Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Teeltmethoden van Spirocheten uit Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex en Relapsing Fever Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

In vitro kweek is een directe detectiemethode voor de aanwezigheid van levende bacteriën. Dit protocol beschrijft methoden voor de kweek van diverse Borrelia spirocheten, waaronder die van het Borrelia burgdorferi sensu lato-complex, recidiverende koorts Borrelia-soorten en Borrelia miyamotoi. Deze soorten zijn kieskeurig en langzaam groeiend, maar kunnen worden gekweekt.

Abstract

De Borrelia bestaat uit drie groepen soorten, die van de Lyme borreliose (LB) groep, ook bekend als B. burgdorferi sensu lato (s.l.) en onlangs opnieuw geclassificeerd in Borreliella, de relapsing fever (RF) groep Borrelia, en een derde reptielen-geassocieerde groep spirocheten. Op cultuur gebaseerde methoden blijven de gouden standaard voor de laboratoriumdetectie van bacteriële infecties voor zowel onderzoek als klinisch werk, omdat de kweek van pathogenen uit lichaamsvloeistoffen of weefsels direct replicerende pathogenen detecteert en bronmateriaal voor onderzoek biedt. Borrelia en Borreliella spirocheten zijn kieskeurig en langzaam groeiend en worden daarom niet vaak gekweekt voor klinische doeleinden; Cultuur is echter noodzakelijk voor onderzoek. Dit protocol demonstreert de methodologie en recepten die nodig zijn om LB- en RF-spirocheten met succes te kweken, inclusief alle erkende soorten uit het B. burgdorferi s.l.-complex, waaronder B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii / bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis en RFspirocheten, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis en B. miyamotoi. Het basismedium voor het kweken van LB- en RF-spirocheten is het Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II of BSK-H) medium, dat de groei van spirocheten in gevestigde culturen betrouwbaar ondersteunt. Om nieuw geïsoleerde Borrelia-isolaten te kunnen kweken uit van teken of gastheer afgeleide monsters waarbij het initiële spirocheetgetal laag is in het entmateriaal, heeft gemodificeerd Kelly-Pettenkofer (MKP) -medium de voorkeur. Dit medium ondersteunt ook de groei van B. miyamotoi. Het succes van de teelt van RF-spirocheten hangt ook kritisch af van de kwaliteit van de ingrediënten.

Introduction

Borrelia is een geslacht van spirocheetbacteriën dat drie belangrijke clades omvat: de Lyme-borreliose (LB) -groep, de relapsing fever (RF) -groep en een minder goed gekarakteriseerde groep die schijnbaar beperkt is tot reptielen. Borrelia-taxonomie is in beweging met de komst van moleculaire methodologieën die genoom- en proteoomvergelijkingen mogelijk maken, zoals geldt voor de meeste andere taxonomische groepen 1,2,3,4,5,6,7. De LB-groep (ook wel de ziekte van Lyme-groep genoemd) wordt van oudsher Borrelia burgdorferi sensu lato genoemd naar zijn best gekarakteriseerde lid Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Dit artikel gebruikt de momenteel meest gebruikte terminologie: de LB, de RF en de reptielen-geassocieerde groep, en beschrijft de kweekprotocollen voor de LB- en de RF-groepen.

Zoals te verwachten is voor een lid van de familie Spirochaetaceae, kan Borrelia de opvallend lange en dunne spiraalvorm aannemen, meestal 20-30 μm lang en 0,2-0,3 μm breed. Borrelia-cellen zijn echter zeer pleomorf en kunnen vele andere vormen aannemen in zowel cultuur als in vivo 1,8 als gevolg van hun complexe cellulaire en genetische structuur. In zijn spirochetale vorm is de morfologie van de vlakke sinusgolf het resultaat van zijn axiale endoflagella die roteert in de periplasmatische ruimte tussen de binnenste en buitenste membranen. Deze structuur stelt de cellen in staat om zeer beweeglijk te zijn, waarbij het buitenmembraan eiwitten bevat die de cel in staat stellen om te interageren met gastheerweefsels 9,10. De expressie van de buitenste membraaneiwitten is strak gereguleerd en beïnvloedt niet alleen de invasie van gastheerweefsel, maar ook de interactie met het immuunsysteem van de gastheer11. Deze complexe genexpressie stelt de Borrelia-cellen in staat om te pendelen tussen de zeer verschillende omgevingen van gewervelde gastheren en ongewervelde vectoren. Het genoom van Borrelia is ongebruikelijk onder prokaryoten, bestaande uit een lineair in plaats van een cirkelvormig chromosoom. Naast het lineaire chromosoom bevatten Borrelia-soorten 7-21 plasmiden, sommige lineair en sommige cirkelvormig. De plasmiden herbergen de meerderheid van de genen die nodig zijn voor gastheeraanpassing en virulentie, en de circulaire plasmiden afgeleid van profagen worden verondersteld verantwoordelijk te zijn voor de meerderheid van de horizontale genstroom tussen spirochetale cellen12,13. In overeenstemming met een rol in gastheeradaptatie, verliezen sommige, mogelijk veel of alle, leden van de Lyme-borreliosegroep plasmiden in cultuur14. De best bestudeerde "laboratorium aangepaste" stam van B. burgdorferi, B31, heeft slechts zeven van de negen plasmiden gevonden in wilde isolaten van deze soort15. Evenzo verliest B. garinii plasmiden in cultuur16. Sommige studies hebben aangetoond dat RF-soorten en B. miyamotoi plasmiden behouden wanneer ze worden gekweekt14,17, maar recent werk toont veranderde plasmiden en infectiviteit met langdurige in vitro kweek 18.

Op cultuur gebaseerde methoden blijven de gouden standaard voor de laboratoriumdetectie van bacteriële infecties, voor zowel onderzoek als klinisch werk14,17. De kweek van pathogenen uit lichaamsvloeistoffen of weefsels detecteert direct replicerende pathogenen en levert bronmateriaal voor onderzoek14,17. Dit protocol demonstreert de methodologie en recepten die nodig zijn om de spirocheten van de LB-groep en RF Borrelia en B. miyamotoi met succes te kweken. Het basismedium voor het kweken van Borrelia spirocheten is het Barbour-Stoenner-Kelly medium (BSK-II of het in de handel verkrijgbare BSK-H), met of zonder antibiotica om de groei van vervuilende prokaryoten te verminderen. Dit medium werd aangepast van een medium dat oorspronkelijk werd gebruikt om RF Borrelia19 te ondersteunen, verder aangepast door Stoenner20 en vervolgens door Barbour21. Sindsdien zijn er veel modificaties ontwikkeld, elk met effecten op de bacteriële fysiologie die de groei, infectiviteit en pathogeniciteit kunnen beïnvloeden22. Dit medium ondersteunt op betrouwbare wijze de groei van spirocheten in gevestigde culturen en is gebruikt om spirocheten te isoleren uit teken-, zoogdier- en klinische monsters23. De meer recent ontwikkelde variatie, gemodificeerd Kelly-Pettenkofer (MKP) medium, kan zorgen voor een beter isolatiesucces, morfologie en beweeglijkheid bij het isoleren van nieuwe Borrelia-isolaten uit omgevingsmonsters, wanneer het aantal spirocheten dat aanwezig is in het monster dat beschikbaar is om de cultuur te zaaien laagis 23,24. In alle gevallen is het succes van de teelt kritisch afhankelijk van het vers bereide medium en het gebruik van geschikte ingrediënten; Niet alle commerciële ingrediënten produceren een medium van hoge kwaliteit. Geënte culturen kunnen gemakkelijk worden geïncubeerd zonder te schudden in een conventionele 32-34 °C incubator in de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid resterende omgevingszuurstof. Borrelia spirocheten zijn anaëroben, maar worden in de natuur blootgesteld aan schommelingen in zuurstof- en koolstofdioxideconcentraties en reageren met veranderingen in genexpressie26,27,28,29. Genexpressie, groei en andere metabole studies moeten dus controleren op zuurstof- en koolstofdioxideniveaus met behulp van een zuurstofgestuurde incubator of anaerobe kamer. In cultuur worden culturen wekelijks, of vaker, gecontroleerd op de aanwezigheid van spirocheten met darkfieldmicroscopie of fasecontrastmicroscopie. Kweekuitstrijkjes kunnen worden gekleurd met zilvervlekken, immunohistochemie of door het gebruik van fluorescerend gelabelde stammen29,30. PCR gevolgd door DNA-sequencing is een gevoelige en specifieke methode om de Borrelia-soort te detecteren en genetisch te identificeren of te bevestigen30,31,32,33.

Er bestaan veel kleine variaties op BSK-II en sommige zijn in de handel verkrijgbaar. Het hier in deel 1 beschreven protocol is overgenomen uit Barbour (1984)21. Vloeibaar MKP-medium is een recenter ontwikkeld medium en wordt beschreven in rubriek 2. Het wordt bereid volgens een eerder gerapporteerd protocol33,34, dat, net als BSK-medium, uit twee stappen bestaat: bereiding van basismedium en bereiding van volledig medium. Borrelia kweekmedium kan worden bereid met of zonder antibiotica, zoals beschreven in rubriek 3; de antibioticawet ter vermindering van verontreinigende bacteriën die worden geïntroduceerd bij het inenten met klinische of omgevingsmonsters, zoals beschreven in rubriek 4; bij inenten met pure Borrelia sp. cultuur zijn antibiotica mogelijk niet nodig. Het maken van Borrelia-aandelen op lange termijn is vaak belangrijk en een protocol hiervoor wordt beschreven in hoofdstuk 5. Rubriek 6 beschrijft het gebruik van deze media om zuivere Borrelia sensu lato-klonen te isoleren uit klinische of omgevingsmonsters. Er zijn een aantal benaderingen mogelijk36; Hieronder is er een die effectief blijkt te zijn. Het beplatingsmedium dat in dit protocol wordt gebruikt, is een modificatie van BSK-II-platingmedium37 en MKP-medium 34 (met konijnenserum verhoogd tot 10%38).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studies met monsters verkregen van menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de relevante universiteit en / of medische faciliteit, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van deelnemers voordat de monsters werden verzameld. Alle studies met monsters verkregen van dieren werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele commissie voor dierethiek. In voorkomend geval zijn goedkeuringen verkregen voor milieubemonstering.

OPMERKING: Het succes van cultuur is kritisch afhankelijk van de kwaliteit van de ingrediënten. Commercieel BSK-medium is beschikbaar en ondersteunt robuust de groei van laboratorium-aangepaste zuivere B. burgdorferi en verwante soorten waar een hoge dosis entmateriaal kan worden gebruikt om de cultuur te zaaien. Voor isolaten van stammen uit primair biologisch materiaal heeft vers bereid medium de voorkeur en is het vaak noodzakelijk.

Borrelia sp. zijn bekende of vermoedelijke pathogenen, en niet-gescreende menselijke of dierlijke weefsels kunnen ook een biorisico zijn. Het hanteren van potentieel besmettelijk materiaal vereist persoonlijke beschermingsmiddelen en steriele technieken voor de veiligheid van onderzoekers. Bovendien is het medium zo voedselrijk dat de cultuur gemakkelijk besmet raakt. Bioveiligheidsniveau 2-insluiting is over het algemeen vereist voor dit werk en alle werkzaamheden met Borrelia sp. of monsters moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.

1. Instructies voor het maken van BSK-II medium

  1. Bereiding van compleet BSK-II medium
    1. Verkrijg reagentia om 1 l van het medium te bereiden, zoals aangegeven in tabel 1.
      OPMERKING: BSA-zuiverheid (of gebrek aan zuiverheid) is van cruciaal belang voor optimale groei. In het bijzonder verschilt de BSA-zuiverheid tussen zowel fabrikant als partij. Zie tabel 2 voor een lijst van meer versus minder succesvolle producten. Het verkrijgen van verschillende monsters van verschillende leveranciers, ze testen op optimale groei en vervolgens een grote hoeveelheid van de beste partij kopen, is een effectieve strategie om dit probleem te verminderen en een goed medium te produceren.
    2. Begin met het oplossen van de BSA in een bekerglas door in het water te roeren, wat minstens een half uur duurt.
    3. Voeg alle droge chemicaliën toe en laat ze oplossen. Voeg vervolgens de CMRL toe.
    4. Stel de pH van het BSK-II-medium indien nodig in op 7,6 met 1 M NaOH.
    5. Voeg konijnenserum toe aan het BSK-II medium tot een concentratie van 6%-10%. Filter steriliseer (poriegrootte 0,22 μm) het BSK-II medium. De benodigde hoeveelheid serum is afhankelijk van de Borrelia-soort . Gebruik 6%-7% voor de RF-soorten en -stammen en voor Borrelia burgdorferi sensu lato. Als de groei niet sterk is, voeg dan nog een 1% -2% steriel konijnenserum toe aan het medium.
    6. Vries de voorraad BSK-II medium in 100 ml of 400 ml aliquots in.
    7. Voor RF-stammen is gelatine vereist. Voeg 100 ml 7% steriele gelatine (licht opgewarmd om het in een oplossing te doen) toe aan 400 ml BSK-II-medium. Verwarm de BSK-II met gelatine op 37 °C om de gelatine te laten smelten voordat u de cultuur ent.
      OPMERKING: Medium kan worden ingevroren (-20 °C) voorafgaand aan filtersterilisatie en de toevoeging van konijnenserum en gelatine (voor RF-spirocheten) of na filtersterilisatie en serum (en gelatine) toevoeging. Het medium is stabiel wanneer het lange tijd wordt ingevroren. Wanneer bewaard in een koelkast, gebruik het medium binnen 1 maand. RF-soorten groeien het beste met vers medium, meestal niet meer dan 1 week oud. Indien niet bevroren, inspecteer dan visueel de kwaliteit van het medium op troebelheid. Gooi het medium weg dat besmet lijkt te zijn, neerslaande ingrediënten of anderszins dubieus.
    8. Als antibiotica aan het medium moeten worden toegevoegd, voeg ze dan toe aan vers gemaakt medium of eerder ingevroren aliquots; Dat laatste is de meer flexibele aanpak. Gebruik antibioticaconcentraties zoals beschreven door Oliver et al.39.
    9. Terwijl u een buis van het medium ontdooit, weegt u antibiotica af in steriele (geautoclaveerde) buizen van 1,7 ml of steriele conische buizen van 15 ml, met behulp van een precisiebalans. Bereid de stamoplossingen als volgt: Los 25 mg amfotericine B op in 10 ml DMSO, 20 mg fosfomycine in 1 ml gedestilleerd water met autoclave en 50 mg rifampicine in 1 ml DMSO.
    10. Filter steriliseer (0,2 μm spuitfilters) de antibiotica en breng ze over in een nieuwe buis van de juiste grootte.
    11. Verdun de antibiotica in een verhouding van 1:1000 van het medium om hun uiteindelijke concentratie te bereiken. Voeg voor 500 ml BSK 0,5 ml amfotericine B-stamoplossing (2,5 mg/ml in DMSO), 0,5 ml fosfomycine-stockoplossing (20 mg/ml in steriel H2O) en 0,5 ml rifampicine (VS: rifampicine) stamoplossing (50 mg/ml DMSO) toe.
    12. Gebruik het met antibiotica aangevulde medium of aliquot en vries in bij -20 °C.
Kiezers Bedrag (/L)
BSA fractie V 50 gr
CMRL-1066 (10x) 100 ml
Neopepton 5 gr
Hepes 6 gr
Citroenzuur trinatriumzoutdihydraat 0,7 g
Glucose 5 gr
TC Yeastolaat 2 gr
Pyruvinezuur (Na-zout) 0,8 g
N-acetyl-D-glucoseamine 0,4 g
Natriumbicarbonaat 2,2 g
Water (hoge zuiverheid) 900 ml

Tabel 1: Samenstelling van 1 L BSK-II medium.

Bron Geschiktheid
Serva GmbH, Heidelberg, Duitsland Ja
Proliant Biologicals, Boone IA, Verenigde Staten Ja
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, Verenigde Staten Nee

Tabel 2: Bronnen van BSA en geschiktheid voor BSK-II medium.

2. Instructies voor het maken van MKP

  1. Bereiding van basismedium
    1. Weeg en los alle poedervormige componenten zoals hieronder vermeld in tabel 3 zorgvuldig af in 3 /4 van het uiteindelijke volume van ddH2O (ca. 750 ml) door te roeren tot het volledig is opgelost, wat ~ 1 uur duurt.
    2. Nadat de pH volledig is opgelost, stelt u de pH met NaOH in op 7,6 en het volume op 1000 ml en steriliseert u vervolgens door filtratie (filter van 0,22 μm).
      OPMERKING: Basismedium kan tot 3 maanden bij -20 °C worden bewaard.
  2. Bereiding van MKP compleet medium
    1. Meng alle componenten zoals vermeld in tabel 4 op een steriele manier; steriliseer de gelatine door autoclaveren en hanteer deze op een steriele manier. Werk in een steriele biologische veiligheidskast en gebruik een steriel gefilterd serum.
    2. Aliquot MKP in 50 ml buizen. Zet een klein aliquot gedurende enkele dagen op 33 °C en controleer vervolgens onder een darkfieldmicroscoop op de afwezigheid van besmetting.
      OPMERKING: Houd MKP volledig medium op +4 °C gedurende niet langer dan 1 maand en vries niet in. Het volledige medium kan bovendien worden gesteriliseerd door filtratie met behulp van een filter van 0,22 μm.
Kiezers Bedrag (/L)
CMRL-1066 (10x zonder glutamine) 100 ml (indien vloeibaar)/9,7 g/l indien poeder
Neopepton 3 gr
Hepes 6 gr
Citroenzuur 0,7 g
Glucose 3 gr
Pyruvinezuur 0,8 g
N-acetylglucoseamine 0,4 g
Natriumbicarbonaat 2 gr

Tabel 3: Samenstelling van 1 L basismedium MKP (gemodificeerd Kelly-Pettenkofer).

Kiezers Hoeveelheid (ml)
Basis medium 500
7% gelatine (in H2O) (vers geautoclaveerd maar niet heet) 100
Konijn serum 36
35% BSA 17.5

Tabel 4: Samenstelling van MKP (Modified Kelly-Pettenkofer) compleet medium.

3. Cultuur van Borrelia, met of zonder antibiotica

  1. Voer alle experimentele stappen uit onder steriele werkomstandigheden in een biologische veiligheidskast. Desinfecteer het oppervlak en alle materialen met 70% ethanol en breng ze onmiddellijk over naar de biologische veiligheidskast. UV-sterilisatie van alle niet-biologische materialen in de biologische veiligheidskast gedurende 5 minuten voor aanvang van de werkzaamheden.
  2. Gebruik een zo vers mogelijk medium.
  3. Om een kweek te starten, verwarmt u het medium (33 °C - 37 °C) voor in een incubator. Breng indien nodig schudden aan.
    OPMERKING: Afhankelijk van het volume van het medium kan deze stap enkele uren duren.
  4. Voeg ~ 1 ml ontdooide Borrelia-cultuur uit een glycerol of soortgelijke bouillon, eerder bewaard bij -80 ° C en ontdooid bij kamertemperatuur (RT), zodra het vloeibaar is, toe aan 5-15 ml voorverwarmd BSK-medium. Ent de cultuur in een klein volume (5-15 ml BSK) met behulp van in de handel verkrijgbare glazen of plastic injectieflacons met schroefdoppen. Vul de buizen bijna vol om een micro- of anaerobe atmosfeer te creëren. Sluit de buizen goed af; als het op deze manier wordt gekweekt, is CO2 niet nodig.
  5. Kweek RF-soorten (en B. persica) bij 37 °C in een incubator zonder roeren of roeren. Kweek B. burgdorferi sensu lato soorten bij 33-34 °C.
  6. Volg de groei van de Borrelia-cultuur met behulp van fasecontrast of darkfieldmicroscopie bij een vergroting van 200x-400x (figuur 3). Om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen, mengt u de cultuur met een serologische pipet of voor meer mengen met een 3 ml transferpipet tijdens het op en neer pipetteren.
    OPMERKING: Borrelia zijn het meest zichtbaar bij een hogere vergroting (200X-400X), maar zijn het best aftelbaar bij 200X vergroting op een hemocytometer40. Borrelia-beweging en morfologie zijn indicatief voor de aanwezigheid van deze bacteriën.
  7. Om de bacteriegroei te kwantificeren, telt u verschillende (10) individuele kleine vierkanten in het zestienveldenrasterpatroon van het telgebied aan beide zijden van de hemocytometer en het gemiddelde. Vermenigvuldig het gemiddelde celaantal per klein vierkantje met de conversiefactor die geschikt is voor de hemocytometer die wordt gebruikt om het celgetal per ml te bepalen.
  8. Controleer de bacteriegroei met tussenpozen van 1-2 dagen. De exponentiële groei van Borrelia is afhankelijk van de levensvatbaarheid en celdichtheid en kan 1 week of langer duren bij 34 °C. Verdun de exponentiële faseculturen in een verhouding van 1:2 of 1:4 met het medium in een buis van 1,7 ml voordat u op de hemocytometer wordt geladen. Neem bij het bepalen van het celgetal voldoende rekening met de verdunningsfactor. Spuit na gebruik de oppervlakken en hemocytometer in met verdund bleekmiddel (10%) en/of 70% ethanol.
    OPMERKING: Borrelia zijn in exponentiële groei wanneer celconcentraties 1-5 x 107 cellen / ml zijn. Binnen dit bereik groeien de cellen goed.
  9. Uitgebreide cultuur zal voedingsstoffen uitputten en de pH van het medium veranderen, dus subculturing is vereist. Breng onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast 1/10 van het kweekvolume over in een nieuwe buis en vul deze met het nieuwe medium (een vers aliquot van hetzelfde medium dat werd gebruikt om de vorige passage te laten groeien). Een verdunning van 1:10 is optimaal. Als het kweekvolume moet worden gewijzigd, past u de hoeveelheid entmateriaal dienovereenkomstig aan en gaat u door met incubatie. Het aantal passages neemt toe met elke mediumverandering.
  10. Voor extractie van DNA of isolatie van Borrelia-cellen, centrifugeer de exponentiële fase Borrelia gedurende 10 minuten bij 4000 x g om de bacteriën te pelleteren. Gooi het supernatant weg in geschikt biologisch gevaarlijk afval. Verwerk de gepelletiseerde bacteriën met een commerciële DNA-extractiekit of resuspendeer de bacteriën in een geschikt medium voor het beoogde experiment.
  11. Steriliseer aan het einde van elke manipulatie alle apparatuur met ethanol en UV-straling, afhankelijk van de apparatuur. Verzamel het vloeibare afval, inclusief overtollige cultuur, in een afvalfles en voeg bleekmiddel toe tot een eindconcentratie van 10%. Plaats deze fles op -80 °C voordat u deze weggooit. Als alternatief, steriliseer het vloeibare afval en de cultuur zonder bleekmiddel of alcohol door autoclaveren.

4. Langdurige opslag van Borrelia-culturen

  1. Bereiding van glycerolvoorraad van Borrelia-cultuur
    1. Neem ~ 1,8 ml aliquots van exponentiële faseculturen, celconcentraties ~ 107-10 8 cellen / ml, en voeg steriele glycerol toe aan een eindconcentratie van 10% (concentraties van 5% -20% werken).
    2. Plaats in cryogene injectieflacons met schroefdop van 2 ml. Bewaren bij -80 °C.
    3. Houd een voorraad aan met ten minste 10 tubes van elke soort in de vriezer.
  2. Een alternatief opslagrecept om een glycerolvoorraad te produceren voor permanente opslag
    1. Meng 2/3 van Borrelia cultuur met 1/3 van 15% glycerol in Brucella bouillon . Gebruik 2,8 g Brucella-bouillon opgelost in 100 ml ddH2O, dat steriel gefilterd was (0,22 μm).
    2. Houd de glycerolvoorraad van de monsters op -70 °C tot -80 °C.

5. Isolatie van spirocheten uit milieu- of klinische bronnen

OPMERKING: Als materiaal wordt geïsoleerd van menselijke, dierlijke of milieubronnen, moet onderzoeksethiek, dierverzorging of ecologische certificering, indien van toepassing, worden verkregen.

  1. Teelt van Borrelia van harde teken
    1. Verzamel volwassen vrouwtjes, mannetjes en/of nimfteken.
    2. Steriliseer alle tekenmonsters door ze gedurende 2 minuten in 70% ethanol te dompelen en aan de lucht te drogen in een biologische veiligheidskast. Ontleed individueel in verschillende stukken met een steriel scalpel. Plaats de stukjes in een buis van 2 ml met 1,5 ml medium, aangevuld met antibiotica.
    3. Incubeer de culturen bij 34 °C en controleer op spirocheten door middel van darkfield- of fasecontrastmicroscopie tweemaal per week gedurende de eerste 2 weken en wekelijks daarna gedurende 6 weken (vaker voor RF-spirocheten). Subcultuur-positieve monsters in 5 ml van hetzelfde medium.
      OPMERKING: Verontreinigde culturen kunnen tot op zekere hoogte worden gezuiverd door filtratie met behulp van een filter van 0,2 μm; Antibiotica kunnen nodig zijn om besmetting volledig op te lossen.
  2. Teelt van Borrelia uit bloedmonsters
    OPMERKING: Het bloedmonster moet worden genomen door een gekwalificeerde medische, veterinaire of onderzoeksprofessional, afhankelijk van de bron van het materiaal. Minder dan 24 uur bij RT moet verstrijken tussen monster
    verwijdering en aankomst in het lab.
    1. Verkrijg 10 ml bloed, verzameld in glazen bloedafnamebuizen met zure citraat dextrose (ACD; "gele top") als antistollingsmiddel. Laat op kamertemperatuur staan. Het wordt aanbevolen dat er minder dan 24 uur verstrijken tussen bloedafname en inenting.
    2. Centrifugeer het bloed met antistollingsmiddel gedurende 10 minuten bij 200-400 x g om plasma van bloedcellen te scheiden.
    3. Verwijder het plasma voorzichtig uit de buis en ent 1 ml plasma in 5 ml voorverwarmd MKP compleet medium. MKP kan worden aangevuld met antibiotica. Incubeer culturen bij 33 °C met dagelijkse visuele inspectie en wekelijkse darkfield- of fasecontrastmicroscopie totdat borreliale groei wordt opgemerkt (vaker voor RF Borrelia), wat tot 9 weken kan duren.
      OPMERKING: Als u grotere of kleinere inentingsvolumes gebruikt, handhaaft u de verhouding 1:5 van entmiddel tot medium. Gebruik sera of plasma in plaats van volbloed.
  3. Teelt van Borrelia uit huidbiopsie
    1. Oppervlak steriliseer de huidbiopsie (idealiter een kubus van 3 mm x 3 mm x 3 mm; d.w.z. met 70% ethanol en waterstofperoxide). Plaats het biopsiemonster in een fysiologische zoutoplossing.
      OPMERKING: Een biopsiemonster moet worden genomen door een gekwalificeerde medische, veterinaire of onderzoeksprofessional, afhankelijk van de bron van het materiaal. Minder dan 24 uur bij RT moet verstrijken tussen het verwijderen van het monster en aankomst in het laboratorium.
    2. Snijd het monster in twee tot zes kleinere stukjes met behulp van een steriel scheermesje in een steriele glazen petrischaal terwijl het wordt ondergedompeld in de fysiologische zoutoplossing. Breng alle monsters en ~ 1 ml van de fysiologische zoutoplossing waarin de huidbiopsie werd opgeslagen over in 5 ml voorverwarmd medium aangevuld met antibiotica en incubeer bij 33 ° C.
    3. Voeg in geval van overgroei van verontreinigende bacteriën antibiotica toe zoals in stap 1.1.10 hierboven, of door twee tabletten sulfamethoxazol (23,75 mg; eindconcentratie 5 mg / ml) + trimethoprim (1,25 mg; 0,25 mg / ml) of Bactrim (minimale remmende concentratie >128 μg / ml), twee tabletten Amikacine (2 x 30 μg; eindconcentratie 12 μg / ml) toe te voegen, en twee tabletten fosfomycine (2 x 200 μg; eindconcentratie 80 μg/ml).
      OPMERKING: Zorg er in alle gevallen voor dat u onder de minimale remmende concentratie van dat antibioticum blijft voor de Borrelia-soort waarvoor wordt geprobeerd te kweken41,42,43.
    4. Als de cultuur positief is voor Borrelia, bewaar de cultuur dan nog eens 3-4 dagen of totdat de hoeveelheid Borrelia 10+ spirocheten bereikt in een microscoopveld met behulp van een 40X-objectief. Maak een glycerolvoorraad voor permanente opslag.

6. Isolatie van monoklonale populaties van B. burgdorferi sensu lato spirocheten en B. miyamotoi uit vloeibare culturen door teelt op vaste media

  1. Verwarm voor het maken van platen 300 ml 1,5X MKP compleet medium (zonder gelatine). Verwarm ook 200 ml 1,7% agarose (geautoclaveerd in gedeïoniseerd water, opgeslagen bij RT en in de magnetron voor gebruik) tot 55 °C. Meng beide vloeistoffen.
  2. Pipetteer 15 ml van dit mengsel in elk van de 16 diepe petrischalen om de onderste agar oselayer te maken.
  3. Bewaar de rest van het medium bij 55 °C in een waterbad.
    OPMERKING: De Borrelia worden gemengd in de bovenste agaroselaag.
  4. Kwantificeer eerst de Borrelia-cultuurdichtheid met behulp van een hemocytometer en verdun tot de gewenste dichtheid in een vloeibaar medium.
    OPMERKING: 500, 200, 100 en 50 spirocheten per bord werken goed.
  5. Nadat de bodemplaten zijn gestold, voegt u 10 ml van het resterende agarosemengsel toe aan een buis van 15 ml met het juiste aantal spirocheten.
  6. Giet de suspensie op de bodem agarose in de gelabelde petrischaal.
    OPMERKING: Aangezien Borrelia spirocheten gevoelig zijn voor hoge temperaturen, moet ervoor worden gezorgd dat de bacteriën gedurende een langere periode niet worden blootgesteld aan 55 °C; Giet de bovenste agar onmiddellijk na toevoeging aan de bacteriële cellen in het medium.
  7. Nadat de borden volledig zijn gestold, sluit u de petrischaaltjes en plaatst u ze ondersteboven bij 34-35 °C in 2,5% CO2.
    OPMERKING: De kolonies verschijnen 1 week na het plateren als de procedure succesvol is.
  8. Om de afzonderlijke kolonies te screenen en uit te breiden, selecteert u enkele kolonies uit de platen en plaatst u ze in 1,5 ml gemodificeerde vloeibare MKP of andere geschikte media in steriele kweekbuizen van 2 ml.
  9. Incubeer de culturen bij 34 °C en onderzoek op spirocheten door middel van darkfield- of fasemicroscopie. Gebruik deze culturen voor analyse of voorraden, gemaakt zoals hierboven beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Borrelia-cultuurmedia BSK en MKP, en varianten, zijn rijke cultuurmedia met ingrediënten die sequentieel moeten worden bereid en gesteriliseerd. Indien correct bereid, moet BSK-medium roodoranje en helder zijn (figuur 1). Troebelheid en neerslag die na opwarming aanhouden, duiden op problematische ingrediënten, gemiddelde productie of verontreiniging; Een dergelijk medium kan het beste worden weggegooid. Als gelatine wordt toegevoegd aan BSK en met MKP, zal het medium gelatineus zijn wanneer het wordt gekoeld; Bij opwarming zal het vloeibaar zijn, hoewel enigszins stroperig.

De groei van pure Borrelia-culturen zal de troebelheid van het medium niet veranderen. De groei van bacterieculturen, Borrelia, evenals verontreinigingen, zal echter van gemiddelde kleur veranderen als gevolg van de pH-indicator. Overgroei door andere bacteriën zal troebelheid en samenklonterde materialen veroorzaken (figuur 2).

De kweekgroei kan worden gevolgd door fasecontrast of darkfieldmicroscopie (figuur 3 en figuur 4). Borrelia-cellen in de exponentiële fase zijn meestal slank en geknikt en tot op zekere hoogte beweeglijk. Naarmate de culturen in de stationaire fase komen, worden ronde lichamen steeds duidelijker (figuur 5). Klinische of omgevingsisolaten bevatten vaak meerdere Borrelia-stammen en/of -soorten. Om zuivere klonen te isoleren, kunnen vloeibare culturen worden verguld om monoklonale kolonies te isoleren (figuur 6); Soms kunnen meerdere rondes van kolonie-isolatie nodig zijn.

Figure 1
Figuur 1: BSK en MKP medium. (A) BSK (met antibiotica) met een zuivere kweek van Borrelia burgdorferi. Met of zonder B. burgdorferi medium blijft zonder zichtbare troebelheid en is oranje-amber (kleur varieert enigszins met ingrediënten). (B) MKP-medium, niet geïnoculeerd, ontdooiend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Verontreinigd BSK- en MKP-medium met overgroei van concurrerende bacteriën. Medium is verkleurd, troebel en na verloop van tijd sterven concurrerende bacteriën af en slaan neer op de bodem van de buis. (A) Overwoekerde BSK-buis. (B) Oude BSK-buis met neergeslagen verontreinigende bacteriën. (C) MKP-buis met (links) en zonder (midden)cultuur en besmette cultuur (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Gebruik van een hemocytometer om de groei van Borrelia te volgen. Borrelia burgdorferi stam B31 (een deelverzameling aangegeven door pijlen) bekeken op een hemocytometer (één lijn van het kleine raster wordt aangegeven door de pijlpunt) onder 200X fasecontrast. Deze vergroting en het proces maken het mogelijk om culturen te monitoren en de celdichtheid te schatten. Schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Darkfield opname van Borrelia burgdorferi. Darkfield-opname van Borrelia burgdorferi-stam SCW-53, met hoge dichtheid in exponentiële fase na 5-7 dagen teelt in MKP-medium (400X vergroting). Schaalbalk is 20 μm. Deze soort werd geïsoleerd uit de harde teek Ixodes affinis, verzameld in South Carolina, VS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Borrelia in oude culturen. Naarmate Borrelia-cellen in oude culturen in de stationaire fase komen, worden ronde lichaamsvormen steeds vaker gezien om de spirochetale vorm te vervangen. Dit kunnen slapende vormen of dode cellen zijn. Linkerpaneel, Dieterle-beits; middenpaneel, immunohistochemische vlek; en rechterpaneel, fluorescerende in situ hybridisatie van een Borrelia-cultuur (vermoedelijk B. burgdorferi op basis van oorsprong, maar de soort en stam werd niet moleculair geïdentificeerd) geënt met hondenurine. Het verzamelen van de gegevens in figuur 5 werd goedgekeurd door de Mrt. Allison University Animal Care Committee, goedkeuringsnummer 16-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Borrelia burgdorferi sensu lato complex spirocheten. Kolonies van Borrelia burgdorferi sensu lato complex spirocheten gekweekt op vast medium om zuivere klonale populaties te isoleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De laboratoriumkweek van bacteriën is de springplank voor onderzoek. Het diepgaande voordeel dat wordt verleend door het vermogen om te kweken, wordt geïllustreerd door de strijd, meer dan een eeuw die pas onlangs in succes culmineerde, om Treponema pallidum te kweken, de spirocheet die de etiologische agent van syfilis is44. Borrelia spirocheten zijn ook een uitdaging voor cultuur, maar cultuur is mogelijk 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Borrelia-cellen zijn kieskeurig en elke soort en stam en zelfs isolaat verschilt, zowel genetisch als door aanpassing aan de gastheer waaruit ze zijn geïsoleerd 51,52,53,54,55. Bij het maken van media maakt het gebruik van geschikte ingrediënten een enorm verschil in de kracht van de Borrelia-cultuur of zelfs de levensvatbaarheid van de cultuur. Het gebruik van vers bereid, sterk verrijkt en goed opgeslagen medium is essentieel om de groei van bacteriën te bevorderen en is een gevestigde vereiste voor bacteriegroei. Voor Borrelia is het handhaven van anaërobe of microaerobe omstandigheden vereist voor een goede groei. Dit kan het eenvoudigst worden bereikt door buizen naar boven te vullen, zodat er weinig tot geen lucht in de buis achterblijft en de culturen zonder agitatie te laten groeien; Een strengere controle van zuurstof en koolstofdioxide kan nodig zijn voor genexpressie en gerelateerde studies 26,27,28,29,30. De toevoeging van antibiotica aan het bacteriële kweekmedium lijkt misschien contra-intuïtief; het gebruik van lage doses antibiotica in het Borrelia-medium is om de groei van sneller groeiende bacteriën te ontmoedigen. Als de cultuur wordt ingeënt met een zuiver Borrelia-isolaat, is de toevoeging van antibiotica niet nodig; het gebruik van toegevoegde antibiotica is echter essentieel om overgroei van concurrerende bacteriën te ontmoedigen bij het inenten met klinische of omgevingsmonsters. BSK-medium kan ook worden aangevuld met 3% -7% gelatine. Dit is nodig voor de groei van RF Borrelia soorten21. Het gebruik van BSK of MKP voor de groei van Borrelia burgdorferi sensu lato-soorten hangt af van de bron van het isolaat. Beide media ondersteunen de groei van gevestigde culturen, maar MKP blijkt beter te presteren bij het zaaien van nieuwe culturen met een laag aantal Borrelia-cellen, zoals gebeurt met klinische of omgevingsisolaten23,24. Dit medium maakt ook de cultuur van B. miyamotoi56,57,58 mogelijk. Uiteindelijk is er een element van kunst in de wetenschap van het kweken van kieskeurige microben, maar het is mogelijk met zorg en doorzettingsvermogen.

De cultuur van Borrelia ligt ten grondslag aan de vooruitgang in biomedisch onderzoek. De cultuur van Borrelia heeft het mogelijk gemaakt om het volledige genoom en proteoom van veel Borrelia-soorten te bepalen, waardoor onderzoekers de evolutie en biologie van deze spirocheten konden ontrafelen54,58,59. Evenzo maakt toegang tot zuivere culturen van Borrelia het mogelijk om de vele complexe interacties van Borrelia met de zoogdiergastheer en geleedpotige vector 61,62,63,64,65, inclusief interacties met het immuunsysteem van de gastheer 11,65, te begrijpen, waardoor mechanismen van overdracht kunnen worden afgeleid 29,66, en biedt het belangrijkste onderzoeksinstrument om kweekbare, dus noodzakelijkerwijs levende, cellen te onderscheiden van cellulair puin, een onderscheid dat van cruciaal belang is bij het ontrafelen van de mechanismen van pathogenese en effectieve behandelingsregimes 8,67,68,69,70,71. Hoewel de in vitro Borrelia-cultuur enkele weken kan duren voordat spirocheten voldoende overvloedig aanwezig zijn voor detectie, heeft het beperken van klinische diagnostische toepassingen, fundamenteel begrip van Borrelia-biologie, genomica, gastheer-pathogeeninteracties en nog veel meer toepassingen vertrouwd op het vermogen om pure Borrelia te isoleren culturen uit omgevingsisolaten, en om die isolaten te versterken door middel van kweek om voldoende materiaal te produceren voor biochemische en genetische analyse. Er is een maatschappelijke drang naar een snelle reactie op infecties om een snelle diagnose en behandeling te ondersteunen. De andere component van deze behoefte is echter het biomedische en biologische onderzoek dat nodig is voor een solide basis om ziekten op de juiste en succesvolle manier te behandelen en te voorkomen. Hoewel het een uitdaging is, is in vitro kweek van Borrelia spirocheten mogelijk en kan deze behoeften ondersteunen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er werden geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natural Science and Engineering Research Council of Canada en de Canadian Lyme disease Foundation (AB en VL), de Swedish Research Council (SB, M-LF en IN), TAČR GAMA 2 project - "Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS" (TP01010022) (MG en NR), en door een subsidie van het Ministerie van Volksgezondheid van de Tsjechische Republiek NV19-05-00191 (MG en NR). We danken S. Vranjes (2021, Rudenko lab) voor de afbeelding in Figuur 4 en J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) voor de beelden in Figuur 5. We bedanken alle onderzoekers die hebben bijgedragen aan het veld en verontschuldigen ons bij degenen wiens werk we niet konden citeren vanwege ruimtebeperkingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 189
Teeltmethoden van Spirocheten uit Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato Complex en Relapsing Fever <em>Borrelia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter