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Bioengineering

Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Este protocolo demonstra o uso de um canal microfluídico com geometria variável ao longo da direção do fluxo de fluido para gerar deformação extensional (alongamento) para alinhar as fibras em um hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espessura). O alinhamento resultante se estende por vários milímetros e é influenciado pela taxa de deformação extensional.

Abstract

As fibras alinhadas de colágeno I (COL1) guiam a motilidade das células tumorais, influenciam a morfologia das células endoteliais, controlam a diferenciação das células-tronco e são uma marca registrada dos tecidos cardíaco e musculoesquelético. Para estudar a resposta celular a microambientes alinhados in vitro, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar matrizes de COL1 com alinhamento de fibras definido, incluindo métodos magnéticos, mecânicos, baseados em células e microfluídicos. Destas, as abordagens microfluídicas oferecem recursos avançados, como controle preciso sobre os fluxos de fluidos e o microambiente celular. No entanto, as abordagens microfluídicas para gerar matrizes alinhadas de COL1 para plataformas avançadas de cultura in vitro têm sido limitadas a "esteiras" finas (<40 μm de espessura) de fibras de COL1 que se estendem por distâncias inferiores a 500 μm e não são propícias a aplicações de cultura celular 3D. Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar matrizes 3D de COL1 (130-250 μm de espessura) com regiões de alinhamento de fibras definidas em escala milimétrica em um dispositivo microfluídico. Esta plataforma fornece recursos avançados de cultura de células para modelar microambientes de tecidos estruturados, fornecendo acesso direto à matriz micro-projetada para cultura de células.

Introduction

As células residem em uma complexa rede fibrosa 3D denominada matriz extracelular (MEC), cuja maior parte é composta pela proteína estrutural colágeno tipo I (COL1)1,2. As propriedades biofísicas da MEC fornecem pistas de orientação às células e, em resposta, as células remodelam a microarquitetura da MEC 3,4,5. Essas interações recíprocas célula-matriz podem dar origem a domínios alinhados das fibras COL16 que promovem angiogênese e invasão celular no ambiente tumoral 7,8,9 e influenciam a morfologia celular 10,11,12, polarização13 e diferenciação 14. As fibras colágenas alinhadas também promovem a cicatrização deferidas15, desempenham papel fundamental no desenvolvimento tecidual 16 e contribuem para a comunicação celular de longo alcance17,18. Portanto, replicar a microarquitetura da fibra COL1 nativa in vitro é um passo importante para o desenvolvimento de modelos estruturados para estudar as respostas celulares a microambientes alinhados.

Sistemas de cultura de células microfluídicas têm se estabelecido como tecnologia preferencial para o desenvolvimento de sistemas microfisiológicos (MPS)19,20,21,22,23. Aproveitando os efeitos favoráveis de escala em microescala, esses sistemas fornecem controle preciso sobre os fluxos de fluidos, suportam a introdução controlada de forças mecânicas e definem o microambiente bioquímico dentro de um microcanal 21,24,25,26,27. As plataformas MPS têm sido utilizadas para modelar microambientes tecido-específicos e estudar interações multi-órgãos28. Simultaneamente, hidrogéis têm sido amplamente explorados para recapitular a mecânica 3D e a influência biológica da MEC que são observadas in vivo29,30. Com uma ênfase crescente na integração da cultura 3D com plataformas microfluídicas, inúmeras abordagens podem combinar hidrogéis de COL1 em dispositivos microfluídicos31,32,33. No entanto, os métodos para alinhar hidrogéis de COL1 em canais microfluídicos têm sido limitados a "esteiras" 2D finas (<40 μm de espessura) em canais <1 mm de largura, oferecendo potencial limitado para modelar respostas celulares em microambientes 3D alinhados31,34,35,36.

Para obter hidrogéis 3D de COL1 alinhados em um sistema microfluídico, foi demonstrado que, quando uma solução de COL1 automontável é exposta a fluxos extensionais locais (mudança de velocidade ao longo da direção do fluxo), os hidrogéis COL1 resultantes exibem um grau de alinhamento da fibra que é diretamente proporcional à magnitude da taxa de deformação extensional que experimentam37, 38º. O design de microcanais neste protocolo é único de duas maneiras; primeiro, o projeto segmentado introduz a tensão extensional local para a solução COL1 e, segundo, sua construção de "duas peças" permite que o usuário alinhe as fibras COL1 e, em seguida, desmonte o canal para acessar diretamente as fibras alinhadas em um formato aberto. Esta abordagem pode ainda ser adotada para o desenvolvimento de plataformas microfluídicas modulares que desenvolvam sistemas microfisiológicos com matrizes de COL1 ordenadas. O protocolo a seguir descreve o processo de fabricação de microcanais segmentados e detalha o uso dos canais para alinhar o ATEL bovino COL1. Este protocolo também fornece instruções para o cultivo de células em COL1 em um formato de poço aberto e discute a adição de funcionalidade à plataforma usando uma camada de base magnética modular.

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Protocol

1. Fabricação do canal de duas peças e da base da plataforma modular

NOTA: O canal microfluídico é construído usando duas partes — o "recorte" do canal microfluídico, que é cortado a partir de uma folha de polidimetil siloxano (PDMS) de espessura definida, e a tampa do canal, que se liga reversivelmente ao recorte e forma o canal. O canal é circundado por uma estrutura de poli(metacrilato de metila) (PMMA) que atuará como um reservatório de meio (Figura 1). O quadro de PMMA também pode ser usado para travar magneticamente módulos especializados para maior funcionalidade.

  1. Canais de corte de navalha de folhas PDMS:
    NOTA: O projeto do canal microfluídico para esta etapa é fornecido na Figura Suplementar 1. O canal é composto por cinco segmentos de comprimento de 5 mm cada e larguras de 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm e 0,75 mm. A velocidade da solução de colágeno, injetada a uma taxa de fluxo constante (50-400 μL·min−1), aumenta localmente ao longo do canal à medida que a largura do canal é diminuída para gerar fluxo extensional.
    1. Monte uma folha de PDMS de 250 μm de espessura em uma folha transportadora de plástico e corte o design microfluídico usando um cortador artesanal a uma profundidade de lâmina de 0,5 mm, velocidade de 1 cm·s−1 e alta força.
    2. Usando um banho ultrassônico, limpe os recortes do canal microfluídico por 5 min. Enxaguar os canais sonicados, em água deionizada (DI), e secá-los em uma placa de aquecimento limpa a 100 °C por 5 min.
    3. Guarde os canais em uma placa de Petri limpa e coberta até o uso.
  2. Fabricação da tampa PDMS e passivação superficial:
    NOTA: O recorte de canal da seção 1.1 requer uma tampa que possa ser colocada sobre ela para criar um canal fechado no qual uma solução de COL1 possa ser injetada (Figura 1 suplementar). A tampa pode ser removida após o COL1 ter se auto-montado. Para minimizar as chances de ligação do COL1 no canal à tampa, a cobertura é passivada com albumina de soro bovino (BSA). O projeto do molde para a tampa do PDMS é fornecido. O molde deve ter pelo menos 2 mm de espessura e deve ter uma pegada igual à pegada do recorte do canal microfluídico. Nesse protocolo, a pegada do molde foi de 35 mm x 15 mm.
    1. Para preparar o molde, afixe uma folha de adesivo sensível à pressão (PSA) em uma folha de PMMA de 2,5 mm de espessura e corte a laser na forma desejada do molde.
    2. Limpe o molde de PMMA cortado a laser com um lenço umedecido e sem fiapos e remova o suporte da película PSA. Fixe o molde a um wafer de silicone de 100 mm de diâmetro pressionando firmemente.
    3. Prepare o PDMS na proporção de 10:1 (base:crosslinker). Misture vigorosamente por 1 min para garantir a mistura adequada e desgaseifique a mistura em uma câmara de vácuo para remover bolhas de ar.
    4. Despeje a solução de PDMS desgaseificado no molde de PMMA/silício e cure em uma placa de aquecimento a 100 °C por 20 min. Deixe o molde esfriar, remova o PDMS curado e corte qualquer excesso com uma lâmina de barbear.
      NOTA: Certifique-se de que os lados voltados para o wafer de silicone (lados planos) das tampas do PDMS estejam voltados para cima ao longo de todas as etapas a seguir.
    5. Use um punção de biópsia de 1 mm de diâmetro para criar orifícios de entrada e saída que correspondam às extremidades do canal microfluídico. O recorte do canal do passo 1.1 pode ser usado como um molde para orientar a posição dos furos.
    6. Sonicar a tampa em isopropanol (IPA) por 5 min, enxaguar com água DI, secar com uma fonte de ar comprimido e, em seguida, armazenar em uma placa de Petri limpa e coberta. Coloque a placa de Petri em uma câmara de esterilização UV (descoberta) por 1 min para esterilizar.
    7. Cobertura e transferência para um gabinete de biossegurança (BSC).
    8. Pipetar 300 μL de 40 mg•mL-1 de albumina de soro bovino (BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x nas tampas do PDMS e espalhar a solução uniformemente usando uma ponta de pipeta. Colocar no frigorífico a 4 °C durante, pelo menos, 4 h antes da utilização.
    9. Mova as tampas da geladeira para um BSC, lave 5x com 1x PBS e deixe-as secar ao ar por 10 min.
      NOTA: As tampas PDMS podem ser armazenadas na geladeira por até 1 semana após o revestimento com BSA.
  3. Tratamento com glutaraldeído de lamínulas
    NOTA: Funcionalizar as lamínulas com glutaraldeído liga covalentemente COL1 à lamínula e evita que o hidrogel se desprenda.
    1. Preparar uma solução de aminopropil trietoxisilano (APTES) a 2% (v/v) num copo de vidro adicionando 1 ml de APTES a 49 ml de acetona.
    2. Diluir uma solução de glutaraldeído a 25% a 5% em água DI. Completar 2 ml de solução por cada lamínula de 24 mm x 50 mm. Para lamínulas de 24 mm x 24 mm ou 22 mm x 22 mm, fazer 1 ml de solução para cada uma.
    3. Limpe as tampas em um sonicator de banho por 5 min usando IPA. Enxágue o IPA das lamínulas usando água DI. O IPA é completamente enxaguado quando uma película lisa de água pode ser vista na lamínula.
    4. Secar as lamínulas numa placa quente durante 5 minutos a 100 °C. Coloque as tampas secas em placas de Petri limpas, garantindo que elas não se sobreponham.
    5. Usando uma varinha de descarga corona, exponha as lamínulas a uma descarga corona por 1 min cada.
      NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma área bem ventilada ou em uma coifa química.
    6. Remova as lamínulas da placa de Petri e, em seguida, mergulhe na solução APTES por 10 s dentro de 5 minutos da exposição corona, garantindo que a lamínula fique submersa.
      NOTA: Certifique-se de manter o controle de qual lado foi tratado com plasma e mantê-lo voltado para cima.
    7. Em seguida, mergulhe a tampa em acetona por 10 s e seque com ar comprimido. Coloque a tampa seca de volta na placa de Petri, com o lado tratado virado para cima.
      NOTA: Repita os passos 1.3.5-1.3.7 para todas as lamínulas.
    8. Pipetar 1 mL de solução de glutaraldeído para a superfície de cada lamínula. Cubra o máximo de superfície possível sem permitir que a solução se espalhe sobre a borda da lamínula. Mais solução de glutaraldeído pode ser adicionada, se necessário. Certifique-se de não riscar a superfície com a ponta da pipeta.
    9. Deixe as lamínulas em contato com a solução por 30 min e, em seguida, enxágue com água DI por 20 s. Seque as lamínulas usando ar comprimido e coloque-as de volta nas placas de Petri, tratadas com plasma de lado para cima.
      NOTA: As lamínulas podem ser armazenadas por até 1 semana à temperatura ambiente (RT).
  4. Corte a laser da base magnética modular
    NOTA: O projeto da base magnética modular é fornecido na Figura Suplementar 1. A base modular serve como um poço para segurar a mídia e também pode ser usada para fixar magneticamente módulos especializados, como descrito em trabalhos publicados anteriormente 22,37,38,39.
    1. Recorte os projetos da camada de PMMA usando configurações de laser apropriadas, como o número de passadas e a potência.
      NOTA: As configurações do laser devem ser ajustadas de modo que os ímãs possam ser pressionados na camada de PMMA. Cada laser é diferente, e os parâmetros de corte devem ser otimizados experimentalmente. Para um laser de 45 W, 100% de velocidade, 100% de potência e 3 passadas são recomendados para cortar PMMA de 2 mm a 2 mm de espessura.
    2. Lave a parte cortada a laser usando água e sabão para remover os detritos do processo de corte a laser.
      NOTA: Não utilize solventes para limpar as peças cortadas a laser. Os solventes podem resultar na propagação de microfissuras nas bordas cortadas a laser.
  5. Montagem da plataforma
    1. Empurre ímãs (3/16 de diâmetro, 1/16 de espessura) manualmente na base cortada a laser. Um martelo macio ou uma extremidade de chave de fenda podem ser usados para ajudar a empurrar o ímã. A espessura dos ímãs deve ser menor do que a espessura da base de PMMA para garantir que os ímãs estejam nivelados com a superfície da base.
      NOTA: Os ímãs permitem que o usuário adicione funcionalidade à plataforma anexando módulos adicionais.
    2. Retire o encosto da folha de PSA e prenda a base a uma lamínula tratada com glutaraldeído com o lado funcionalizado voltado para cima.
    3. Coloque suavemente o recorte do canal PDMS na cavidade definida pelo quadro. Pressione para baixo com pinças de ponta larga para remover bolhas de ar e garantir contato conforme.
    4. Coloque a tampa do canal tratado com BSA na parte superior do recorte do canal, com o lado BSA voltado para baixo. Verifique se as portas de entrada e saída de fluido estão alinhadas com o canal.
    5. O dispositivo está pronto para a injeção de COL1.

2. Injetar a solução de COL1 no microcanal e remover a tampa para aplicações em cultura de células

  1. Preparando a solução COL1
    1. Coloque todos os reagentes necessários (solução estoque de COL1 [6 mg·mL−1], água ultrapura, 10x PBS, NaOH 0,1 M) no gelo no gabinete de biossegurança.
    2. Calcule o volume de reagentes da seguinte forma:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      NOTA: Portanto, para fazer 1 mL de colágeno neutralizado 2,5 mg·mL−1 a partir de um estoque de 6 mg·mL−1, adicione 416,67 μL de colágeno, 429,16 μL de água DI, 100 μL de 10x PBS e 54,16 μL de NaOH 0,1 M para um pH final de 7. Adicionar 20 μL de NaOH 0,1 M para atingir um pH de 9,0.
    3. Adicionar os reagentes em um frasco vazio de 5 mL na seguinte ordem: i) estoque de COL1, ii) água DI, iii) 10x PBS, iv) NaOH 0,1 M.
      Observação : use uma pipeta de deslocamento para manipular a solução COL1. Pode ocorrer uma perda significativa de amostra se for utilizada uma pipeta regular, levando a flutuações na concentração final da solução.
    4. Elevar o pH da solução para o pH desejado (tipicamente entre 7-9).
  2. Injetando a solução de COL1
    1. Coloque uma bomba de seringa, uma seringa estéril resfriada, uma solução de COL1 neutralizada resfriada e uma agulha de bloqueio Luer estéril de 20 G e 90° em um armário de biossegurança. Coloque a solução de COL1 na seringa, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas.
    2. Ligue a ponta da agulha de 90° 20 G à seringa, carregue a seringa na bomba da seringa, agulha virada para baixo e prima a agulha com a solução de COL1.
    3. Ajuste a bomba de seringa para a taxa de fluxo necessária, entre 50-2.000 μL/min.
    4. Coloque os canais PDMS preparados (secção 1) numa tomada de laboratório e nivele com a agulha.
    5. Insira a agulha na porta de entrada do canal PDMS (lado largo). Injete o canal até que uma gota de ~30 μL de COL1 se colete no lado de saída.
    6. Abaixe o macaco de laboratório e separe suavemente a agulha do canal recém-preenchido.
    7. Repita as etapas 2.2.5-2.2.9 até que todos os canais tenham sido preenchidos com a solução COL1.
    8. Coloque os canais preenchidos nas placas de Petri ao lado de um lenço limpo e sem fiapos saturado com água DI para evitar a desidratação do gel COL1 recém-formado.
    9. Cubra a placa de Petri e coloque os canais carregados na incubadora (37 °C, 95% de umidade) por 2 h antes da etapa de descascamento.
  3. Descascamento e equilíbrio dos meios
    1. Exponha o gel polimerizado de COL1 retirando a tampa do PDMS usando uma pinça. O tratamento BSA impede que o COL1 se fixe à tampa.
    2. Adicionar 650 μL de EGM ao poço.
    3. Deixar os dispositivos na incubadora (37 °C, 95% de umidade) por um mínimo de 4 h para equilibrar o gel e o meio. Substitua a mídia antes de semear por células
  4. Células semeadoras
    1. Colocar tripsina a 0,25% e meios de cultura aquecidos juntamente com o número necessário de pipetas de 5 mL e 10 mL no gabinete de biossegurança.
    2. Cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) para confluência de 80% em meio de crescimento endotelial (EGM) a 37 °C, em umidade de 95%. Colocar o frasco de cultura de tecidos contendo HUVECs no BSC após verificar a confluência ao microscópio.
    3. Eliminar o meio no frasco T25 e lavar as células 2x com PBS 1x. Adicionar 1 ml de tripsina ao balão e colocá-lo na incubadora (37 °C, 95% de humidade) durante 3 min.
    4. Verifique o frasco ao microscópio após 3 min para garantir que as células estão completamente separadas da superfície.
    5. Adicionar 3 mL de EGM (com soro) ao balão para neutralizar a tripsina. Em seguida, transferir a solução celular usando uma pipeta de 5 mL para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo cónico contendo células a 150 x g durante 5 min.
    6. Coloque o tubo cônico no armário de biossegurança e descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 1 mL de meio de cultura fresco.
    7. Adicionar e misturar 15 μL de azul de tripano e 15 μL da solução celular ressuspensa num tubo cónico de 1 ml.
    8. Injete azul de tripano e solução de células em ambos os lados de uma lâmina de contagem de células e insira a lâmina em um dispositivo de contagem de células.
    9. Diluir a solução celular em meio de crescimento endotelial até a concentração necessária com base na concentração celular obtida do dispositivo de contagem celular.
      NOTA: Um frasco T25 de HUVECs com 80% de confluência produzirá ~750.000 células·ml−1 se diluído em 1 mL de meio. O volume da suspensão celular a ser semeada é calculado como área da superfície de cultura × densidade celular/concentração de suspensão celular. Exemplo: Para semear 20.000 células·cm−2 no poço de 35 mm x 15 mm, será necessário ~140 μL da suspensão celular.
    10. Aspirar a mídia na matriz COL1 projetada.
    11. Adicione o volume necessário da solução celular ao substrato COL1 e deixe as células acomodarem-se por um mínimo de 4 h antes da aquisição de imagens.
  5. Marcação do núcleo celular e citoesqueleto
    1. Aspirar o meio das células e lavar 3x com 1x PBS, 500 μL em cada lavagem. Cobrir a camada celular com paraformaldeído a 4% por 15 min em TR.
    2. Aspirar o paraformaldeído e lavar com 1x PBS Tween-20 por 5 min.
    3. Permeabilizar a membrana celular usando 500 μL de solução de Triton-X a 0,1% em PBS por 15 min. Lave com 1x PBS Tween-20 por 5 min.
    4. Bloquear os sítios de ligação inespecíficos com 500 μL de BSA a 4% em PBS por 30 min na RT.
    5. Diluir a solução fluorescente de faloidina-actina em BSA a 4% (1 μL de estoque em 400 μL de BSA).
    6. Aspirar a solução de BSA, adicionar a solução de faloidina às células e aguardar 30 min na RT.
    7. Diluir a coloração nuclear em BSA a 4% (1 μL em 500 μL), aspirar a faloidina, adicionar a solução de corante nuclear de trabalho e aguardar 15 min na RT.
    8. Aspirar a solução de trabalho de coloração nuclear, lavar com PBS Tween-20 3x por 5 min cada, e substituir por 1x PBS antes da aquisição de imagens.
    9. Imagem utilizando microscópio epifluorescente utilizando o canal FITC (ex 491 nm/em 516 nm) e canal DAPI (ex 360 nm/em 460 nm) com lente de 40x. Obtenha imagens do colágeno usando um confocal de varredura a laser no modo de reflectância usando a linha laser de 488 nm (15% de potência) e objetiva de imersão em água de 40x.

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Representative Results

Quando uma solução de COL1 automontável flui através de um canal com área de secção transversal decrescente, a velocidade de fluxo (v x) da solução de COL1 aumenta localmente em uma magnitude, ∂v x, ao longo do comprimento da constrição entre os dois segmentos (∂x), resultando em uma taxa de deformação extensional (ε̇) onde ε̇ = ∂v x/∂x. A taxa de deformação extensional pode ser calculada a partir da velocidade do fluido, que é medida por meio da velocimetria por imagem de partículas (PIV), como pode ser visto na Figura 2.

Previamente, foi demonstrado que a deformação extensional local promove alinhamento de longo alcance das fibras de COL137,38,40 (Figura 3). O alinhamento do COl1 é diretamente influenciado pela magnitude da taxa de deformação extensional na constrição e pode ser observado estendendo-se uniformemente por todo o comprimento de 5mm do segmento. Para medir o alinhamento das fibras, imagens de microscopia de reflectância confocal (MRC) das fibras foram usadas para criar um histograma de alinhamento das fibras. O coeficiente de alinhamento (CoA) é a fração de fibras alinhadas dentro de ±15° do valor da moda no histograma 38,42,43,44. Intervalos de CoA de 0-1 com valores >0,5 foram considerados alinhados.

Injetar um hidrogel 3D em microcanais tradicionais e selados limites onde meios e células podem ser introduzidos na matriz. O canal de duas peças neste protocolo supera a limitação de acessar um hidrogel em um canal, permitindo que o usuário levante a tampa do canal e acesse diretamente toda a matriz COL1. A decolagem do canal é possibilitada pela funcionalização da lamínula de vidro com glutaraldeído para promover a fixação de COL1 usando interações amina-aldeído-amina e funcionalizando a tampa de PDMS com BSA para evitar a adsorção de COL1 na tampa. O alinhamento da fibra COL1 permanece inalterado após a retirada da tampa, como visto visualmente na Figura 4.

Sabe-se que substratos alinhados de COL1 influenciam o alinhamento celular por meio do direcionamento de protrusões 9,12,45,46 e, por sua vez, a organização dos filamentos de tensão. Células endoteliais nos segmentos não alinhados e alinhados de COL1 foram imageadas para investigar a resposta celular às matrizes de COL1 desenvolvidas usando este protocolo. As células foram fixadas e coradas 4 h após a semeadura. Imagens representativas das HUVECs cultivadas no segmento alinhado da matriz mostraram maior alinhamento das fibras de actina em relação às HUVECs no segmento com fibras aleatórias (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Esquema mostrando a montagem das camadas. Essa figura foi adaptada com permissão de Ahmed et al.38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Canal escalonado e taxas de deformação extensional. (A) Esquema do canal escalonado com dimensões. Outset mostra o cálculo da taxa de deformação extensional. A taxa de deformação extensional em cada constrição é calculada a partir da velocidade medida por velocimetria por imagem de partículas (PIV). (B) As taxas de deformação extensional em cada constrição. Essa figura foi adaptada com permissão de Ahmed et al.38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagens de reflectância confocal das fibras de COL1 em cada segmento microcanal após a polimerização de COL1. O aumento do grau de alinhamento das fibras do segmento (a) para o segmento (e) pode ser observado visualmente. Barra de escala = 25 μm. Essa figura foi adaptada com permissão de Ahmed et al.38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagens de reflectância confocal das fibras COL1 mostrando que o alinhamento da fibra permanece inalterado pela remoção da tampa do canal. Barra de escala = 25 μm. Essa figura foi adaptada com permissão de Ahmed et al.38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Imagens representativas de células e fibras de COL1. Imagens representativas de células e fibras de COL1 no segmento (e) da matriz de COL1 e segmento (a) da matriz de COL1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Figura mostrando componentes cortados a laser com dimensões. (A) Canal, (B) base magnética e (C) molde de tampa de canal. Todas as dimensões em milímetros. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Protocolos para geração de matrizes de COL1 com fibras alinhadas têm sido descritos utilizando métodos magnéticos, aplicação direta de deformações mecânicas e técnicasmicrofluídicas47. Abordagens microfluídicas são comumente usadas para criar sistemas microfisiológicos devido às suas características de fluxo e transporte bem definidas, que permitem o controle preciso sobre o microambiente bioquímico. Uma vez que as fibras de COL1 alinhadas fornecem pistas instrutivas importantes durante processos fisiopatológicos, como cicatrização de feridas, invasão de células tumorais e desenvolvimento de tecidos, gerar matrizes de COL1 alinhadas em sistemas microfluídicos é um passo em direção ao desenvolvimento de sistemas microfisiológicos biologicamente relevantes.

Este protocolo fornece a capacidade de fabricar matrizes COL1 alinhadas em escala milimétrica com regiões de alinhamento de fibra definidas. Para induzir o alinhamento, utiliza-se um canal microfluídico com reduções graduais na largura. À medida que uma solução de COL1 automontável flui através do canal a uma taxa de fluxo constante, a velocidade do fluxo da solução aumenta nas constrições, resultando em deformação extensional local e alinhamento de longo alcance das fibras de COL1 automontáveis. Em comparação com o alinhamento de fibra induzido por fluxo de cisalhamento, observamos o alinhamento da fibra em canais de até 250 μm de espessura, permitindo-nos criar hidrogéis 3D em um canal microfluídico. Como o alinhamento da fibra COL1 depende da taxa de deformação extensional, os usuários podem modificar o canal fornecido ou desenvolver projetos de canal personalizados para gerar fluxo extensional e criar matrizes COL1 do tamanho e forma desejados. Flexibilidade adicional é fornecida através da fabricação livre de litografia suave dos canais, permitindo a prototipagem rápida de projetos de canais.

A abordagem de dois canais apresentada neste protocolo supera as limitações de acesso a um hidrogel 3D em microcanais. Um canal de duas peças fornece acesso direto ao hidrogel COL1, no qual a tampa do canal pode ser levantada para revelar a matriz COL1 no canal. O acesso direto ao COL1 após a polimerização elimina a necessidade de as células serem misturadas na solução precursora de COL1, permitindo que o usuário manipule a solução precursora de COL1 por longos períodos em pH não fisiológico e baixas temperaturas. Além disso, uma abordagem modular pode ser usada para posicionar as células e fornecer recursos de biofabricação camada por camada, como mostrado em nosso trabalho anterior. Os módulos podem ser usados para introduzir membranas para co-cultura, introduzir perfusão contínua e também criar construções de MEC multicamadas 22,38,39. Módulos personalizados também podem ser fabricados dependendo das necessidades experimentais. Juntamente com o travamento magnético, a abordagem modular também é adequada para experimentos que exigem funcionalidade adicional com o tempo.

Existem algumas etapas críticas que precisam ser consideradas neste protocolo. Todos os componentes, incluindo o recorte do canal, a tampa, as lamínulas e a base modular, devem ser limpos adequadamente para garantir a colagem adequada e a funcionalização química. O colágeno deve ser preparado sobre gelo, e todos os componentes devem ser mantidos frios para garantir a consistência. Uma vez preparada, a solução de colágeno deve ser usada dentro de 10 minutos de preparação. O pH final da solução de colágeno deve ser medido usando uma sonda de pH para garantir a consistência. Um lenço limpo e úmido deve ser colocado na placa de Petri com o colágeno para garantir que o colágeno não seque na incubadora quente.

Algumas modificações e solução de problemas do protocolo incluem o seguinte. (i) Se a mídia vazar durante a cultura celular, deve-se garantir que a estrutura e as lamínulas de PMMA sejam fixadas sem lacunas na camada adesiva. (ii) Se os ímãs não forem colocados nivelados na camada de base, eles impedirão que a lamínula adera à base, resultando em lacunas. (iii) O revestimento de glutaraldeído na lamínula também pode ser de menor concentração, se necessário (até 0,1%). A concentração ótima de glutaraldeído para prevenir toxicidade deve ser determinada experimentalmente para cada linhagem celular a ser utilizada no experimento, uma vez que o glutaraldeído pode apresentar toxicidade às células. (iv) Pode-se incluir materiais adicionais, como ácido hialurônico, fibronectina ou esferas fluorescentes, juntamente com colágeno para personalizar ainda mais a matriz. (v) Se necessário, o design do canal pode ser modificado para ter segmentos mais longos ou mais curtos para evitar efeitos de contorno e borda48.

Este protocolo tem as seguintes limitações. O colágeno bovino do Atelo é um material mole (G' <100 Pa) na concentração de 2,5 mg·mL−1. Para aumentar a rigidez do gel, os pesquisadores podem usar concentrações mais altas de colágeno ou introduzir agentes reticulantes. Embora este protocolo só tenha sido validado para alinhar matrizes de colágeno de até 250 μm de espessura, matrizes mais espessas podem ser desenvolvidas aumentando a espessura do canal e otimizando as taxas de fluxo para introduzir taxas de deformação extensional adequadas.

Espera-se que este protocolo seja útil para pesquisadores que buscam desenvolver microambientes ordenados tecido-específicos. Também pode ser usado como um guia para a criação de plataformas fluídicas modulares para estabelecer sistemas microfisiológicos.

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Disclosures

Todos os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte pelo Instituto Nacional de Saúde sob o número de prêmio R21GM143658 e pela National Science Foundation sob o número de concessão 2150798. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa, necessariamente, a opinião oficial das agências de fomento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

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Retratação Edição 187
Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance
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Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

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