for en fullstendig reduksjon i levedyktigheten ved de høyeste konsentrasjonene som er testet, og et platå for ingen reduksjon i levedyktigheten ved de laveste konsentrasjonene som er testet, slik at kvantifisering av hele spekteret av peptidaktivitet.
  2. Løs opp hvert peptid i sterilt vann ved to ganger ønsket høyeste konsentrasjon. For dataene som ble presentert i den representative resultatdelen, ble 150 μL 100 μM løsninger av histatin 5 og konstruerte analoger fremstilt i sterilt vann.
    MERK: Hvis et peptid ikke er løselig i vann, kan det være nødvendig med oppløseliggjøring i et annet løsningsmiddel før dette trinnet. Dimetylsulfoksid (DMSO) brukes ofte til å oppløse peptider i høy konsentrasjon før fortynning til arbeidskonsentrasjonen. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av DMSO er 1% (v / v) eller lavere29 , og at alternative løsningsmidler ikke påvirker veksten av cellene. Sørg også for at løsningsmiddelkonsentrasjonen holdes konstant i alle brønnene i trinn 3.4-3.5.
  3. Tilsett 40 μL av de ønskede peptidstamløsningene til den første brønnen (kolonne 1) i hver rad i en 96-brønns, rundbunnet kulturplate (se materialtabell). Denne platen er plate 1 (figur 1).
    MERK: Hver plate har åtte rader som brukes til testing av peptider. Disse radene kan brukes til forskjellige peptider eller for replikater av de samme peptidene. Inkluder bare et enkelt peptid i hver rad.
  4. Tilsett 20 μL sterilt ultrarent vann til kolonne 2 til kolonne 12 i radene som inneholder peptid (figur 1).
    MERK: Hvis peptidlagrene ble fremstilt med et annet løsningsmiddel enn rent vann i trinn 3.2, bør det sterile vannet i dette trinnet erstattes med løsningsmidlet i peptidstamflokken tilsatt den første kolonnen. For eksempel, hvis peptidet ble solubilisert i DMSO og peptidbestanden inneholder 1 % (v/v) DMSO i vann, må vann som inneholder 1 % DMSO tilsettes i kolonne 2 til kolonne 12.
  5. Serielt fortynn peptidstamoppløsningene over platen til kolonne 10 (figur 1).
    MERK: I stedet for å utføre serielle fortynninger i platen som beskrevet nedenfor, kan fortynningene også utføres i mikrosentrifugerør og overføres til 96-brønnsplaten.
    1. Fjern 20 μL fra kolonne 1, overfør den til kolonne 2 og bland ved å pipettere opp og ned. Kolonne 2 inneholder nå 40 μl peptidoppløsning ved en 1:2 fortynning av konsentrasjonen i kolonne 1.
    2. Fjern 20 μL fra kolonne 2, overfør den til kolonne 3 og bland ved å pipettere opp og ned, slik at kolonne 3 nå inneholder 40 μL peptidoppløsning ved en 1:4-fortynning av konsentrasjonen i kolonne 1.
    3. Gjenta denne prosessen til kolonne 10 inneholder 40 μl peptidoppløsning ved en 1:512 fortynning av konsentrasjonen i kolonne 1.
    4. Fjern 20 mikrol peptidoppløsning fra kolonne 10 og kast den. Hver kolonne inneholder nå 20 μL peptidløsning (kolonne 1-10) eller vann (kolonne 11 og kolonne 12).
      MERK: Brønnene i kolonne 11 fungerer som sterilitetskontroller, og brønnene i kolonne 12 fungerer som kontroller som ikke inneholder peptid.

4. Fortynning av C. albicans subkultur

MERK: Begynn dette trinnet etter at subkulturen har nådd en OD600 på ~ 1,0-1,2 (trinn 2.3.3).

  1. Overfør subkulturen til et 15 ml sentrifugerør, og sentrifuge ved 3,900 x g i 3 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene. Fjern supernatanten ved pipettering eller dekantering.
  2. Resuspender pelleten med 1 ml 2 mM NaPB (trinn 1,1), og overfør suspensjonen til et 1,7 ml sentrifugerør.
  3. Pellet cellene (som i trinn 4.1), kast supernatanten, og resuspender pelleten igjen i 1 ml av 2 mM NaPB.
  4. Gjenta trinn 4.3 ytterligere to ganger for å la de vaskede cellene være i 1 ml NaPB på 2 mM.
  5. Bestem celletettheten til den vaskede suspensjonen, og beregn fortynningsfaktoren som trengs for å oppnå en celletetthet på 5 x 105 celler/ml. Denne konsentrasjonen vil til slutt føre til å legge til 1 x 104 celler til hver brønn i 96-brønnplaten.
    MERK: Celletettheten til suspensjonen kan bestemmes ved hjelp av en rekke metoder, inkludert et hemocytometer eller automatisert celleteller. En standardkurve for celletetthet versus OD600 for stammen av interesse dyrket under relevante forhold ble brukt for denne studien. Denne kurven ble utarbeidet ved hjelp av et hemocytometer (se materialtabell) for å bestemme celletettheten av suspensjoner med varierende OD600-verdier .
  6. Fortynn cellesuspensjonen til 5 x 105 celler/ml i 2 mM NaPB. Tilberedning av 10 ml av denne fortynnede suspensjonen vil være mer enn tilstrekkelig for å fullføre denne studien.

5. Inkubasjon av C. albicans med peptidløsninger og fremstilling av cellene for kvantifisering av levedyktighet

  1. Tilsett 20 μL av den fortynnede C. albicans-suspensjonen (trinn 4.6 ) til kolonne 1-10 og kolonne 12 i hver rad (figur 1).
    MERK: Den endelige peptidkonsentrasjonen i den første kolonnen er nå halvparten av peptidkonsentrasjonen. For denne studien var den endelige peptidkonsentrasjonen 50 μM på dette tidspunktet. Den endelige cellesuspensjonen i hver brønn inneholder 2,5 x 105 celler/ml. Kolonne 1-10 tjener som eksperimentelle brønner for å evaluere antifungal aktivitet ved forskjellige peptidkonsentrasjoner, og kolonne 12 fungerer som en kontroll for vekst uten peptid.
  2. Tilsett 20 μL 2 mM NaPB til kolonne 11. Alle brønnene har nå en endelig konsentrasjon på 1 mM NaPB. Kolonne 11 fungerer som en sterilitetskontroll.
  3. Dekkplate 1 (inneholder både celler og peptid), og inkuber den ved 30 °C i 30 minutter.
    MERK: En inkubasjonstid på 30 min er tilstrekkelig for mange peptider 17,21,22,30, men inkubasjonstiden kan økes til 60 min hvis ønskelig for å ta hensyn til peptider som kan kreve lengre tid for å utøve sin antifungal aktivitet 25,31,32.
  4. Forbered en ny 96-brønns kulturplate (plate 2) til bruk i kvantifisering av levedyktigheten (figur 2).
    MERK: Kulturplaten skal tilberedes under inkubasjonen av plate 1.
    1. Tilsett 100 μL YPD (trinn 1.2) til alle brønnene på platen.
    2. Tilsett 100 μL 2 mM NaPB (trinn 1.1) til alle brønnene på platen.
  5. Fortynn prøvene i plate 1 (som inneholder celler og peptider), og overfør til plate 2 (inneholdende medium og buffer).
    1. Hent plate 1 fra inkubatoren etter 30 min inkubasjon.
    2. Fortynn hver brønn på plate 1 ved å tilsette 280 μL 1 mM NaPB (trinn 1.1) for et totalt volum på 320 μL i hver brønn (figur 2).
    3. Bland alle brønnene som inneholder celler og peptider ved å pipettere opp og ned for å sikre at alle cellene resuspenderes og at ingen sedimenterte celler er synlige i bunnen av brønnene.
    4. Overfør 8 μL fra hver brønn i plate 1 til tilsvarende brønn på plate 2. Dette volumet overfører ca. 250 celler fra hver brønn i plate 1 til plate 2 (figur 2).
  6. Dekkplate 2 og inkuber på en mikrotiterplaterister (se materialfortegnelse) ved 350 o / min i 17 timer ved 30 °C.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling av plate 1 for inkubasjon av peptid serielle fortynninger med celler. Serielle fortynninger av peptidet er laget i vann, og C. albicans celler blir tilsatt til plate 1. En blå farge indikerer at peptid er tilstede i brønnen, og grå indikerer en brønn med vann og ingen peptid. Brønner som inneholder celler er indikert med et mønster av svarte prikker. Etter disse trinnene inkuberes platen for å tillate peptidet å utøve sin antifungale aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fremstilling av plate 2 for å kvantifisere reduksjonen i levedyktighet på grunn av peptidet. YPD-medium og NaPB legges til plate 2. Etter fortynning av innholdet i plate 1 overføres en alikot fra hver brønn fra plate 1 til plate 2. Plate 2 inkuberes deretter for å tillate levedyktige celler å vokse for kvantifisering ved å måle OD600. For Plate 2 er brønner med kun YPD og NaPB vist i oransje. Brønner med alikoter fra plate 1 blandet med YPD og NaPB er vist i grønt. Se forklaringen i figur 1 for beskrivelsen av fargene på plate 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Bestemmelse av antifungal aktivitet

  1. Få OD600-avlesninger for hver brønn i plate 2.
    1. Fjern plate 2 fra inkubatoren etter 17 timers inkubasjon.
    2. Bland alle brønnene i plate 2 ved å pipettere opp og ned for å sikre at alle cellene resuspenderes og at ingen sedimenterte celler er synlige i bunnen av brønnene.
      MERK: Unngå å generere bobler i løpet av dette trinnet, da de kan forstyrre OD600-avlesningene . Hvis bobler dannes, kan de ofte poppes med en tørr pipetspiss eller fjernes ved å bruke to pipettespisser for å løfte dem ut av brønnen.
    3. Bruk en absorbansplateleser (se Materialfortegnelse) ved en bølgelengde på 600 nm for å oppnå OD600 for hver brønn.
  2. Beregn inhiberingen av vekst (i prosent), og plott den for å bestemme effekten av peptidene på veksten av C. albicans.
    1. For hver brønn, beregne reduksjonen i levedyktighet i forhold til kontrollen (i prosent) ved hjelp av følgende ligning 17,22,23:
      Equation 1
      hvor OD med peptid er OD 600 i en brønn som inneholder en gitt konsentrasjon av peptid, er OD-bakgrunnen OD600 i kolonne 11 i samme rad (kontroll som ikke inneholder celler), og
      OD ingen peptid er OD600 i kolonne 12 i samme rad (kontrollceller og ingen peptid).
    2. Bruk for eksempel følgende uttrykk til å beregne reduksjonen i levedyktighet i brønn B5 fra OD600-verdiene for rad B:
      Equation 2
  3. Plott reduksjonen i levedyktighet som en funksjon av peptidkonsentrasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved å bruke OD600-målinger for å kvantifisere reduksjonen i vekst på grunn av soppdrepende peptider, sparer du betydelig tid sammenlignet med platingprøver og telling av CFUer. Metoden beskrevet i denne protokollen krever at du fullfører trinnene på tre forskjellige dager. På den første dagen er det nødvendig med ca. 1 time for å forberede buffere og medier (ikke inkludert steriliseringstiden) og inokulere startkulturen av C. albicans for inkubasjon over natten. På den andre dagen krever trinnene 5-6 timer (inkludert subkultureringstid) for å forberede en 96-brønnsplate for 17-timers inkubasjon. På den tredje dagen kan trinnene fullføres på mindre enn 1 time. Den delen av protokollen som innebærer innsamling av kvantitative data om levedyktighet krever ca. 30 minutters arbeid (pluss 17 timer inkubasjon). I motsetning til dette vil plating av prøvene på agar og telling av CFUene for en enkelt replikasjon av innholdet i hver 96-brønnsplate kreve over 3 timers arbeid (pluss 24 timer inkubasjon), noe som resulterer i over 2,5 timer mindre tid som trengs for å fullføre kvantifiseringen av levedyktighet ved hjelp av denne protokollen. Disse tidsbesparelsene ville bli forsterket hvis flere 96-brønnsplater var nødvendig i et eksperiment.

Den beskrevne protokollen ble brukt til å analysere den antifungale aktiviteten til histatin 5 og flere varianter av histatin 5 som inneholder modifikasjoner ved lysinrester. Etter å ha inkubert peptidene med C. albicans-cellene i trinn 5, ble den antifungale aktiviteten kvantifisert ved hjelp av både CFU-tellemetoden og den beskrevne protokollen som inkorporerte OD600-målinger (figur 3). Det er viktig at de to metodene ga lignende resultater for alle peptider, selv om hvert peptid hadde en konsentrasjon med en statistisk signifikant forskjell i reduksjonen i levedyktighet bestemt av de to metodene. I hvert av disse tilfellene viste OD600-dataene en lavere reduksjon i levedyktighet enn CFU-dataene, noe som indikerer at en enkelt metode må brukes når dataene skal sammenlignes. Det er viktig at data som bruker OD600-avlesningene er svært reproduserbare, som indikert av de generelt små standardavvikene til replikatene i figur 3 og publiserte resultater ved bruk av denne protokollen17,22,23,24,25.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av tradisjonelle (CFU) og beskrevne (OD) metoder for å kvantifisere reduksjonen i C. albicans cellevekst. Peptidet (A) histatin 5 (Hst-5) og variantene av histatin 5 (B) K5R, (C) K11R, (D) K13R og (E) K17R (med lysin til arginin modifikasjon ved de angitte restene) ble inkubert med C. albicans-celler i konsentrasjoner på 50 μM til 0,20 μM, som beskrevet i protokollen. Etter trinn 5.5.3 ble prøvene fjernet for plating på agar (en replikat for hvert eksperiment) eller overført til en ny plate (to replikater for hvert eksperiment) for å fortsette protokollen. Dataene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter (N = 3 datapunkter for CFU-data, N = 6 datapunkter for OD-data), og feilfeltene angir standardavviket til dataene. En toveis variansanalyse (ANOVA) med Tukeys multiple comparisons test (α = 0,05) ble utført for å identifisere statistiske forskjeller mellom de to metodene. Peptidkonsentrasjoner med statistisk signifikant forskjell er notert med en stjerne (*) på plottene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en effektiv tilnærming for å skaffe kvantitative data om den antifungale aktiviteten til AMPs mot sopppatogenet C. albicans. En vanlig alternativ tilnærming til testing av peptider og andre antifungale midler er buljongmikrodilusjonen beskrevet i Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) standard M2718, men denne standarden fokuserer på å oppnå kvalitative visuelle resultater i stedet for kvantitative resultater. En annen alternativ tilnærming er å bruke en metode som ligner den som er beskrevet i denne protokollen for å forberede peptider og inkubere dem med celler og deretter plate innholdet i brønnene på agar for å telle antall CFU og kvantifisere effekten av peptidene. Som nevnt i avsnittet om representative resultater, reduserer denne bruken av OD600 for måling av cellevekst i denne protokollen tidsbelastningen betydelig sammenlignet med plating og telling av CFUer. Eliminering av behovet for plate av innholdet i brønner på agar reduserer også mengden plastavfall som genereres av peptidtestprotokollen.

Flere aspekter ved denne protokollen er viktige for suksessen. Siden mange kationiske antimikrobielle peptider fungerer dårlig i fysiologiske saltkonsentrasjoner i analyser utført in vitro 8,32,33,34, ble en 1 mM NaPB-buffer valgt for denne analysen. I tillegg inkuberes peptidene og C. albicans-cellene i kort tid (30 min) i buffer i stedet for lang tid i vekstmedium. Dette reduserer potensiell vekst og deling av cellene, noe som vil påvirke den etterfølgende kvantifiseringen av de levedyktige cellene som gjenstår etter inkubasjonen med peptidene. Etter inkubasjonen av peptidene med cellene, fortynnes brønnene for å redusere konsentrasjonen av peptidet, noe som reduserer potensialet for antifungal aktivitet som fortsetter utover den ønskede 30 minutters inkubasjonen35. Potensialet for fortsatt aktivitet av peptidene reduseres ytterligere ved overføring av celle-peptidoppløsningen til en plate inneholdende YPD-medium; mange peptider mister sin aktivitet i YPD-mediet (upubliserte data), muligens på grunn av tilstedeværelsen av mono- og divalente kationer, som er kjent for å redusere aktiviteten til noen antimikrobielle peptider 6,7,34,36. Mangel på aktivitet i YPD-mediet er imidlertid ikke nødvendig for protokollens suksess. Til slutt dyrkes C. albicans-cellene ved 30 °C for de relevante trinnene i protokollen. Ved å dyrke cellene ved denne temperaturen, bør cellene primært være i gjærmorfologien, noe som er viktig for å oppnå nøyaktige estimater av antall celler i trinn 2 og trinn 4 og for pålitelig kvantifisering av reduksjonen i levedyktighet i trinn 6.

Brukere kan støte på utfordringer under denne protokollen, inkludert forurensning med uønskede mikrobielle organismer eller fordampning av væske fra brønnene på kantene av 96-brønnplaten. Protokollen inkluderer brønner for sterilitetskontroller for å identifisere om forurensning har oppstått; Forurensning ugyldiggjør analyseresultatene. Hvis brukere observerer forurensning, må det utvises forsiktighet for å sikre at alle buffere og medier er riktig sterilisert og at riktig steril teknikk brukes ved pipettering37. Arbeid i et biosikkerhetsskap vil også redusere potensialet for forurensning. Fordampning av væske fra kantbrønnene til 96-brønnsplater er en kjent utfordring med mikrotiterplater38 og kan påvirke resultatene av denne protokollen. Mens den korte inkubasjonstiden til cellene med peptidet i trinn 5.3 sannsynligvis ikke vil føre til problemer med kanteffekter, kan den lengre inkubasjonen av de gjenværende levedyktige cellene i trinn 5.6 føre til overholdelse av fordampning. Hvis fordampning observeres, kan bruk av forskjellige 96-brønnsplater eller fylling av rommet rundt brønnene med vann redusere fordampningen38. Brukere kan også vurdere å ikke bruke rad A og rad H og kolonne 1 og kolonne 12 på platen for å hente data, i stedet fylle dem med vann, medium eller buffer.

Endringer i mange aspekter av protokollen er mulige. For eksempel kan en annen buffer (eller medium) brukes når man inkuberer cellene og peptidene sammen (trinn 4-5.3), eller et annet soppkulturmedium kan brukes til cellevekst etter inkubasjon med peptidene (trinn 5.4-5.6). Bruk av alternative buffere og medier kan åpne for benchmarking med andre metoder publisert i litteraturen eller med CLSI-standarden18 , og vil være viktig for å teste peptider under forhold som etterligner deres tiltenkte in vivo-bruk . En annen modifikasjon som noen brukere kan finne nyttig, er å fortynne peptidene nedover radene på platen i stedet for over kolonnene. Endring av orienteringen vil redusere antall konsentrasjoner som kan testes for et gitt peptid, men det vil tillate at flere peptider testes i en enkelt plate, noe som kan være nyttig for eksperimenter som krever testing av et stort antall forskjellige peptider.

Det er viktig å skaffe replikatdata for hvert peptid som testes i denne protokollen. Å inkludere tekniske replikater på en gitt testdag gjør det mulig å forstå variasjonen i protokollen. I tillegg er det viktig å utføre biologiske replikater for å forstå variabiliteten fra tilfeldig variasjon i celleveksten. Forfatterens laboratorium oppnår vanligvis minst seks replikere datapunkter for et gitt peptid. Testing utføres på minimum 2 forskjellige dager, og minimum to tekniske replikater er inkludert på hver dag. Vanligvis utføres tre replikater på hver av 2 forskjellige dager eller to replikater på hver av 3 forskjellige dager. Figur 3 viser at denne protokollen gir konsistente data med små standardavvik når den utføres riktig.

Den enkle naturen til denne protokollen gjør at den kan tilpasses for bruk i mange eksperimenter som ikke er direkte beskrevet i protokollen. For eksempel kan protokollen enkelt tilpasses for testing av andre gjærsopper, inkludert andre Candida-arter. Det er imidlertid ikke godt egnet for trådformede arter eller dimorfe arter som vokser i deres trådformede morfologi. Protokollen kan også tilpasses for bruk med ikke-peptid antifungale midler, for eksempel småmolekylære legemidler, eller blandinger av forskjellige peptider eller peptidfragmenter. For eksempel har lignende protokoller tidligere blitt brukt til å teste småmolekylære legemidler, inkludert amfotericin B, flukonazol og caspofungin, mot histoplasmagjær 39. Forfatterne har brukt protokollen til å sammenligne den antifungale aktiviteten til ikke-nedbrutte peptider med bassenger av peptidfragmenter dannet ved proteolyse av peptidet17,22. En annen utvidelse av denne protokollen ville være å utforske kinetikken til den antifungale aktiviteten til AMP-er. Denne protokollen bruker en inkubasjonstid på 30 minutter for peptidene til å utøve sin antifungale aktivitet, men kortere eller lengre inkubasjonstider kan brukes til bedre å bestemme tiden som kreves for peptidene for å redusere cellens levedyktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), National Science Foundation (CBET 1511718), Department of Education (GAANN-P200A180093) og et University of Maryland Cross-Campus Seed Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates (round bottom) VWR 10062-902
Absorbance microplate reader N/A N/A Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314 ATCC  MYA-2876 Other C. albicans may also be used
Hemocytometer N/A N/A Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker VWR 2620-926
Peptide(s) N/A N/A Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors VWR 18900-320 Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic Fisher Scientific BP332-500 For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific BP329-500 For making NaPB
UV spectrophotometer N/A N/A Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder BD Life Sciences 242820 May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Tags

Biologi utgave 191 Candida albicans peptider antimikrobielle peptider soppdrepende følsomhetstesting gjær optisk tetthet
Kvantifisering av antifungal aktivitet av peptider mot <em>Candida albicans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P.,… More

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P., Karlsson, A. J. Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans. J. Vis. Exp. (191), e64416, doi:10.3791/64416 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter