Summary
开发了一种简单且可扩展的方法来评估Ube3a中错义变异的功能意义， Ube3a是一种基因，其功能的丧失和获得与Angelman综合征和自闭症谱系障碍有关。
Abstract
测序在医学中的使用越来越多，已经在人类基因组中发现了数百万个编码变异。这些变异中的许多发生在与神经发育障碍相关的基因中，但绝大多数变异的功能意义仍然未知。本协议描述了Ube3a变异的研究， Ube3a是一种编码与自闭症和安格曼综合征相关的E3泛素连接酶的基因。 Ube3a 的重复或三重与自闭症密切相关，而其缺失会导致Angelman综合征。因此，了解UBE3A蛋白活性变化的效价对临床结果很重要。在这里，描述了一种快速的，基于细胞的方法，该方法将 Ube3a变体与Wnt 通路报告基因配对。这种简单的测定是可扩展的，可用于确定任何 Ube3a 变体中活性变化的价和幅度。此外，该方法的便利性允许产生丰富的结构功能信息，这些信息可用于深入了解UBE3A的酶机制。
Introduction
最近的技术进步使外显子组和基因组的测序成为临床环境中的常规1，2。这导致了大量遗传变异的发现，包括数百万个错义变异，这些变异通常会改变蛋白质中的一个氨基酸。了解这些变异的功能意义仍然是一个挑战，只有一小部分（~2%）已知的错义变异具有临床解释1，3。
这个问题的一个突出例子是Ube3a，这是一种编码E3泛素连接酶的基因，该酶靶向底物蛋白进行降解4。Ube3a 位于染色体 15q11-13 内，仅由母系遗传等位基因5，6，7 表达。疾病遗传学的观察强烈表明，UBE3A酶活性不足或过度会导致明显的神经发育障碍。母体染色体 15q11-13 缺失会导致安格曼综合征 （AS）8，这是一种以严重智力障碍、运动障碍、癫痫发作、快乐举止和频繁微笑和面部畸形特征为特征的疾病8，9，10。相比之下，母体染色体15q11-13的重复或三重会导致Dup15q综合征，这是一种被认为是自闭症最普遍的综合征形式之一的异质性疾病11，12，13。此外，在Ube3a中发现了数百种错义变异，其中大多数被认为是具有不确定意义的变异（VUS），因为它们的功能和临床意义是未知的。因此，人们对开发能够实证评估Ube3a变异以确定它们是否有助于神经发育疾病的方法产生了相当大的兴趣。
UBE3A 酶属于 E3 泛素连接酶的 HECT（与 E6-AP C 末端同源）结构域家族，它们都具有同名的 HECT 结构域，其中包含接受来自 E2 酶的活化泛素并将其转移到底物蛋白所需的生化机制14。从历史上看，E3酶的表征依赖于需要纯化蛋白质集合的体外重建系统4，15，16。这种方法缓慢且费力，不适合评估大量变体的活性。在以前的工作中，UBE3A被鉴定为通过调节蛋白酶体的功能来激活HEK293T细胞中的Wnt途径，以减缓β-连环蛋白17的降解。这种洞察力允许使用 Wnt 通路报告基因作为一种有效和快速的方法来识别 Ube3a18 的功能丧失和获得变体。下面的协议详细描述了一种生成Ube3a变体的方法以及基于荧光素酶的报告基因，用于评估Ube3a变体活性的变化。
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Protocol
1. 诱变克隆生成Ube3a 变体
- 将所有 Ube3a 变体克隆到pCIG2质粒中（图1A），这是一种双纤载体，其中包含鸡-β-肌动蛋白启动子和用于EGFP表达的内部核糖体进入位点（IRES）19。全长 Ube3a 构建体包含一个N端Myc标签序列，并使用5'SacI位点和3'XmaI位点克隆到pCIG2中。此外， Ube3a 编码序列中天然存在的EcoRI，EcoRV和PstI位点也用于亚克隆片段。
注意： Ube3a 的去标识化变体可以通过文献和可公开访问的存储库（如 ClinVar 数据库1）获得。其他未报告的变异可以通过与医疗中心的个人沟通获得。 - 使用适应的两步巨引物诱变方法20 将突变引入 Ube3a 阅读框。在第一步中，设计包含所需突变的诱变寡核苷酸（本协议中显示的示例是生成UBE3A Q588E变体），两侧是至少30个与突变同源5′和3′的碱基对（bp）（图1B 和 表1）。
- 使用诱变寡核苷酸和互补寡核苷酸进行第一轮PCR，以产生含有突变的200-400 bp巨型引物（图1C;表 2 和 表 3）。使用整个 50 μL PCR 反应体积，使用 1% 凝胶进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行凝胶纯化（材料表）。将 PCR 产物洗脱在 30 μL 去离子H2 O （diH2O） 中，用于下面的第二轮 PCR 步骤。
- 如图所示设置第二轮PCR（图1C;表 2 和 表 3）。此步骤将产生更大的DNA片段（长度通常为~1-1.5 kb），其中包含适合亚克隆的突变和末端限制性位点（图1C）。
- PCR反应完成后，使用PCR纯化试剂盒纯化所得产物（材料表）。洗脱 30 μL 并用适当的限制性内切酶消化所有纯化产物和 pCIG2 Ube3a WT 构建体（示例显示了使用 EcoRI 和 XmaI 进行消化）。
- 在37°C下消化2小时后，通过琼脂糖凝胶电泳（1%凝胶）溶解消化产物，并对适当的产物进行凝胶纯化。根据制造商的方案（材料表）设置连接，将连接产物转化为DH10B细菌菌株（材料表），然后用氨苄青霉素（100μg/ mL）选择板。
- 第二天，挑选 2 到 4 个菌落接种含有 Luria 肉汤 （LB） 和 100 μg/mL 氨苄西林的 3 mL 培养物。让培养物在37°C下在振荡（225rpm）的轨道培养箱中生长过夜。
- 第二天，使用1-1.5 mL细菌培养物对质粒DNA进行小型制备（材料表）。通过将剩余的培养物置于4°C来保存它们。 使用寡核苷酸通过Sanger测序筛选小制备质粒，该寡核苷酸与所需突变结合~200 bp。
- 使用保存在4°C的细菌培养物重新接种50mL培养物以midiprep正确的质粒（材料表）。对 Ube3a 编码序列进行完全测序，以验证DNA的正确序列。
- 使用无菌 H2O 以 100 ng/μL 的浓度创建 Ube3a 变体质粒的工作储备，以及 β-连环蛋白活化报告基因 （BAR）21、TK-雷尼拉荧光素酶、连接酶-死 Ube3a（UBE3A C820A 突变）和 pCIG2 空载体，用于后续转染步骤。
2. 人胚胎肾293T（HEK293T）细胞的制备和转染
- 如前所述，在预补充有谷氨酰胺、10% 胎牛血清 （FBS） 和抗生素-抗真菌剂的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中生长的 HEK293T 细胞中进行测定17。在37°C的无菌加湿培养箱中用5%CO2培养细胞生长细胞。
- 使用生物安全柜，首先将悬浮的HEK293T细胞以每孔2.2×10 4个细胞的密度在100μL培养基中以每孔2.2104 个细胞的密度接种到组织培养处理的96孔平底板上，并让它们生长过夜。
- 第二天，用萤火虫和 雷尼拉 荧光素酶报告质粒（表4）和 Ube3a 质粒一式三份在生物安全柜中转染细胞。使用10：1：8比例的质粒（分别为每孔50 ng的BAR，5 ng的TK-Renilla和40 ng的 Ube3a 质粒），如前所述18和0.4 μL转染试剂（表4），每孔总体积为10 μL。
注意：对于每个实验，还转染一个空载体（仅GFP）和编码连接酶死 Ube3a 的质粒作为阴性对照。 - 在 1.5 mL 微量离心管中为每个变体的转染创建预混液（表 4），并在室温 （RT） 下孵育 15 分钟。孵育后，通过敲击试管轻轻搅拌转染混合物，然后将 10 μL 转染混合物直接添加到孔中的现有生长培养基中。
- 之后，将细胞放回培养箱并让质粒表达48小时。无需更换生长培养基。
- 使用荧光显微镜通过GFP荧光监测转染效率。HEK293T细胞通过该方法高效转染，48小时后>80%的细胞应表达GFP。
3. 荧光素酶活性的测定
注意：荧光素酶活性使用市售系统进行评估，该系统根据制造商的方案测定萤火虫和 雷尼拉 荧光素酶（材料表）。
- 小心地从转染的HEK293T细胞中吸出培养基，然后用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。吸出PBS并通过加入25μL非变性裂解缓冲液裂解细胞，并在冰上轻轻摇动孵育15分钟。
- 之后，将 20 μL 所得裂解物（无需离心）加入含有 100 μL 萤火虫荧光素酶底物试剂的新 96 孔测定板中。轻敲轻轻混合盘子。
- 将板装载到读板器上，并使用读数高度为1 mm，积分时间为1 s的顶部检测器测量发光。
注意：探测器的增益可能需要根据信号强度进行调整。 - 读取萤火虫荧光素酶发光后，立即向孔中加入 100 μL Renilla 荧光素酶底物。此步骤同时淬灭萤火虫荧光素酶活性，同时评估雷尼拉荧光素酶活性。通过轻轻搅拌板混合样品并再次测量发光以评估 Renilla 荧光素酶活性。
注意：虽然其他板可用于此测定，但使用带有黑框和白色孔的板将提供最灵敏的结果，因为这可以放大荧光素酶信号，同时最大限度地减少噪声。 - 将报告者的反应量化为萤火虫荧光素酶与雷尼 拉 荧光素酶的比率（萤火虫/雷尼拉），并平均一式三份测量值。然后，将每个变体的Firefly/Renilla 值与表达野生型（WT） Ube3a 的细胞的值标准化，以比较变体蛋白的相对活性。
