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Biology

Quantificando a atividade antifúngica de peptídeos contra Candida albicans

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64416
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Summary

Este protocolo descreve um método para a obtenção de dados quantitativos sobre a atividade antifúngica de peptídeos e outros compostos, como agentes antifúngicos de moléculas pequenas, contra Candida albicans. Seu uso de densidade óptica em vez de contar unidades formadoras de colônias para quantificar a inibição do crescimento economiza tempo e recursos.

Abstract

Os métodos tradicionais para a realização de testes de suscetibilidade antifúngica para Candida albicans são demorados e carecem de resultados quantitativos. Por exemplo, uma abordagem comum baseia-se no revestimento de células tratadas com diferentes concentrações de moléculas antifúngicas em placas de ágar e, em seguida, na contagem das colônias para determinar a relação entre a concentração da molécula e a inibição do crescimento. Este método requer muitas placas e tempo substancial para contar as colônias. Outra abordagem comum elimina as placas e a contagem de colônias, inspecionando visualmente as culturas tratadas com agentes antifúngicos para identificar a concentração mínima necessária para inibir o crescimento; no entanto, a inspeção visual produz apenas resultados qualitativos e as informações sobre o crescimento em concentrações subinibitórias são perdidas. Este protocolo descreve um método para medir a suscetibilidade de C. albicans a peptídeos antifúngicos. Baseando-se em medições ópticas de densidade de culturas, o método reduz o tempo e os materiais necessários para obter resultados quantitativos sobre o crescimento da cultura em diferentes concentrações de peptídeos. A incubação do fungo com peptídeos é realizada em uma placa de 96 poços usando um tampão apropriado, com controles representando nenhuma inibição de crescimento e inibição completa do crescimento. Após a incubação com o peptídeo, as suspensões celulares resultantes são diluídas para reduzir a atividade peptídica e, em seguida, cultivadas durante a noite. Após o crescimento noturno, a densidade óptica de cada poço é medida e comparada com os controles positivos e negativos para calcular a inibição de crescimento resultante em cada concentração de peptídeo. Os resultados usando este ensaio são comparáveis aos resultados usando o método tradicional de chapeamento das culturas em placas de ágar, mas este protocolo reduz o desperdício de plástico e o tempo gasto na contagem de colônias. Embora as aplicações deste protocolo tenham se concentrado em peptídeos antifúngicos, o método também será aplicável ao teste de outras moléculas com atividade antifúngica conhecida ou suspeita.

Introduction

Candida albicans é um membro da microbiota humana que coloniza vários locais, incluindo a cavidade oral, pele, trato gastrointestinal e vagina1. Para pacientes imunocomprometidos devido a doenças como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e tratamentos imunossupressores, a colonização de C. albicans pode levar à candidíase local ou sistêmica 2,3. O uso de terapias antifúngicas de moléculas pequenas atualmente disponíveis, como anfotericina B, azóis ou equinocandinas, pode ser complicado por problemas de solubilidade e toxicidade e pela resistência de infecções à terapêutica 4,5. Devido às limitações dos agentes antifúngicos atuais, os pesquisadores estão continuamente procurando novas moléculas antifúngicas com atividade contra C. albicans.

Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são uma alternativa potencial aos atuais agentes antifúngicos de moléculas pequenas 6,7,8 e são propostos como menos suscetíveis ao desenvolvimento de resistência em comparação com os fármacos de moléculas pequenas 9. Os AMPs são um conjunto diversificado de peptídeos, mas muitas vezes são catiônicos, com amplo espectro de atividade10,11,12. Os AMPs com atividade contra C. albicans incluem peptídeos bem conhecidos das famílias histatina e cecropina13,14,15, juntamente com peptídeos descritos mais recentemente como ToAP2, NDBP-5.7 e a variante de histatina 5 K11R-K17R 16,17. Devido ao seu potencial para o tratamento de infecções por Candida, identificar e projetar novos AMPs que visam C. albicans é um objetivo importante para muitos grupos de pesquisa.

Como parte do processo para desenvolver AMPs eficazes (e outros agentes antifúngicos) que visam C. albicans, testes in vitro são comumente usados para identificar peptídeos promissores. Métodos para testar a atividade antifúngica contra C. albicans geralmente envolvem a incubação de células com diluições seriadas dos AMPs (em tampão ou meio) em placas de 96 poços. Vários métodos estão disponíveis para avaliar a atividade antifúngica após a incubação. Uma técnica descrita pelo Clinical Laboratory Standards Institute utiliza uma avaliação puramente visual da turbidez dos poços para determinar a concentração mínima (CIM) para a inibição completa do crescimento (pelo menos 50% de inibição para agentes antifúngicos selecionados, como azóis e equinocandinas) e não fornece quantificação do crescimento em concentrações sub-CIM18 . Outra abordagem comumente usada envolve quantificar a viabilidade após a incubação com AMPs chapeando o conteúdo dos poços em placas de ágar, incubando as placas e, em seguida, contando o número de unidades formadoras de colônias (UFCs) na placa. Este método tem sido utilizado para avaliar uma série de peptídeos, incluindo peptídeos à base de histatina 5, LL-37 e lactoferrina humana 19,20,21. Esta técnica requer um volume relativamente grande de ágar e um alto número de placas e envolve a tediosa contagem de UFCs nas placas. Para obter mais dados quantitativos, gerando menos resíduos plásticos e evitando a contagem de UFCs, o conteúdo dos poços pode ser usado para inocular o meio fresco em outra placa de 96 poços. Após a incubação da placa recém-inoculada, o crescimento pode ser quantificado medindo a densidade óptica a 600 nm (OD600) em um leitor de placa de absorbância. Este método tem sido utilizado para determinar a atividade antifúngica da histatina 5 e seus fragmentos de degradação e peptídeos penetrantes celulares 17,22,23,24,25.

Este protocolo descreve como testar a atividade antifúngica de peptídeos e utiliza o método OD600 para quantificar a redução da viabilidade de C. albicans devido a peptídeos.

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Protocol

A aprovação foi obtida da University of Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) para o trabalho com C. albicans neste protocolo (PN 274). A cepa SC5314 de C. albicans (ver Tabela de Materiais) foi utilizada no presente estudo; no entanto, qualquer outra estirpe também pode ser utilizada.

1. Preparação do tampão, da água estéril e do meio de cultura

  1. Preparar tampão de fosfato de sódio estéril 0,1 M (NaPB)26 a pH 7,4 e diluir a 2 mM e 1 mM com água estéril. Preparar 100 mL cada de 2 mM de NaPB e 1 mM de NaPB será mais do que suficiente para a maioria das aplicações deste protocolo.
  2. Preparar levedura líquida estéril-peptona-dextrose (YPD, ver Tabela de Materiais) meio (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de dextrose, 20 g/L de peptona). A preparação de 100 mL de YPD será mais do que suficiente para a maioria das aplicações deste protocolo.
  3. Prepare água ultrapura estéril. A preparação de 100 mL de água será mais do que suficiente para a maioria das aplicações deste protocolo.
    NOTA: Os tampões, meios e água são esterilizados por autoclave a 121 °C em um ciclo líquido por um tempo apropriado com base no volume nos recipientes a serem autoclavados27. Por exemplo, para frascos contendo 500 mL, o tempo de exposição deve ser de 40 min.

2. Inoculação, cultivo e subcultura de C. albicans

CUIDADO: Siga todas as regulamentações institucionais e governamentais para trabalhar com C. albicans, que é frequentemente classificado por instituições de pesquisa acadêmica como um organismo de nível de biossegurança (BSL) 2, independentemente da resistência a medicamentos, e pela American Type Culture Collection (ATCC) como um organismo BSL1 ou BSL2, dependendo da resistência a medicamentos da cepa28.

NOTA: Execute as partes de inoculação e cultura desta etapa (etapas 2.1-2.2) no dia anterior ao início do teste de atividade antifúngica. Se possível, execute todas as etapas do protocolo com as células (e as soluções que serão incubadas com as células) em um gabinete de biossegurança.

  1. Inocular a cepa desejada de C. albicans em 10 mL de meio YPD em um tubo de cultura.
    NOTA: A cultura pode ser inoculada a partir de um estoque congelador ou de uma placa de ágar, mas uma fonte consistente deve ser usada para todos os dados que serão comparados.
  2. Cultive a cultura durante a noite (~12-16 h) a 30 °C e 230 rpm em um agitador rotativo.
  3. Subcultura a cultura noturna de C. albicans, e crescer para um OD600 de ~ 1,0-1,2.
    1. Medir a OD600 da cultura noturna usando um espectrofotômetro UV (ver Tabela de Materiais).
    2. Com base na OD 600 da cultura noturna, use a cultura noturna para inocular uma subcultura a uma OD600 de 0,1 em10 mL de YPD.
    3. Aumente a subcultura a 30 °C em um agitador rotativo a 230 rpm até que o OD600 atinja ~1,0-1,2, o que provavelmente levará de 4 a 6 h. Completar a etapa 3 (preparação de soluções peptídicas) enquanto a subcultura está crescendo; a subcultura será diluída para utilização no ensaio no passo 4.

3. Preparação das soluções peptídicas em uma placa de 96 poços

NOTA: Esta etapa pode ser feita com antecedência, se as soluções de estoque de peptídeos forem estáveis durante o armazenamento. Normalmente, as soluções peptídicas são armazenadas a -20 °C até o uso. Eles podem ser descongelados em um banho de água à temperatura ambiente antes de prosseguir para a próxima etapa.

  1. Determinar a concentração mais elevada de cada péptido a ensaiar no ensaio. Isso irá variar com base nos peptídeos selecionados. Para os dados apresentados na seção de resultados representativos, a histatina 5 e os análogos de engenharia22 foram testados, e a maior concentração testada foi de 50 μM.
    NOTA: A concentração mais elevada a ensaiar é determinada utilizando dados reportados na literatura ou através da realização de experiências preliminares numa vasta gama de concentrações de péptidos. Quando possível, a concentração mais alta deve ser selecionada para observar um platô para uma redução completa da viabilidade nas concentrações mais altas testadas e um platô para nenhuma redução na viabilidade nas concentrações mais baixas testadas, permitindo a quantificação de toda a faixa de atividade peptídica.
  2. Dissolva cada peptídeo em água estéril com o dobro da concentração mais alta desejada. Para os dados apresentados na seção de resultados representativos, 150 μL de soluções de 100 μM de histatina 5 e análogos de engenharia foram preparados em água estéril.
    NOTA: Se um peptídeo não é solúvel em água, a solubilização em outro solvente pode ser necessária antes desta etapa. O sulfóxido de dimetilo (DMSO) é comumente usado para solubilizar peptídeos em uma alta concentração antes de diluir para a concentração de trabalho. Certifique-se de que a concentração final do DMSO seja de 1% (v/v) ou inferior29 e que solventes alternativos não afetem o crescimento das células. Além disso, certifique-se de que a concentração de solvente é mantida constante em todos os poços nas etapas 3.4-3.5.
  3. Adicionar 40 μL das soluções-estoque de peptídeos desejadas ao primeiro poço (Coluna 1) de cada linha em uma placa de cultura de fundo redondo de 96 poços (ver Tabela de Materiais). Esta placa é a Placa 1 (Figura 1).
    NOTA: Cada placa tem oito linhas que são usadas para testar peptídeos. Essas linhas podem ser usadas para diferentes peptídeos ou para replicações dos mesmos peptídeos. Inclua apenas um único peptídeo em cada linha.
  4. Adicionar 20 μL de água ultrapura estéril à coluna 2 à coluna 12 das linhas que contêm péptido (Figura 1).
    NOTA: Se as reservas de péptidos tiverem sido preparadas com um solvente diferente da água pura no passo 3.2, a água estéril nesta etapa deve ser substituída pelo solvente presente na reserva de péptidos adicionado à primeira coluna. Por exemplo, se o peptídeo foi solubilizado em DMSO e o estoque de peptídeo contém 1% (v/v) de DMSO em água, a água contendo 1% de DMSO deve ser adicionada à coluna 2 à coluna 12.
  5. Diluir serialmente as soluções-mãe peptídicas através da placa até à coluna 10 (Figura 1).
    NOTA: Em vez de realizar as diluições em série na placa, conforme descrito abaixo, as diluições também podem ser realizadas em tubos de microcentrífuga e transferidas para a placa de 96 poços.
    1. Remova 20 μL da coluna 1, transfira-o para a coluna 2 e misture pipetando para cima e para baixo. A coluna 2 contém agora 40 μL de solução peptídica a uma diluição 1:2 da concentração na coluna 1.
    2. Remova 20 μL da coluna 2, transfira-a para a coluna 3 e misture pipetando para cima e para baixo, de modo que a coluna 3 agora contém 40 μL de solução peptídica a uma diluição 1:4 da concentração na coluna 1.
    3. Repetir este processo até que a coluna 10 contenha 40 μL de solução peptídica a uma diluição 1:512 da concentração na coluna 1.
    4. Remova 20 μL de solução peptídica da coluna 10 e descarte-a. Cada coluna contém agora 20 μL de solução peptídica (Colunas 1-10) ou água (Coluna 11 e Coluna 12).
      NOTA: Os poços na Coluna 11 servem como controles de esterilidade, e os poços na Coluna 12 servem como controles que não contêm peptídeo.

4. Diluição da subcultura de C. albicans

Observação : inicie esta etapa depois que a subcultura atingiu um OD600 de ~ 1.0-1.2 (etapa 2.3.3).

  1. Transfira a subcultura para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 3.900 x g por 3 min à temperatura ambiente para peletizar as células. Remova o sobrenadante por pipetagem ou decantação.
  2. Ressuscite o pellet com 1 mL de NaPB 2 mM (etapa 1.1) e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,7 mL.
  3. Pellet as células (como na etapa 4.1), descarte o sobrenadante e ressuspenda novamente o pellet em 1 mL de 2 mM de NaPB.
  4. Repita o passo 4.3 duas vezes adicionais para deixar as células lavadas em 1 ml de NaPB 2 mM.
  5. Determine a densidade celular da suspensão lavada e calcule o fator de diluição necessário para obter uma densidade celular de 5 x 105 células/mL. Esta concentração acabará por levar à adição de 1 x 104 células a cada poço da placa de 96 poços.
    NOTA: A densidade celular da suspensão pode ser determinada usando vários métodos, incluindo um hemocitômetro ou contador de células automatizado. Uma curva padrão de densidade celular versus DO600 para a cepa de interesse cultivada em condições relevantes foi utilizada para o presente estudo. Esta curva foi preparada usando um hemocitômetro (ver Tabela de Materiais) para determinar a densidade celular de suspensões com valores variáveis deDO 600 .
  6. Diluir a suspensão celular para 5 x 105 células/ml em 2 mM de NaPB. A preparação de 10 ml desta suspensão diluída será mais do que suficiente para completar este estudo.

5. Incubação de C. albicans com soluções peptídicas e preparação das células para a quantificação da viabilidade

  1. Adicionar 20 μL da suspensão diluída de C. albicans (passo 4.6 ) às colunas 1-10 e 12 de cada linha (Figura 1).
    NOTA: A concentração final de peptídeo na primeira coluna é agora metade da concentração de estoque de peptídeo. Para o presente estudo, a concentração final do peptídeo foi de 50 μM neste momento. A suspensão celular final em cada poço contém 2,5 x 105 células/mL. As colunas 1-10 servem como poços experimentais para avaliar a atividade antifúngica em diferentes concentrações de peptídeos, e a coluna 12 serve como um controle para o crescimento sem peptídeo.
  2. Adicionar 20 μL de 2 mM de NaPB à coluna 11. Todos os poços agora têm uma concentração final de 1 mM de NaPB. A coluna 11 serve como um controle de esterilidade.
  3. Cobrir a placa 1 (contendo células e péptido) e incubá-la a 30 °C durante 30 min.
    NOTA: Um tempo de incubação de 30 min é suficiente para muitos peptídeos 17,21,22,30, mas o tempo de incubação pode ser aumentado para 60 min se desejado para explicar peptídeos que podem exigir um tempo maior para exercer sua atividade antifúngica 25,31,32.
  4. Preparar uma nova placa de cultura de 96 poços (Placa 2) para uso na quantificação da viabilidade (Figura 2).
    NOTA: A placa de cultura deve ser preparada durante a incubação da Placa 1.
    1. Adicionar 100 μL de YPD (passo 1.2) a todos os poços da placa.
    2. Adicionar 100 μL de 2 mM de NaPB (Passo 1.1) a todos os poços da placa.
  5. Diluir as amostras na Placa 1 (contendo células e péptidos) e transferir para a Placa 2 (contendo meio e tampão).
    1. Recupere a Placa 1 da incubadora após os 30 minutos de incubação.
    2. Diluir cada poço da placa 1 adicionando 280 μL de 1 mM de NaPB (passo 1.1) para um volume total de 320 μL em cada poço (Figura 2).
    3. Misture todos os poços que contêm células e peptídeos pipetando para cima e para baixo para garantir que todas as células sejam ressuspensas e que nenhuma célula sedimentada seja visível no fundo dos poços.
    4. Transferir 8 μL de cada poço na Placa 1 para o poço correspondente da Placa 2. Esse volume transfere aproximadamente 250 células de cada poço da Placa 1 para a Placa 2 (Figura 2).
  6. Cobrir a placa 2 e incubar num agitador de placa de microtitulação (ver Tabela de Materiais) a 350 rpm durante 17 h a 30 °C.

Figure 1
Figura 1: Preparação da Placa 1 para a incubação de diluições seriadas peptídicas com células. Diluições seriadas do peptídeo são feitas em água, e células de C. albicans são adicionadas à Placa 1. Uma cor azul indica que o peptídeo está presente no poço, e cinza indica um poço com água e sem peptídeo. Poços contendo células são indicados com um padrão de pontos pretos. Após essas etapas, a placa é incubada para permitir que o peptídeo exerça sua atividade antifúngica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparação da Placa 2 para quantificar a redução da viabilidade devido ao peptídeo. O meio YPD e o NaPB são adicionados à Placa 2. Após diluição do conteúdo da placa 1, uma alíquota de cada poço é transferida da placa 1 para a placa 2. A placa 2 é então incubada para permitir que quaisquer células viáveis cresçam para quantificação, medindo a OD600. Para a Placa 2, os poços contendo apenas YPD e NaPB são mostrados em laranja. Poços contendo alíquotas da Placa 1 misturadas com o YPD e NaPB são mostrados em verde. Consulte a legenda da Figura 1 para obter a descrição das cores na Placa 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Determinação da atividade antifúngica

  1. Obtenha leituras OD600 para cada poço na Placa 2.
    1. Retirar a Placa 2 da incubadora após 17 h de incubação.
    2. Misture todos os poços na Placa 2 pipetando para cima e para baixo para garantir que todas as células sejam ressuspensas e que nenhuma célula assentada seja visível no fundo dos poços.
      Observação : evite gerar bolhas durante esta etapa, pois elas podem interferir com as leituras OD600 . Se as bolhas se formarem, muitas vezes elas podem ser estouradas com uma ponta de pipeta seca ou removidas usando duas pontas de pipeta para levantá-las para fora do poço.
    3. Use um leitor de placas de absorbância (ver Tabela de Materiais) a um comprimento de onda de 600 nm para obter o OD600 para cada poço.
  2. Calcule a inibição do crescimento (como uma porcentagem) e plote-a para determinar o efeito dos peptídeos no crescimento de C. albicans.
    1. Para cada poço, calcule a redução da viabilidade em relação ao controle (em porcentagem) usando a seguinte equação 17,22,23:
      Equation 1
      onde OD com peptídeo é o OD600 de um poço contendo uma dada concentração de peptídeo, ofundo OD é o OD600 da coluna 11 na mesma linha (controle que não contém células), e
      OD no peptídeo é o OD600 da Coluna 12 na mesma linha (controle contendo células e sem peptídeo).
    2. Por exemplo, use a seguinte expressão para calcular a redução na viabilidade no Poço B5 a partir dos valores OD600 para a Linha B:
      Equation 2
  3. Plotar a redução da viabilidade em função da concentração de péptidos.

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Representative Results

O uso de medições de OD600 para quantificar a redução no crescimento devido a peptídeos antifúngicos economiza tempo substancial em comparação com o revestimento de amostras e a contagem de UFCs. O método descrito neste protocolo requer a conclusão das etapas em três dias diferentes. No primeiro dia, aproximadamente 1 h é necessário para preparar os tampões e meios (não incluindo o tempo de esterilização) e inocular a cultura inicial de C. albicans para incubação noturna. No segundo dia, as etapas requerem 5-6 h (incluindo o tempo de subcultura) para preparar uma placa de 96 poços para a incubação de 17 h. No terceiro dia, as etapas podem ser concluídas em menos de 1 h. A parte do protocolo que envolve a coleta de dados quantitativos sobre viabilidade requer aproximadamente 30 min de trabalho (mais 17 h de incubação). Em contraste, o revestimento das amostras em ágar e a contagem das UFCs para uma única repetição do conteúdo de cada placa de 96 poços exigiriam mais de 3 h de trabalho (mais 24 h de incubação), resultando em mais de 2,5 h a menos de tempo necessário para completar a quantificação da viabilidade usando este protocolo. Essas economias de tempo seriam amplificadas se várias placas de 96 poços fossem necessárias em um experimento.

O protocolo descrito foi utilizado para testar a atividade antifúngica da histatina 5 e várias variantes da histatina 5 contendo modificações nos resíduos de lisina. Após incubação dos peptídeos com as células de C. albicans na etapa 5, a atividade antifúngica foi quantificada tanto pelo método de contagem da UFC quanto pelo protocolo descrito incorporando medidas de DO600 (Figura 3). É importante ressaltar que os dois métodos produziram resultados semelhantes para todos os peptídeos, embora cada peptídeo tivesse uma concentração com uma diferença estatisticamente significativa na redução da viabilidade determinada pelos dois métodos. Em cada um desses casos, os dados do OD600 mostraram uma redução de viabilidade menor do que os dados da UFC, indicando que um único método deve ser usado quando os dados serão comparados. É importante ressaltar que os dados que utilizam as leituras de OD600 são altamente reprodutíveis, como indicado pelos desvios-padrão geralmente pequenos das replicações na Figura 3 e resultados publicados utilizando esse protocolo17,22,23,24,25.

Figure 3
Figura 3: Comparação dos métodos tradicionais (UFC) e descritos (OD) para quantificar a redução do crescimento celular de C. albicans. O peptídeo (A) histatina 5 (Hst-5) e as variantes de histatina 5 (B) K5R, (C) K11R, (D) K13R e (E) K17R (com modificação de lisina para arginina nos resíduos indicados) foram incubados com células de C. albicans nas concentrações de 50 μM a 0,20 μM, conforme descrito no protocolo. Após a etapa 5.5.3, as amostras foram retiradas para plaqueamento em ágar (uma réplica para cada experimento) ou transferidas para uma nova placa (duas repetições para cada experimento) para dar continuidade ao protocolo. Os dados representam a média de três experimentos independentes (N = 3 pontos de dados para dados de UFC , N = 6 pontos de dados para dados de DO), e as barras de erro indicam o desvio padrão dos dados. Uma análise de variância bidirecional (ANOVA) com o teste de comparações múltiplas de Tukey (α = 0,05) foi realizada para identificar diferenças estatísticas entre os dois métodos. As concentrações de péptidos com uma diferença estatisticamente significativa são observadas por um asterisco (*) nas parcelas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve uma abordagem eficiente para a obtenção de dados quantitativos sobre a atividade antifúngica de AMPs contra o patógeno fúngico C. albicans. Uma abordagem alternativa comum para testar peptídeos e outros agentes antifúngicos é a microdiluição em caldo descrita no padrão M2718 do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), mas esse padrão se concentra na obtenção de resultados visuais qualitativos em vez de resultados quantitativos. Outra abordagem alternativa é usar um método semelhante ao descrito neste protocolo para preparar peptídeos e incubá-los com células e, em seguida, chapear o conteúdo dos poços em ágar para contar o número de UFCs e quantificar o efeito dos peptídeos. Como observado na seção de resultados representativos, esse uso de OD600 para medir o crescimento celular neste protocolo reduz substancialmente a carga de tempo em comparação com o revestimento e a contagem de UFCs. Eliminar a necessidade de chapear o conteúdo de poços em ágar também reduz a quantidade de resíduos plásticos gerados pelo protocolo de teste de peptídeos.

Vários aspectos deste protocolo são importantes para o seu sucesso. Como muitos peptídeos antimicrobianos catiônicos apresentam desempenho ruim em concentrações fisiológicas de sal em ensaios realizados in vitro 8,32,33,34, um tampão NaPB de 1 mM foi selecionado para este ensaio. Além disso, os peptídeos e as células de C. albicans são incubados por um curto período de tempo (30 min) em tampão, em vez de um longo tempo em meio de crescimento. Isso reduz o potencial de crescimento e divisão das células, o que afetaria a quantificação subsequente das células viáveis remanescentes após a incubação com os peptídeos. Após a incubação dos peptídeos com as células, os poços são diluídos para reduzir a concentração do peptídeo, reduzindo o potencial de atividade antifúngica continuando além dos 30 min de incubação desejados35. O potencial para a atividade contínua dos peptídeos é ainda mais reduzido pela transferência da solução de peptídeo celular para uma placa contendo meio YPD; muitos peptídeos perdem sua atividade no meio YPD (dados não publicados), possivelmente devido à presença de cátions mono e divalentes, que são conhecidos por reduzir a atividade de alguns peptídeos antimicrobianos 6,7,34,36. No entanto, a falta de atividade no meio YPD não é necessária para o sucesso do protocolo. Finalmente, as células de C. albicans são cultivadas a 30 °C para as etapas relevantes do protocolo. Ao cultivar as células a esta temperatura, as células devem estar principalmente na morfologia da levedura, o que é importante para a obtenção de estimativas precisas do número de células nas etapas 2 e 4 e para a quantificação confiável da redução da viabilidade na etapa 6.

Os usuários podem encontrar desafios durante este protocolo, incluindo a contaminação com organismos microbianos indesejados ou a evaporação do líquido dos poços nas bordas da placa de 96 poços. O protocolo inclui poços para controles de esterilidade para identificar se ocorreu contaminação; a contaminação invalida os resultados do ensaio. Se os usuários observarem contaminação, deve-se tomar cuidado para garantir que todos os tampões e meios sejam devidamente esterilizados e que a técnica estéril adequada seja usada na pipetagem37. Trabalhar em um gabinete de biossegurança também reduzirá o potencial de contaminação. A evaporação do líquido dos poços de borda de placas de 96 poços é um desafio conhecido com placas de microtitulação38 e pode afetar os resultados deste protocolo. Embora o curto tempo de incubação das células com o peptídeo na etapa 5.3 provavelmente não leve a problemas com efeitos de borda, a incubação mais longa das células viáveis restantes na etapa 5.6 pode levar à observância da evaporação. Se a evaporação for observada, o uso de diferentes placas de 96 poços ou o preenchimento do espaço ao redor dos poços com água pode reduzir a evaporação38. Os usuários também podem considerar não usar a Linha A e a Linha H e a Coluna 1 e a Coluna 12 da placa para obter dados, em vez disso, enchê-los com água, meio ou buffer.

Modificações em muitos aspectos do protocolo são possíveis. Por exemplo, um tampão diferente (ou meio) poderia ser usado ao incubar as células e peptídeos juntos (etapas 4-5.3), ou outro meio de cultura fúngica poderia ser usado para o crescimento celular após a incubação com os peptídeos (etapas 5.4-5.6). O uso de buffers e meios alternativos pode permitir o benchmarking com outros métodos publicados na literatura ou com o padrão CLSI18 e será importante para testar peptídeos em condições que imitam seu uso in vivo pretendido. Outra modificação que alguns usuários podem achar útil é diluir os peptídeos nas linhas da placa, em vez de através das colunas. Mudar a orientação reduziria o número de concentrações que poderiam ser testadas para um determinado peptídeo, mas permitiria que mais peptídeos fossem testados em uma única placa, o que poderia ser útil para experimentos que exigem o teste de um grande número de peptídeos diferentes.

A obtenção de dados replicados para cada peptídeo testado neste protocolo é importante. A inclusão de replicações técnicas em um determinado dia de teste permite entender a variabilidade do protocolo. Além disso, a realização de replicações biológicas é importante para entender a variabilidade da variação aleatória no crescimento das células. O laboratório dos autores normalmente obtém pelo menos seis pontos de dados replicados para um determinado peptídeo. O teste é realizado em um mínimo de 2 dias diferentes, e um mínimo de duas replicações técnicas são incluídas em cada dia. Comumente, três repetições são realizadas em cada um dos 2 dias diferentes ou duas replicações em cada um dos 3 dias diferentes. A Figura 3 mostra que esse protocolo produz dados consistentes com pequenos desvios-padrão quando bem executado.

A natureza simples deste protocolo permite que ele seja adaptado para uso em muitos experimentos não diretamente descritos no protocolo. Por exemplo, o protocolo poderia ser facilmente adaptado para testar outras leveduras, incluindo outras espécies de Candida. No entanto, não é adequado para espécies filamentosas ou dimórficas que crescem em sua morfologia filamentosa. O protocolo também pode ser adaptado para uso com agentes antifúngicos não peptídicos, como drogas de moléculas pequenas, ou misturas de diferentes peptídeos ou fragmentos de peptídeos. Por exemplo, protocolos semelhantes foram utilizados anteriormente para testar drogas de moléculas pequenas, incluindo anfotericina B, fluconazol e caspofungina, contra leveduras Histoplasma 39. Os autores utilizaram o protocolo para comparar a atividade antifúngica de peptídeos não degradados com pools de fragmentos peptídicos formados por proteólise do peptídeo17,22. Outra extensão desse protocolo seria explorar a cinética da atividade antifúngica dos AMPs. Este protocolo usa um tempo de incubação de 30 min para que os peptídeos exerçam sua atividade antifúngica, mas tempos de incubação mais curtos ou mais longos poderiam ser usados para determinar melhor o tempo necessário para que os peptídeos reduzam a viabilidade das células.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R03DE029270, T32AI089621B), a National Science Foundation (CBET 1511718), o Departamento de Educação (GAANN-P200A180093) e um Subsídio de Sementes Cross-Campus da Universidade de Maryland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates (round bottom) VWR 10062-902
Absorbance microplate reader N/A N/A Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314 ATCC  MYA-2876 Other C. albicans may also be used
Hemocytometer N/A N/A Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker VWR 2620-926
Peptide(s) N/A N/A Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors VWR 18900-320 Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic Fisher Scientific BP332-500 For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific BP329-500 For making NaPB
UV spectrophotometer N/A N/A Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder BD Life Sciences 242820 May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose

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References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

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Biologia Edição 191 Candida albicans peptídeos peptídeos antimicrobianos antifúngicos testes de suscetibilidade levedura densidade óptica
Quantificando a atividade antifúngica de peptídeos contra <em>Candida albicans</em>
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Makambi, W. K., Ikonomova, S. P.,… More

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P., Karlsson, A. J. Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans. J. Vis. Exp. (191), e64416, doi:10.3791/64416 (2023).

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