Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Количественная оценка противогрибковой активности пептидов против Candida albicans

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64416
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Summary

В этом протоколе описан способ получения количественных данных о противогрибковой активности пептидов и других соединений, таких как низкомолекулярные противогрибковые средства, против Candida albicans. Использование оптической плотности, а не подсчета колониеобразующих единиц для количественной оценки ингибирования роста, экономит время и ресурсы.

Abstract

Традиционные методы проведения тестирования на чувствительность к противогрибковым препаратам для Candida albicans отнимают много времени и не дают количественных результатов. Например, общий подход основан на нанесении клеток, обработанных различными концентрациями противогрибковых молекул на агаровые пластины, а затем подсчете колоний для определения взаимосвязи между концентрацией молекул и ингибированием роста. Этот метод требует много табличек и значительного времени для подсчета колоний. Другой распространенный подход исключает планшеты и подсчет колоний путем визуального осмотра культур, обработанных противогрибковыми средствами, для определения минимальной концентрации, необходимой для подавления роста; Однако визуальный осмотр дает только качественные результаты, и информация о росте при субингибирующих концентрациях теряется. В этом протоколе описывается метод измерения чувствительности C. albicans к противогрибковым пептидам. Опираясь на оптические измерения плотности культур, метод сокращает время и материалы, необходимые для получения количественных результатов роста культур при различных концентрациях пептидов. Инкубацию гриба с пептидами проводят в 96-луночном планшете с использованием соответствующего буфера, при этом контрольные элементы представляют собой отсутствие ингибирования роста и полное ингибирование роста. После инкубации с пептидом полученные клеточные суспензии разбавляют для снижения активности пептидов, а затем выращивают в течение ночи. После ночного роста измеряется оптическая плотность каждой лунки и сравнивается с положительным и отрицательным контрольными элементами для расчета результирующего ингибирования роста при каждой концентрации пептида. Результаты с использованием этого анализа сопоставимы с результатами при использовании традиционного метода нанесения культур на агаровые пластины, но этот протокол сокращает пластиковые отходы и время, затрачиваемое на подсчет колоний. Хотя применение этого протокола было сосредоточено на противогрибковых пептидах, метод также будет применим для тестирования других молекул с известной или предполагаемой противогрибковой активностью.

Introduction

Candida albicans является членом микробиоты человека, которая колонизирует многочисленные места, включая полость рта, кожу, желудочно-кишечный тракт и влагалище1. Для пациентов с ослабленным иммунитетом из-за таких заболеваний, как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и иммуносупрессивное лечение, колонизация C. albicans может привести к местному или системному кандидозу 2,3. Использование доступных в настоящее время низкомолекулярных противогрибковых терапевтических средств, таких как амфотерицин В, азолы или эхинокандины, может быть осложнено проблемами растворимости и токсичности, а также резистентностью инфекций к терапевтическим средствам 4,5. Из-за ограничений современных противогрибковых агентов исследователи постоянно ищут новые противогрибковые молекулы с активностью против C. albicans.

Антимикробные пептиды (АМП) являются потенциальной альтернативой существующим низкомолекулярным противогрибковым средствам 6,7,8 и, как предполагается, менее восприимчивы к развитию резистентности по сравнению с низкомолекулярными лекарственными средствами 9. АМФ представляют собой разнообразный набор пептидов, но они часто катионные, с широким спектром активности10,11,12. AMP с активностью против C. albicans включают хорошо известные пептиды из семейств гистатинов и цекропинов 13,14,15, а также недавно описанные пептиды, такие как ToAP2, NDBP-5.7 и вариант гистатина 5 K11R-K17R16,17. Из-за их потенциала для лечения инфекций Candida, выявление и разработка новых AMP, нацеленных на C. albicans, является важной целью для многих исследовательских групп.

В рамках процесса разработки эффективных AMP (и других противогрибковых агентов), нацеленных на C. albicans, тестирование in vitro обычно используется для выявления перспективных пептидов. Методы проверки противогрибковой активности против C. albicans обычно включают инкубацию клеток с последовательными разведениями AMP (в буфере или среде) в 96-луночных планшетах. Существует несколько методов оценки противогрибковой активности после инкубации. Метод, описанный Институтом клинических лабораторных стандартов, использует чисто визуальную оценку мутности лунок для определения минимальной концентрации (MIC) для полного ингибирования роста (по крайней мере, 50% ингибирование для отдельных противогрибковых агентов, таких как азолы и эхинокандины) и не обеспечивает количественной оценки роста при суб-МПК концентрациях18 . Другой широко используемый подход включает количественную оценку жизнеспособности после инкубации с АМП путем нанесения содержимого лунок на агаровые пластины, инкубации пластин и последующего подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на пластине. Этот метод был использован для оценки ряда пептидов, включая пептиды на основе гистатина 5, LL-37 и лактоферринчеловека 19,20,21. Этот метод требует относительно большого объема агара и большого количества тарелок и включает в себя утомительный подсчет КОЕ на тарелках. Чтобы получить больше количественных данных при меньшем количестве пластиковых отходов и избежать подсчета КОЕ, содержимое скважин можно использовать для инокуляции свежей среды в другой 96-луночный планшет. После инкубации вновь инокулированной пластины рост можно количественно определить путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD600) на считывателе абсорбционных пластин. Этот метод был использован для определения противогрибковой активности гистатина 5 и его фрагментов деградации и проникающих в клетки пептидов 17,22,23,24,25.

Этот протокол описывает, как проверить противогрибковую активность пептидов, и использует метод OD600 для количественной оценки снижения жизнеспособности C. albicans из-за пептидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Было получено одобрение от Университета Мэриленда, Колледж-Парк, Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) для работы с C. albicans в этом протоколе (PN 274). Штамм C. albicans SC5314 (см. Таблицу материалов) был использован в настоящем исследовании; Однако можно использовать и любой другой штамм.

1. Подготовка буфера, стерильной воды и питательной среды

  1. Приготовьте стерильный 0,1 М натрий-фосфатный буфер (NaPB)26 при рН 7,4 и разбавьте до 2 мМ и 1 мМ стерильной водой. Приготовление по 100 мл по 2 мМ NaPB и 1 мМ NaPB будет более чем достаточным для большинства применений этого протокола.
  2. Приготовьте стерильную жидкую дрожжевую-пептон-декстрозу (YPD, см. Таблицу материалов) среднюю (10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л декстрозы, 20 г/л пептона). Приготовления 100 мл YPD будет более чем достаточно для большинства применений этого протокола.
  3. Приготовьте стерильную сверхчистую воду. Приготовления 100 мл воды будет более чем достаточно для большинства применений этого протокола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы, среды и воду стерилизуют автоклавированием при 121 °C в жидкостном цикле в течение соответствующего времени в зависимости от объема в автоклавируемых контейнерах27. Например, для флаконов, содержащих 500 мл, время экспозиции должно составлять 40 мин.

2. Инокуляция, культивирование и субкультивирование C. albicans

ВНИМАНИЕ: Соблюдайте все институциональные и правительственные правила работы с C. albicans, который часто классифицируется академическими исследовательскими институтами как организм уровня биобезопасности (BSL) 2 независимо от лекарственной устойчивости и Американской коллекцией типовых культур (ATCC) как организм BSL1 или BSL2, в зависимости от лекарственной устойчивости штамма28.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните прививку и культивирование частей этого шага (этапы 2.1-2.2) за день до начала тестирования на противогрибковую активность. Если возможно, выполните все этапы протокола с клетками (и растворами, которые будут инкубироваться с клетками) в шкафу биобезопасности.

  1. Инокулируют желаемый штамм C. albicans в 10 мл среды YPD в культуральной пробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культура может быть инокулирована из морозильной камеры или из агаровой тарелки, но для всех данных, которые будут сравниваться, необходимо использовать последовательный источник.
  2. Выращивают культуру в течение ночи (~12-16 ч) при 30 ° C и 230 об/мин на ротационном шейкере.
  3. Субкультура ночной культуры C. albicans и вырастает доOD 600 ~ 1,0-1,2.
    1. Измерьте OD600 ночной культуры с помощью УФ-спектрофотометра (см. Таблицу материалов).
    2. Основываясь на OD600 ночной культуры, используйте ночную культуру для инокуляции субкультуры при OD600 0,1 в 10 мл YPD.
    3. Выращивайте субкультуру при 30 ° C на ротационном шейкере при 230 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет ~ 1,0-1,2, что, вероятно, займет 4-6 часов. Выполните шаг 3 (приготовление пептидных растворов), пока субкультура растет; Субкультура будет разбавлена для использования в анализе на шаге 4.

3. Приготовление пептидных растворов в 96-луночном планшете

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен заранее, если растворы пептидов стабильны во время хранения. Как правило, растворы пептидов хранят при -20 °C до использования. Их можно разморозить на водяной бане комнатной температуры, прежде чем переходить к следующему шагу.

  1. Определите наибольшую концентрацию каждого пептида, подлежащего тестированию в анализе. Это будет варьироваться в зависимости от выбранных пептидов. Для данных, представленных в репрезентативном разделе результатов, были протестированы гистатин 5 и инженерные аналоги22 , и самая высокая испытанная концентрация составила 50 мкМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая концентрация, подлежащая тестированию, определяется с использованием данных, представленных в литературе, или путем проведения предварительных экспериментов в широком диапазоне концентраций пептидов. Когда это возможно, следует выбирать самую высокую концентрацию, чтобы наблюдать плато для полного снижения жизнеспособности при самых высоких протестированных концентрациях и плато для отсутствия снижения жизнеспособности при самых низких протестированных концентрациях, что позволяет количественно оценить весь диапазон пептидной активности.
  2. Растворите каждый пептид в стерильной воде в удвоенной дозе желаемой максимальной концентрации. Для данных, представленных в репрезентативном разделе результатов, 150 мкл 100 мкМ растворов гистатина 5 и инженерных аналогов готовили в стерильной воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пептид не растворяется в воде, перед этим этапом может потребоваться солюбилизация в другом растворителе. Диметилсульфоксид (ДМСО) обычно используется для растворения пептидов в высокой концентрации перед разбавлением до рабочей концентрации. Убедитесь, что конечная концентрация ДМСО составляет 1% (об./об.) или ниже29 и что альтернативные растворители не влияют на рост клеток. Кроме того, убедитесь, что концентрация растворителя поддерживается постоянной во всех лунках на этапах 3.4-3.5.
  3. Добавьте 40 мкл желаемых растворов пептидов в первую лунку (столбец 1) каждого ряда в 96-луночную культуральную пластину с круглым дном (см. Таблицу материалов). Эта табличка является табличкой 1 (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пластина имеет восемь рядов, которые используются для тестирования пептидов. Эти ряды могут быть использованы для разных пептидов или для репликаций одних и тех же пептидов. Включите только один пептид в каждую строку.
  4. Добавьте 20 мкл стерильной сверхчистой воды в столбец 2 в столбец 12 рядов, содержащих пептид (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пептидные запасы были приготовлены с растворителем, отличным от чистой воды, на этапе 3.2, стерильная вода на этой стадии должна быть заменена растворителем, присутствующим в пептидной массе, добавленной в первую колонку. Например, если пептид был солюбилизирован в ДМСО, а пептидный запас содержит 1% (об./об.) ДМСО в воде, вода, содержащая 1% ДМСО, должна быть добавлена в столбец 2 в столбец 12.
  5. Последовательно разбавляют исходные растворы пептидов по всей пластине до столбца 10 (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо того, чтобы выполнять последовательные разбавления в пластине, как описано ниже, разбавления можно также проводить в микроцентрифужных пробирках и переносить на 96-луночную пластину.
    1. Удалите 20 мкл из колонки 1, перенесите ее в колонку 2 и перемешайте, пипеткой вверх и вниз. Колонка 2 теперь содержит 40 мкл раствора пептида при разведении 1:2 концентрации в колонке 1.
    2. Удалите 20 мкл из колонки 2, перенесите ее в колонку 3 и перемешайте пипеткой вверх и вниз, чтобы колонка 3 теперь содержала 40 мкл раствора пептида при разведении концентрации в колонке 1 1:4.
    3. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока колонка 10 не будет содержать 40 мкл раствора пептида при разведении концентрации в колонке 1 в соотношении 1:512.
    4. Удалите 20 мкл раствора пептида из колонки 10 и выбросьте его. Каждая колонка теперь содержит 20 мкл раствора пептида (колонки 1-10) или воды (колонки 11 и колонки 12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лунки в колонке 11 служат для контроля стерильности, а лунки в колонке 12 служат для контроля, не содержащие пептида.

4. Разведение субкультуры C. albicans

ПРИМЕЧАНИЕ: Начинайте этот шаг после того, как субкультура достигнет OD600 ~ 1.0-1.2 (шаг 2.3.3).

  1. Перенесите субкультуру в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 3,900 x g в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. Удалите надосадочную жидкость пипеткой или декантацией.
  2. Ресуспендируют гранулу 1 мл 2 мМ NaPB (этап 1.1) и переносят суспензию в центрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
  3. Гранулируйте клетки (как на шаге 4.1), выбросьте надосадочную жидкость и снова ресуспендируйте гранулу в 1 мл 2 мМ NaPB.
  4. Повторите шаг 4.3 еще два раза, чтобы оставить промытые клетки в 1 мл 2 мМ NaPB.
  5. Определите плотность клеток промытой суспензии и рассчитайте коэффициент разбавления, необходимый для получения плотности клеток 5 х 105 клеток/мл. Эта концентрация в конечном итоге приведет к добавлению 1 х 104 клеток в каждую лунку 96-луночной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток суспензии может быть определена с использованием ряда методов, включая гемоцитометр или автоматический счетчик клеток. Для настоящего исследования использовалась стандартная кривая плотности клеток по сравнению с OD600 для интересующего штамма, выращенного в соответствующих условиях. Эта кривая была получена с использованием гемоцитометра (см. Таблицу материалов) для определения плотности клеток суспензий с различными значениями OD600 .
  6. Разбавьте клеточную суспензию до 5 x10,5 клеток/мл в 2 мМ NaPB. Приготовления 10 мл этой разбавленной суспензии будет более чем достаточно для завершения этого исследования.

5. Инкубация C. albicans с растворами пептидов и подготовка клеток к количественной оценке жизнеспособности

  1. Добавьте 20 мкл разбавленной суспензии C. albicans (этап 4.6) в колонки 1-10 и колонку 12 каждой строки (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация пептида в первом столбце теперь составляет половину исходной концентрации пептида. Для настоящего исследования конечная концентрация пептида составляла 50 мкМ на этом этапе. Конечная клеточная суспензия в каждой лунке содержит 2,5 х10,5 клеток/мл. Колонки 1-10 служат экспериментальными лунками для оценки противогрибковой активности при различных концентрациях пептидов, а колонка 12 служит контролем роста без пептида.
  2. Добавьте 20 мкл 2 мМ NaPB в колонку 11. В настоящее время конечная концентрация NaPB во всех скважинах составляет 1 мМ. Графа 11 служит для контроля стерильности.
  3. Накройте пластину 1 (содержащую как клетки, так и пептид) и инкубируйте при 30 °C в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации 30 мин достаточно для многих пептидов 17,21,22,30, но время инкубации может быть увеличено до 60 мин, если это необходимо, чтобы учесть пептиды, которым может потребоваться более длительное время для проявления их противогрибковой активности 25,31,32.
  4. Подготовьте новую культуральную пластину на 96 лунок (табличка 2) для количественной оценки жизнеспособности (рис. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культуральная тарелка должна быть подготовлена во время инкубации планшета 1.
    1. Добавьте 100 мкл YPD (шаг 1.2) во все лунки пластины.
    2. Добавьте 100 мкл 2 мМ NaPB (шаг 1.1) во все лунки пластины.
  5. Разбавьте образцы в Планшете 1 (содержащем клетки и пептиды) и перенесите на Планшет 2 (содержащий среду и буфер).
    1. Извлеките планшет 1 из инкубатора после 30 минут инкубации.
    2. Разбавьте каждую лунку планшета 1, добавив 280 мкл 1 мМ NaPB (этап 1.1) для общего объема 320 мкл в каждой лунке (рис. 2).
    3. Смешайте все лунки, содержащие клетки и пептиды, пипеткой вверх и вниз, чтобы убедиться, что все клетки ресуспендированы и на дне лунок не видно осевших клеток.
    4. Перенесите 8 мкл из каждой лунки на пластине 1 в соответствующую лунку на пластине 2. Этот объем переносит примерно 250 ячеек из каждой лунки пластины 1 в пластину 2 (рис. 2).
  6. Накройте пластину 2 и выдержите на микротитровальной пластинчатой шейкерной машине (см. Таблицу материалов) при 350 об/мин в течение 17 ч при 30 °C.

Figure 1
Рисунок 1: Подготовка планшета 1 к инкубации пептидных серийных разведений с клетками. Серийные разведения пептида делают в воде, а клетки C. albicans добавляют на планшет 1. Синий цвет указывает на то, что в колодце присутствует пептид, а серый указывает на колодец с водой и без пептида. Лунки, содержащие клетки, обозначены рисунком из черных точек. После этих этапов пластину инкубируют, чтобы пептид мог проявить свою противогрибковую активность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Подготовка планшета 2 для количественной оценки снижения жизнеспособности из-за пептида. Среда YPD и NaPB добавляются на табличку 2. После разбавления содержимого пластины 1 аликвота из каждой лунки переносится с пластины 1 на пластину 2. Затем планшет 2 инкубируют, чтобы позволить любым жизнеспособным клеткам расти для количественного определения путем измерения OD600. На табличке 2 оранжевым цветом показаны скважины, содержащие только YPD и NaPB. Скважины, содержащие аликвоты из таблички 1, смешанные с YPD и NaPB, показаны зеленым цветом. Описание цветов на табличке 1 см. в условных обозначениях рисунка 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Определение противогрибковой активности

  1. Получите показания OD600 для каждой скважины на табличке 2.
    1. Выньте планшет 2 из инкубатора через 17 ч инкубации.
    2. Перемешайте все лунки на табличке 2, пипеткой вверх и вниз, чтобы убедиться, что все ячейки ресуспендированы и на дне лунок не видно осевших ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков на этом этапе, так как они могут повлиять на показания OD600 . Если образуются пузырьки, их часто можно лопнуть сухим наконечником пипетки или удалить с помощью двух наконечников пипеток, чтобы поднять их из колодца.
    3. Используйте считыватель абсорбционных пластин (см. Таблицу материалов) на длине волны 600 нм, чтобы получить OD600 для каждой скважины.
  2. Рассчитайте ингибирование роста (в процентах) и построите его, чтобы определить влияние пептидов на рост C. albicans.
    1. Для каждой скважины рассчитайте снижение жизнеспособности по сравнению с контролем (в процентах) по следующему уравнению 17,22,23:
      Equation 1
      где OD с пептидом представляет собой OD 600 лунки, содержащей заданную концентрацию пептида, фон OD представляет собой OD600 столбца 11 в той же строке (контроль, не содержащий клеток), и
      OD без пептида - это OD600 в столбце 12 в той же строке (контроль, содержащий клетки и не содержащий пептида).
    2. Например, используйте следующее выражение для расчета снижения жизнеспособности скважины B5 по значениям OD600 для строки B:
      Equation 2
  3. Постройте график снижения жизнеспособности в зависимости от концентрации пептида.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование измерений OD600 для количественной оценки снижения роста из-за противогрибковых пептидов значительно экономит время по сравнению с нанесением проб на покрытие и подсчетом КОЕ. Метод, описанный в этом протоколе, требует выполнения шагов в три разных дня. В первые сутки требуется примерно 1 ч для подготовки буферов и сред (не считая времени стерилизации) и инокуляции исходной культуры C. albicans для ночной инкубации. На второй день для выполнения этапов требуется 5-6 часов (включая время субкультивирования), чтобы подготовить 96-луночную тарелку для 17-часовой инкубации. На третий день шаги можно выполнить менее чем за 1 час. Часть протокола, включающая сбор количественных данных о жизнеспособности, требует примерно 30 минут работы (плюс 17 часов инкубации). Напротив, нанесение образцов на агар и подсчет КОЕ для однократной репликации содержимого каждой 96-луночной пластины потребует более 3 часов работы (плюс 24 часа инкубации), что приведет к сокращению времени более чем на 2,5 часа, необходимого для завершения количественной оценки жизнеспособности с использованием этого протокола. Эта экономия времени была бы увеличена, если бы в эксперименте потребовалось несколько 96-луночных планшетов.

Описанный протокол был использован для анализа противогрибковой активности гистатина 5 и нескольких вариантов гистатина 5, содержащих модификации остатков лизина. После инкубации пептидов с клетками C. albicans на этапе 5 противогрибковую активность количественно определяли с использованием как метода подсчета КОЕ, так и описанного протокола, включающего измерения OD600 (рис. 3). Важно отметить, что эти два метода дали одинаковые результаты для всех пептидов, хотя каждый пептид имел одну концентрацию со статистически значимой разницей в снижении жизнеспособности, определяемой двумя методами. В каждом из этих случаев данные OD600 показали более низкое снижение жизнеспособности, чем данные КОЕ, что указывает на то, что при сопоставлении данных необходимо использовать один метод. Важно отметить, что данные, использующие показания OD600, являются высоковоспроизводимыми, о чем свидетельствуют в целом небольшие стандартные отклонения реплик на рисунке 3 и опубликованные результаты с использованием этого протокола 17,22,23,24,25.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение традиционных (КОЕ) и описанных (ОД) методов количественной оценки снижения роста клеток C. albicans. Пептид (А) гистатин 5 (Hst-5) и варианты гистатина 5 (В) K5R, (C) K11R, (D) K13R и (E) K17R (с модификацией лизина на аргинин в указанных остатках) инкубировали с клетками C. albicans в концентрациях от 50 мкМ до 0,20 мкМ, как описано в протоколе. После этапа 5.5.3 образцы были удалены для нанесения покрытия на агар (одна реплика для каждого эксперимента) или перенесены на новую пластину (две реплики для каждого эксперимента) для продолжения протокола. Данные представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов (N = 3 точки данных для данных КОЕ, N = 6 точек данных для данных OD), а полосы погрешности указывают стандартное отклонение данных. Был проведен двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с тестом множественных сравнений Тьюки (α = 0,05) для выявления статистических различий между двумя методами. Концентрации пептидов со статистически значимой разницей отмечены звездочкой (*) на участках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данном протоколе описан эффективный подход к получению количественных данных о противогрибковой активности АМП в отношении грибкового патогена C. albicans. Одним из распространенных альтернативных подходов к тестированию пептидов и других противогрибковых агентов является микроразведение бульона, описанное в стандарте M2718 Института клинических лабораторных стандартов (CLSI), но этот стандарт фокусируется на получении качественных визуальных результатов, а не количественных результатов. Другой альтернативный подход заключается в использовании метода, аналогичного описанному в этом протоколе, для получения пептидов и инкубации их с клетками, а затем нанесения содержимого лунок на агар для подсчета количества КОЕ и количественной оценки эффекта пептидов. Как отмечалось в разделе репрезентативных результатов, такое использование OD600 для измерения роста клеток в этом протоколе существенно снижает временную нагрузку по сравнению с нанесением покрытия и подсчетом КОЕ. Устранение необходимости наносить содержимое лунок на агар также уменьшает количество пластиковых отходов, образующихся в результате протокола тестирования пептидов.

Несколько аспектов этого протокола важны для его успеха. Поскольку многие катионные антимикробные пептиды плохо работают в физиологических концентрациях соли в анализах, выполненных in vitro 8,32,33,34, для этого анализа был выбран буфер NaPB 1 мМ. Кроме того, пептиды и клетки C. albicans инкубируют в течение короткого времени (30 мин) в буфере, а не в течение длительного времени в питательной среде. Это снижает потенциальный рост и деление клеток, что повлияет на последующее количественное определение жизнеспособных клеток, оставшихся после инкубации с пептидами. После инкубации пептидов с клетками лунки разбавляют для снижения концентрации пептида, снижая потенциал противогрибковой активности, продолжающейся после желаемой 30-минутной инкубации35. Потенциал для продолжения активности пептидов дополнительно снижается путем переноса клеточного пептидного раствора в пластину, содержащую среду YPD; многие пептиды теряют свою активность в среде YPD (неопубликованные данные), возможно, из-за присутствия моно- и двухвалентных катионов, которые, как известно, снижают активность некоторых антимикробных пептидов 6,7,34,36. Тем не менее, отсутствие активности в среде YPD не является необходимым для успеха протокола. Наконец, клетки C. albicans выращивают при 30 ° C для соответствующих этапов протокола. При выращивании клеток при этой температуре клетки должны быть в основном в морфологии дрожжей, что важно для получения точных оценок количества клеток на шагах 2 и 4 и для надежной количественной оценки снижения жизнеспособности на стадии 6.

Пользователи могут столкнуться с проблемами во время этого протокола, включая загрязнение нежелательными микробными организмами или испарение жидкости из скважин на краях 96-луночной пластины. Протокол включает скважины для контроля стерильности, чтобы определить, произошло ли загрязнение; Загрязнение делает результаты анализа недействительными. Если пользователи наблюдают загрязнение, необходимо позаботиться о том, чтобы все буферы и среды были должным образом стерилизованы и чтобы при пипетировании37 использовалась надлежащая стерильная техника. Работа в шкафу биобезопасности также снизит вероятность загрязнения. Испарение жидкости из краевых лунок 96-луночных планшетов является известной проблемой для микротитровальных планшетов38 и может повлиять на результаты этого протокола. В то время как короткое время инкубации клеток с пептидом на стадии 5.3 вряд ли приведет к проблемам с краевыми эффектами, более длительная инкубация оставшихся жизнеспособных клеток на стадии 5.6 может привести к соблюдению испарения. Если наблюдается испарение, использование различных 96-луночных пластин или заполнение пространства вокруг скважин водой может уменьшить испарение38. Пользователи также могут рассмотреть возможность отказа от использования строк A и H, а также столбцов 1 и 12 таблички для получения данных, вместо этого заполняя их водой, средой или буфером.

Возможны изменения во многих аспектах протокола. Например, другой буфер (или среда) может быть использован при инкубации клеток и пептидов вместе (этапы 4-5.3), или другой грибковый питательный концентратор может быть использован для роста клеток после инкубации с пептидами (этапы 5.4-5.6). Использование альтернативных буферов и сред может позволить провести сравнительный анализ с другими методами, опубликованными в литературе, или со стандартом CLSI18 и будет иметь важное значение для тестирования пептидов в условиях, имитирующих их предполагаемое использование in vivo . Еще одна модификация, которая может оказаться полезной для некоторых пользователей, заключается в разбавлении пептидов вниз по рядам пластины, а не по столбцам. Изменение ориентации уменьшило бы количество концентраций, которые можно было бы проверить для данного пептида, но это позволило бы тестировать больше пептидов в одной пластине, что может быть полезно для экспериментов, требующих тестирования большого количества различных пептидов.

Получение реплицированных данных для каждого пептида, протестированного в этом протоколе, имеет важное значение. Включение технических повторений в данный день тестирования позволяет понять вариативность протокола. Кроме того, выполнение биологических реплик важно для понимания изменчивости случайных изменений в росте клеток. Лаборатория авторов обычно получает, по крайней мере, шесть точек реплицированных данных для данного пептида. Тестирование проводится как минимум в 2 разных дня, и каждый день включается как минимум две технические реплики. Как правило, три репликации выполняются в каждый из 2 разных дней или две репликации в каждый из 3 разных дней. На рисунке 3 показано, что этот протокол выдает согласованные данные с небольшими стандартными отклонениями при правильном выполнении.

Простота этого протокола позволяет адаптировать его для использования во многих экспериментах, прямо не описанных в протоколе. Например, протокол может быть легко адаптирован для тестирования других дрожжей, включая другие виды Candida. Однако он не очень хорошо подходит для нитевидных или диморфных видов, растущих в своей нитевидной морфологии. Протокол также может быть адаптирован для использования с непептидными противогрибковыми агентами, такими как низкомолекулярные лекарственные средства, или смеси различных пептидов или пептидных фрагментов. Например, аналогичные протоколы использовались ранее для тестирования низкомолекулярных препаратов, включая амфотерицин B, флуконазол и каспофунгин, против дрожжей Histoplasma 39. С помощью протокола проведено сравнение противогрибковой активности недеградированных пептидов с пулами пептидных фрагментов, образованных протеолизом пептида17,22. Еще одним расширением этого протокола будет изучение кинетики противогрибковой активности AMP. Этот протокол использует время инкубации 30 минут для пептидов, чтобы проявить свою противогрибковую активность, но более короткое или более длительное время инкубации может быть использовано для лучшего определения времени, необходимого пептидам для снижения жизнеспособности клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R03DE029270, T32AI089621B), Национальным научным фондом (CBET 1511718), Министерством образования (GAANN-P200A180093) и Университетом Мэриленда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates (round bottom) VWR 10062-902
Absorbance microplate reader N/A N/A Any available microplate reader is sufficient
C. albicans strain SC5314 ATCC  MYA-2876 Other C. albicans may also be used
Hemocytometer N/A N/A Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600
Microplate shaker VWR 2620-926
Peptide(s) N/A N/A Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended
Reagent reservoirs for multichannel pipettors VWR 18900-320 Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor
Sodium phosphate, dibasic Fisher Scientific BP332-500 For making NaPB
Sodium phosphate, monobasic Fisher Scientific BP329-500 For making NaPB
UV spectrophotometer N/A N/A Any available UV spectrophotometer is sufficient
YPD medium powder BD Life Sciences 242820 May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
  4. Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
  5. Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
  6. Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
  7. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
  8. Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
  9. Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
  10. Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
  11. Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
  12. Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
  13. Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
  14. Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
  15. Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
  16. do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
  17. Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
  18. Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
  19. Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
  20. Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
  21. den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
  22. Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
  23. Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
  24. Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
  25. Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
  27. Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
  28. American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
  29. Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
  30. Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
  31. Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
  32. Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
  33. Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
  34. Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
  35. Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
  36. Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
  38. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
  39. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).

Tags

Биология выпуск 191 Candida albicans пептиды антимикробные пептиды противогрибковое тестирование на чувствительность дрожжи оптическая плотность
Количественная оценка противогрибковой активности пептидов против <em>Candida albicans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P.,… More

Makambi, W. K., Ikonomova, S. P., Karlsson, A. J. Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans. J. Vis. Exp. (191), e64416, doi:10.3791/64416 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter