Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att erhålla kvantitativa data om den antifungala aktiviteten hos peptider och andra föreningar, såsom småmolekylära svampdödande medel, mot Candida albicans. Dess användning av optisk densitet snarare än att räkna kolonibildande enheter för att kvantifiera tillväxthämning sparar tid och resurser.
Abstract
Traditionella metoder för att utföra svampdödande känslighetstestning för Candida albicans är tidskrävande och saknar kvantitativa resultat. Till exempel bygger ett vanligt tillvägagångssätt på pläteringsceller behandlade med olika koncentrationer av svampdödande molekyler på agarplattor och sedan räknar kolonierna för att bestämma förhållandet mellan molekylkoncentration och tillväxthämning. Denna metod kräver många plattor och betydande tid att räkna kolonierna. Ett annat vanligt tillvägagångssätt eliminerar plattorna och räkningen av kolonier genom att visuellt inspektera kulturer behandlade med svampdödande medel för att identifiera den minsta koncentration som krävs för att hämma tillväxten. Visuell inspektion ger emellertid endast kvalitativa resultat, och information om tillväxt vid subhämmande koncentrationer går förlorad. Detta protokoll beskriver en metod för att mäta känsligheten hos C. albicans för svampdödande peptider. Genom att förlita sig på optiska densitetsmätningar av kulturer minskar metoden den tid och material som behövs för att erhålla kvantitativa resultat på odlingstillväxt vid olika peptidkoncentrationer. Inkubationen av svampen med peptider utförs i en 96-brunnsplatta med användning av en lämplig buffert, med kontroller som representerar ingen tillväxthämning och fullständig tillväxthämning. Efter inkubationen med peptiden späds de resulterande cellsuspensionerna för att minska peptidaktiviteten och odlas sedan över natten. Efter tillväxt över natten mäts den optiska densiteten hos varje brunn och jämförs med de positiva och negativa kontrollerna för att beräkna den resulterande tillväxthämningen vid varje peptidkoncentration. Resultaten som använder denna analys är jämförbara med resultaten med den traditionella metoden att plätera kulturerna på agarplattor, men detta protokoll minskar plastavfall och den tid som spenderas på att räkna kolonier. Även om tillämpningarna av detta protokoll har fokuserat på svampdödande peptider, kommer metoden också att vara tillämplig för att testa andra molekyler med känd eller misstänkt svampdödande aktivitet.
Introduction
Candida albicans är medlem i den mänskliga mikrobioten som koloniserar många platser, inklusive munhålan, huden, mag-tarmkanalen och vagina1. För patienter som är immunsupprimerade på grund av sjukdomar som humant immunbristvirus (HIV) och immunsuppressiva behandlingar kan kolonisering av C. albicans leda till lokal eller systemisk candidiasis 2,3. Användningen av för närvarande tillgängliga småmolekylära antimykotiska läkemedel, såsom amfotericin B, azoler eller echinocandiner, kan kompliceras av löslighets- och toxicitetsproblem och av infektionernas resistens mot terapierna 4,5. På grund av begränsningarna hos nuvarande svampdödande medel, forskare söker kontinuerligt efter nya svampdödande molekyler med aktivitet mot C. albicans.
Antimikrobiella peptider (AMP) är ett potentiellt alternativ till de nuvarande småmolekylära antifungala medlen 6,7,8 och föreslås vara mindre mottagliga för resistensutveckling jämfört med småmolekylära läkemedel 9. AMPs är en mångsidig uppsättning peptider, men de är ofta katjoniska, med ett brett spektrum av aktivitet10,11,12. AMPs med aktivitet mot C. albicans inkluderar välkända peptider från histatin- och cecropinfamiljerna 13,14,15, tillsammans med nyligen beskrivna peptider som ToAP2, NDBP-5.7 och histatin 5-varianten K11R-K17R16,17. På grund av deras potential för behandling av Candida-infektioner är identifiering och design av nya AMPs som riktar sig mot C. albicans ett viktigt mål för många forskargrupper.
Som en del av processen för att utveckla effektiva AMPs (och andra svampdödande medel) som riktar sig mot C. albicans, in vitro-testning används ofta för att identifiera lovande peptider. Metoder för att testa svampdödande aktivitet mot C. albicans involverar vanligtvis inkubation av celler med seriella utspädningar av AMP (i buffert eller medium) i 96-brunnsplattor. Flera metoder finns tillgängliga för att bedöma den svampdödande aktiviteten efter inkubation. En teknik som beskrivs av Clinical Laboratory Standards Institute använder en rent visuell bedömning av brunnarnas grumlighet för att bestämma minimikoncentrationen (MIC) för fullständig tillväxthämning (minst 50% hämning för utvalda antifungala medel, som azoler och echinocandiner) och ger ingen kvantifiering av tillväxt vid sub-MIC-koncentrationer18 . Ett annat vanligt tillvägagångssätt innefattar kvantifiering av livskraften efter inkubation med AMP genom plätering av innehållet i brunnarna på agarplattor, inkubering av plattorna och sedan räkning av antalet kolonibildande enheter (CFU) på plattan. Denna metod har använts för att utvärdera ett antal peptider, inklusive histatin 5-baserade peptider, LL-37 och humant laktoferrin 19,20,21. Denna teknik kräver en relativt stor volym agar och ett stort antal plattor och innebär tråkig räkning av CFUs på plattorna. För att få mer kvantitativa data samtidigt som man genererar mindre plastavfall och undviker att räkna CFU, kan innehållet i brunnarna användas för att inokulera färskt medium i en annan 96-brunnsplatta. Efter inkubation av den nyligen inokulerade plattan kan tillväxten kvantifieras genom mätning av den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) på en absorbansplattläsare. Denna metod har använts för att bestämma den antifungala aktiviteten hos histatin 5 och dess nedbrytningsfragment och cellpenetrerande peptider 17,22,23,24,25.
Detta protokoll beskriver hur man testar den antifungala aktiviteten hos peptider och använder OD600-metoden för att kvantifiera minskningen av livskraften hos C. albicans på grund av peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande erhölls från University of Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) för arbetet med C. albicans i detta protokoll (PN 274). C. albicans stam SC5314 (se materialtabell) användes i den aktuella studien; Emellertid, någon annan stam kan också användas.
1. Beredning av buffert, sterilt vatten och odlingsmedium
- Bered steril 0,1 M natriumfosfatbuffert (NaPB)26 vid pH 7,4 och späd till 2 mM och 1 mM med sterilt vatten. Att förbereda 100 ml vardera av 2 mM NaPB och 1 mM NaPB kommer att vara mer än tillräckligt för de flesta tillämpningar av detta protokoll.
- Bered sterilt flytande jäst-pepton-dextros (YPD, se Materialförteckning) medium (10 g/L jästextrakt, 20 g/L dextros, 20 g/L pepton). Att förbereda 100 ml YPD kommer att vara mer än tillräckligt för de flesta tillämpningar av detta protokoll.
- Förbered sterilt ultrarent vatten. Att förbereda 100 ml vatten kommer att vara mer än tillräckligt för de flesta tillämpningar av detta protokoll.
OBS: Buffertar, media och vatten steriliseras genom autoklav vid 121 °C på en vätskecykel under lämplig tid baserat på volymen i behållarna som autoklaveras27. Till exempel, för flaskor som innehåller 500 ml, bör exponeringstiden vara 40 min.
2. Ympning, odling och subkultur av C. albicans
VARNING: Följ alla institutionella och statliga bestämmelser för att arbeta med C. albicans, som ofta klassificeras av akademiska forskningsinstitutioner som en biosäkerhetsnivå (BSL) 2-organism oavsett läkemedelsresistens och av American Type Culture Collection (ATCC) som en BSL1- eller BSL2-organism, beroende på läkemedelsresistensen hos stammen28.
OBS: Utför inokulerings- och odlingsdelarna av detta steg (steg 2.1-2.2) dagen innan testningen för svampdödande aktivitet påbörjas. Om möjligt, utför alla protokollsteg med cellerna (och lösningarna som kommer att inkuberas med cellerna) i ett biosäkerhetsskåp.
- Inokulera önskad C. albicans-stam i 10 ml YPD-medium i ett odlingsrör.
OBS: Kulturen kan inokuleras från en frysstock eller från en agarplatta, men en konsekvent källa måste användas för alla data som kommer att jämföras. - Odla kulturen över natten (~ 12-16 timmar) vid 30 ° C och 230 rpm på en roterande shaker.
- Subkultur över natten kultur av C. albicans, och växa till en OD600 av ~ 1.0-1.2.
- Mät OD600 för nattkulturen med en UV-spektrofotometer (se materialtabell).
- Baserat på OD 600 i nattkulturen, använd övernattningskulturen för att inokulera en subkultur vid en OD600 på 0,1 i10 ml YPD.
- Odla subkulturen vid 30 °C på en roterande skakapparat vid 230 rpm tills OD600 når ~1,0-1,2, vilket sannolikt tar 4-6 timmar. Slutför steg 3 (beredning av peptidlösningar) medan subkulturen växer; Subkulturen kommer att spädas ut för användning i analysen i steg 4.
3. Beredning av peptidlösningarna i en 96-brunnsplatta
OBS: Detta steg kan göras i förväg, om peptidstamlösningarna är stabila under lagring. Vanligtvis lagras peptidlösningarna vid -20 ° C tills de används. De kan tinas i ett rumstemperaturvattenbad innan de går vidare till nästa steg.
- Bestäm den högsta koncentrationen av varje peptid som ska testas i analysen. Detta varierar beroende på de valda peptiderna. För de data som presenterades i avsnittet representativa resultat testades histatin 5 och konstruerade analoger22 och den högsta testade koncentrationen var 50 μM.
OBS: Den högsta koncentrationen som ska testas bestäms med hjälp av data som rapporterats i litteraturen eller genom att utföra preliminära experiment över ett brett spektrum av peptidkoncentrationer. Om möjligt bör den högsta koncentrationen väljas för att observera en platå för en fullständig minskning av viabiliteten vid de högsta testade koncentrationerna och en platå för ingen minskning av viabiliteten vid de lägsta testade koncentrationerna, vilket möjliggör kvantifiering av hela skalan av peptidaktivitet. - Lös upp varje peptid i sterilt vatten vid två gånger den önskade högsta koncentrationen. För de data som presenteras i avsnittet representativa resultat framställdes 150 μL 100 μM lösningar av histatin 5 och konstruerade analoger i sterilt vatten.
OBS: Om en peptid inte är löslig i vatten kan löslighet i ett annat lösningsmedel vara nödvändigt före detta steg. Dimetylsulfoxid (DMSO) används vanligen för att solubilisera peptider i hög koncentration innan de späds till arbetskoncentrationen. Se till att den slutliga koncentrationen av DMSO är 1% (v / v) eller lägre29 och att alternativa lösningsmedel inte påverkar cellernas tillväxt. Se också till att lösningsmedelskoncentrationen hålls konstant i alla brunnar i steg 3.4-3.5. - Tillsätt 40 μl av de önskade peptidstamlösningarna till den första brunnen (kolumn 1) i varje rad i en rundbottnad odlingsplatta med 96 brunnar (se materialtabell). Denna platta är platta 1 (figur 1).
OBS: Varje platta har åtta rader som används för att testa peptider. Dessa rader kan användas för olika peptider eller för replikat av samma peptider. Inkludera endast en enda peptid i varje rad. - Tillsätt 20 μl sterilt ultrarent vatten till kolumn 2 till kolumn 12 på raderna som innehåller peptid (figur 1).
OBS: Om peptidlagren bereddes med ett annat lösningsmedel än rent vatten i steg 3.2, bör det sterila vattnet i detta steg ersättas med lösningsmedlet i peptidstammen tillsatt till den första kolonnen. Till exempel, om peptiden solubiliserades i DMSO och peptidstammen innehåller 1% (v / v) DMSO i vatten, måste vatten innehållande 1% DMSO läggas till kolumn 2 till kolumn 12. - Seriellt späd peptidstamlösningarna över plattan till kolumn 10 (figur 1).
OBS: I stället för att utföra de seriella utspädningarna i plattan enligt beskrivningen nedan kan utspädningarna också utföras i mikrocentrifugrör och överföras till 96-brunnsplattan.- Ta bort 20 μl från kolumn 1, överför den till kolumn 2 och blanda genom pipettering upp och ner. Kolumn 2 innehåller nu 40 μl peptidlösning vid en 1:2 spädning av koncentrationen i kolumn 1.
- Ta bort 20 μl från kolumn 2, överför den till kolumn 3 och blanda genom pipettering uppåt och nedåt så att kolumn 3 nu innehåller 40 μl peptidlösning vid en spädning på 1:4 av koncentrationen i kolumn 1.
- Upprepa denna process tills kolumn 10 innehåller 40 μl peptidlösning vid en spädning på 1:512 av koncentrationen i kolumn 1.
- Ta bort 20 μl peptidlösning från kolonn 10 och kassera den. Varje kolonn innehåller nu 20 μL peptidlösning (kolumn 1-10) eller vatten (kolumn 11 och kolumn 12).
OBS: Brunnarna i kolumn 11 fungerar som sterilitetskontroller, och brunnarna i kolumn 12 fungerar som kontroller som inte innehåller någon peptid.
4. Utspädning av C. albicans subkultur
Börja det här steget när subkulturen har nått en OD600 på ~1,0–1,2 (steg 2.3.3).
- Överför subkulturen till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 3 900 x g i 3 minuter vid rumstemperatur för att pellet cellerna. Ta bort supernatanten genom pipettering eller dekantering.
- Återsuspendera pelleten med 1 ml 2 mM NaPB (steg 1.1) och överför suspensionen till ett 1,7 ml centrifugrör.
- Pellet cellerna (som i steg 4.1), kassera supernatanten och återsuspendera pelleten igen i 1 ml 2 mM NaPB.
- Upprepa steg 4.3 ytterligare två gånger för att lämna de tvättade cellerna i 1 ml 2 mM NaPB.
- Bestäm celldensiteten hos den tvättade suspensionen och beräkna den utspädningsfaktor som behövs för att erhålla en celldensitet på 5 x 105 celler/ml. Denna koncentration kommer i slutändan att leda till att 1 x 104 celler tillsätts till varje brunn på 96-brunnsplattan.
OBS: Suspensionens celldensitet kan bestämmas med hjälp av ett antal metoder, inklusive en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. En standardkurva för celldensitet kontra OD600 för den intressestam som odlats under relevanta förhållanden användes för den aktuella studien. Denna kurva preparerades med hjälp av en hemocytometer (se materialtabell) för att bestämma celldensiteten hos suspensioner med varierande OD600-värden . - Späd cellsuspensionen till 5 x 105 celler/ml i 2 mM NaPB. Beredning av 10 ml av denna utspädda suspension kommer att vara mer än tillräckligt för att slutföra denna studie.
5. Inkubation av C. albicans med peptidlösningar och beredning av cellerna för kvantifiering av viabiliteten
- Tillsätt 20 μl av den utspädda C. albicans suspensionen (steg 4.6) till kolumnerna 1–10 och kolumn 12 på varje rad (figur 1).
OBS: Den slutliga peptidkoncentrationen i den första kolonnen är nu hälften av peptidstamkoncentrationen. För den aktuella studien var den slutliga peptidkoncentrationen 50 μM vid denna tidpunkt. Den slutliga cellsuspensionen i varje brunn innehåller 2,5 x 105 celler/ml. Kolumn 1-10 fungerar som experimentella brunnar för att utvärdera den antifungala aktiviteten vid olika peptidkoncentrationer, och kolumn 12 fungerar som en kontroll för tillväxt utan peptid. - Tillsätt 20 μl 2 mM NaPB till kolumn 11. Samtliga brunnar har nu en slutlig koncentration på 1 mM NaPB. Kolumn 11 fungerar som en sterilitetskontroll.
- Täckplatta 1 (som innehåller både celler och peptid) och inkubera den vid 30 °C i 30 minuter.
OBS: En inkubationstid på 30 min är tillräcklig för många peptider 17,21,22,30, men inkubationstiden kan ökas till 60 min om så önskas för att ta hänsyn till peptider som kan kräva längre tid för att utöva sin svampdödande aktivitet 25,31,32. - Bered en ny odlingsplatta med 96 brunnar (platta 2) för kvantifiering av bärkraften (figur 2).
OBS: Odlingsplattan bör beredas under inkubationen av platta 1.- Tillsätt 100 μL YPD (steg 1.2) till plattans alla brunnar.
- Tillsätt 100 μL 2 mM NaPB (steg 1.1) till plattans alla brunnar.
- Späd proverna på platta 1 (innehållande celler och peptider) och överför till platta 2 (innehållande medium och buffert).
- Hämta platta 1 från inkubatorn efter 30 minuters inkubation.
- Späd varje brunn på platta 1 genom tillsats av 280 μl 1 mM NaPB (steg 1.1) till en total volym på 320 μl i varje brunn (figur 2).
- Blanda alla brunnar som innehåller celler och peptider genom pipettering upp och ner för att säkerställa att alla celler är återsuspenderade och inga sedimenterade celler är synliga i botten av brunnarna.
- Överför 8 μl från varje brunn på platta 1 till motsvarande brunn på platta 2. Denna volym överför cirka 250 celler från varje brunn på platta 1 till platta 2 (figur 2).
- Täckplatta 2 och inkubera på en mikrotiterplattskakare (se Materialförteckning) vid 350 rpm i 17 timmar vid 30 °C.
Figur 1: Beredning av platta 1 för inkubation av peptid serieutspädningar med celler. Seriella utspädningar av peptiden görs i vatten och C. albicans celler tillsätts till platta 1. En blå färg indikerar att peptid är närvarande i brunnen, och grå indikerar en brunn med vatten och ingen peptid. Brunnar som innehåller celler indikeras med ett mönster av svarta prickar. Efter dessa steg inkuberas plattan för att tillåta peptiden att utöva sin svampdödande aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beredning av platta 2 för kvantifiering av den minskade viabiliteten på grund av peptiden. YPD-medium och NaPB läggs till platta 2. Efter utspädning av innehållet i platta 1 överförs en alikvot från varje brunn från platta 1 till platta 2. Platta 2 inkuberas sedan så att eventuella viabla celler kan växa för kvantifiering genom mätning av OD600. För platta 2 visas brunnar som endast innehåller YPD och NaPB i orange. Brunnar som innehåller alikvoter från platta 1 blandade med YPD och NaPB visas i grönt. Se figur 1-förklaringen för beskrivningen av färgerna på platta 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Bestämning av svampdödande aktivitet
- Få OD600-avläsningar för varje brunn i platta 2.
- Ta bort platta 2 från inkubatorn efter 17 timmars inkubation.
- Blanda alla brunnar i platta 2 genom pipettering upp och ner för att säkerställa att alla celler är återsuspenderade och inga sedimenterade celler är synliga i botten av brunnarna.
Undvik att generera bubblor under detta steg, eftersom de kan störa OD600-avläsningarna . Om bubblor bildas kan de ofta poppas med en torr pipetspets eller avlägsnas med hjälp av två pipettspetsar för att lyfta dem ur brunnen. - Använd en absorbansplattläsare (se Materialtabell) vid en våglängd på 600 nm för att erhålla OD600 för varje brunn.
- Beräkna hämningen av tillväxt (i procent) och plotta den för att bestämma effekten av peptiderna på tillväxten av C. albicans.
- För varje brunn beräknas minskningen av viabiliteten jämfört med kontrollen (i procent) med hjälp av följande ekvation 17,22,23:
där OD med peptid är OD 600 i en brunn som innehåller en given koncentration av peptid, OD-bakgrund är OD600 i kolumn 11 på samma rad (kontroll som inte innehåller några celler), och
OD ingen peptid är OD600 i kolumn 12 på samma rad (kontroll innehållande celler och ingen peptid). - Använd till exempel följande uttryck för att beräkna minskningen av livskraften i brunn B5 från OD600-värdena för rad B:
- För varje brunn beräknas minskningen av viabiliteten jämfört med kontrollen (i procent) med hjälp av följande ekvation 17,22,23:
- Plotta minskningen av livskraften som en funktion av peptidkoncentrationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av OD600-mätningar för att kvantifiera minskningen av tillväxten på grund av svampdödande peptider sparar betydande tid jämfört med pläteringsprover och räkning av CFU. Metoden som beskrivs i detta protokoll kräver att stegen slutförs på tre olika dagar. Den första dagen behövs cirka 1 timme för att förbereda buffertarna och mediet (exklusive steriliseringstiden) och inokulera startkulturen hos C. albicans för inkubation över natten. På den andra dagen kräver stegen 5-6 timmar (inklusive subkultureringstid) för att förbereda en 96-brunnsplatta för 17 timmars inkubation. På den tredje dagen kan stegen slutföras på mindre än 1 h. Den del av protokollet som innebär att kvantitativa data om livskraft samlas in kräver cirka 30 minuters arbete (plus 17 timmars inkubation). Däremot skulle plätering av proverna på agar och räkning av CFU: erna för ett enda replikat av innehållet i varje 96-brunnsplatta kräva över 3 timmars arbete (plus 24 timmars inkubation), vilket resulterar i över 2,5 timmar mindre tid som behövs för att slutföra kvantifieringen av livskraften med hjälp av detta protokoll. Dessa tidsbesparingar skulle förstärkas om flera 96-brunnsplattor behövdes i ett experiment.
Det beskrivna protokollet användes för att analysera den antifungala aktiviteten hos histatin 5 och flera varianter av histatin 5 innehållande modifieringar vid lysinresterna. Efter inkubation av peptiderna med C. albicans-cellerna i steg 5 kvantifierades den antifungala aktiviteten med användning av både CFU-räkningsmetoden och det beskrivna protokollet som innehåller OD600-mätningar (figur 3). Viktigt är att de två metoderna gav liknande resultat för alla peptider, även om varje peptid hade en koncentration med en statistiskt signifikant skillnad i minskningen av livskraften bestämd av de två metoderna. I vart och ett av dessa fall visade OD600-uppgifterna en lägre minskning av livskraften än CFU-uppgifterna, vilket tyder på att en enda metod måste användas när uppgifterna ska jämföras. Det är viktigt att data som använder OD600-avläsningarna är mycket reproducerbara, vilket indikeras av de generellt små standardavvikelserna för replikaten i figur 3 och publicerade resultat med detta protokoll 17,22,23,24,25.
Figur 3: Jämförelse av traditionella (CFU) och beskrivna (OD) metoder för kvantifiering av minskningen av C. albicans celltillväxt. Peptiden (A) histatin 5 (Hst-5) och varianterna av histatin 5 (B) K5R, (C) K11R, (D) K13R och (E) K17R (med lysin till argininmodifiering vid de angivna resterna) inkuberades med C. albicans celler i koncentrationer av 50 μM till 0,20 μM, såsom beskrivs i protokollet. Efter steg 5.5.3 avlägsnades proverna för plätering på agar (en replikat för varje experiment) eller överfördes till en ny platta (två replikat för varje experiment) för att fortsätta protokollet. Data representerar medelvärdet av tre oberoende experiment (N = 3 datapunkter för CFU-data, N = 6 datapunkter för OD-data), och felstaplarna indikerar standardavvikelsen för data. En tvåvägsanalys av varians (ANOVA) med Tukeys multipeljämförelsetest (α = 0,05) utfördes för att identifiera statistiska skillnader mellan de två metoderna. Peptidkoncentrationer med en statistiskt signifikant skillnad markeras med en asterisk (*) i diagrammen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver ett effektivt tillvägagångssätt för att erhålla kvantitativa data om den antifungala aktiviteten hos AMPs mot svamppatogenen C. albicans. Ett vanligt alternativt tillvägagångssätt för att testa peptider och andra svampdödande medel är buljongmikroutspädningen som beskrivs i Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) standard M2718, men denna standard fokuserar på att erhålla kvalitativa visuella resultat istället för kvantitativa resultat. Ett annat alternativt tillvägagångssätt är att använda en metod som liknar den som beskrivs i detta protokoll för att förbereda peptider och inkubera dem med celler och sedan platta innehållet i brunnarna på agar för att räkna antalet CFUs och kvantifiera effekten av peptiderna. Som noterats i avsnittet om representativa resultat minskar denna användning av OD600 för mätning av celltillväxt i detta protokoll avsevärt tidsbördan jämfört med plätering och räkning av CFU. Att eliminera behovet av att plåta innehållet i brunnar på agar minskar också mängden plastavfall som genereras av peptidtestprotokollet.
Flera aspekter av detta protokoll är viktiga för dess framgång. Eftersom många katjoniska antimikrobiella peptider presterar dåligt i fysiologiska saltkoncentrationer i analyser utförda in vitro 8,32,33,34, valdes en 1 mM NaPB-buffert för denna analys. Dessutom inkuberas peptiderna och C. albicans celler under en kort tid (30 min) i buffert snarare än en lång tid i tillväxtmedium. Detta minskar den potentiella tillväxten och delningen av cellerna, vilket skulle påverka den efterföljande kvantifieringen av de livskraftiga celler som återstår efter inkubationen med peptiderna. Efter inkubation av peptiderna med cellerna späds brunnarna för att minska koncentrationen av peptiden, vilket minskar potentialen för antifungal aktivitet som fortsätter utöver den önskade 30 minuters inkubationen35. Potentialen för fortsatt aktivitet av peptiderna reduceras ytterligare genom att cellpeptidlösningen överförs till en platta innehållande YPD-medium; många peptider förlorar sin aktivitet i YPD-mediet (opublicerade data), möjligen på grund av närvaron av mono- och divalenta katjoner, som är kända för att minska aktiviteten hos vissa antimikrobiella peptider 6,7,34,36. Brist på aktivitet i YPD-mediet är dock inte nödvändigt för protokollets framgång. Slutligen odlas C. albicans celler vid 30 °C för de relevanta stegen i protokollet. Genom att odla cellerna vid denna temperatur bör cellerna primärt vara i jästmorfologin, vilket är viktigt för att erhålla exakta uppskattningar av antalet celler i steg 2 och steg 4 och för tillförlitlig kvantifiering av minskningen av livskraften i steg 6.
Användare kan stöta på utmaningar under detta protokoll, inklusive kontaminering med oönskade mikrobiella organismer eller avdunstning av vätska från brunnarna på kanterna på 96-brunnsplattan. Protokollet innehåller brunnar för sterilitetskontroller för att identifiera om kontaminering har inträffat; Kontaminering ogiltigförklarar analysresultaten. Om användarna observerar kontaminering måste man se till att alla buffertar och medier är korrekt steriliserade och att korrekt sterilteknik används vid pipettering37. Att arbeta i ett biosäkerhetsskåp kommer också att minska risken för kontaminering. Avdunstningen av vätska från kantbrunnarna på 96-brunnsplattor är en känd utmaning med mikrotiterplattor38 och kan påverka resultaten av detta protokoll. Medan den korta inkubationstiden för cellerna med peptiden i steg 5.3 sannolikt inte leder till problem med kanteffekter, kan den längre inkubationen av de återstående livskraftiga cellerna i steg 5.6 leda till att avdunstningen följs. Om avdunstning observeras kan användning av olika 96-brunnsplattor eller fyllning av utrymmet runt brunnarna med vatten minska avdunstningen38. Användare kan också överväga att inte använda rad A och rad H och kolumn 1 och kolumn 12 på plattan för att få data, istället fylla dem med vatten, medium eller buffert.
Ändringar av många aspekter av protokollet är möjliga. Till exempel kan en annan buffert (eller medium) användas vid inkubation av cellerna och peptiderna tillsammans (steg 4-5.3), eller ett annat svampodlingsmedium kan användas för celltillväxt efter inkubation med peptiderna (steg 5.4-5.6). Användningen av alternativa buffertar och medier skulle kunna möjliggöra benchmarking med andra metoder som publicerats i litteraturen eller med CLSI-standard18 och kommer att vara viktig för testning av peptider under förhållanden som efterliknar deras avsedda användning in vivo . En annan modifiering som vissa användare kan hitta till hjälp är att späda peptiderna ner raderna på plattan snarare än över kolumnerna. Att ändra orienteringen skulle minska antalet koncentrationer som kan testas för en given peptid, men det skulle göra det möjligt att testa fler peptider i en enda platta, vilket kan vara användbart för experiment som kräver testning av ett stort antal olika peptider.
Det är viktigt att erhålla replikatdata för varje peptid som testas i detta protokoll. Att inkludera tekniska repliker på en viss testdag gör det möjligt att förstå protokollets variabilitet. Dessutom är det viktigt att utföra biologiska replikat för att förstå variationen från slumpmässig variation i cellernas tillväxt. Författarnas laboratorium erhåller vanligtvis minst sex replikerade datapunkter för en given peptid. Testning utförs på minst 2 olika dagar, och minst två tekniska replikat ingår varje dag. Vanligtvis utförs tre replikat på var och en av 2 olika dagar eller två replikat på var och en av 3 olika dagar. Figur 3 visar att detta protokoll producerar konsekventa data med små standardavvikelser när de utförs korrekt.
Den enkla karaktären hos detta protokoll gör att det kan anpassas för användning i många experiment som inte direkt beskrivs i protokollet. Till exempel kan protokollet enkelt anpassas för att testa andra jästar, inklusive andra Candida-arter. Det är emellertid inte väl lämpat för trådformiga arter eller dimorfa arter som växer i sin trådformiga morfologi. Protokollet kan också anpassas för användning med icke-peptidsvampande medel, såsom småmolekylära läkemedel, eller blandningar av olika peptider eller peptidfragment. Till exempel har liknande protokoll tidigare använts för att testa småmolekylära läkemedel, inklusive amfotericin B, flukonazol och kaspofungin, mot histoplasmajäst 39. Författarna har använt protokollet för att jämföra den antifungala aktiviteten hos icke-nedbrutna peptider med pooler av peptidfragment bildade genom proteolys av peptiden17,22. En annan utvidgning av detta protokoll skulle vara att utforska kinetiken för den antifungala aktiviteten hos AMP. Detta protokoll använder en inkubationstid på 30 minuter för peptiderna att utöva sin antifungala aktivitet, men kortare eller längre inkubationstider kan användas för att bättre bestämma den tid som krävs för peptiderna att minska cellernas livskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), National Science Foundation (CBET 1511718), Department of Education (GAANN-P200A180093) och ett University of Maryland Cross-Campus Seed Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
References
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
- de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
- Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
- Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
- Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
- Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
- Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature's reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
- Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
- Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
- Mercer, D. K., O'Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
- Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
- Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
- Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
- Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
- do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
- Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
- Clinical Laboratory Standards Institute. M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard - Third edition. , Clinical Laboratory Standards Institute. (2008).
- Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
- Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
- den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
- Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
- Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
- Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
- Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (2012).
- Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves. , Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022).
- American Type Culture Collection. , Available from: www.atcc.org (2022).
- Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
- Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
- Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d'Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
- Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van't Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
- Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
- Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
- Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
- Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
- Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).
