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Bioengineering

लंबी दूरी के फाइबर संरेखण के साथ माइक्रोइंजीनियरिंग 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

यह प्रोटोकॉल 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल (मोटाई में <250 μm) में फाइबर को संरेखित करने के लिए विस्तारात्मक तनाव (स्ट्रेचिंग) उत्पन्न करने के लिए द्रव प्रवाह दिशा के साथ ज्यामिति को बदलने के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के उपयोग को प्रदर्शित करता है। परिणामी संरेखण कई मिलीमीटर में फैला हुआ है और विस्तारात्मक तनाव दर से प्रभावित होता है।

Abstract

संरेखित कोलेजन I (COL1) फाइबर ट्यूमर सेल गतिशीलता का मार्गदर्शन करते हैं, एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान को प्रभावित करते हैं, स्टेम सेल भेदभाव को नियंत्रित करते हैं, और हृदय और मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों की एक पहचान हैं। विट्रो में संरेखित माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए, चुंबकीय, यांत्रिक, सेल-आधारित और माइक्रोफ्लुइडिक विधियों सहित परिभाषित फाइबर संरेखण के साथ सीओएल 1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। इनमें से, माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण उन्नत क्षमताओं की पेशकश करते हैं जैसे द्रव प्रवाह और सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट पर सटीक नियंत्रण। हालांकि, उन्नत इन विट्रो कल्चर प्लेटफार्मों के लिए संरेखित सीओएल 1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण सीओएल 1 फाइबर के पतले "मैट" (<40 μm मोटाई) तक सीमित हैं जो 500 μm से कम दूरी तक फैले हुए हैं और 3 डी सेल कल्चर अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं हैं। यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में परिभाषित फाइबर संरेखण के मिलीमीटर-स्केल क्षेत्रों के साथ 3 डी सीओएल 1 मैट्रिसेस (मोटाई में 130-250 μm) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह मंच सेल संस्कृति के लिए माइक्रो-इंजीनियर मैट्रिक्स तक सीधी पहुंच प्रदान करके संरचित ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करने के लिए उन्नत सेल कल्चर क्षमताएं प्रदान करता है।

Introduction

कोशिकाएं एक जटिल 3 डी रेशेदार नेटवर्क में रहती हैं जिसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कहा जाता है, जिसका बड़ा हिस्सा संरचनात्मक प्रोटीन कोलेजन प्रकार I (COL1)1,2 से बना होता है। ईसीएम के बायोफिज़िकल गुण कोशिकाओं को मार्गदर्शन संकेत प्रदान करते हैं, और जवाब में, कोशिकाएं ईसीएम माइक्रोआर्किटेक्चर 3,4,5 को फिर से तैयार करती हैं। ये पारस्परिक सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन संरेखित सीओएल 1 फाइबर डोमेन6 को जन्म दे सकते हैं जो ट्यूमर वातावरण 7,8,9 में एंजियोजेनेसिस और सेल आक्रमण को बढ़ावा देते हैं और सेल आकृति विज्ञान10,11,12, ध्रुवीकरण13 और भेदभाव 14 को प्रभावित करते हैं। संरेखित कोलेजन फाइबर घाव भरने को भी बढ़ावा देते हैं15, ऊतक विकास16 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और लंबी दूरी के सेल संचार17,18 में योगदान करते हैं। इसलिए, इन विट्रो में देशी COL1 फाइबर माइक्रोआर्किटेक्चर की प्रतिकृति बनाना संरेखित माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए संरचित मॉडल विकसित करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है।

माइक्रोफिज़ियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) 19,20,21,22,23 विकसित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर सिस्टम को एक पसंदीदा तकनीक के रूप में स्थापित किया गया है। अनुकूल माइक्रोस्केल स्केलिंग प्रभावों का लाभ उठाते हुए, ये प्रणालियां द्रव प्रवाह पर सटीक नियंत्रण प्रदान करती हैं, यांत्रिक बलों के नियंत्रित परिचय का समर्थन करती हैं, और माइक्रोचैनल21,24,25,26,27 के भीतर जैव रासायनिक माइक्रोएन्वायरमेंट को परिभाषित करती हैं। एमपीएस प्लेटफार्मों का उपयोग ऊतक-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करने और बहु-अंग इंटरैक्शन का अध्ययन करनेके लिए किया गया है। इसके साथ ही, विवो29,30 में देखे गए ईसीएम के 3 डी यांत्रिकी और जैविक प्रभाव को पुन: उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोगेल का व्यापक रूप से पता लगाया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों के साथ 3 डी संस्कृति को एकीकृत करने पर बढ़ते जोर के साथ, कई दृष्टिकोण माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों31,32,33 में सीओएल 1 हाइड्रोगेल को जोड़ सकते हैं। हालांकि, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में COL1 हाइड्रोगेल को संरेखित करने के तरीके <1 मिमी चौड़े चैनलों में पतले 2D "मैट" (<40 μm मोटाई) तक सीमित हैं, जो संरेखित 3D माइक्रोएन्वायरमेंट 31,34,35,36 में मॉडल सेल प्रतिक्रियाओं की सीमित क्षमता प्रदान करते हैं।

माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में संरेखित 3 डी सीओएल 1 हाइड्रोगेल प्राप्त करने के लिए, यह दिखाया गया है कि, जब एक स्व-संयोजन सीओएल 1 समाधान स्थानीय विस्तार प्रवाह (धारावार दिशा के साथ वेग परिवर्तन) के संपर्क में आता है, तो परिणामस्वरूप सीओएल 1 हाइड्रोगेल फाइबर संरेखण की एक डिग्री प्रदर्शित करते हैं जो सीधेविस्तारक तनाव दर के परिमाण के आनुपातिक होता है जो वे अनुभव करते हैं। 38. इस प्रोटोकॉल में माइक्रोचैनल डिजाइन दो मायनों में अद्वितीय है; सबसे पहले, खंडित डिजाइन COL1 समाधान के लिए स्थानीय विस्तारात्मक तनाव का परिचय देता है, और दूसरा, इसका "दो-टुकड़ा" निर्माण उपयोगकर्ता को COL1 फाइबर को संरेखित करने की अनुमति देता है और फिर एक खुले प्रारूप में सीधे संरेखित फाइबर तक पहुंचने के लिए चैनल को अलग करता है। इस दृष्टिकोण को मॉड्यूलर माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों को विकसित करने के लिए अपनाया जा सकता है जो आदेशित सीओएल 1 मैट्रिसेस के साथ माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम विकसित करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल खंडित माइक्रोचैनलबनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है और गोजातीय एटेलो सीओएल 1 को संरेखित करने के लिए चैनलों के उपयोग का विवरण देता है। यह प्रोटोकॉल एक खुले कुएं प्रारूप में COL1 पर कोशिकाओं की खेती के लिए निर्देश भी प्रदान करता है और मॉड्यूलर, चुंबकीय आधार परत का उपयोग करके प्लेटफ़ॉर्म में कार्यक्षमता जोड़ने पर चर्चा करता है।

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Protocol

1. दो-टुकड़ा चैनल और मॉड्यूलर प्लेटफ़ॉर्म बेस का निर्माण

नोट: माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का निर्माण दो भागों का उपयोग करके किया जाता है - माइक्रोफ्लुइडिक चैनल "कटआउट", जो परिभाषित मोटाई की पॉली डाइमिथाइल सिलोक्सेन (पीडीएमएस) शीट से काटा गया रेजर है, और चैनल कवर, जो विपरीत रूप से कटआउट से बंधता है और चैनल बनाता है। चैनल एक पॉली (मिथाइल मेथैक्रिलेट) (पीएमएमए) फ्रेम से घिरा हुआ है जो मीडिया जलाशय (चित्रा 1) के रूप में कार्य करेगा। पीएमएमए फ्रेम का उपयोग अतिरिक्त कार्यक्षमता के लिए विशेष मॉड्यूल को चुंबकीय रूप से कुंडीबद्ध करने के लिए भी किया जा सकता है।

  1. पीडीएमएस शीट से रेजर काटने के चैनल:
    नोट: इस चरण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल डिजाइन पूरक चित्रा 1 में प्रदान किया गया है। चैनल में 5 मिमी की लंबाई और 10 मिमी, 5 मिमी, 2.5 मिमी, 1.25 मिमी और 0.75 मिमी की चौड़ाई के पांच खंड शामिल हैं। कोलेजन समाधान का वेग, एक स्थिर प्रवाह दर (50-400 μL.min-1) पर इंजेक्ट किया जाता है, चैनल के साथ स्थानीय रूप से बढ़ता है क्योंकि विस्तार प्रवाह उत्पन्न करने के लिए चैनल की चौड़ाई कम हो जाती है।
    1. प्लास्टिक वाहक शीट पर 250 μm मोटी पीडीएमएस शीट माउंट करें और 0.5 मिमी की ब्लेड गहराई, 1 सेमी -1 गति और उच्च बल पर क्राफ्ट कटर का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक डिज़ाइन को रेजर-कट करें।
    2. अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग करके, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल कटआउट को 5 मिनट के लिए साफ करें। सोनिकेटेड चैनलों को विआयनीकृत (डीआई) पानी में धोएं और उन्हें 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक साफ हॉटप्लेट पर सुखाएं।
    3. उपयोग होने तक चैनलों को एक साफ, कवर किए गए पेट्री डिश में स्टोर करें।
  2. पीडीएमएस कवर और सतह निष्क्रिय बनाना:
    नोट: अनुभाग 1.1 से चैनल कटआउट के लिए एक कवर की आवश्यकता होती है जिसे एक संलग्न चैनल बनाने के लिए इसके ऊपर रखा जा सकता है जिसे COL1 समाधान में इंजेक्ट किया जा सकता है (पूरक चित्र 1)। COL1 के स्वयं इकट्ठे होने के बाद कवर को हटाया जा सकता है। कवर से बंधे चैनल में COL1 की संभावना को कम करने के लिए, कवर को गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) का उपयोग करके पारित किया जाता है। पीडीएमएस कवर के लिए मोल्ड डिजाइन प्रदान किया गया है। मोल्ड की मोटाई कम से कम 2 मिमी होनी चाहिए और इसमें एक पदचिह्न होना चाहिए जो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल कटआउट के पदचिह्न के बराबर हो। इस प्रोटोकॉल में, मोल्ड पदचिह्न 35 मिमी x 15 मिमी था।
    1. मोल्ड तैयार करने के लिए, पीएमएमए की 2.5 मिमी मोटी शीट पर दबाव-संवेदनशील चिपकने वाला (पीएसए) की एक शीट चिपकाएं और लेजर वांछित मोल्ड आकार को काटें।
    2. लेजर-कट पीएमएमए मोल्ड को नम, लिंट-फ्री वाइप के साथ साफ करें और पीएसए फिल्म से बैकिंग को हटा दें। मोल्ड को 100 मिमी व्यास सिलिकॉन वेफर बीटी से जोड़ें जो मजबूती से दबा रहा है।
    3. पीडीएमएस को 10: 1 (आधार: क्रॉसलिंकर) के अनुपात में तैयार करें। उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए 1 मिनट के लिए जोर से मिलाएं और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए मिश्रण को वैक्यूम कक्ष में डीगैस करें।
    4. सिलिकॉन मोल्ड में डिगैस्ड पीडीएमएस घोल डालें और 20 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर ठीक करें। मोल्ड को ठंडा होने दें, ठीक किए गए पीडीएमएस को हटा दें, और रेजर ब्लेड के साथ किसी भी अतिरिक्त को ट्रिम करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि पीडीएमएस कवर के सिलिकॉन वेफर फेसिंग साइड (फ्लैट साइड) निम्नलिखित सभी चरणों में सामने आ रहे हैं।
    5. माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के सिरों के अनुरूप इनलेट और आउटलेट छेद बनाने के लिए 1 मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग करें। चरण 1.1 से चैनल कटआउट का उपयोग छेद की स्थिति का मार्गदर्शन करने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जा सकता है।
    6. कवर को 5 मिनट के लिए आइसोप्रोपेनोल (आईपीए) में रखें, डीआई पानी से कुल्ला करें, संपीड़ित वायु स्रोत से सुखाएं, और फिर एक साफ, कवर किए गए पेट्री डिश में स्टोर करें। पेट्री डिश को यूवी नसबंदी कक्ष (खुला) में 1 मिनट के लिए नसबंदी करने के लिए रखें।
    7. कवर और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में स्थानांतरित करें।
    8. पीडीएमएस कवर पर 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 40 मिलीग्राम/ एमएल -1 गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) का पिपेट 300 μL और पिपेट टिप का उपयोग करके समान रूप से घोल फैलाएं। उपयोग करने से पहले कम से कम 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में रखें।
    9. कवर को रेफ्रिजरेटर से बीएससी में ले जाएं, 1x PBS के साथ 5x धोएं, और उन्हें 10 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।
      नोट: पीडीएमएस कवर को बीएसए के साथ कोटिंग करने के बाद 1 सप्ताह तक फ्रिज में संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. कवरलिप्स का ग्लूटारल्डिहाइड उपचार
    नोट: ग्लूटारल्डिहाइड के साथ कवरलिप्स को कार्यात्मक बनाना सहसंयोजक रूप से COL1 को कवरस्लिप से बांधता है और हाइड्रोगेल को अलग होने से रोकता है।
    1. एसीटोन के 49 एमएल में 1 एमएल एपीटीईएस जोड़कर ग्लास बीकर में 2% (वी / वी) एमिनोप्रोपिल ट्राइथोक्सिसिलिन (एपीटीईएस) समाधान तैयार करें।
    2. डीआई पानी में 25% ग्लूटारल्डिहाइड घोल को 5% तक पतला करें। प्रत्येक 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप के लिए 2 एमएल समाधान बनाएं। 24 मिमी x 24 मिमी या 22 मिमी x 22 मिमी कवरलिप्स के लिए, प्रत्येक के लिए 1 एमएल समाधान बनाएं।
    3. आईपीए का उपयोग करके 5 मिनट के लिए स्नान सोनिकेटर में कवरलिप्स साफ करें। डीआई पानी का उपयोग करके कवरलिप्स से आईपीए को धो लें। आईपीए पूरी तरह से धोया जाता है जब कवरस्लिप पर पानी की एक चिकनी फिल्म देखी जा सकती है।
    4. कवरलिप्स को 100 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म प्लेट पर सुखाएं। सूखे कवरलिप्स को साफ पेट्री व्यंजनों में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे ओवरलैप न हों।
    5. कोरोना डिस्चार्ज वैंड का उपयोग करके, कवरलिप्स को 1 मिनट के लिए कोरोना डिस्चार्ज के संपर्क में रखें।
      नोट: यह चरण एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र या रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए।
    6. पेट्री डिश से कवरलिप्स को हटा दें और फिर कोरोना एक्सपोजर के 5 मिनट के भीतर 10 सेकंड के लिए एपीटीईएस समाधान में डुबोएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि कवरस्लिप जलमग्न है।
      नोट: प्लाज्मा के साथ किस तरफ इलाज किया गया था, इसका ट्रैक रखना सुनिश्चित करें और इसे ऊपर की ओर रखें।
    7. फिर, कवरस्लिप को एसीटोन में 10 सेकंड के लिए डुबोएं और संपीड़ित हवा से सुखाएं। सूखे कवरस्लिप को पेट्री डिश में वापस रखें, साइड फेसिंग साइड में रखें।
      नोट: सभी कवरलिप्स के लिए चरण 1.3.5-1.3.7 दोहराएं।
    8. प्रत्येक कवरस्लिप की सतह पर ग्लूटारैल्डिहाइड समाधान का पिपेट 1 एमएल। समाधान को कवरस्लिप के किनारे पर फैलने की अनुमति दिए बिना जितना संभव हो उतना सतह कवर करें। यदि आवश्यक हो तो अधिक ग्लूटारैल्डिहाइड समाधान जोड़ा जा सकता है। सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप के साथ सतह को खरोंच न करें।
    9. कवरलिप्स को 30 मिनट के लिए घोल के संपर्क में बैठने दें और फिर 20 सेकंड के लिए डीआई पानी से कुल्ला करें। संपीड़ित हवा का उपयोग करके कवरलिप्स को सुखाएं और उन्हें पेट्री व्यंजनों में वापस रखें, प्लाज्मा का इलाज किया गया।
      नोट: कवरलिप्स को कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. मॉड्यूलर चुंबकीय आधार को काटने वाला लेजर
    नोट: मॉड्यूलर चुंबकीय आधार का डिजाइन पूरक चित्रा 1 में प्रदान किया गया है। मॉड्यूलर बेस मीडिया को पकड़ने के लिए एक अच्छी तरह से कार्य करता है और इसका उपयोग चुंबकीय रूप से विशेष मॉड्यूल को संलग्न करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसा कि पहले प्रकाशित कार्यों 22,37,38,39 में वर्णित है।
    1. पास और पावर की संख्या जैसे उपयुक्त लेजर सेटिंग्स का उपयोग करके पीएमएमए परत से डिजाइन काटें।
      नोट: लेजर सेटिंग्स को समायोजित किया जाना चाहिए ताकि मैग्नेट को पीएमएमए परत में दबाया जा सके। प्रत्येक लेजर अलग है, और कट पैरामीटर को प्रयोगात्मक रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए। 45 वाट लेजर के लिए, 100% गति, 100% शक्ति, और 2 मिमी मोटी पीएमएमए के माध्यम से 2 मिमी काटने के लिए 3 पास की सिफारिश की जाती है।
    2. लेजर-कटिंग प्रक्रिया से मलबे को हटाने के लिए साबुन और पानी का उपयोग करके लेजर-कट भाग को धोएं।
      नोट: लेजर-कट भागों को साफ करने के लिए सॉल्वैंट्स का उपयोग न करें। सॉल्वैंट्स के परिणामस्वरूप लेजर-कट किनारों में माइक्रोक्रैक्स का प्रसार हो सकता है।
  5. मंच को इकट्ठा करना
    1. लेजर-कट बेस में हाथ से मैग्नेट (व्यास में 3/16, मोटा 1/16) पुश करें। चुंबक में धक्का देने में मदद करने के लिए एक नरम हथौड़ा या स्क्रू-ड्राइवर छोर का उपयोग किया जा सकता है। मैग्नेट की मोटाई पीएमएमए आधार की मोटाई से कम होनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि मैग्नेट बेस की सतह के साथ फ्लश हैं।
      नोट: मैग्नेट उपयोगकर्ता को अतिरिक्त मॉड्यूल संलग्न करके प्लेटफ़ॉर्म में कार्यक्षमता जोड़ने की अनुमति देते हैं।
    2. पीएसए शीट से बैकिंग को छील लें और आधार को ग्लूटार्ल्डिहाइड-उपचारित कवरस्लिप से संलग्न करें, जिसमें कार्यात्मक पक्ष ऊपर की ओर हो।
    3. धीरे से पीडीएमएस चैनल कटआउट को फ्रेम द्वारा परिभाषित गुहा में रखें। हवा के बुलबुले को हटाने और अनुरूप संपर्क सुनिश्चित करने के लिए वाइड-टिप ट्वीज़र्स के साथ नीचे दबाएं।
    4. बीएसए-उपचारित चैनल कवर को चैनल कटआउट के शीर्ष पर रखें, जिसमें बीएसए पक्ष नीचे की ओर हो। सुनिश्चित करें कि द्रव इनलेट और आउटलेट पोर्ट चैनल के साथ संरेखित हैं।
    5. डिवाइस COL1 इंजेक्शन के लिए तैयार है।

2. माइक्रोचैनल में COL1 समाधान इंजेक्ट करना और सेल कल्चर अनुप्रयोगों के लिए कवर को हटाना

  1. COL1 समाधान तैयार करना
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में बर्फ पर सभी आवश्यक अभिकर्मकों (COL1 स्टॉक समाधान [6 mg.mL-1], अल्ट्राप्योर पानी, 10x PBS, 0.1 M NaOH) रखें।
    2. अभिकर्मकों की मात्रा की गणना निम्नानुसार करें
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      नोट: इसलिए, 6 mgl-1 स्टॉक से 2.5 mgl-1 न्यूट्रलाइज्ड कोलेजन का 1 mL बनाने के लिए, 7 के अंतिम pH के लिए 416.67 μL कोलेजन, 429.16 μL DI पानी, 10x PBS का 100 μL और 0.1 M NaOH का 54.16 μL जोड़ें। 9.0 के पीएच को प्राप्त करने के लिए 0.1 एम एनएओएच का 20 μL जोड़ें।
    3. अभिकर्मकों को निम्नलिखित क्रम में एक खाली 5 एमएल शीशी में जोड़ें: i) COL1 स्टॉक, ii) DI पानी, iii) 10x PBS, iv) 0.1 M NaOH।
      नोट: COL1 समाधान को संभालने के लिए विस्थापन पिपेट का उपयोग करें। यदि नियमित पिपेट का उपयोग किया जाता है तो महत्वपूर्ण नमूना हानि हो सकती है, जिससे अंतिम समाधान एकाग्रता में उतार-चढ़ाव होता है।
    4. समाधान के पीएच को वांछित पीएच (आमतौर पर 7-9 के बीच) तक बढ़ाएं।
  2. COL1 समाधान इंजेक्ट करना
    1. एक सिरिंज पंप, एक ठंडा बाँझ सिरिंज, ठंडा बेअसर COL1 समाधान, और एक बाँझ 20 G 90 ° कोण टिप ल्यूर लॉक सुई को जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें। बुलबुले पेश करने से बचने के लिए ध्यान रखते हुए, सीओएल 1 समाधान को सिरिंज में लोड करें।
    2. सिरिंज से 90 ° 20 ग्राम सुई टिप संलग्न करें, सिरिंज को सिरिंज पंप में लोड करें, सुई को नीचे की ओर रखें, और सुई को COL1 समाधान के साथ प्राइम करें।
    3. सिरिंज पंप को आवश्यक प्रवाह दर पर सेट करें, 50-2,000 μL / min के बीच।
    4. तैयार पीडीएमएस चैनल (अनुभाग 1) को एक लैब जैक पर रखें और सुई के साथ स्तर दें।
    5. सुई को पीडीएमएस चैनल (वाइड साइड) के इनलेट पोर्ट में डालें। चैनल को तब तक इंजेक्ट करें जब तक कि COL1 की ~ 30 μL की बूंद आउटलेट साइड पर एकत्र न हो जाए।
    6. लैब जैक को नीचे करें और धीरे से सुई को नए भरे हुए चैनल से अलग करें।
    7. चरण 2.2.5-2.2.9 को दोहराएँ जब तक कि सभी चैनल COL1 समाधान से भर न जाएं।
    8. नवगठित COL1 जेल के निर्जलीकरण को रोकने के लिए डीआई पानी से संतृप्त एक साफ, लिंट-मुक्त पोंछे के साथ पेट्री व्यंजनों में भरे हुए चैनलों को लोड करें।
    9. पेट्री डिश को कवर करें और लोड किए गए चैनलों को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता) में 2 घंटे के लिए पील-ऑफ चरण से पहले रखें।
  3. छील और मीडिया संतुलन
    1. चिमटी का उपयोग करके पीडीएमएस कवर को उठाकर पॉलीमराइज्ड सीओएल 1 जेल को उजागर करें। बीएसए उपचार COL1 को कवर से जोड़ने से रोकता है।
    2. कुएं में ईजीएम का 650 μL जोड़ें।
    3. जेल और मीडिया को बराबर करने के लिए उपकरणों को न्यूनतम 4 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता) में छोड़ दें। कोशिकाओं के साथ बीज बोने से पहले मीडिया को बदलें
  4. बीज बोने की कोशिकाएं
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में 5 एमएल और 10 एमएल पिपेट की आवश्यक संख्या के साथ गर्म 0.25% ट्रिप्सिन और कल्चर मीडिया रखें।
    2. मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) को 95% आर्द्रता में 37 डिग्री सेल्सियस पर एंडोथेलियल ग्रोथ मीडिया (ईजीएम) में 80% कंफ्लुएंसी तक। माइक्रोस्कोप के तहत कंफ्लुएंसी की जांच करने के बाद बीएससी में एचयूवीईसी युक्त टिशू कल्चर फ्लास्क रखें।
    3. टी 25 फ्लास्क में मीडिया को छोड़ दें और कोशिकाओं को 1x PBS के साथ 2x धोएं। फ्लास्क में 1 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें और इसे 3 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता) में रखें।
    4. 3 मिनट के बाद माइक्रोस्कोप के नीचे फ्लास्क की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाएं सतह से पूरी तरह से अलग हैं।
    5. ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए फ्लास्क में 3 एमएल ईजीएम (सीरम के साथ) जोड़ें। इसके बाद, 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके सेल समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। शंक्वाकार ट्यूब को 5 मिनट के लिए 150 x g पर कोशिकाओं से युक्त सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. शंक्वाकार ट्यूब को जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें और सेल गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। ताजा संस्कृति मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. 1 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ट्राइपैन ब्लू के 15 μL और पुन: निलंबित सेल समाधान के 15 μL जोड़ें और मिलाएं।
    8. सेल गिनती स्लाइड के दोनों किनारों पर ट्रिपैन ब्लू और सेल समाधान इंजेक्ट करें और स्लाइड को सेल काउंटिंग डिवाइस में डालें।
    9. सेल गिनती डिवाइस से प्राप्त सेल एकाग्रता के आधार पर एंडोथेलियल ग्रोथ मीडिया में सेल समाधान को आवश्यक एकाग्रता में पतला करें।
      नोट: 80% कंफ्लुएंसी पर एचयूवीईसी के एक टी 25 फ्लास्क से ~ 750,000 सेल -एमएल -1 प्राप्त होगा यदि 1 एमएल मीडिया में पतला किया जाता है। बीज दिए जाने वाले सेल निलंबन की मात्रा की गणना सेल घनत्व / सेल निलंबन की एकाग्रता के × संस्कृति सतह के क्षेत्र के रूप में की जाती है। उदाहरण: 35 मिमी x 15 मिमी अच्छी तरह से 20,000 कोशिकाओं -सेमी -2 को बीज देने के लिए, किसी को सेल निलंबन के ~ 140 μL की आवश्यकता होगी।
    10. इंजीनियर किए गए COL1 मैट्रिक्स पर मीडिया को प्रेरित करें।
    11. COL1 सब्सट्रेट पर सेल समाधान की आवश्यक मात्रा जोड़ें और इमेजिंग से पहले कोशिकाओं को न्यूनतम 4 घंटे तक व्यवस्थित होने दें।
  5. सेल न्यूक्लियस और साइटोस्केलेटन को लेबल करना
    1. कोशिकाओं से मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रत्येक धोने में 1x PBS, 500 μL के साथ 3x धोएं। आरटी पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ सेल परत को कवर करें।
    2. पैराफॉर्मलडिहाइड को एस्पिरेट करें और 5 मिनट के लिए 1x PBS ट्वीन -20 से धो लें।
    3. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स समाधान के 500 μL का उपयोग करके कोशिका झिल्ली को स्थिर करें। 5 मिनट के लिए 1x PBS ट्वीन -20 के साथ धो लें।
    4. आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 4% बीएसए के 500 μL के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करें।
    5. 4% बीएसए में फेलोइडिन-एक्टिन फ्लोरोसेंट लेबल समाधान को पतला करें (बीएसए के 400 μL में स्टॉक का 1 μL)।
    6. बीएसए समाधान को एस्पिरेट करें, कोशिकाओं में फैलोइडिन समाधान जोड़ें, और आरटी में 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    7. परमाणु दाग को 4% बीएसए (500 μL में 1 μL) में पतला करें, फेलोइडिन को एस्पिरेट करें, काम कर रहे परमाणु दाग समाधान जोड़ें, और आरटी पर 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    8. परमाणु दाग के काम करने वाले समाधान को एस्पिरेट करें, पीबीएस ट्वीन -20 3 एक्स के साथ 5 मिनट के लिए धोएं, और इमेजिंग से पहले 1 एक्स पीबीएस के साथ बदलें।
    9. 40x लेंस के साथ FITC चैनल (उदा.491 nm/em 516 nm) और DAPI चैनल (उदा.360 nm/em 460 nm) का उपयोग करते हुए एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए छवि। 488 एनएम लेजर लाइन (15% शक्ति) और 40x जल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके परावर्तनीयता मोड में लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल का उपयोग करके कोलेजन की छवि बनाएं।

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Representative Results

जब एक स्व-संयोजन COL1 समाधान घटते क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र के साथ एक चैनल के माध्यम से बहता है, तो COL1 समाधान का धारावार वेग (vx) स्थानीय रूप से एक परिमाण, ∂vx, दो खंडों (∂x) के बीच कसना की लंबाई के साथ बढ़ता है, जिसके परिणामस्वरूप एक विस्तारात्मक तनाव दर (a)) होती है, जहां 3 = ∂vx/∂x होता है। विस्तारात्मक तनाव दर की गणना द्रव वेग से की जा सकती है, जिसे कण छवि वेलोसिमेट्री (पीआईवी) का उपयोग करके मापा जाता है, जैसा कि चित्र 2 में देखा गया है।

इससे पहले, यह दिखाया गया है कि स्थानीय विस्तार तनाव लंबी दूरी के COL1 फाइबर संरेखण 37,38,40 (चित्रा 3) को बढ़ावा देता है। सीएल 1 का संरेखण सीधे कसना में विस्तारात्मक तनाव दर के परिमाण से प्रभावित होता है और इसे खंड की 5 मिमी लंबाई में समान रूप से विस्तारित देखा जा सकता है। फाइबर संरेखण को मापने के लिए, फाइबर संरेखण के हिस्टोग्राम बनाने के लिए फाइबर की कॉन्फोकल परावर्तनीयता माइक्रोस्कोपी (सीआरएम) छवियों का उपयोग किया गया था। संरेखण गुणांक (सीओए) हिस्टोग्राम 38,42,43,44 में मोड मान के ±15 ° के भीतर संरेखित फाइबर का अंश है। सीओए 0-1 से लेकर 0.5 > मानों के साथ संरेखित माना जाता है।

पारंपरिक, सील किए गए माइक्रोचैनलों की सीमा में 3 डी हाइड्रोगेल इंजेक्ट करना जहां मीडिया और कोशिकाओं को मैट्रिक्स में पेश किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में टू-पीस चैनल उपयोगकर्ता को चैनल कवर को उठाने और सीधे पूरे COL1 मैट्रिक्स तक पहुंचने की अनुमति देकर एक चैनल में हाइड्रोगेल तक पहुंचने की सीमा को दूर करता है। चैनल लिफ्ट-ऑफ को ग्लूटारल्डिहाइड के साथ ग्लास कवरस्लिप को कार्यात्मक बनाकर सक्षम किया जाता है ताकि एमाइन-एल्डिहाइड-एमाइन इंटरैक्शन का उपयोग करके सीओएल 1 अटैचमेंट को बढ़ावा दिया जा सके और कवर पर सीओएल 1 सोखना को रोकने के लिए बीएसए के साथ पीडीएमएस कवर को कार्यात्मक बनाया जा सके। कवर को उठाने के बाद COL1 फाइबर संरेखण अप्रभावित रहता है, जैसा कि चित्र 4 में देखा गया है।

संरेखित COL1 सब्सट्रेट्स को प्रोट्रूशियंस 9,12,45,46 और बदले में, तनाव फिलामेंट्स के संगठन को निर्देशित करके सेल संरेखण को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विकसित सीओएल 1 मैट्रिसेस के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए असंरेखित और संरेखित सीओएल 1 खंडों में एंडोथेलियल कोशिकाओं को चित्रित किया गया था। बीज बोने के 4 घंटे बाद कोशिकाओं को ठीक किया गया और दाग दिया गया। मैट्रिक्स के संरेखित खंड पर संवर्धित एचयूवीईसी की प्रतिनिधि छवियों ने यादृच्छिक फाइबर के साथ खंड पर एचयूवीईसी की तुलना में एक्टिन फाइबर संरेखण में वृद्धि दिखाई (चित्रा 5)।

Figure 1
चित्रा 1: परतों की असेंबली दिखाने वाला योजनाबद्ध। इस आंकड़े को अहमद एट अल .38 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: स्टेप्ड चैनल और एक्सटेंशनल स्ट्रेन रेट। (ए) आयामों के साथ स्टेप्ड चैनल का योजनाबद्ध। आउटसेट विस्तारात्मक तनाव दर की गणना को दर्शाता है। प्रत्येक कसना में विस्तारात्मक तनाव दर की गणना कण छवि वेलोसिमेट्री (पीआईवी) का उपयोग करके मापा गया वेग से की जाती है। (बी) प्रत्येक कसना में विस्तारात्मक तनाव दर। इस आंकड़े को अहमद एट अल .38 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीओएल 1 पोलीमराइजेशन के बाद प्रत्येक माइक्रोचैनल सेगमेंट में सीओएल 1 फाइबर की कॉन्फोकल परावर्तनीयता छवियां। खंड (ए) से खंड (ई) तक फाइबर संरेखण की डिग्री में वृद्धि को नेत्रहीन रूप से देखा जा सकता है। स्केल बार = 25 μm. इस आंकड़े को अहमद एट अल .38 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सीओएल 1 फाइबर की कॉन्फोकल प्रतिबिंब छवियां दिखाती हैं कि चैनल कवर को हटाने से फाइबर संरेखण अप्रभावित रहता है। स्केल बार = 25 μm. इस आंकड़े को अहमद एट अल .38 की अनुमति से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: कोशिकाओं और COL1 तंतुओं की प्रतिनिधि छवियां। COL1 मैट्रिक्स के खंड (e) और COL1 मैट्रिक्स के खंड (a) में कोशिकाओं और COL1 तंतुओं की प्रतिनिधि छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: आयामों के साथ लेजर-कट घटकों को दिखाने वाला चित्र। (ए) चैनल, (बी) चुंबकीय आधार, और (सी) चैनल कवर मोल्ड। मिलीमीटर में सभी आयाम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

संरेखित तंतुओं के साथ COL1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के प्रोटोकॉल को चुंबकीय विधियों, यांत्रिक तनाव के प्रत्यक्ष अनुप्रयोग और माइक्रोफ्लुइडिकतकनीकों का उपयोग करके वर्णित किया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण का उपयोग आमतौर पर उनके अच्छी तरह से परिभाषित प्रवाह और परिवहन विशेषताओं के कारण माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम बनाने के लिए किया जाता है, जो जैव रासायनिक माइक्रोएन्वायरमेंट पर सटीक नियंत्रण को सक्षम करते हैं। चूंकि संरेखित COL1 फाइबर घाव भरने, ट्यूमर सेल आक्रमण और ऊतक विकास जैसे पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं के दौरान महत्वपूर्ण शिक्षाप्रद संकेत प्रदान करते हैं, इसलिए माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में संरेखित COL1 मैट्रिसेस उत्पन्न करना जैविक रूप से प्रासंगिक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम विकसित करने की दिशा में एक कदम है।

यह प्रोटोकॉल परिभाषित फाइबर संरेखण के क्षेत्रों के साथ मिलीमीटर-स्केल, संरेखित सीओएल 1 मैट्रिसेस बनाने की क्षमता प्रदान करता है। संरेखण को प्रेरित करने के लिए, चौड़ाई में चरणबद्ध कटौती के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का उपयोग किया जाता है। चूंकि एक स्व-संयोजन COL1 समाधान एक निरंतर प्रवाह दर पर चैनल के माध्यम से बहता है, समाधान प्रवाह वेग कसना पर बढ़ जाता है, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय विस्तार तनाव और स्वयं-संयोजन COL1 फाइबर का लंबी दूरी का संरेखण होता है। कतरनी प्रवाह-प्रेरित फाइबर संरेखण की तुलना में, हमने मोटाई में 250 μm तक चैनलों में फाइबर संरेखण देखा, जिससे हमें माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में 3 डी हाइड्रोगेल बनाने की अनुमति मिली। चूंकि COL1 फाइबर संरेखण विस्तारात्मक तनाव दर पर निर्भर करता है, इसलिए उपयोगकर्ता प्रदान किए गए चैनल को संशोधित कर सकते हैं या विस्तार प्रवाह उत्पन्न करने और वांछित आकार और आकार के COL1 मैट्रिसेस बनाने के लिए कस्टम चैनल डिज़ाइन विकसित कर सकते हैं। चैनलों के नरम लिथोग्राफी-मुक्त निर्माण के माध्यम से अतिरिक्त लचीलापन प्रदान किया जाता है, जिससे चैनल डिजाइनों के तेजी से प्रोटोटाइप की अनुमति मिलती है।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दो-टुकड़ा चैनल दृष्टिकोण माइक्रोचैनलों में 3 डी हाइड्रोगेल तक पहुंचने की सीमाओं को दूर करता है। एक दो-टुकड़ा चैनल COL1 हाइड्रोगेल तक सीधी पहुंच प्रदान करता है, जिसमें चैनल में COL1 मैट्रिक्स को प्रकट करने के लिए चैनल कवर को उठाया जा सकता है। पोलीमराइजेशन के बाद COL1 तक सीधे पहुंचने से कोशिकाओं को COL1 अग्रदूत समाधान में मिश्रित करने की आवश्यकता समाप्त हो जाती है, जिससे उपयोगकर्ता गैर-शारीरिक पीएच और कम तापमान पर विस्तारित अवधि के लिए COL1 अग्रदूत समाधान में हेरफेर कर सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं को स्थिति देने और परत-दर-परत बायोफैब्रिकेशन क्षमताओं को प्रदान करने के लिए एक मॉड्यूलर दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है, जैसा कि हमारे पहले के काम में दिखाया गया है। मॉड्यूल का उपयोग सह-संस्कृति के लिए झिल्ली पेश करने, निरंतर छिड़काव शुरू करने और बहु-स्तरित ईसीएम निर्माण 22,38,39 बनाने के लिए किया जा सकता है। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर कस्टम मॉड्यूल भी बनाए जा सकते हैं। चुंबकीय लैचिंग के साथ युग्मित, मॉड्यूलर दृष्टिकोण उन प्रयोगों के लिए भी उपयुक्त है जिनके लिए समय के साथ कार्यक्षमता जोड़ने की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर विचार करने की आवश्यकता है। चैनल कटआउट, कवर, कवरलिप्स और मॉड्यूलर बेस सहित सभी घटकों को उचित संबंध और रासायनिक कार्यात्मकता सुनिश्चित करने के लिए उचित रूप से साफ किया जाना चाहिए। कोलेजन को बर्फ पर तैयार किया जाना चाहिए, और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए सभी घटकों को ठंडा रखा जाना चाहिए। एक बार तैयार होने के बाद, कोलेजन समाधान तैयारी के 10 मिनट के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए। स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए कोलेजन समाधान के अंतिम पीएच को पीएच जांच का उपयोग करके मापा जाना चाहिए। कोलेजन के साथ पेट्री डिश में एक साफ, नम पोंछा रखा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोलेजन गर्म इनक्यूबेटर में सूख न जाए।

प्रोटोकॉल के कुछ संशोधनों और समस्या निवारण में निम्न शामिल हैं। (i) यदि सेल कल्चर के दौरान मीडिया लीक होता है, तो किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि चिपकने वाली परत में बिना किसी अंतराल के पीएमएमए फ्रेम और कवरलिप संलग्न हों। (ii) यदि चुम्बकों को आधार परत में फ्लश सेट नहीं किया जाता है, तो वे कवरस्लिप को आधार का पालन करने से रोकेंगे, जिसके परिणामस्वरूप अंतराल होगा। (iii) कवरस्लिप पर ग्लूटारल्डिहाइड कोटिंग भी आवश्यकता पड़ने पर कम सांद्रता की हो सकती है (0.1% तक)। विषाक्तता को रोकने के लिए ग्लूटारल्डिहाइड की इष्टतम एकाग्रता प्रयोगात्मक रूप से प्रयोग में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सेल लाइन के लिए निर्धारित की जानी चाहिए क्योंकि ग्लूटारल्डिहाइड कोशिकाओं के लिए विषाक्तता पेश कर सकता है। (iv) मैट्रिक्स को और अनुकूलित करने के लिए कोलेजन के साथ हाइलूरोनिक एसिड, फाइब्रोनेक्टिन, या फ्लोरोसेंट बीड्स जैसी अतिरिक्त सामग्री शामिल की जा सकती है। (v) यदि आवश्यक हो, तो सीमा और किनारे के प्रभावों से बचने के लिए चैनल डिजाइन को लंबे या छोटे खंडों के लिए संशोधित किया जा सकताहै।

इस प्रोटोकॉल की निम्नलिखित सीमाएँ हैं. एटेलो बोवाइन कोलेजन 2.5 मिलीग्राम एमएल -1 पर एक नरम सामग्री (जी' <100 पीए) है। जेल कठोरता बढ़ाने के लिए, शोधकर्ता कोलेजन की उच्च सांद्रता का उपयोग कर सकते हैं या क्रॉसलिंकिंग एजेंटपेश कर सकते हैं। यद्यपि इस प्रोटोकॉल को केवल मोटाई में 250 μm तक कोलेजन मैट्रिसेस को संरेखित करने के लिए मान्य किया गया है, लेकिन चैनल मोटाई को बढ़ाकर और पर्याप्त विस्तार तनाव दरों को पेश करने के लिए प्रवाह दरों को अनुकूलित करके मोटे मैट्रिक्स विकसित किए जा सकते हैं।

यह अनुमान लगाया गया है कि यह प्रोटोकॉल ऊतक-विशिष्ट आदेशित माइक्रोएन्वायरमेंट विकसित करने की मांग करने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोग किया जाएगा। इसका उपयोग माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम स्थापित करने के लिए मॉड्यूलर फ्लूडिक प्लेटफॉर्म बनाने के लिए एक गाइड के रूप में भी किया जा सकता है।

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Disclosures

सभी लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को पुरस्कार संख्या R21GM143658 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और अनुदान संख्या 2150798 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि फंडिंग एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

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वापसी अंक 187
लंबी दूरी के फाइबर संरेखण के साथ माइक्रोइंजीनियरिंग 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल
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Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

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