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Representative Results
Ube3a错义变异的大规模功能筛选确定了功能丧失和获得突变的广泛前景
先前对Ube3a突变体的研究表明，Wnt反应可以作为细胞 UBE3A 蛋白活性的报告基因。扩大了这些观察结果，并进行了额外的验证实验，以研究BAR测定是否适合报告细胞中的一系列UBE3A活性。首先，用编码人WT Ube3a的不同量的质粒DNA转染HEK293T细胞。该实验表明，BAR反应随转染到细胞中的 Ube3a 量呈线性变化（图2A）。其次，使用编码先前在文献22中表征的疾病相关变异的质粒DNA测试BAR测定。其中包括良性变异（R39H和A178T），一种自闭症相关功能获得变异（T458A），以及一系列已确认的安格曼综合征相关变异，这些变异通过各种机制导致UBE3A功能丧失15，22。BAR测定正确识别了每个变体（图2B），包括所有功能丧失变体，证明了该方法的准确性和通用性18。
BAR测定用于筛选152个错义变异，其中大部分是从ClinVar数据库中鉴定的。与 Ube3a依赖性疾病中拷贝数变异的遗传证据类似，错义变异的功能影响是广泛的，包括良性变异以及功能丧失和功能获得变异（图3）18。特别令人感兴趣的是，使用这种方法鉴定的功能获得变异都是新颖的，随后的验证强烈表明他们定义了 Ube3a依赖性疾病的一个亚类，其表型不同于经典的Angelman综合征18。
错义变异的影响通常是不可预测的，这强调了功能评估的必要性
Ube3a变体的功能筛选的一个有趣的观察结果是，某些氨基酸位置的变化会产生截然不同的效果，从而强调了经验变异评估的重要性18。例如，在UBE3A的谷氨酰胺588（Q588）位置鉴定出三个个体的变异，其中包括功能获得性谷氨酸替代（Q588E），功能丧失精氨酸替代（Q588R）和另一种功能丧失脯氨酸替代（Q588P;图 4A）。使用全面的突变方法将Q588位置突变为每种可能的氨基酸。当使用BAR测定法测量这些变体的活性时，它表明588位置的任何带负电荷的氨基酸都会产生过度活跃的酶（图4B）。这一见解提供了重要的功能线索，允许在UBE3A的HECT结构域内发现促进泛素链伸长的新位点18。
图1： Ube3a的PCR依赖性诱变 。 （A）Ube3a表达载体的表示，指示相关的限制性位点。（B）编码UBE3A的DNA序列显示在顶部。Q588密码子用粗体字表示。Q588E诱变引物（Mut.引物）与UBE3A序列对齐。红色字母表示诱变的部位。（C）显示了生成巨型引物的PCR和用于亚克隆Q588E片段的DNA片段的示意图。Q588E突变的位置用红色星号表示。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：BAR 测定作为 UBE3A 泛素连接酶活性报告基因的验证。 （A）用越来越多的编码WT UBE3A的质粒转染的HEK293T细胞显示出BAR反应的线性增加。图中显示了萤火虫/雷尼拉荧光素酶比率±标准误差 （SE） 的平均值。N = 3个独立实验。（B）先前表征的Ube3a变体在BAR测定中进行测试。响应归一化为WT UBE3A，值显示为SE±平均值。使用单样本t检验（双尾）和Benjamini-Hochberg多重比较校正（FDR = 0.05）计算的实验数（n）和p值如下：GFP，n = 19，***p = 1.733×10−31;WT UBE3A， n = 19;UBE3A LD， n = 19， ****p = 1.519 × 10−31;R39H， n = 3， p = 0.567;A178T， n = 4， p = 0.828;T485A， n = 5， *p = 0.019;C21Y， n = 3， ****p = 8.725 × 10−6;C117R， n = 3， ****p = 3.419 × 10−4;N243K， n = 3， **p = 0.0072;E269G， n = 3， **p = 7.787 × 10−4;L273F， n = 3， **p = 0.0052;S349P， n = 3， **p = 0.0016;L502P， n = 3， **p = 0.0033;R506C， n = 3， **p = 0.0033;T106K， n = 6， **p = 0.0.0078;T106P， n = 3， **p = 0.0013;I130T， n = 6， *p = 0.016;R477P， n = 3， ****p = 4.24 × 10−4;M478I， n = 3， ****p = 3.39 × 10−4;R482P， n = 3， **p = 5.82 × 10−4;I329T， n = 5， ****p = 1.22 × 10−5;E550L， n = 3， *p = 0.0013.经Weston等人许可转载的数据18。请点击此处查看此图的大图。
图 3：包含各种功能效果的 UBE3A 变体。 152 个 Ube3a 变体的 BAR 检测筛选显示相对于 WT UBE3A 的良性（灰色）、功能丧失（蓝色）和功能获得（红色）突变。使用单样本 t检验（双尾）和Benjamini-Hochberg多重比较校正（FDR = 0.05）确定显著性。红色，功能获得;灰色，与WT UBE3A没有变化;蓝色，功能丧失。经Weston等人许可转载的数据18。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：包含各种功能效应的 UBE3A 变体。 （A） UBE3A 位置 588 处变体的 BAR 测定结果显示功能丧失和获得替代。Q588E， n = 6;Q588P， n = 3;Q588R， n = 4;p < 0.0005，单样本t检验（双尾）与Benjamini-Hochberg多重比较校正（FDR = 0.05）。（B） 热图显示归一化 BAR 结果，用于 UBE3A 中位置 588 处的综合突变分析。白色阴影表示WT UBE3A活动水平，蓝色阴影表示功能丧失，红色阴影表示功能获得。比例尺显示相对于WT UBE3A的百分比变化。N = 3 个独立实验，分别用于 Q588S、Q588T、Q588N、Q588K、Q588P、Q588M、Q588G、Q588A、Q588F、Q588Y、Q588W、Q588L、Q588V、Q588I、Q588C;n = 8 表示 Q588E，n = 6 表示 Q588D，n = 5 表示 Q588R，n = 4 表示 Q588H，*p < 0.05，**p < 0.005，***p < 0.0005。单样本t检验（双尾）与Benjamini-Hochberg多重比较校正（FDR = 0.05）。经Weston等人许可转载的数据18。请点击此处查看此图的大图。
| 名字 | 序列 | 用于 | |
| 引物 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a 生态RI感 | |
| 通用底漆 | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E诱变反义 | |
| 入门 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a 圣诞节反义 | |
表1：用于UBE3A Q588E诱变的引物。
| 第一轮聚合酶链反应 | |
| 试剂 | 反应量 |
| 5x 高保真缓冲器 | 10 微升 |
| dNTP（10 mM 原液） | 1 微升 |
| 引物 1（10 mM 储备液） | 1 微升 |
| 引物 2（10 mM 储备液） | 1 微升 |
| WT-Ube3a DNA（150 ng/μL 原液） | 1 微升 |
| H2O | 35 微升 |
| 高保真DNA聚合酶 | 1 微升 |
| 总体积 | 50 微升 |
| 第二轮聚合酶链反应 | |
| 试剂 | 反应量 |
| 5x 高保真缓冲器 | 10 微升 |
| dNTP（10 mM 原液） | 1 微升 |
| 引物 3（10 mM 原液） | 1 微升 |
| 纯化的PCR产物（超级引物） | 30 微升 |
| WT-Ube3a DNA（150 ng/μL 原液） | 1 微升 |
| H2O | 6 微升 |
| 高保真DNA聚合酶 | 1 微升 |
| 总体积 | 50 微升 |
表2：诱变的PCR参数。
| 第一轮聚合酶链反应 | ||
| 步 | 温度 | 时间 |
| 初始变性 | 95 °C | 2 分钟 |
| （1 周期） | ||
| 变性 | 95 °C | 30 秒 |
| 退火 | 50 °C | 20 秒 |
| 外延 | 72 °C | 15 秒 |
| （30 次循环） | ||
| 最终延期 | 72 °C | 1 分钟 |
| 拿 | 4°C | 无限 |
| 第二轮聚合酶链反应 | ||
| 步 | 温度 | 时间 |
| 初始变性 | 95 °C | 2 分钟 |
| （1 周期） | ||
| 变性 | 95 °C | 30 秒 |
| 退火 | 50 °C | 20 秒 |
| 外延 | 72 °C | 35 秒 |
| （30 次循环） | ||
| 最终延期 | 72 °C | 1 分钟 |
| 拿 | 4°C | 无限 |
表3：诱变的PCR程序参数。
| 试剂 | 工作专注度 | 1次转染 | 3.5x 预混液 |
| pGL3 巴质粒 | 100 纳克/微升 | 0.5 微升 | 1.75 微升 |
| pTK雷尼拉质粒 | 100 纳克/微升 | 0.05 微升 | 0.175 微升 |
| Ube3a 质粒 | 100 纳克/微升 | 0.4 微升 | 1.4 微升 |
| DMEM补充谷氨酰胺 | 8.65 微升 | 30.275 微升 | |
| 转染试剂 | 0.4 微升 | 1.4 微升 |
表4：转染混合物。
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Discussion
此处描述的方案提供了一种有效且可扩展的方法来评估Ube3a变体的酶活性。使用该测定时，有几个技术细节值得仔细考虑。一个考虑因素是选择该测定中使用的Wnt报告质粒。这里描述的方案专门使用β-连环蛋白激活报告基因（BAR）21，该报告基因包含由专门设计的接头序列分隔的12个T细胞因子（TCF）响应元件的串联体，以最大限度地减少TCF结合位点的重组和丢失。文献中还描述了额外的基于荧光素酶的Wnt报告质粒23，尽管先前的研究表明有些可用于评估UBE3A活性，但为此目的对BAR质粒进行了最彻底的表征17，18。其次，雷尼拉荧光素酶质粒的选择至关重要。在转染步骤中加入编码Renilla荧光素酶的质粒，以使转染效率正常化。本协议中使用的质粒在胸苷激酶（TK）启动子（TK-Renilla）的控制下组成型表达肾素荧光素酶。使用含有其他启动子的质粒，例如广泛使用的巨细胞病毒（CMV）启动子，可能导致雷尼拉荧光素酶表达的结果不同。
第二个考虑因素是细胞的行为，具体取决于用于细胞培养的FBS的类型和批次。例如，FBS可以改变HEK293T细胞的生长速率。对当前方案进行了优化，细胞的典型倍增时间为18-24小时，使转染时的细胞密度约为~4×每孔104 个细胞。由于细胞密度可能会影响转染效率，因此用户应仔细评估细胞生长速率，并在接种时相应地调整细胞数量。此外，UBE3A依赖性BAR反应需要在实验过程中存在一定量的Wnt配体。在大多数标准条件下，FBS 中有足够的 Wnt 来驱动此响应;但是，此响应也可能有所不同。建议滴定用于转染的质粒比值，以确保在适当的线性范围内测量BAR响应。另一种方法是使用重组Wnt配体或补充Wnt的生长培养基刺激Wnt信号传导17。
BAR测定的一个优点是它可以报告所有 Ube3a 亚型的泛素连接酶活性。人类表达 Ube3a 的三种亚型，由于使用了替代转录起始位点，它们的极端N端有所不同24。BAR测定提供与亚型相同的读数不可知性，因此，该测定可用于评估所有 Ube3a 变体。此外， Ube3a 变体的大规模表征提供了深入的结构功能数据，可以揭示对酶功能至关重要的新结构域和机制。之前的一项研究利用变异数据发现了UBE3A中的泛素结合结构域，该结构域促进了泛素链伸长18。更多的结构功能研究可能会为UBE3A的生化机制提供新的见解，可用于治疗开发。
BAR测定存在一些局限性，在确定变异的致病性时需要仔细考虑。由于 Ube3a 在神经元中的表观遗传印记，该测定不能区分母系和父系等位基因，并且必须将其他遗传证据与功能数据一起权衡以确定变异的致病性。此外，在疾病背景下，必须考虑UBE3A泛素连接酶活性以外的其他变量。例如，先前的工作表明，核定位的UBE3A有助于Angelman综合征病理学25 ，并且一些变体扰乱了酶26的这种定位模式。因此，必须进行额外的下游表征，以全面了解 Ube3a 变异对神经发育病理学的贡献。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了西蒙斯基金会独立之桥奖（SFARI奖#387972;J.J.Y.），大脑和行为研究基金会（J.J.Y.）的NARSAD青年研究员奖，阿尔弗雷德·P·斯隆基金会（J.J.Y.）的研究奖学金，以及天使综合症基金会（J.J.Y.），白厅基金会（J.J.Y.）和NIMH（R01MH122786;杰杰）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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